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1. Titulo: MUESTREO, DILUCIONES Y RECUENTO MICROBIANO


2. Objetivos
2.1 Familiarizar al estudiante en el tratamiento adecuado de una muestra para anlisis
microbiolgico.
2.2 Conocer las tcnicas utilizadas en la preparacin de diluciones.
2.3 Identificar la manera correcta de reportar y registrar los resultados de los anlisis
microbiolgicos.
3. Marco Terico
Muestreo: Es la operacin que consiste en separar un determinado numero de muestras
de un lote con el fin de obtener resultados analticos confiables.
Nmero de Muestras: Para que el muestreo tenga utilidad estadstica, se debe realizar
sobre un nmero apreciable de unidades de un lote. El numero de muestras esta en
relacin con la precisin que se desee obtener de los resultados.
El nmero de muestras es el igual a la raz cuadrada del nmero total de unidades que
conforman el lote, o tomando el 1 %, del total cuando este es grande y el 10%, cuando el
lote es pequeo. Cuando los productos se controlan con regularidad, es suficiente
analizar de 5 a 10 muestras de cada lote.
Parmetros a tener en cuenta en un programa de Muestreo:
-

Inspeccin
Tamao del lote (N)
Tamao de la muestra(n)
Muestra
Toma de muestra
Muestra defectuosa
Riesgo del comprador
Riesgo del vendedor
Nivel de calidad Aceptable (NCA): Es el porcentaje mximo de unidades defectuosas
(nmero mximo de
unidades defectuosas por cada 100), que se considera
satisfactorio o que se admite en un lote.

Condiciones para el muestreo:


Para obtener una muestra representativa se deben cumplir las siguientes condiciones:
-

La persona responsable del muestreo debe conocer perfectamente su finalidad e


importancia, debe estar bien entrenada.
En lo posible la muestra se tomara en sus envases originales.

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El muestreo sobre lotes o remesas, se puede hacer, usando la tcnica del muestreo
aleatorio, aplicando la tabla de nmeros al azar.
Cuando los envases son muy grandes y difciles de transportar, se toman,
aspticamente, muestras representativas y se pasan a envases estriles ms
pequeos.

Envo de la muestra al laboratorio:


Una vez tomadas las muestras, se empaquetan de forma adecuada segn su naturaleza,
para evitar las roturas y el deterioro; estos recipientes se maraca correctamente as:
-

Nombre y direccin de la persona que ha tomado la muestra


Nombre y direccin de la persona, empresa donde se han tomado las muestras
Fecha, lugar y hora de la toma de muestras
Clase de alimentos que integran las muestras
Nombre del fabricante, importador, vendedor, comprador
Razn del muestreo
Nmero, tamao y marca de las unidades que forman el lote
Forma de transporte, punto de origen y lugar de destino
Mtodo de muestreo utilizado
Temperatura del producto en el momento del muestreo
Temperatura ambiental de almacenamiento
Condiciones de envo

Tipos de Muestreo:
Los muestreos se pueden clasificar de acuerdo a los siguientes criterios:
Segn la calidad prejuzgada:
-

Muestreo Normal: No existe evidencia de desviacin de las condiciones


Muestreo reducido: El margen de calidad es superior al normal y la muestra se divide
en dos
Muestreo riguroso: Hay indicios de calidad inferior a lo normal

Segn la intencionalidad:
-

Muestreo Aleatorio: Se lleva a cabo mediante planes establecidos al azar


Muestreo Intencional: Hay indicios de fraude y por tanto, puede existir una distribucin
intencionada del lote.

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Segn el nmero de Muestras:


-

Muestreo simple: Se analiza un nico grupo de unidades extradas del lote


Muestreo Doble: Se selecciona una muestra inicial, que se somete a inspeccin, que
se acepta o se rechaza segn la cantidad de unidades defectuosas sea pequea o
grande. Si los resultados no son decisivos se toma otra muestra.
Muestreo Mltiple: Se escogen varias muestras formadas por un numero pequeo de
unidades, hasta decidir su aceptacin o rechazo.

Muestreo Aleatorio:
Consiste en elegir las unidades al azar, utilizando tablas matemticas calculadas para
este fin. Estas tablas se manejan de la siguiente manera:
Se procede a enumerar cada unidad del lote (paquetes, contenedores, unidades del
producto), si el lote esta integrado por 200 unidades, su numeracin se marcara de 1 al
200. Con un lpiz se seala un lugar cualquiera en la tabla de nmeros al azar,
coincidiendo con un digito o su proximidad, este dgito sirve de punto de partida para la
separacin del nmero de muestras destinadas al anlisis. Supongamos que se ha
punteado con el lpiz un lugar que corresponde a la fila 15 y la columna 10, este numero
es el 1 (uno) y los que le siguen en las columnas 11 y 12, son el 4 y el 6;, en este caso la
unidad que se debe separar del lote esta marcada con el numero 146. A continuacin se
pasa a la fila 16 y a las mismas columnas 10,11,y 12, a las que corresponde el numero
078, una nueva unidad que se separa del lote, pasando a la fila 17, columnas 10,11,y 12
figura el numero 152,que debe ser tambin separado del lote. Se procede de la misma
forma hasta obtener el nmero de muestras sealado previamente.
Preparacin de las muestras y proceso de dilucin:
La Porcin del alimento destinada al anlisis microbiolgico debe ser representativo de
toda la muestra y constituida normalmente por 200 gramos o mililitros. Para la puesta en
marcha, se utilizan 100 g o ml, el resto se almacena como contramuestra.
Si el alimento esta integrado por distintos componentes, se toman fracciones
representativas de cada uno de ellos.
Pesada de la muestra:
-

Tarar el recipiente estril que se va a usar para triturar la muestra.


Introducir, aspticamente, la porcin de un volumen adecuado en dicho recipiente.
Pesar de nuevo para determinar el peso neto del alimento.
Con una probeta graduada estril, se aadir la cantidad de diluyente estril, para
obtener la dilucin deseada.

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Casi todos los anlisis se realizan a partir de una suspensin liquida de concentracin
conocida, que se denomina suspensin madre y que tiene una dilucin 1:10. Para
conseguir este factor de dilucin, se pesa una cantidad de muestra y la pesada que
resulte, se multiplica por 9 (nueve), este nuevo resultado sern los mililitros de diluyente
que se debe aadir a la muestra pesada. A partir de esta dilucin se preparan las
siguientes (1:100,1:1000, as sucesivamente....) hasta el factor requerido y establecido por
el laboratorio que realiza el anlisis.
Un buen diluyente, no debe producir modificaciones cualitativas ni cuantitativas en la
microbiota de los alimentos que van a ser analizados, sin suprimir ni favorecer su
desarrollo. Los diluyentes ms utilizados en microbiologa alimentarla son: Agua de
triptona con sal, solucin Ringer Y* y/o Agua de peptona tamponada.
Triturado y homogenizado de la muestra:
Para obtener resultados confiables en un recuento o nmero mas probable es primordial
obtener muestras bien homogenizadas, para ello existen diversos equipos, el ms
conocido es el Stomacher, creado en 1971 por Stomacher Colweil. Dentro de sus ventajas
se encuentran:
-

Se suprime la necesidad de limpiar y guardar tos recipientes de la mezcladora.


Durante los tiempos normales de funcionamiento (generalmente dos minutos) no se
produce aumento de calor.
Los homogeneizados se pueden guardar en refrigeracin en las bolsas del Stomacher
para ser utilizadas posteriormente.
La intensidad del ruido no es tan desagradable como el de las mezcladoras
mecnicas.

Cuando no se cuenta con el Stomacher puede utilizarse un homogeneizador o licuadora


con una velocidad de hasta 8.000 rpm que permita una buena homogeneizacin del
producto.
RECUENTO MICROBIANO:
RECUENTO EN PLACA DE MICROORGANISMOS. Mtodo ICONTEC
El presente mtodo esta basado en los lineamientos de la Norma Tcnica Colombiana
NTC-4092, que establece directrices generales para realizar anlisis microbiolgicos de
conformidad con las normas internacionales (ISO 7218 DE 1997).
Para la correcta aplicacin de esta norma, la preparacin de la muestra es fundamental,
por lo tanto se requiere que la siembra se realice a partir de dos diluciones consecutivas y
por duplicado, a dems de Inocular correctamente los volmenes, 0.1 ml, para superficie y
bajo ciertas condiciones 1ml, como cuando se sospecha baja carga microbiana y 1ml,
para anlisis en profundidad.

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Rangos para el Recuento:


Bacterias: Despus del periodo especificado de incubacin, se cuentan las unidades
formadoras de colonias (ufc), presentes en las cajas que contengan entre 15 y 300 ufc;
los anlisis que aplican para dicho rango son: Aerobios mesfilos, Coliformes, Bacterias
termfilas, proteolticas, lipolticas, Clostridium sulfito reductores, S. aureus, entre otros
excepto para aquellas bacterias cuya norma exige presencia o ausencia o cuando se
deban realizar anlisis especiales que requieren de una identificacin posterior, como la
confirmacin de S. aureus coagulasa positivo.
Hongos: Despus del periodo especificado de incubacin, se cuentan las ufc presentes en
las cajas que contengan entre 15 y 150 ufc, para Mohos y levaduras y levaduras
osmfilas.
Recuento y expresin de los resultados:
Se calcula el nmero de microorganismos presentes en la muestra, a partir del recuento
de dos diluciones consecutivas; se requiere, que al menos una de las dos cajas de cada
dilucin
Est dentro del rango, aplicando la siguiente formula:

Se redondea el resultado a dos cifras significativas; para esto, si la ltima cifra es inferior
a 5, la unidad anterior no se modifica; si la ultima cifra es 5 o mayor, la unidad anterior no
se modifica; si la ltima cifra es 5 o mayor, la unidad anterior se incrementa en una
unidad. De esta forma se prosigue hasta obtener dos cifras significativas. Los resultados
se expresan en ufc por gramo o mililitro, del producto, segn la naturaleza del mismo
(slido o lquido), expresado como un numero entre 1.0 y 9.9 (dos cifras significativas, un
entero y un decimal), multiplicado por lux, donde x es la potencia apropiada de 10.

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Ejemplo: A partir de un anlisis de Aerobios mesfilos para un jugo de papaya, se


obtuvieron los siguientes resultados:
Primera dilucin retenida 10-2: 168 y 215
Segunda dilucin retenida 10-3:14 y 25
168+ 215+25
N=
________________
1 (2+(0.1x1))0.01

N=

408
___________________
0.021

N=

19428

Al redondear la cifra como se especifico anteriormente, se obtiene como resultado 19000,


que egresado en dos cifras significativas es igual a 1,9 X 104 ufc/ml.
Casos Especiales:
CASO 1: Cuando el numero de ufc se encuentra por debajo del rango mnimo en ambas
cajas de una o de las dos diluciones consecutivas, se informar de la siguiente manera:
Se descarta el recuento obtenido en la mayor dilucin y se calcula la media aritmtica de
las colonias presentes en las dos cajas de la menor dilucin, multiplicndose por el
inverso de la dilucin, e informando el resultado as:
Conteo Estimado de ufc /g o ml, expresado con las dos cifras significativas por la
potencia adecuada de 10.
Ejemplo: A partir de un anlisis de Aerobios mesfilos en una muestra de agua, se obtuvo
este resultado:
Primera dilucin retenida: 10-1: 45 y 10
Segunda dilucin retenida: 10-2:4 y 3
Se descarta el recuento obtenido en la dilucin ms alta (10 -2) y se calcula la media
aritmtica de la dilucin ms baja (10 -1), y se multiplica por el inverso de la dilucin
respectiva:
N = 45+10/2x10
N = C.E.3,3x102 ufc/ml.

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CASO 2: Ausencia de crecimiento, si las dos cajas correspondientes a la primera dilucin


no presentan crecimiento, se informa el resultado como sigue, reportando el factor de
dilucin de la ms concentrada
< 1 x 10x ufc /g o ml, segn corresponda.
Ejemplo: A partir de un anlisis de aerobios mesfilos en una muestra de jugo, se obtuvo
este resultado:
Primera dilucin retenida 10-2: 0 y 0 ufc
Segunda dilucin retenida 10-3 0 y 0 ufc
Se informa de la siguiente manera, utilizando el factor de dilucin de las cajas ms
concentradas:
< 1x102 ufc/ml
Nota: Cuando el conteo de colonias excede al mximo rango, se recomienda repetir el
anlisis empleando diluciones mayores, con el fin de obtener resultados ms confiables.
RECUENTO EN PLACA DE MICROORGANISMOS EN ALIMENTOS MTODO Ministerio
de Salud
Para la correcta aplicacin de esta norma, la preparacin de la muestra es fundamental,
por lo tanto se requiere que la siembra se realice a partir de dos diluciones consecutivas y
por duplicado, adems de inocular correctamente los volmenes, 0.1ml, para superficie y
bajo ciertas circunstancias 1 ml, como cuando se sospecha baja carga microbiana y 1 ml
para anlisis en profundidad.
RANGOS PARA EL RECUENTO:
Bacterias: Despus del periodo especificado de incubacin, se cuentan las unidades
formadoras de colonias presentes en las cajas que contengan entre 30 a 300 ufc; los
anlisis que aplican a dicho rango son: Aerobios mesfilos, Coliformes, Bacterias
termfilas y en general para el anlisis de microorganismos donde no se observan
reacciones enzimticos ni de crecimiento sobre la superficie del Agar.
Bacterias (patgenos o identificacin enzimtico posterior al recuento): Para el recuento
de estos ltimos microorganismos se emplea el rango 20 a 200 ufc, como para el anlisis
de S. aureus, B. cereus.
Mohos y Levaduras: Para el recuento de mohos y levaduras y levaduras osmfilas se
debe utilizar el rango comprendido entre 10 y 100 ufc.
RECUENTO Y EXPRESIN DE LOS RESULTADOS:

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Caso General:
Se calcula el promedio de colonias para cada una de las diluciones a examinar,
multiplicando el resultado por el inverso de la dilucin respectiva, a partir del recuento de
dos diluciones consecutivas. A continuacin se divide el resultado obtenido en la mayor
dilucin por el obtenido en la menor dilucin (dividir la menos concentrada por la mas
concentrada).
Si el cociente de esta divisin es mayor a 2, se reporta el resultado obtenido en la
dilucin ms concentrada, pero, si el cociente es menor o igual a 2, se reporta la
media aritmtica de los recuentos de las dos diluciones utilizadas para el clculo.
El resultado obtenido se redondea a dos cifras significativas. Para esto, si la ltima cifra
es inferior a 5, la cifra anterior no se modifica, pero, si la ultima cifra es mayor o igual a 5,
la cifra anterior se incrementa en una unidad y se prosigue as hasta obtener las dos cifras
significativas.
Los resultados se expresan en ufc/g o ml, de producto, segn la naturaleza del mismo y
expresado como un nmero entre 10 y 99 (dos cifras significativas enteras), multiplicado
por 10x donde x es la potencia apropiada de 10.
Ejemplo: A partir de un anlisis de aerobios mesfilos, para un agua embotellada, se
obtuvieron los siguientes resultados:
Primera dilucin retenida 10-2 168 y 215 ufc
Segunda dilucin retenida 10-3 35 y 45 ufc
N = 168+215/2 x100
N = 19150
N=

35+45/2 x 1000

N=

40000

N=

40000/19150 = 2.087 >2

Como el cociente es mayor a dos, se reporta el resultado de la menor dilucin, 10 -2:19150


ufc/ml. Al redondear la cifra a dos enteros, como se especifico anteriormente, se obtiene
19000, que expresado con dos cifras significativas es 19 x 103 ufc/ml.
Casos especiales:
CASO 1: Cuando el numero de ufc se encuentra por debajo del rango mnimo en ambas
cajas de una o de las dos diluciones consecutivas, se informar de la siguiente manera:
Se descarta el recuento obtenido en la mayor dilucin y se calcula la media aritmtica de

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las colonias presentes en las dos cajas de la menor dilucin, multiplicndose por el
inverso de la dilucin, e informando el resultado as:
Conteo Estimado de ufc/g o ml, expresado con las dos cifras significativas enteras.
CASO 2: Ausencia de crecimiento, si las dos cajas correspondientes a la primera dilucin
no presentan crecimiento, se reporta como negativo y se informa el resultado como sigue,
utilizando para el reporte el factor de dilucin mas concentrado.
Conteo Estimado < 1 x 10x ufc /g o ml, segn corresponda
CASO 3: Crecimiento abundante; si las dos cajas correspondientes a la primera dilucin
presentan crecimiento mayor de 300, 200 o 100, segn sea el anlisis, se divide la caja en
4,6, u 8 cuadrantes, se cuenta el numero de colonias presentes en un cuadrante y se
multiplica por el total de cuadrantes hechos en la caja. Se realiza el mismo procedimiento
con la otra caja correspondiente a la misma dilucin y posterior a ello se saca la media
aritmtica de cada dilucin, multiplicando por el inverso de la dilucin respectiva. Se
contina el recuento como en el caso general, pero se informa el resultado como conteo
estimado de ufc/g o ml, (es decir, dividir el resultado de la mayor dilucin por el de las
menores y ver si el resultado es menor o igual o mayor a 2 y proseguir como los casos
generales.
Ejemplo: A partir de un anlisis de aerobios mesfilos en una muestra de jugo se
obtuvieron los siguientes resultados, para una leche pasteurizada:
Primera dilucin retenida 10-2: > 300 ufc en las dos cajas
Segunda dilucin retenida 10-3 > 300 ufc en las dos cajas
Al dividir las cajas de 10-2 en 4, se cont en un solo cuadrante 180 y 150 colonias
respectivamente. Y al dividir las cajas de 10-3 en 4, se cont en un solo cuadrante 100 y
120 colonias respectivamente.
10-2 (caja 1) ((180 X 4) X 100))
10-3 (caia1) ((100 X 4 ) X1000))

10-2 (caja 2) ((150 X 4) X 100))


10-3 (caia2) ((120 X 4) X1000))

10-2 = 720+600 X 100/2 = 66000


10-3 = 400+480 X1000 12 = 440000
440000/66000= 6,66 > 2
Como el cociente es > a 2, se reporta el resultado de la menor dilucin 10'10 2
:66000ufc/ml. Al redondear la cifra a dos enteros, como se especific anteriormente, se
obtiene 66000, que expresado con dos cifras significativas es igual al Conteo Estimado de
66 X 103 ufc/ml.
NOTA: Cuando el conteo de colonias exceda de 200 en 1/8 de la caja, se reportar como
Conteo Estimado > 1600 ufc/g o ml, multiplicado por el inverso de la mayor dilucin.

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4. Materiales, Equipos e Insumos


-

Agar OGY fundido 40 ml


Agar SPC fundido 40 ml
1 Frasco de dilucin o Fiola con capacidad de 250 ml con 90 ml de agua
peptonada 0.1%
3 tubos taparrosca con 9 ml de agua peptonada cada uno
3 Pipetas de 1 ml estriles
1 Pipeta de 10 ml estril
2 Asas de Hockey estriles
1 Vaso de licuadora con cuchillas estriles y su correspondiente motor.
1 Balanza de precisin 0.1g.
4 Cajas de petri estriles.

5. Reactivos
-

Cristal violeta
Fuschina
Lugol
Alcohol Acetona
-Naftol

6. Procedimiento
El trabajo de las muestras debe iniciarse lo antes posible despus de su recoleccin, si no
se puede, se debe mantener en refrigeracin sin exceder las 24 horas. Si la muestra est
congelada, descongelarla en el envase original.
En muestras lquidas la dilucin 10-1 se prepara midiendo 11 ml o 10 ml de la muestra en
un frasco de dilucin que contenga 99 ml o 90 ml de diluyente, sosteniendo la pipeta en
un ngulo de 45 grados sobre la parte interior del cuello del frasco.
Para muestras slidas pesar 11 g o 10 g del total del alimento, en un frasco de dilucin
que contenga 99 ml o 90 ml de diluyente, tratando de coger de la superficie e interior del
alimento (no debe olvidar que este procedimiento se debe hacer en condiciones de
esterilidad). Guardar una contramuestra para eventuales verificaciones, en condiciones de
refrigeracin, congelacin o medio ambiento de acuerdo con las caractersticas de
almacenamiento del producto.
Agitar el frasco vigorosamente, dejar en reposo de 2 a 5 minutos.
-

Transferir un mililitro de la dilucin 10-1 a un tubo que contenga 9 ml de diluyente para


obtener la dilucin 10-2 homogenizar cuidadosamente la dilucin, y transferir un mililitro
a otro tubo que contenga 9 ml del diluyente para obtener la dilucin 10-3. Repetir estos

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pasos hasta obtener el nmero de diluciones deseadas, cada dilucin sucesiva


disminuir 10 veces la concentracin.
Siembre en profundidad y por duplicado, Inoculando 1 ml de la(s) diluciones
seleccionadas encajas De Petri estriles.
Vierta el Agar SPC fundido y mantenido a 45 C.(15 a 20 ml)
Mezcle inmediatamente las cajas con el medio, moviendo estas a la derecha,
izquierda, arriba y abajo, mnimo 5 veces.
Deje solidificar, e incube las cajas invertidas a 37 C 2 C.
Pasadas 24 horas de incubacin, revise las cajas y realice el recuento de colonias
visibles, incube nuevamente y revise a las 48 horas, realice el recuento.
Criterio de seleccin: Cuando se va a realizar el recuento, debe seleccionar las
diluciones para bacterias mesfilas aerobias, en el rango de 30 a 300 colonias.
Para el recuento de mohos y levaduras, inocule 0.1 ml, de la dilucin correspondiente
sobre la superficie de una caja de Agar OGY, deje absorber e incube invertidas las
cajas a 25 C por 3 a 5 das.
Seleccione las cajas que estn entre 15 y 150 colonias, cuente las colonias que
presenten las caractersticas de hongos y levaduras, informe el resultado de mohos y
levaduras por g o ml.
Con los datos obtenidos en los dos casos, proceda a realizar los clculos por los
mtodos de ICONTEC y Ministerio de Salud.
Reporte los resultados correctamente.

7. Nivel de Riesgo
2. (bata de laboratorio manga larga, guantes, cofia, zapato cerrado, tacn bajo, pantaln
largo)
8. Bibliografa
-

Albarracin, F. Y.; Herrera, F. C. Texto de Laboratorio de Microbiologa de


Alimentos.1995
Alaert, C. , Escola. M. Mtodos de Anlisis Microbiolgicos de Alimentos .Madrid:
Editorial Daz de Santos. 2002.
Doyle, M. P. Beuchat, L R. Microbiologa de Alimentos. Fundamentos y Fronteras.
Zaragoza: Editorial Acribia, 2001.
Pascual, M.R. Microbiologa Alimentara: Metodologa Analtica para Alimentos y
Bebidas. Segunda Edicin. Editorial Daz de Santos. 2000
Forsythe, S.J., Hayos, P.R. Higiene de los Alimentos, Microbiologa y HACCP.
Segunda Edicin. Zaragoza: Editorial Acribia 2002.
Rojas, A. Recopilacin Guas de Microbiologa de Alimentos. Universidad de
Pamplona. 2003.
Carrascal, A.K.; Paez,A.y Burbano, Mariela. Manual de Laboratorio Microbiologa de
Alimentos.1 ed._ Bogota: CEJA,2003.

9. Anexos

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Titulo: RECUENTO DE BACTERIAS MESFILAS AEROBIAS

2. Objetivos:
2.1 Conocer las tcnicas empleadas para el recuento de bacterias Mesfilas Aerobias
en alimentos.
2.2 Interpretar los resultados obtenidos y reprtanos correctamente.
2.3 Determinar las implicaciones que para los alimentos tiene un recuento alto de este
tipo de bacterias.
3. Marco terico:
La mayora de los alimentos industrializados (excepto, los productos fermentados), deben
ser considerados como inadecuados para el consumo, cuando contienen un gran nmero
de microorganismos, aun cuando estos microorganismos no sean conocidos como
patgenos y no hayan alterado de forma inapreciable las caractersticas organolpticas
del alimento.
Las bacterias mesfilas aerobias son un grupo heterogneo de bacterias capaces de
crecer entre 15 y 45 C, con un rango ptimo de 35 C, en la industria de alimentos es
considerado como el grupo indicador ms grande que existe. En productos terminados es
utilizado como indicador de vida til.
Para su recuento se utilizan medios de cultivo que no tengan inhibidores para permitir el
crecimiento de los microorganismos. Este recuento no se hace en productos enlatados ni
fermentados, ya que por la naturaleza de estos alimentos, el recuento no sera
representativo.
Recuentos altos en alimentos estables indican materias primas contaminadas o
tratamiento no satisfactorio, en productos perecederos, pueden indicar condiciones
inadecuadas de tiempo y temperatura durante su almacenamiento. La presencia de un
nmero elevado de bacterias aerobias mesfilas que crecen bien a temperatura corporal o
prxima a ella, significa que puede haberse dado condiciones favorables a la
multiplicacin de microorganismos patgenos de origen humano o animal.
En alimentos deshidratados y en los congelados, siempre se obtienen recuentos de
bacterias viables ms bajos. As un recuento en placa no puede reflejar la calidad
microbiolgica de la materia prima, antes de los procesos o tratamientos
correspondientes, y por ello, es necesario llevar un examen microscpico directo para
comprobar si efectivamente, en un principio existan o no abundantes microorganismos.
Los recuentos de bacterias mesfilas son de poco valor a la hora de predecir la vida til
de un alimento conservado en refrigeracin, ya que muchos microorganismos mesfilos
no crecen a temperaturas por debajo de los 5 C.

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Los recuentos elevados de bacterias mesfilas en productos crudos o no tratados, a


menudo estn constituidos por microflora normal o pueden indicar alteraciones incipientes
del alimento y no un peligro potencial para la salud del consumidor.
4. Materiales, Equipos e Insumos
1 Frasco de dilucin o Erlenmeyer capacidad de 250 ml con 90 de agua peptonada
0.1%.
- 3 Tubos taparrosca que contengan 9 ml de agua peptonada cada uno
- 6 Cajas de petri estriles.
- 1 Pipetas de 10 ml estril
- 3 Pipetas de 1 ml estriles.
- 120 ml Agar Plate Count fundido
- 1 Vaso de licuadora con cuchillas estriles y su correspondiente motor.
- Balanza
- Incubadora a 35C
-

5. Reactivos
6. Procedimiento
-

Prepare las diluciones 10-1,10-2 y 10-3 en agua de peptona al 0.1 % a partir de las
muestras de alimentos.
Siembre en profundidad por duplicado, 1 ml de cada una de las diluciones
seleccionadas.
Adicione
20 ml de Agar Plate Count (debe estar a una temperatura de
aproximadamente 45C).
Mezcle inmediatamente las cajas con el medio, de acuerdo con los movimientos de las
agujas del reloj, mnimo 5 veces.
Deje solidificar y adicione una capa sellante sobre la caja, deje solidificar nuevamente.
Incube a 35 C durante 48 horas.
Saque de la incubadora y realice el recuento en cada caso.
Cuando se va a realizar el recuento seleccione las diluciones para bacterias
mesfilas aerobias, que contengan entre 30 a 300 colonias.

7. Nivel de Riesgo
-

2 bata manga larga, guantes, cofia, zapato cerrado de tacn bajo, pantaln largo.
Material biolgico para descartar se empaca en bolsa, se marca y entrega al
auxiliar.

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8. Bibliografa
-

Albarracin, F. Y.; Herrera, F. C. Texto de Laboratorio de Microbiologa de


Alimentos.1995
Alaert, C. , Escola. M. Mtodos de Anlisis Microbiolgicos de Alimentos .Madrid:
Editorial Daz de Santos. 2002.
Doyle, M. P. Beuchat, L.R. Microbiologa de Alimentos. Fundamentos y Fronteras.
Zaragoza: Editorial Acribia, 2001.
Pascual, M.R. Microbiologa Alimentara: Metodologa Analtica para Alimentos y
Bebidas. Segunda Edicin. Editorial Daz de Santos. 2000
Forsythe, S.J., Hayos, P.R. Higiene de los Alimentos, Microbiologa y HACCP.
Segunda Edicin. Zaragoza: Editorial Acribia 2002.
Rojas, A. Recopilacin Guas de Microbiologa de Alimentos. Universidad de
Pamplona. 2003.
Carrascal,A.K.;Paez,A.y Burbano, Mariela. Manual de Laboratorio Microbiologa de
Alimentos.1 ed._ Bogota: CEJA,2003.

9. Anexos

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1.

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Titulo: ANLISIS MICROBIOLGICO DE AGUAS POTABLES, TRATADAS Y


ENVASADAS

2. Objetivos:
2.1 Capacitar a los estudiantes con las diferentes metodologas empleadas para el
anlisis microbiolgico de aguas potables de acuerdo a los requerimientos del
Decreto 475/98
2.2 Identificar la flora contaminante de los tipos de aguas
2.3 Adquirir destrezas en el adecuado manejo de las tablas utilizadas para hacer los
recuentos
3. Marco terico:
El agua destinada a la alimentacin como agua de bebida, as como la utilizada en el
tratamiento de los alimentos o la industria alimentara debe presentar una gran pureza,
dependiendo esta de su procedencia. Las aguas subterrneas, si proceden de capas
profundas, estn mejor protegidas que las aguas superficiales, por cuanto la
contaminacin es ms difcil en las aguas subterrneas y la filtracin a travs de las capas
sedimentarias limita el nmero de microorganismos.
La microbiota del agua es muy variada, encontrndose en general: Microorganismos
habituales del agua, Microorganismos de origen telrico y de origen humano y animal.
Los microorganismos tpicamente acuticos son: algas microscpicas y bacterias
pertenecientes a los gneros vibrio spp, Pseudomonas spp, Chromobacterium spp,
Achromobacter
spp,
Corynebacterium
spp,
entre
otros.
Habitualmente
microorganismos de origen telrico como: bacterias esporuladas (Bacillus spp,
clostridium spp), Streptomyces spp, esporas fngicas. Los microorganismos de origen
humano y animal con frecuencia son patgenos y esencialmente Enterobacterias, como:
Escherichia coli y otros coliformes, Salmonella spp, Streptococcus fecales,
Clostridium perfringes, Vibrio Cholerae.
En climas tropicales se pueden encontrar en el agua protozoos y otros parsitos animales.
Tambin se pueden encontrar virus, como el causante de poliomielitis y hepatitis.
En el caso de aguas envasadas, los microorganismos pueden proceder de la microbiota
autctona, registrando crecimiento pos-embotellado. Durante el procesamiento muchos
de los microorganismos pueden desprenderse de las superficies de los equipos, paredes
de tuberas, deducindose que la contaminacin procede del ambiente de la planta de
proceso y del personal encargado de (Staphylococcus epidermidis y S. hominis se han
aislado del agua mineral envasada).

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Las aguas no carbonatadas presentan un recuento viable total que va desde 103 hasta
ms de 105 ufc/ml. Los recuentos en aguas carbonatadas son generalmente ms bajos,
debido a su pH y al efecto antimicrobiano directo del CO2.
4. Materiales, Equipos e Insumos
-

1 Frasco de dilucin o fiola de 250ml .con 90 ml de agua de peptona


3 tubos taparrosca con 9ml de agua de peptona
Incubadora a 35 C 2 C y 44.5 C 0.5 C
3 Pipetas estriles de 1 ml
3 pipetas estriles de 10 ml
1 Asa bacteriolgica de argolla
1 Gradilla
3 tubos con 10 ml de caldo lactosado doble concentracin
6 tubos con 10 ml de Caldo Lactosado simple concentracin
6 tubos con 10 ml de Caldo LMX- Fluorocult simple concentracin y 3 tubos con 10
ml de Caldo LMX-Fluorocult doble concentracin
Caldo Lactosado Bilis Verde Brillante al 2% (6 tubos con 9ml)
Equipo completo para anlisis de agua por el mtodo Miliporo o (MF)
4 Cajas de Petri pequeas servidas con EMB-Agar
4 Filtros Miliporo
1 par de Pinzas
Lmpara UV

5. Reactivos
-

Reactivo de Kovacs
Indol, Rojo de metilo,vogues Proskauer, Citrato

6. Procedimiento
Anlisis Microbiolgicos
NMP para coliformes Totales y Fecales
Determinacin de Coliformes en agua Tratada envasada
Prueba Presuntiva
-

Pipetear 10 ml de la muestra a tres tubos, conteniendo cada uno 10 ml de Caldo


Lactosado doble concentracin.
Pipetear 1 ml de la muestra a tres tubos, conteniendo cada uno 10 ml de Caldo
Lactosado simple concentracin.
Pipetear 0.1 ml de la muestra a tres tubos, conteniendo cada uno 10 ml de Caldo
Lactosado simple concentracin.

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-

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Incubar los tubos a 35 C 2 C por 48 horas.


Pasado el tiempo de incubacin, examinar los tubos y registrar los tubos que
presenten produccin de gas (en la campana de Durham). Si a las 24 horas todos los
tubos presentan gas, se puede continuar con la prueba confirmativa.

Prueba Confirmativa
-

Confirmar los tubos de Caldo Lactosado positivos, transfiriendo 0.1 ml o una asada de
cada tubo positivo a un tubo con 10 ml de Caldo Lactosado Bilis Verde Brillante o
caldo lactosado.
Incubar los tubos a 35 C 2 C por 24 48 horas.
Pasado el tiempo de incubacin, examinar y registrar los tubos que presenten
fermentacin con produccin de gas (positivos).
Buscar en la tabla del NMP y anotar el resultado correspondiente al nmero de tubos
positivos de cada dilucin.
Informar el valor correspondiente como NMP DE Coliformes totales en 100 ml.

NMP de Coliformes de Origen Fecal en agua envasada (Test de Mac-Kenzie)


-

A partir de los tubos positivos del aprueba presuntiva para Coliformes, transferir a
cada tubo una asada de cultivo en:
Caldo Lactosado Bilis Verde Brillante al 2% con campana de
Durham.
Caldo Triptfano.
Mezclar suavemente los tubos e incubarlos a 44.5 C 0.5 C por 48 horas, en
bao de agua teniendo cuidado que el nivel de agua sobrepase el nivel de caldo
en los tubos.
Leer la prueba de Mac-kenzie de la siguiente forma:
Observar la produccin de gas en caldo Lactosado bilis verde brillante al 2%
Revelar en cada Triptfano la formacin de Indol, adicionando unas gotas de
Reactivo Kovacs
Considerar como Coliformes Fecales, los que demuestren positividad en ambas
pruebas.
Confrontar los resultados con la tabla NMP y expresar los resultados como
Coliformes Fecales / gr. ml.

NMP de Coliformes Totales y Escherechia coli


-

Incube de 10 ml de la muestra a una serie de tres tubos con 10 ml de Caldo LMXFluorocult doble concentracin (a cada tubo). Para la siguiente serie de tubos con
10 ml de caldo simple concentracin, adicione 1 ml de la muestra; y para la tercera
serie de tubos con 10 ml de caldo simple concentracin, adicione, 0.1 ml de la
muestra a cada uno de ellos (total de tubos 9).
Incube a 35 C 2 C por 24 horas.
Pasado el tiempo de incubacin, proceda a hacer la lectura de los tubos de la
siguiente forma:

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Coliformes Totales: Viraje del color del caldo a verde-azulado.


Escherechia coli: Viraje del color del caldo a verde-azulado, fluorescencia a
la luz UV de 366 nm, y reaccin de indol positiva al adicionar el reactivo de
kovacs.
Confronte los resultados con la tabla del NMP y reporte como CT y E.coli / 100 ml.
Recuerde que el medio de cultivo tiene la capacidad de detectar especficamente
E.coli (sustrato especfico).

NMP de Coliformes totales y Escherichia coli


-

Realice las diluciones decimales de la muestra del alimento hasta 10-3


En 9 tubos con 10 mililitros de caldo LMX Fluorocult, provistos de campana de
Durham, siembre un mililitro de cada dilucin en cada serie de tres tubos.
Incubar todos los tubos a 35C 2C/24 horas
Observar los tubos y tomar nota de produccin de gas en la campana de Durham,
turbidez, coloracin azul, flouresencia azul verdosa, al revelar con la lmpara UV y
produccin de Indol al revelar con el reactivo de Kovacs.
Calcular el NMP de coliformes / ml o g. de alimento.

Mtodo Filtracin por Membrana o Miliporo


El mtodo se basa en hacer pasar la muestra de agua problema a travs de un filtro de
membrana microporosa, en cuya superficie quedan retenidos los microorganismos.
Se utilizan membranas milipore tipo HA, que tiene un tamao de poro de 0.45m(micras),
ya que la mayora de los microorganismos a analizar tienen un dimetro superior a
0.45m.
Posteriormente, se incuba la membrana, sobre un medio de cultivo adecuado, a la
temperatura y durante el tiempo necesario, para luego recontar directamente las colonias
sobre la superficie de la membrana. Para el procedimiento adecuado en el laboratorio,
seguir las instrucciones dadas por el profesor.
Nota: Consultar el Decreto No. 1575 de 2007
7. Nivel de Riesgo:
-2 bata de laboratorio manga larga, cofia, zapato cerrado, tacn bajo, pantaln largo.
- El materia biolgico para descartar se empaca en bolsa, se marca y entrega al
auxiliar

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8. Bibliografa
-

Albarracin, F. Y. ; Herrera, F.C. Texto de laboratorio de Microbiologa de Alimentos.


1995
Alaert, C. , Escol. M. Mtodos de Anlisis Microbiolgicos de Alimentos. Madrid
Editorial Diaz de Santos, 2002
Doyle, M.P Beuchat, L.R. Microbiologa de Alimentos. Fundamentos y Fronteras.
Zaragoza: Editorial Acribia, 2001
Pascual, M.R. Microbiologa de Alimentaria: Metodologa Analtica para alimentos y
Bebidas Segunda Edicin. Editorial Diaz de Santos. 2000
Forsythe, S.J. Hayes, P.R. Higiene de los alimentos, Microbiologa y HACCP.
Segunda Edicin. Zaragoza: Editorial Acribia 2002
Rojas, A. Recopilacin guas de Microbiologa de Alimentos. Universidad de
Pamplona 2003.

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9. Anexos

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1. Titulo: ANLISIS MICROBIOLGICO DE BEBIDAS REFRESCANTES,


HIDRATANTES Y CARBONATADAS
2. Objetivos:
2.1 Conocer las tcnicas utilizadas para el anlisis microbiolgico de bebidas
refrescantes
2.2 Identificar la microbiota que puede estar presente en las bebidas refrescantes
2.3 Interpretar los resultados obtenidos y comprobarlos con las normas vigentes para
este tipo de productos
3. Marco terico:
Las bebidas refrescantes derivan de dos fuentes principales, de las aguas minerales con
gas y aromatizadas con frutas, como: los zumos de frutas, concentrados de zumos de
frutas, bebidas a base de zumos de frutas son las ms expuestas a contaminacin, en la
mayora de las veces el azcar es el portador de flora fngica y bacteriana (Leuconostoc).
La limpieza del ambiente, influye notablemente en la contaminacin de los productos, as
como tambin las malas manipulaciones de la materia prima pueden incorporar
Micrococcus, Estafilococos, y flora de origen fecal.
La flora presente en los zumos recin extrados es muy elevada, predominando las
levaduras, que son las que en un 90% de los casos, alteran las bebidas refrescantes, por
cuanto sus caractersticas como: soportar pH bajos y altas concentraciones de azcar,
tolerar tasas elevadas de CO2 utilizar Nitrgeno inorgnico para su desarrollo favorecen
el crecimiento y multiplicacin de este tipo de microorganismos.
Las levaduras aisladas con ms frecuencia pertenecen a los gneros: Cndida spp y
Saccharomyces spp. Los mohos por ser aerobios no se desarrollan en las bebidas
gaseosas, pero si se pueden hallar en las bebidas de frutas.
Las bacterias no soportan las condiciones propias de las bebidas gaseosas anteriormente
expuestas. En los zumos de frutas los gneros bacterianos ms frecuentes son:
Achromobacter, Pseudomonas, Bacillus, Flavobacterium, Lactobacillus. La flora
acidfila y osmfila puede causar: fermentaciones alcohlicas originadas por
Sacharomyces cerevisiae, S. carlsbergensis, S. acidifaciens; produciendo sabor
alcohol y desprendimiento de gas.
Las bacterias lcticas, homo y heterofermentativas (Lactobacillus brevis, Leuconostoc
mesenteroides), al fermentar los azucares producen olores y sabores anormales as
como desprendimiento de gas.

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4. Materiales, Equipos e Insumos


-

1 Stomacher o licuadora que permita una buena homogenizacin.


1 Recipiente de vidrio esterilizable (o bolsas de polietileno para Stomacher).
1 Balanza (precisin 0.1 gr.)
Para preparacin de muestras: cuchilla y tijeras previamente esterilizadas.
3 Pipetas de 1ml y 1 pipeta de 10 ml, estriles.
1 Frasco de dilucin capacidad de 250 ml con el diluyente (90 ml de agua peptona
0.1% estril).
6 Cajas de petri estriles
Bao de agua (45 C 50 C).
Incubadora.
Contador de colonias.
40 ml de Agar Plate count fundido para recuento en placa.
40 ml Agar OGY .fundido
40 ml Agar SPS (Sulfito Polimixina Sulfadiazina) o Agar TSN (TRIPTONA- Sulfito
Neomicina)
9Tubos con 10 ml de caldo caldo LMX Fluorocult.
Jarras de anaerobiosis con sus indicadores de la atmsfera
1 Tubo de bioqumicas con 5ml de caldo tioglicolato
4 tubos de bioqumicas: con 5ml de gelatina, 5ml de lactosa, 5 ml de caldo nitratos
y SIM
Una caja de Agar BHI.
3 tubos tapa rosca con 9ml de agua de peptona

5. Reactivos

6. Procedimiento
-

Prepare la muestra para su respectivo anlisis siguiendo las pautas dadas por el
profesor.
Realice diluciones iguales a 10-1, 10-2, 10-3, o de acuerdo al criterio o necesidad del
producto.
Realice los anlisis de acuerdo al producto (guese por la tabla 3, de criterios
microbiolgicos).
Siembre por duplicado, en profundidad 1ml de las diluciones seleccionadas
Agregar 40 ml agar SPS o TSN fundido previamente atemperado.
Mezcle las cajas con el medio haciendo movimientos lentos arriba abajo
derecha e izquierda.
Deje solidificar y aplique una capa sellante de 5ml
Coloque las cajas con la tapa hacia arriba en la campana de anaerobiosis (colocar
el sobre de anaerobiosis y el indicador de oxido reduccin).
Incube a 35C de 48 a 72 horas.
Seleccione las cajas que contengan entre 20 y 200 colonias color negro.

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-

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Para confirmar, seleccione 3 o ms colonias y realice las bioqumicas como se


indica en el protocolo anexo. (Clostridium sulfito reductor)
De acuerdo a los resultados obtenidos, proceda a realizar los clculos tabule e
informe correctamente, tomando como valor de comparacin los criterios
microbiolgicos de la tabla 3.
De acuerdo a sus resultados concluya acerca de la calidad microbiolgica del
producto.

NOTA: No olvide que para el anlisis de E.C.S.R., debe contar con las jarras de
anaerobiosis, los sistemas de anaerobiosis y los indicadores de la atmsfera; as como los
reactivos reveladores de las pruebas que se presenten en los medios de cultivo utilizados.
7. Nivel de Riesgo:
-2 bata de laboratorio manga larga, cofia, zapato cerrado, tacn bajo, pantaln largo.
- El materia biolgico para descartar se empaca en bolsa, se marca y entrega al
auxiliar
8. Bibliografa
-

Albarracin, F. Y. ; Herrera, F.C. Texto de laboratorio de Microbiologa de Alimentos.


1995
Alaert, C. , Escol. M. Mtodos de Anlisis Microbiolgicos de Alimentos. Madrid
Editorial Diaz de Santos, 2002
Doyle, M.P Beuchat, L.R. Microbiologa de Alimentos. Fundamentos y Fronteras.
Zaragoza: Editorial Acribia, 2001
Pascual, M.R. Microbiologa de Alimentaria: Metodologa Analtica para alimentos y
Bebidas Segunda Edicin. Editorial Diaz de Santos. 2000
Forsythe, S.J. Hayes, P.R. Higiene de los alimentos, Microbiologa y HACCP.
Segunda Edicin. Zaragoza: Editorial Acribia 2002
Rojas, A. Recopilacin guas de Microbiologa de Alimentos. Universidad de
Pamplona 2003.

9. Anexos

NORMAS MICROBIOLGICAS
ANLISIS ESPECIALES Y/O
ESPORDICOS
S.
MOHOS Y
aureus E..C.S.R Salmon
LEVADUR
OTROS
COAG(
.
ella sp
AS
+)

ANLISIS DE RUTINA
PRODUCTO

NORMA

AEROBIO
S
COLIFOR
MESFIL
MES
OS

Bebida diettica a base de MS. Res.


jugo de frutas
11488/84
Bebida
diettica MS. Res.
carbonatada
11488/84
MS. Res.
Bebida hidratante energtica
02229/94
Bebida hidratante energtica MS. Res.
en polvo
02229/94
Nctares y refrescos de > 30 MS. Res.
100 300
das de duracin
07992/91
Nctares y refrescos de 30 MS. Res. 1000
das mx. de duracin
07992/91
3000
Refrescos
INS
<30000
Gaseosas

INS

Jugo de tomate
Jugos
y
pulpas
y
pasterizados
Jugos y pulpas Ultra
pasterizados
Jugos-pulpas concentrados
congelados no pasterizados

100

MS. Res.
100 300
15789/84
MS. Res. 1000
07992/91
3000
MS. Res.
100 300
07992/91
MS. Res. 20000/5000
07992/91
0

E. coli

<3

<3

100 200

--

<10

--

--

<3

<3

<10

--

<10

--

--

<3

<3

<10

--

<10

--

--

<3

<3

<10

--

<10

--

--

<3

<3

10 100

--

<10

--

--

9 29

<3

100 200

--

<10

--

--

11

<3

<300

--

<10

--

<3

<3

<10

--

<10

--

-v.
cholerae
O

<3

20 50

--

<10

--

--

<3

<3

100 200

--

<10

--

--

<3

<3

<10

--

<10

--

--

9 -29

<3

1000 - 3000

--

<10

--

--

Tabla 3. Criterios microbiolgicos para algunas bebidas refrescantes

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Clostridium sp

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Profesora:Fanny Yolanda Albarracin C.

MTODO A

MTODO B

10 -

1 ml de cada dilucin

10-

10-

1 ml de cada dilucin

80C/15min
+
Agua fra
Agar SPS
Adicionar
35+/-2C/24-48h
En anaerobiosis
10 ml Agar SPS

Dejar secar y adicionar


Otra capa de medio.

Observar cajas con


colonias tpicas
(20-200).

Incubar 35+/-2C/24h

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Cdigo

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25 de 68

PRUEBAS CONFIRMATIVAS
Seleccionar 3 colonias y sembrar en Caldo Tioglicolato
5 ml

CATALASA

35+/-2C/4-6h

NITRATOS

Sembrar en
Tomar una asada
Agar BHI

MOTILIDAD

Adicionar al tubo de
Tioglicolato, Reactivo de
Griess.

37C
24 hh
Adicionar 1 o 2 ml
en un tubo con SIM
De Perxido de Hidrogeno

Observar burbujas
Catalasa (-).
Observar crecimiento

Color rojo indica prueba

Sembrar

positiva.
35+/-2C
24 h
Si no hay cambio de color
Agregar pizca de Zinc.
a travs de la
estra.(-).
o crecimiento difuso
en todo el medio.

FERMENTACIN DE LA
LACTOSA

LICUEFACCIN DE LA
GELATINA

Pasar una asada


37C/24h
Tomar una asada del m.o. Sembrar en medio con el
Azcar a investigar. Color amarillo (+).
Sembrar en Agar
Gelatina(+).
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1.

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Titulo: ANLISIS MICROBIOLGICO DE LECHES Y DERIVADOS LCTEOS

2.

Objetivos:
2.1 Capacitar al estudiante en las diferentes tcnicas utilizadas para el anlisis de
leche y sus derivados.
2.2 Identificar la flora contaminante de cada tipo de leche y sus derivados
2.3 Analizar los resultados obtenidos en los recuentos, de los productos examinados

3. Marco terico:
La leche se define como el producto integro, no alterado ni adulterado y sin calostros
producto del ordeo higinico, regular, completo e interrumpido de vacas sanas y bien
alimentadas. Es el alimento completo para el hombre. Su valor nutritivo se debe a los
componentes esenciales como: protenas, carbohidratos, grasas, minerales, vitaminas,
agua; enzimas como: Lactenina, Lactoperoxidasa, Catalasa, reductasa. lipasa, fosfatasa,
proteasa, amilasa y lisozima. La lactenina, lactoperoxidasa y lisozima tienen actividad
inhibidora, por tanto, la composicin y pH: 6.5-6.7 de la leche la constituye un ideal medio
de cultivo para el crecimiento y proliferacin de numerosos microorganismos, (bacterias,
mohos y levaduras).
La leche constituye un producto altamente perecedero, que adems puede ser vehculo
de bacterias patgenas para el hombre (Mycobacterium tuberculosis, Brucella spp,
Salmonella spp, Escherichia coli. Listeria monocytogenes). En la leche tambin
pueden estar presentes Micotoxinas procedentes de vacas que han consumido alimentos
contaminados (aflatoxina M segregada por Aspergillus flavus), o del desarrollo directo de
mohos como el Penicillium cyclopium, P. viridicatum o P. stoloniferu, en las leches en
polvo.
Los derivados lcteos, por ser productos obtenidos en algunos casos a partir de leche
cruda, si no se realizan tratamientos adecuados para la reduccin o eliminacin de
microorganismos patgenos, se pueden encontrar remanentes de microorganismos
asociados a la alteracin de estos productos.
Entre los microorganismos asociados al agriado y otros tipos de alteraciones se
encuentran Streptococcus
thermophilus, S. lactis, Lactobacillus bulgaricus, entre otros. Los gneros Bacillus
spp y Clostridium
spp son productores de agriado y gas, mientras que Enterococcus faecalis y Proteus
spp son causantes de la protelisis y su sabor amargo.

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28 de 68

La mantequilla por su baja humedad (15%) puede ser alterada por bacterias psicrotroficas
como Pseudomonas fragi y Pseudomona putrefaciens, causantes de enranciamiento y

superficie ptrida, los mohos principalmente son pertenecientes a los gneros Altemarias
spp, Aspergillus spp, Rhizopus spp,
Geotrichum spp, Penicillum spp, Cladosporium spp y Mucor spp, as como algunas
levaduras del genero Torulopsis spp, producen liplisis y coloraciones verdes, azules,
blancas o grises, dependiendo del color de sus esporas.
En los derivados con altos contenidos de azcar como la leche condensada y el arequipe,
los microorganismos no tienen un medio fcil de crecimiento y solo cuando las
condiciones de envase y la manipulacin no son adecuadas se puede presentar la
entrada y crecimiento de hongos y levaduras osmfilas especialmente en la superficie,
como: Torulopsis lactis- condensi, Torulopsis globula y mohos como Aspergillus spp y
Penicillium spp.
La mayora de los derivados lcteos se fabrican con leche tratada trmicamente, pero
este proceso de destruccin de microorganismos algunas veces no es eficiente, ya que
existen microorganismos resistentes a estos procesos (microorganismos termodricos),
como Streptococcus thermophilus, Micrococcus lacteus, Corynebacterium lacticum,
junto con esporas de Bacillus spp y Clostridium spp.
En los tratamientos UHT, puede presentarse la sobrevivencia de esporas de Bacillus
stearothermohillus y Bacillus subtillis

4. Materiales, Equipos e Insumos


-

Stomacher o licuadora que permita una buena homogenizacin.


Recipiente de vidrio esterilizable (o bolsas de polietileno para Stomacher).
Balanza (precisin 0.1 gr.).
Para preparacin de muestras: cuchilla, tijeras, cuchillo y tenedor previamente
esterilizados.
3 Pipetas de 1 ml y 1 pipeta de 10 ml, estriles.
2 Pipetas de 0.1ml estriles
1 Frasco para dilucin con capacidad de 250 ml ,con 90 ml de agua peptona
0.1% estril).
8 Cajas de petri estriles.
Asa bacteriolgica de argolla y recta.
Bao de agua (45 C 50 C).
Incubadora.
Contador de colonias.
40 ml de Agar SPC fundido para recuento en placa
40 ml de Agar OGY .fundido
40 ml Agar OPSP o Sulfito Polimixina Sulfadiazina.
2 Cajas e petri servidas con agar Mossel o Selectivo para B. cereus.
5 Tubos de bioqumicas: con 5ml de gelatina, caldo nitratos, glucosa, caldo voges
proskauer
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Agar almidn
2 cajas de petri servidas con Baird Parker Agar

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1 Tubo bioqumicas con 5ml de BHI


1 Tubo con 0.3 ml de plasma humano
1 caja de petri servida con Agar DNASA
9 Tubos taparrosca con 10 ml de caldo LMX Fluorocult.

5. Reactivos
-

Reactivo de Kovacs
Reactivo de greiss , polvo de zinc
Alfa-naftol, KOH

6. Procedimiento
-

Preparar la muestra y las diluciones de los homogenizados, como se ha venido


haciendo en las prcticas anteriores.
De acuerdo al producto a analizar, realizar los anlisis correspondientes citados en
la tabla de Criterios Microbiolgicos (tabla 4) para leche y sus derivados. Ver
protocolos anexos Staphylococcus aureus, Clostridium sulfito reductor,
Bacillus cereus y Listeria monocytogenes.
Pipetear por duplicado en cajas de petri alcuotas de las diluciones seleccionadas
para realizar los anlisis. El inculo depender de si la tcnica aplicada es en
superficie o en placa profunda (0.1 y 1ml respectivamente).
Recuerde
homogenizar correctamente las cajas, cuando se aplique placa profunda y
extender el inculo con el asa de vidrio cuando se inocula la superficie del agar.
Invierta las placas e incbelas a la temperatura adecuada de acuerdo al anlisis
realizad (ver protocolos anexos)
Pasado el tiempo de incubacin, en cada caso, proceda a realizar las
confirmaciones de los anlisis que lo ameriten, e incube estas pruebas a la
temperatura y por el tiempo apropiado.

NOTA: el tiempo transcurrido entre el momento de depositar las distintas diluciones en las
placas y verter sobre ellas el medio de cultivo no debe ser superior a 10 minutos, as
como la extensin de los inculos con el asa de vidrio en la superficie de los agares debe
ser inmediata. Del mismo modo, no se superarn los 20 minutos desde que se prepara la
primera dilucin en la serie de diluciones decimales, hasta que se vierte el agar en la
ltima placa.

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30 de 68

7. Nivel de Riesgo:
-2 bata de laboratorio manga larga, cofia, zapato cerrado, tacn bajo, pantaln largo.

El materia biolgico para descartar se empaca en bolsa, se marca y entrega al


auxiliar

8. Bibliografa
-

Albarracin, F. Y.; Herrera, F. C. Texto de Laboratorio de Microbiologa de


Alimentos.1995
Alaert, C. , Escola. M. Mtodos de Anlisis Microbiolgicos de Alimentos .Madrid:
Editorial Daz de Santos. 2002.
Doyle, M. P. Beuchat, L R. Microbiologa de Alimentos. Fundamentos y Fronteras.
Zaragoza: Editorial Acribia, 2001.
Pascual, M.R. Microbiologa Alimentara: Metodologa Analtica para Alimentos y
Bebidas. Segunda Edicin. Editorial Daz de Santos. 2000
Forsythe, S.J., Hayos, P.R. Higiene de los Alimentos, Microbiologa y HACCP.
Segunda Edicin. Zaragoza: Editorial Acribia 2002.
Rojas, A. Recopilacin Guas de Microbiologa de Alimentos. Universidad de
Pamplona. 2003.

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9. Anexos

NORMAS MICROBIOLGICAS

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31 de 68

ANLISIS ESPECIALES
Y/O ESPORDICOS
AEROBI
MOHOS S.
Bacill
PRODUCTO
NORMA
OS
COLIFO E.
Y
aureus E..C.S. us Salmonel OTRO
MESFI RMES coli LEVAD COAG( R. cereu la sp
S
LOS
URAS
+)
s
Leche
con
sabores MS. Res. 50000
11 40 <3
------pasteurizada
02310/86 10000
MS. Res. 10000
200
100
Leche condensada
<3
<3
----02310/86 30000
500
200
MS. Dec. 10000
200 < 100 100 100
Leche en polvo
<3
<3
0
-2437/83 30000
1000
200
1000 1000
MS. Dec. 50000
Leche pasteurizada
11 93 <3
------2437/83 100000
Ea/an
Leche UHT envasada e MS. Dec. 20000
< 10 23 <3
-----< 10 higienizada
476/98
30000
20
Ea/an
Leche UHT larga vida y MS. Dec.
100 200 < 3 11 <3
-----< 10 mediana
476/98
20
MS. Res.
100 1000
Queso fresco
-*
<3
--0
-01804/89
500
3000
MS. Res. 30000
100
100 100 100
Queso fundido
20 93 <3
0
-01804/89 50000
200
200
500 500
Queso
semimadurado. MS. Res.
500
--<3
---0
-Madurado
01804/89
1000
MS. Res.
200
Yogurt / kumis
-20 93 <3
-----02310/83
500
Postre
de
leche MS. Res. 5000
200
100 100 100
20 50 <3
0
-pasteurizado
02310/89 10000
500
200
1000 1000
Crema
de
leche MS. Res.
100
100
-75 150 <3
--0
-pasteurizada
02310/86
200
200
MS. Res.
500
100
Mantequilla
-75 150 <3
--0
-02310/86
1000
200
MS. Res.
100
Arequipe
500 2000 11 40 <3 10 100
----02310/86
200
MS. Res. 100000
100
Helados (con leche)
93 150 <3
---0
-01804/84 150000
200
ANLISIS DE RUTINA

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Staphylococcus aureus

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32 de 68

Profesora: Fanny Yolanda Albarracin C.

10 -
0.1 ml

10-
0.1 ml

10-

Baird Parker

Salado Manitol
35+/-2C/24h
Seleccionar colonias tpicas entre
20-200 ufc
1-3 ufc

5 ml de Caldo BH
35+/-2C/24 h

0.1 ml cultivo +0.3 ml plasma


35+/-2C
Observar coagulacin cada 4 horas/24horas
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33 de 68

PRUEBA DE LA TERMONUCLEASA

Calentar tubos coagualasa (+) a 80C/15 min


0.1ml

Agar DNAsa
35+/-2C/4horas

Aparicin de halo rosado prueba positiva


Si a las 4 horas no aparece dejar incubado por 24 horas y realizar la lectura.

Aplicar factor de correccin


Recuento colonias* Colonias positivas/Colonias examinadas

Informar por la frmula de ICONTEC o MinSalud.

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34 de 68

Bacillus cereus

10 -
0.1 ml

10-

10-

0.1 ml

Agar Mossell

Selectivo para
B.cereus
35+/-2C/24-48 h
Seleccionar colonias tpicas entre
20-200 ufc
Realizar Bioqumicas
GELATINA

NITRATOS

Sembrar en Agar
una colonia
Gelatina una asada
sembrar en un tubo

FERMENTACIN
GLUCOSA

Tomar una colonia y sembrar en


Caldo Nitratos.

Tomar
Y

Que contenga el
azcar.
37C/
24h

37C/
24h

Hidrlisis de la
Gelatina.

Adicionar gotas de Reactivo de Griess


Color amarillo, prueba
(+). B.cereus acidifica
el medio sin gas.
Color rojo indica prueba. Si no hay viraje
Adicionar polvo de Zinc. Si no hay cambio de
Color, prueba (+). B.cereus reduce nitratos.
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Clostridium sp
Albarracin C.

35 de 68

Profesora:Fanny Yolanda

MTODO A

MTODO B
10 -

10-

1 ml de cada dilucin

10-

1 ml de cada dilucin

80C/15min
+
Agua fra
Agar SPS
Adicionar
35+/-2C/24-48h
En anaerobiosis
10 ml Agar SPS

Dejar secar y adicionar


Otra capa de medio.

Observar cajas con


colonias tpicas
(20-200).

Incubar 35+/-2C/24h

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36 de 68

PRUEBAS CONFIRMATIVAS
Seleccionar 3 colonias y sembrar en Caldo Tioglicolato
5 ml

CATALASA

Sembrar en
Tomar una asada
Agar BHI

35+/-

2C/4-6h

NITRATOS

MOTILIDAD

Adicionar al tubo de
Tioglicolato, Reactivo de
Griess.

37C
24 h
Adicionar 1 o 2 ml
en un tubo con SIM
De Perxido de Hidrogeno

Color rojo indica prueba

Sembrar

positiva.
35+/-2C

Observar burbujas
Catalasa (-).
Observar crecimiento

24 h
Si no hay cambio de color
Agregar pizca de Zinc.
a travs de la
estra.(-).
o crecimiento difuso
en todo el medio.

FERMENTACIN DE LA
LACTOSA

LICUEFACCIN DE LA
GELATINA

Pasar una asada


37C/24h
Tomar una asada del m.o. Sembrar en medio con el
Azcar a investigar. Color amarillo (+).
Sembrar en Agar
Gelatina(+).
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Listeria monocytgenes

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37 de 68

Enriquecimiento
Selectivo
25 gr
+
225 ml
30C/24 h
Caldo
Palcam

0.1 ml
Agar Mac-Bride, Oxford o Palcam
30C/48 horas
Realizar bioqumicas aquellas colonias
que presenten hidrlisis de la esculina.

COLORACION DE
HENRY
GRAM

Bacilos Gram(+)
una caja con colonias

CATALASA

PRUEBA DE

Adicionar un as

Colocar

gotas de Perxido

presuntivas en un

de Hidrgeno sobre

45 frente a la luz

ngulo de
blanca
una colonia
MOVILIDAD
presenta colonias

Listeria sp es catalasa positivo


(aparicin de burbujas).

Listeria sp
Color azul-

cielo.
Sembrar en SIM
Una asada

Incubar 22C
Albarracin Contreras
Listeria sp es mvil

Profesora: Fanny Yolanda

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38 de 68

HIDRLISIS DEL
ALMIDN

VOGES-PROSKAUER

Tomar una asada del m.o. y sembrar


del m.o. y sembrar
en agar Almidn.

Tomar una asada


En un tubo con VP

37C/
24h
Adicionar lugol y observar
B.cereus
Hidrlisis.

37C/
24h
Adicionar alfa-naftol y KOH.
Es VP (+).

Profesora: Fanny Yolanda Albarracin Contreras

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39 de 68

1. Titulo: ANLISIS MICROBIOLGICO DE CARNES Y DERIVADOS CRNICOS


2. Objetivos:
2.1 Determinar los anlisis microbiolgicos que se realizan a las carnes crudas: rojas y
blancas y sus derivados.
2.2 Identificar la flora microbiana contaminante de cada tipo de carnes
2.3 Conocer las diferentes tcnicas empleadas para el aislamiento de Salmonella spp.
2.4 Interpretar los resultados de los anlisis y compararlos con las normas vigentes
para este tipo de productos

3. Marco terico:
La carne de los animales constituye la base de la alimentacin humana y su industria es
de gran importancia en el mbito de la alimentacin. La carne es uno de tos alimentos
ms perecederos debido a sus caractersticas de composicin: pH y actividad acuosa:
constituye un medio muy favorable para el crecimiento y proliferacin de la mayor parte de
los microorganismos. La profundidad del msculo de un animal recin sacrificado contiene
una microbiota muy escasa, del orden de un germen por gramo aproximadamente; esta
microbiota procede generalmente, del intestino y es transportada al msculo por la
sangre.
La parte superficial de la carne, especialmente en la canal esta mucho ms contaminada
por una diversidad de microorganismos, que dependen de las condiciones higinicas de
manipulacin, as como del ambiente del matadero. Esta contaminacin empieza durante
el sacrificio del animal, contina en otras dependencias del matadero y lugares de venta,
para terminar en el hogar del consumidor. En el momento del sacrificio, algunos grmenes
pueden atravesar la barrera intestinal, (por falta de un ayuno previo a la matanza, en el
caso de los animales fatigados o cuando se trata de animales enfermos) para llegar a tos
msculos por va sangunea.
Durante el desuello, evisceracion y despiece, resulta fcil la contaminacin de las canales
con grmenes procedentes del intestino, suelo, ambiente o personas que manipulan las
canales o las piezas de la carne.
La canal preparada adecuadamente tambin esta sujeta a nuevas contaminaciones por
tos instrumentos utilizados en el despiece y posteriores manipulaciones.
La contaminacin en el frigorfico es muy importante, pues all entran en contacto unas
carnes con otras de diferente procedencia, y por las condiciones de manipulacin, son
varias las vas de contaminacin durante todo el proceso de faenado. En el caso de largos
periodos de almacenamiento en fro, puede presentarse la proliferacin de
microorganismos psicrfilos. Durante el transporte, la contaminacin de las canales o
piezas puede potenciarse, as como en los lugares de venta, donde puede seguir este
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40 de 68

proceso, cuando esta es nuevamente almacenada en algunos casos por corto tiempo si

las condiciones higinicas no son apropiadas.


4. Materiales, Equipos e Insumos
Muestras: carne fresca de vacuno, porcino, aves, y/o animales de abasto; chorizo,
salchichn, pasta de hamburguesa, cbanos, mortadela, morcilla, salchichas, queso de
cabeza.
-

Stomacher o licuadora que permita una buena homogenizacin.


Recipiente de vidrio esterilizable (o bolsas de polietileno para Stomacher).
Balanza (precisin 0.1 gr.).
Para preparacin de muestras: cuchilla, tijeras, cuchillo y tenedor previamente
esterilizados.
3 Pipetas de 1 ml y 2 pipetas de 10 ml, estriles.
Frascos de 250 ml con 90 ml de agua peptona 0.1% estril
3 tubos taparrosca con 9 ml de agua de peptona estril
6 Cajas de petri estriles.
Asa bacteriolgica de argolla y recta.
Bao de agua (45 C 50 C).
Incubadora.
Contador de colonias.
Agar SPC fundido 40 ml
Agar OPSP o Sulfito Polimixina Sulfadiazina.fundido 40 ml
2 Cajas con agar Baird Parker servido
1 Erlenmeyer con 225 ml de agua peptona.
1 Erlenmeyer con 225 ml de Caldo de Enriquecimiento para Listeria spp.
1Tubo de bioqumicas con 10 ml de caldo Rapapport y 1 tubo bioqumicas con 10
ml de caldo Selenito Cistina o tetrationate.
1 Caja con XLD servido y 1 caja con Rambach servido
1 Cajas con Agar Triptosa- cido nalidixco ATN
1Tubo con agar LIA, 1 de TSI en bisel, 1 tubo con 5ml de caldo urea, 1 de SIM en
tubo recto, 1 tubo con caldo Rojo de Fenol + 0.5% de Ramnosa, Xilosa y Manosa,
1 tubo con caldo BHI con 0.5 ml y plasma.
9 tubos con 10 ml de caldo LMX Fluorocult.

5. Reactivos
-

Coloracin de Gram.: Cristal violeta, lugol,alcohol acetona,fuscina bsica, azul de


metileno.

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6. Procedimiento

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41 de 68

Preparar la muestra y las diluciones de los homogenizados, como se han realizado en


prcticas anteriores.
De acuerdo al producto a analizar, realizar los anlisis correspondientes citados en la
Tabla de Criterios Microbiolgicos (tabla 5), para crnicos y sus derivados y los
protocolos anexos de s. aureus, Clostridium sulfito reductor, Salmonella spp.
Pipetear por duplicado en cajas de petri alcuotas de las diluciones seleccionadas para
realizar los anlisis. El inculo depender de su la tcnica aplicada es en superficie o
en placa profunda (0.1 y 1 ml, respectivamente).
Recuerde homogenizar
correctamente las cajas, cuando se aplique placa profunda y extender inmediatamente
la alcuota con el asa de vidrio, cuando se inocula la superficie del agar.
Invierta las placas e incbelas a la temperatura adecuada de acuerdo al anlisis
realizado. (ver protocolos anexos)
Pasado el tiempo de incubacin, proceda a realizar el conteo de las colonias
presentes en cada una de las placas cuando el anlisis as lo requiera.
Proceda a realizar confirmaciones pruebas bioqumicas de los anlisis que lo
ameriten, e incube estas pruebas a la temperatura y por el tiempo apropiado. (ver
protocolos anexos en cada caso)
Reporte resultados correctamente.

7. Nivel de Riesgo:
-2 bata de laboratorio manga larga, cofia, zapato cerrado, tacn bajo, pantaln largo.
- El materia biolgico para descartar se empaca en bolsa, se marca y entrega al
auxiliar
8. Bibliografa
-

Albarracin, F. Y.; Herrera, F. C. Texto de Laboratorio de Microbiologa de


Alimentos.1995
Alaert, C. , Escola. M. Mtodos de Anlisis Microbiolgicos de Alimentos .Madrid:
Editorial Daz de Santos. 2002.
Doyle, M. P. Beuchat, LR. Microbiologa de Alimentos. Fundamentos y Fronteras.
Zaragoza: Editorial Acribia, 2001.
Pascual, M.R. Microbiologa Alimentara: Metodologa Analtica para Alimentos y
Bebidas. Segunda Edicin. Editorial Daz de Santos. 2000
Forsythe, S.J., Hayos, P.R. Higiene de los Alimentos, Microbiologa y HACCP.
Segunda Edicin. Zaragoza: Editorial Acribia 2002.
Rojas, A. Recopilacin Guas de Microbiologa de Alimentos. Universidad de
Pamplona. 2003.

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9. Anexos

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42 de 68

NORMAS MICROBIOLGICAS
ANLISIS ESPECIALES Y/O
ESPORDICOS

ANLISIS DE RUTINA
AEROBI
MOHOS
S.
OS
COLIFO E.
Y
aureus
MESFI RMES coli LEVAD
LOS
URAS
Crnicos cocidos o
200000
NTC 1325
120 1100 <3
-<100
ecaldados
300000
120
100
Crnicos crudos
NTC 1325
--
-1000
1100
100
NTC
100
Crnico crudo pollo
--
-36442
500
1100
PRODUCTO

Crnicos
madurados

crudos

Pollo carne cruda


adobada

NORMA

NTC 1325
INS

--

E..C.S.
R.

Bacill
Salmon
us
OTROS
ella spp
cereus

100
1000

--

--

100
1000

--

--

100
1000

--

< 3 93

<3

--

<100 10 100

--

120

1100

--

100
1000

--

--

100
1000

Tabla 5. Criterios Microbiolgicos para algunas Carnes y Derivados crnicos

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Fundamentos de Microbiologa de alimentos
Staphylococcus aureus

10 -

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43 de 68

Profesora: Fanny Yolanda Albarracin C.

10-

10-

Listeria
monocyti
genes 0
Listeria
monocyti
genes 0
--

0.1 ml

0.1 ml

Baird Parker

Salado Manitol
35+/-2C/24h
Seleccionar colonias tpicas entre
20-200 ufc
1-3 ufc

5 ml de Caldo BH
35+/-2C/24h

0.1 ml cultivo +0.3 ml plasma

35+/-2C
Observar coagulacin cada 4 horas/24horas
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44 de 68

PRUEBA DE LA TERMONUCLEASA

Calentar tubos coagualasa (+) a 80C/15 min


0.1ml

Agar DNAsa
35+/-2C/4horas
Aparicin de halo rosado prueba positiva
Si a las 4 horas no aparece dejar incubado por 24 horas y realizar la lectura.

Aplicar factor de correccin


Recuento colonias* Colonias positivas/Colonias examinadas

Informar por la frmula de ICONTEC o MinSalud.

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Fundamentos de Microbiologa de alimentos

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45 de 68

Escherichia coli
SIEMBRA EN PLACA PROFUNDA

10 -

10-

1 ml

10-

1 ml

Agar EMB
Mac Conkey
Endo
44C/24-48 h
Seleccionar colonias tpicas entre
En agar EMB y ENDO colonias con brillo metlico
En Agar Mac Conkey colonias rojas

Realizar Bioqumicas
INDOL

(+)

RM

VP

(+)

CITRATO

(-)

(-)

Fanny Yolanda Albarracin Contreras

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46 de 68

Escherichia coli
SIEMBRA POR NMP EN LMX-F

1 ml
9ml A.P.E.
10 -
10 gr/ml de
Muestra
+
90 ml A.P.E.
1 ml

10-

10-

1 ml

1 ml

37C/24h
Observar cambio de color en los tubos(verde-azuloso)
Positivo para Coliformes Totales

De los positivos para C.T. realizar confirmativo para Fecales y E.coli


Exponiendo a luz ultravioleta a 360nm

Si se presenta Fluorescencia, adicionar Indol, aparicin de un halo rojo


indica prueba positiva para E.coli y coliformes fecales. Informar
segn la tabla de NMP/gr ml.

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47 de 68

Salmonella sp
Pre-enriquecimiento
No Selectivo

Enriquecimiento
Selectivo

25 gr
+
225 ml
A.P.E.

1 ml
10 ml Caldo
Rapport
Incubar
Tetrationate
37C/24

37C/24 horas
horas

0.1 ml
XLD

RAM BACH

I
M V I C
(-) (+) (-) (+)
35+/-2C/24-48 h
Selecionar colonias
tpicas
Realizar Bioqumicas.
TSI

UREA

LA

Sembrar en Agar
una colonia
TSI por estria.
sembrar en un tubo

Tomar una colonia y sembrar en


Agar Urea una asada.

Tomar
Y

Que contenga agar


LA
37C/
24 h
Acido con o sin
Descarboxilacin de la
Produccin de H2S.

37C/
24 h

37C/
24 h
Salmonella sp es urea (-).
Lisina con o sin

Produccin de H2S.
Profesora:Fanny Yolanda Albarracin Contreras

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Fundamentos de Microbiologa de alimentos
Clostridium sp

Cdigo

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48 de 68

Profesora:Fanny Yolanda Albarracin C.

MTODO A

MTODO B

10 -

10-

10-

1 ml de cada dilucin
dilucin

1 ml de cada

80C/15min
+
Agua fra
Agar SPS
Adicionar
35+/-2C/24-48h
En anaerobiosis
10 ml Agar SPS

Dejar secar y adicionar


Otra capa de medio.

Observar cajas con


colonias tpicas
(20-200).

Incubar 35+/-2C/24h

Gua Unificada de Laboratorios


Cdigo
Fundamentos de Microbiologa de alimentos

FLA-23 V. 00

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49 de 68

PRUEBAS CONFIRMATIVAS
Seleccionar 3 colonias y sembrar en Caldo Tioglicolato
5 ml

CATALASA

Sembrar en
Tomar una asada
Agar BHI

35+/-2C/4-6 h

NITRATOS

MOTILIDAD

Adicionar al tubo de
Tioglicolato, Reactivo de
Griess.

37C
24 h
Adicionar 1 o 2 ml
en un tubo con SIM
De Perxido de Hidrogeno

Color rojo indica prueba

Sembrar

positiva.
35+/2C

Observar burbujas
Catalasa (-).
Observar crecimiento

24h
Si no hay cambio de color
Agregar pizca de Zinc.

FERMENTACIN DE LA
LACTOSA

a travs de la
estra.(-).
o crecimiento difuso
en todo el medio.
LICUEFACCION DE LA
GELATINA

Pasar una asada


37C/24h
Tomar una asada del m.o. Sembrar en medio con el
Azcar a investigar. Color amarillo (+).
Sembrar en Agar
Gelatina(+).
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Fundamentos de Microbiologa de alimentos

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50 de 68

1. Titulo: ANLISIS MICROBIOLGICO DE CONSERVAS - TEST DE


ESTERILIDAD COMERCIAL
2. Objetivos:
2.1 Conocerlas tcnicas empleadas para realizar el Test de esterilidad comercial de las
conservas.
2.2 Identificar los diferentes tipos de microorganismos asociados a los procesos de
alteracin de este tipo de productos.

3. Marco terico:
Las conservas son productos alimenticios preparados en recipientes metlicos, de vidrio,
plstico u hojalata que tiene cierre hermtico y han sido sometidos a un tratamiento que
garantiza la destruccin de todas las formas bacterianas vegetativas o esporuladas y de
cualquier enzima.
Son aquellos productos que permanecen sin contaminar a temperatura ambiente, durante
largos periodos de tiempo y tienen una vida til que puede variar desde 6 meses a varios
aos.
Las principales caractersticas exigibles en una conserva son:
-

Inocuidad para el consumidor


Mantenimiento inalterable de sus caractersticas organolpticas durante largos
periodos de tiempo.

Para lograr la inocuidad de una conserva, sera suficiente con utilizar un tratamiento
trmico elevado, lo que por otra parte, dar lugar a que los caracteres organolpticos del
producto envasado sufrieran una modificacin sensible. Por esta causa, se suelen tener
en cuenta dos conceptos, respecto a la esterilidad de las conservas:
Esterilidad Biolgica
Esterilidad Comercial
En la esterilidad biolgica, existe una ausencia total de microorganismos y sus toxinas, as
como la inactivacin absoluta de enzimas celulares y microbianas.
En la esterilidad comercial, no deben existir formas vegetativas, esporas de bacterias
patgenas o toxinas de microorganismos capaces de alterar el producto. Las enzimas
celulares y microbianas debern estar inactivas. En las conservas de esterilidad comercial
se toleran esporas de microorganismos pertenecientes a la familia Bacillaceae no
patgenos, no toxignicos e inertes, es decir, incapaces de germinar.

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Definicin NTC 4433


Esterilidad comercial de un alimento tratado trmicamente es: el estado que se consigue
aplicando el calor suficiente, solo o en combinacin con otros tratamientos apropiados con
el objeto de liberar a ese alimento de microorganismos patgenos y de otros
microorganismos capaces de reproducirse en el, en unas condiciones normales no
refrigeradas en las que se mantendr probablemente el alimento durante su distribucin y
almacenamiento.
CLASIFICACIN:
Las conservas segn su tecnologa y con fines de control, las conservas se suelen
clasificar: Segn el pH y segn el envase.
Segn el pH del producto envasado, las conservas se clasifican en:
-

Conservas no cidas, de pH superior a 4.5


Conservas cidas, de pH inferior a 4.5

Las conservas no cidas, exigen un tratamiento trmico elevado, de acuerdo con un


baremo de esterilizacin adecuado, previamente estudiado.
Las conservas cidas, se someten generalmente, a un tratamiento trmico que gira
alrededor de los 100C, temperatura suficiente para destruir la microbiota acidofila
(bacterias, levaduras y mohos).
Segn el pH del contenido:
Poco cidas, con pH superior a 5.3: como las conservas de carne y pescado
De acidez media, con pH entre 5.3 y 4.5: como las conservas de legumbres y verduras
cidas, con pH entre 4.3 y 3.7
Muy cidas, con pH inferior a 3.7: como el choucroute (o col fermentada).
Segn el envase:
Teniendo en cuenta el envase que las contiene, las conservas se pueden clasificar en:
-

Conservas en envases metlicos hermticamente cerrados


Conservas en envase de vidrio, cerrados con cpsulas metlicas o de plstico, al
vaco.
Conservas en envase de plstico flexible o duro, cerradas por termosellado o
cpsula.
Conservas en envase de cartn parafinado o de plstico, estriles, donde se
introduce aspticamente el producto previamente esterilizado. El envase se cierra
mediante cpsula o termosellado.

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Procedencia de la Microbiota:
Las conservas pueden contener, microorganismos revivificables debido a causas
diversas, principalmente:
- Por tratamiento trmico insuficiente
- Por microfugas en los envases.
En el caso de tratamiento trmico insuficiente, puede ocurrir que:
- El tratamiento trmico fuera correcto pero, si se ha partido de materias primas
excesivamente contaminadas, se encuentren en la conserva esporas de Bacillus
termorresistentes.
- Tratamiento trmico insuficiente, por lo que se podran encontrar Bacillus
termorresistentes, y otros microorganismos termosensibles.
El mayor riesgo esta en el primer caso, pues existe la posibilidad de persistencia de
esporas pertenecientes a Clostridium botulinum.
El crecimiento microbiano del segundo caso se descubre por el abombamiento del
envase.
Cuando se trata de microfugas, se considera que la conserva ha sido esterilizada
correctamente, pero defectos del envase facilitan la penetracin de microorganismos
desde el exterior, especialmente cuando se utilizan aguas contaminadas para el
enfriamiento de conservas una vez esterilizadas.
Alteracin por bacterias esporuladas:
Acidificacin: Se presenta en conservas de legumbres, por la presencia de Bacilos
termfilos y algunas veces por mesfilos que han resistido el tratamiento trmico. El
agente causal en legumbres, suele ser
Bacillus stearothermophilus y B. thermoacidurans y B. themioaceticum, son bacilos
esporulados termfilos con metabolismo muy activo.
Abombamiento: Consiste en la sobreproteccin interna del envase, como consecuencia
de la produccin de gas que puede incluso originar explosin. El agente causal suele ser
Clostridium thermosaccharlyticum, bacilo esporulado anaerobio estricto.
Ennegrecimiento: Se debe al crecimiento de Clostridium nigrficans, esporulado
anaerobio termfilo, productor de SH2. El envase se presenta mas o menos abombado y
el contenido de color negro, desprende olor ptrido.
Abombamiento por bacterias esporuladas mesfilas:
Acidificacin: Provocad por presencia de B. subtilis, B. lcheniformis.
Abombamiento por fermentacin butrica: Producida por Clostridium butyricum,
Clostridium

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pasteurianum, se fermenta el alimento, con acidificacin y desprendimiento de gas,


causante del abombamiento del envase.
Abombamiento con putrefaccin: Producido por Clostridium sporogenes, produce la
descomposicin de las protenas con liberacin de compuestos de la putrefaccin.
Abombamiento por desprendimiento de nitrgeno: Ocasionado por
desnitrificantes, al trasformar los nitratos en nitritos Ejemplo: Bacillus circulans.

bacilos

Alteracin de la calidad Higinico sanitaria: Existe riesgo de toxi-infeccin alimentaria en


aquellas conservas de pH mayor de 4.5. Las de pH menor de 4.5 solo permite el
crecimiento de bacterias patgenas.
El crecimiento de microorganismos patgenos altera las caractersticas organolpticas de
la conserva, por lo que causa rechazo, esto no siempre es as puesto que, a veces,
aunque el producto no este alterado aparentemente, contiene flora patgena, hecho que
supone un enorme riesgo. Es el caso de Clostridium botulinum, tipos A-B-E, as como
S. aureus, microorganismos capaces de producir toxinas.
CONTROL MICROBIOLGICO DE LAS CONSERVAS
Este control se establece en dos niveles:
-

Control de rutina: comprueba que las conservas no han sufrido modificaciones,


despus de haber sido sometidas a una esterilizacin previa: Control de
estabilidad
Control completo: cuando existen problemas de alteracin o si se desea poner a
punto un baremo de esterilizacin: Control de esterilidad.

El control de estabilidad se puede realizar en fbrica, mientras que el control de esterilidad


requiere un examen delicado y minucioso por parte del Laboratorio de Microbiologa.
Control de estabilidad: Se logra analizar un considerable nmero de muestras, consiste en
someter a incubacin parte de las muestras del mismo lote que se va a controlar, con el
fin de comprobar posteriormente, si se han producido modificaciones sensibles cuando se
comparan con una muestra del mismo lote no incubada y que sirve como testigo.
Pasado el tiempo de incubacin se procede a:
-

Estudiar el aspecto del envase incubado, comparando con el testigo.


Comprobar la variacin del pH con el testigo.
Realizar examen bacterioscpico del alimento, con recuento de microorganismos,
comparando la microbiota de los envases incubados y el testigo.

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Control de esterilidad (Esterilidad comercial): Constituye un anlisis completo, reservado


habitualmente, a laboratorios especializados. Esta indicado, cuando despus del control
de estabilidad, se ha manifestado una alteracin positiva o dudosa, o cuando se trate de
conservas alteradas espontneamente.
El control consiste en comprobar si el alimentos, alberga microorganismos revivificables y,
en caso positivo, determinar su naturaleza para poder explicar la falta de estabilidad. En
este examen se comprueba:
-

Morfologa de la microbiota revivificable


Termorresistencia de la microbiota
Temperatura ptima de crecimiento.

Este anlisis exige las siguientes etapas:


Muestreo: Consiste en separar cierto numero de unidades del lote que sean
representativas de este. Se deben dejar contramuestras (mnimo dos recipientes del
mismo lote).
Lavado de Envases: Antes de proceder a su anlisis se deben lavar cada una de las
unidades muestreadas, con agua jabonosa y aclarar con agua potable.
Examen macroscpico preliminar de los envases: Comprobar el estado de los envases,
para descubrir posibles defectos o alteraciones tales como: abombamiento, oxidacin,
microfugas, deformaciones.
Incubacin: Una vez realizado el examen externo de los envases, se someten a
incubacin, para comprobar la estabilidad del producto envasado.(los detectados
alterados no se incuban).
Examen externo del envase despus de la incubacin: Transcurrido el tiempo de
incubacin, es necesario que las conservas se estabilicen, a temperatura ambiente entre
1 a 4 horas, antes de ser examinadas.
Luego de este tiempo, se examina la conserva para detectar posibles alteraciones como:
-

Abombamiento fsico
Oxidacin
Deformacin

Abombamiento: Segn su resistencia a la presin, la presin del envase puede ser


reductible o no reductible.
El abombamiento de origen fsico: se debe a diversas causas, como el exceso de llenado
o la deformacin del envase, como consecuencia de golpes. En este tipo de
abombamiento, el producto es estril y sus caractersticas organolpticas normales.

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El abombamiento de origen qumico: deriva de la reaccin qumica entre envase y


contenido, con desprendimiento de H2 y corrosin del metal. El contenido puede ser
normal o estar ligeramente alterado.
El abombamiento biolgico: De origen microbiano se produce como consecuencia del
crecimiento de determinados microorganismos en el interior de la conserva. En este tipo
de abombamiento se alteran el envase y el contenido.
La oxidacin, es una alteracin propia de las conservas, mantenidas en lugares hmedos,
no implica necesariamente el deterioro del alimento envasado, pero, como puede ser
causa de rotura del envase, existe peligro de contaminacin por parte de
microorganismos procedentes del exterior.
La deformacin, es causada por golpes: es posible encontrar microfugas, en el envase
deformado, que permitan la entrada de microorganismos. No deben existir diferencias en
el aspecto del envase cuando se comparan las conservas incubadas y la testigo.
Apertura del envase y toma de muestra para anlisis:
Con el fin de evitar contaminaciones externas, que pueden falsear los resultados, se
recomienda el uso de cmaras de flujo laminar, por cuanto, en el interior de la conserva
existe un vaco que, al abrir el envase, da lugar a una aspiracin de aire exterior, por lo
que, para impedir poluciones, el aire circulante debe ser estril.
Apertura del envase: La tapa de la conserva que se va a abrir, se lava enrgicamente con
algodn empapado con alcohol de 70, se vierte una pequea cantidad de alcohol que
debe actuar durante algunos minutos y desecharse despus. La pelcula de alcohol que
permanece se flamea de forma rpida. Este flameado se omite cuando los envases estn
abombados.
Cuando se trata de envases abombados, como su apertura puede generar peligro para el
manipulador, se toman precauciones para protegerse de la salida violenta del contenido,
Se recomienda en este caso, usar un embudo de vidrio invertido sobre la conserva, que a
su vez debe estar sobre una bandeja metlica, la tapa de la conserva se perfora con un
punzn metlico estril, a travs del vstago del embudo. Los gases que salen por el
orificio de apertura, se recogen en un tubo de ensayo o en una probeta colocada en
posicin invertida sobre el vstago del embudo.
Para detectar la presencia de H;, se aplica una llama a la boca del tubo donde se han
recogido los gases, en caso positivo se producir una pequea explosin, La presencia de
CO2, se detecta aadiendo 3ml de KOH al tubo y agitando , previa obturacin del tubo con
el dedo.
Cuando se crea un vaco se succiona el dedo, la prueba es positiva. En el mismo tubo se
puede comprobar la presencia de H2S, que se manifiesta por el ennegrecimiento de una
tira de acetato de ploma.

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Medida del pH:


Separada la muestra para el anlisis microbiolgico, se mide le pH, utilizando peachimetro
con electrodo de vidrio, la medida se hace directamente sobre el producto, si es
homogneo y sobre u triturado si el producto es heterogneo, utilizando como diluyente
un tampn cuyo pH se aproxime al del alimento.
Examen del contenido de la conserva:
Consiste en observar la posible modificacin de las caractersticas organolpticas, del
producto conservado, comparando las conservas incubadas, con las testigos, sin incubar.
Olor putrefacto: propio de microorganismos esporulados anaerobios, mesfilos como: CL.
Sporogenes, Cl. Perfringes, Cl. Putrefaciens, Cl. Nigrificans.
Olor fecal: Por coniformes procedentes del exterior que indican fisuras del envase.
Olor H2S: suele ir acompaado de ennegrecimiento (CI. Nigrificans)
Olor a queso: Por algunas especies de Clostridium
Olor a cido butrico: Por algunas
Thermosaccharolyticum, Cl. Butyricum,
Cl. Perfringes y Cl. Pasteurianum.

especies

de

Clostridium

spp:

Cl.

Aspecto: Textura blanda, digerida


Aspecto: Consistencia lquida, viscosa, filante.
Aspecto: Elementos extraos
Sabor: No se debe comprobar esta caracterstica.
Examen interna del envase:
Se extrae el producto para hacer un examen minucioso del interior del envase, con el fin
de descubrir posibles alteraciones del color de las paredes, debidas generalmente, a
reacciones qumicas, as como lesiones de oxidacin y desprendimiento del esmalte
protector.
Examen bacterioscopico:
Se examina microscpicamente el contenido de las muestras incubadas y la testigo. Con
este examen se pon e de manifiesto la calidad bacteriolgica del producto. Se pueden
encontrar formas vegetativas, esporuladas y muertas.
En productos sometidos a esterilizacin, la forma comn es la de clulas vegetativas
muertas y esporas inertes. La cifra de estos microorganismos se pone en evidencia
mediante el examen microscpico directo.

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Si esta cifra es alta (>107), significa que la materia prima es microbiolgica mente
deficiente. Una buena conserva no debe tener de 2 a 3 bacterias muertas por campo
microscpico, excepto en alimentos cuya elaboracin es consecuencia de fermentacin
biolgica.
El examen microscpico directo, es en ocasiones el nico medio de detectar el flan sour,
ya que los Bacillus
spp termfilos causantes de esta alteracin, al multiplicarse en la conserva, dan lugar al
fenmeno de auto esterilizacin, por lo que no se produce el crecimiento de colonias de
microorganismos revivificables sobre los medios de cultivo y, en cambio aparecen multitud
de microorganismos muertos por examen bacterioscopico.
La presencia de formas microbianas variadas (cocos, bacilos, levaduras), y esporangios,
indican microfugas o deficiente proceso de esterilizacin. Si se observan bacilos con
esporas subterminales o esporas libres se puede a proceder hacer bioensayos con
ratones blancos para la investigacin de la toxina botulnica.
La tcnica para el examen microscpico, consiste en hacer una extensin fina del
alimento y teida por tinciones simples o de Gram. y observada bajo el objetivo se
inmersin, se examinan 10-20 campos distintos al azar. Se cuentan las agrupaciones
encontradas (parejas, racimos, cadenas, aislados), Gram positivas y Gram negativas.
En la agrupacin microscpica, se cuentan como un solo microorganismo las
agrupaciones microbianas encontradas, as como cada clula aislada que esta separada
del grupo a una distancia superior al eje mayor de dicha bacteria.
Interpretacin del control de estabilidad:
De acuerdo con tos exmenes efectuados, para que la estabilidad de una conserva sea
correcta, debe ocurrir:
-

Que despus de la fase de incubacin no existan modificaciones en el envase


Que despus de la incubacin no se observen modificaciones en el contenido
Que la validacin del pH entre la conserva incubada y la testigo, sea igual o
inferior a 0.5 unidades
Que la variacin del nmero y naturaleza de los elementos microbianos
observados al microscopio en la conserva incubada con respecto a la testigo sea
inferior a 100.

4. Materiales, Equipos e Insumos


-

1Pipeteador
1 pH - metro
1 Abrelatas o punzn de acero inoxidable estriles
2 Pipetas de 1 ml estriles
Incubadoras a 35 C Y 55C

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-

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12 Tubos de ensayo con 10 ml de caldo BHI con almidn


Portaobjetos
Agua clorada con 100 mg/kg 300 mg*kg de Cloro libre o solucin de yodo y alcohol
(2.5% m/v de Yodo de etanol).
Caldo BHI con 0.1% de almidn soluble
Asas bacteriolgicas
Muestras de conservas de origen animal o vegetal (mnimo 2 iguales y del mismo lote)
1 Embudo de vidrio estril y 1 probeta
Algodn
1 microscopio

5. Reactivos

- Cristal violeta
- Azul De metileno
- Fascina bsica
- Alcohol acetona

6. Procedimiento
-

Proceda a realizar la inspeccin externa de los envases.


Posterior a la inspeccin, tome dos envases y envulvalos en papel absorbente.
Incube uno de ellos a 35 C 2 C y el otro a 55 C 2 C durante 10 das. Examine
todos los das los envases para ver si el papel est manchado o los envases estn
abombados. En malquiera de los dos casos, se procede a retirar la muestra y se abre
y examina el contenido.
Pasado el tiempo de incubacin, proceda a limpiar, desinfectar y abrir el envase
guindose por las indicaciones dadas en la fundamentacin terica de la gua. Los
envases hinchados se atemperan durante 1 ms horas antes de abrirlos, con el fin
de disminuir la presin interna y el esparcimiento del contenido. Estos envases
hinchados se manipulan como si tuviesen toxinas o patgenos, evitando cmaras de
flujo horizontal que despidan aire sobre el manipulador (usar cmara de flujo vertical).
Registrar olores extraos evitando olfatear directamente el envase.
A continuacin, tome 1 2 ml gr de producto homogneo e inocule esta cantidad en
cada uno de los 12 tubos de caldo BHI con almidn (10 ml cada tubo). A seis de los
tubos, adicione parafina estril para conseguir anaerobiosis. Incube tres tubos
aerobios y tres anaerobios a 35 C 2 C e igual nmero de tubos en las mismas
condiciones atmosfricas a 55 C 2 C durante 72 horas.
Realice el anlisis microscpico directo, coloreando las placas con Gram. o tincin
simple.
Interpretacin de resultados: S mximo en 1 (uno), tubo de los seis aerobios da
positivo y ninguno anaerobio registra crecimiento, se reportar el informe como:
Prueba de esterilidad comercial satisfactoria. Si no se cumple la condicin
anterior se reportar como: Prueba de esterilidad comercial insatisfactoria.

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-

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Las muestras tambin pueden ser sembradas en otros medios lquidos o slidos, con
el fin de establecer la naturaleza de los microorganismos; el medio de cultivo debe ser
muy nutritivo para que los microorganismos se desarrollen bien; el pH debe ajustarse
al del alimento analizado.
Medios para el crecimiento de aerobios y que favorezcan el crecimiento de
Bacillus spp.
Medios para crecimiento de anaerobios y que favorezcan el crecimiento de
Clostridium spp.
Medios especficos para grmenes de la familia Bacillaceae.
Medios para mohos y levaduras, sobretodo en conservas de frutas y conservas
cidas.
Medios para el crecimiento de Lactobacillus spp, sobre todo en conservas de
fruta y otras conservas cidas.

7. Nivel de Riesgo:
-

3 bata manga larga, guantes, zapato cerrado, gafas protectores, cofia, tapabocas
El materia biolgico para descartar se empaca en bolsa, se marca y entrega al
auxiliar

8. Bibliografa
-

Albarracin, F. Y.; Herrera, F. C. Texto de Laboratorio de Microbiologa de


Alimentos.1995
Alaert, C. , Escola. M. Mtodos de Anlisis Microbiolgicos de Alimentos .Madrid:
Editorial Daz de Santos. 2002.
Doyle, M. P. Beuchat, LR. Microbiologa de Alimentos. Fundamentos y Fronteras.
Zaragoza: Editorial Acribia, 2001.
Pascual, M.R. Microbiologa Alimentara: Metodologa Analtica para Alimentos y
Bebidas. Segunda Edicin. Editorial Daz de Santos. 2000
Forsythe, S.J., Hayos, P.R. Higiene de los Alimentos, Microbiologa y HACCP.
Segunda Edicin. Zaragoza: Editorial Acribia 2002.
Rojas, A. Recopilacin Guas de Microbiologa de Alimentos. Universidad de
Pamplona. 2003.

9. Anexos

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1.

Titulo: ANLISIS MICROBIOLGICO DE EQUIPOS, SUPERFICIES, AMBIENTES


Y MANIPULADORES

2.

Objetivos:
2.1 Conocer las tcnicas empleadas para hacer anlisis de superficies, equipos,
ambiente y manipuladores de alimentos.
2.2 Desarrollar destrezas para analizar y evaluar si las prcticas de limpieza y
desinfeccin son efectivas en la industria alimentaria.

3. Marco terico:
Para garantizar la calidad sanitaria de los productos alimenticios que se procesan en las
fbricas de alimentos, estas deben tener implementados procedimientos adecuados de
limpieza y desinfeccin, as como, adecuados y suficientes agentes detergentes y
desinfectantes, que permitan mantener a la fbrica libre de focos de contaminacin, y
prevenir riesgos que puedan afectar la salud del consumidor.
Limpieza: Es el proceso de remocin de mugre (contaminantes) y prevencin de la
acumulacin de restos de alimentos que pueden descomponer o soportar el crecimiento
de organismos que causen deterioro al alimento o enfermedades al consumidor.
La limpieza se debe aplicar a todas las reas de la planta, detectando puntos de control
critico, con nfasis en especial en las superficies de contacto con alimentos.
Desinfeccin: Es la destruccin de microorganismos, presentes en una superficie. No
siempre incluye sus formas de resistencia
Saneamiento: Reduccin de las formas vegetativas de os microorganismos patgenos o
perjudiciales para el alimento, hasta niveles seguros que permitan garantizar la inocuidad
del alimento durante toda su vida til.
ORIGEN DE LA CONTAMINACIN EN LAS INDUSTRIA DE ALIMENTOS
En la industria de alimentos se considera que la contaminacin procede de:
1. La materia de contacto con los alimentos
2. El aire
3. El personal
Desinfeccin de superficies:
Antes de cualquier operacin de desinfeccin, es necesario definir cual es el problema
que se va a tratar para poder fijar tos parmetros de tos procesos de desinfeccin, lo cual

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incluye: la concentracin del producto activo, la temperatura, el tiempo de contacto, la


accin mecnica (cepillado, circulacin, pulveracin, remojo entre otras formas). Cada
empresa debe fijar sus parmetros de desinfeccin, as como de limpieza. Adaptando un
modelo de limpieza y desinfeccin acorde a las necesidades de la planta de produccin.
El aire:
La contaminacin del ambiente procede de restos de alimentos, en el suelo o sobre las
superficies, favoreciendo el desarrollo de microorganismos, de la manipulacin de
embalajes de cartn contaminados en su mayora con esporas de mohos, de la
contaminacin generada por el personal, de las corrientes de aire y de las instalaciones
de aire acondicionado que se encuentran en mal estado. Esta contaminacin se puede
reducir mediante el uso de radiaciones ultravioleta, filtracin, uso de aerosoles,
pulverizaciones o nebulizaciones que no precipiten rpidamente y que sean seguras para
el personal y el alimento.
El personal:
Los operarios que trabajan en las industrias de alimentos, pueden transmitir
microorganismos a los alimentos a travs del cabello, la barba, la cavidad nasofaringea, la
ropa, las manos y el calzado; en cada caso se produce una contaminacin por diferentes
microorganismos y de diferente procedencia. Las labores de desinfeccin enfocadas al
personal son limitadas a: desinfeccin de las manos, con alcoholes o mezclas de ellos y a
la desinfeccin de uniformes, particularmente las botas, petos, delantales, batas, con
productos alcalinos o clorados.
MTODOS PARA EL CONTROL DE LA DESINFECCIN EN LA INDUSTRIA
ALIMENTARIA
Utilizacin de hisopos: La toma de muestras con hisopos se emplea mucho, sobre todo
para el control de material en las salas de despiece, quesera, moldes, bandejas, vlvulas,
palas de agitadores y en general de superficies que entren en contacto con el alimento o
donde se sospeche sea una fuente de microorganismos y donde el mtodo sea factible de
aplicacin.
Mtodos de enjuague: Utilizados para el control de circuitos, tanques, botellas, el
inconveniente radica, en que en los sistemas cerrados no se logra establecer cual es el
punto de contaminacin, si es que el problema persiste en algn equipo.
Mtodos de vaciado: Se utilizan para el control de recipientes pequeos, requiriendo de
cierta experiencia para la distribucin regular del medio, durante la operacin de vaciado.
Mtodos por impresin: Se adaptan bien a las superficies planas, los microorganismos
son extrados por contacto directo con el medio de cultivo. De esta forma se puede
establecer la localizacin de los microorganismos en las superficies desinfectadas
(mtodo de placa RODACb).

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Control de aire con placas de medio de cultivo: El control se lleva a cabo exponiendo la
superficie del medio de cultivo a la atmsfera seleccionada por un tiempo determinado
(sedimentacin).
Sistemas colectores de aire: Estos equipos toman un volumen de aire determinado en una
unidad de tiempo determinada, proyectando el aire captado sobre la superficie de una
placa de petri con un medio definido. Es una tcnica significativa de la contaminacin
ambiental.
4. Materiales, Equipos e Insumos
Muestras: Elegir un rea de trabajo en las cual se puedan aplicar los controles de
superficies, operarios, ambiente de trabajo.
-

5 Pipetas de 1 ml estriles
2 Pipetas de 0.1 ml estriles
5 tubos taparrosca con 10 ml de caldo nutritivo
5 cajas de Petri estriles
6 hisopos estriles
1 plantilla de 5x5 cm2
Incubadoras
20 ml de Agar SPC fundido
20 ml de Agar OGY fundido
60 ml de EMB fundido
2 cajas servidas de Baird Parker Agar
2 cajas servidas de OGY Agar
2 cajas servidas de SPC Agar

5. Reactivos

6. Procedimiento

Toma de muestras de superficies. Seleccione del lugar a trabajar un rea de 100


cm2 y realice un hisopado, guindose por las pautas dadas en la fundamentacin
terica de la gua. Utilice los medios de cultivo apropiados para el anlisis a realizar
(conteo total de bacterias, mohos y levaduras, coliformes totales, E. coli y otros grupos
de microorganismos).
Para la misma determinacin, realice los mtodos de enjuague con caldo nutritivo y
tcnica RODAC con los medios adecuados. Incube todos los anlisis por el tiempo y
temperatura adecuados.

Toma de muestras de aire. Seleccione del lugar de trabajo, un rea, en la cual debe
exponer la superficie de una caja de agar plate Count para conteo total de bacterias y
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de Ogy para recuento de


mohos y levaduras (por sedimentacin de
microorganismos). Exponga las cajas durante mximo 15 minutos al ambiente y
cirrelas. Proceda a incubar por el tiempo y temperatura adecuados.

Toma de muestras a manipuladores. Con los hisopos previamente humedecidos


con el caldo TAT, realice un frotis por las manos de los operarios, siguiendo las
indicaciones dadas en la fundamentacin terica de la gua. Con estos, proceda a
realizar los anlisis de grupos de microorganismos que se desea detectar (Coliformes
totales, E. coli, etc...). Con algunos de los hisopos con el frotis de las manos, realice
directamente una siembra masiva sobre la superficie de la placa de petri con el medio
apropiado para el anlisis.

Reporte correctamente los resultados. Pasado el tiempo de incubacin de todos los


anlisis realizados a las superficies, operarios y aire, proceda a realizar los conteos y
reporte los resultados correctamente, guindose por los criterios mencionados en los
cuadros de la fundamentacin terica o en el anexo C. Los resultados deben en su
totalidad estar tabulados.

NOTA: siempre tenga la precaucin de marcar previamente los tubos, cajas y dems
pruebas con la fecha, lugar, anlisis, hora, temperaturas de incubacin y dems
informacin necesaria para el correcto desarrollo de las pruebas.
ANEXO A. EVALUACIN RPIDA DE PROCEDIMIENTOS DE L&D
Un ambiente limpio involucra procesos verdaderos que garanticen superficies y aire no
contaminados; por el contrario pisos sucios, aire de baja calidad microbiolgica, operarios
que no cumplen con las BPM, crean las condiciones propicias para la contaminacin del
producto.
Para poder verificar si un programa de L&D est funcionando correctamente, existen dos
tipos de pruebas que pueden aplicarse: las pruebas rpidas y los mtodos tradicionales,
sin embargo estos ltimos requieren de tiempo y no permiten determinar en el momento si
el proceso ha quedado en las condiciones ptimas para su utilizacin; dentro de estos
sistemas el que ha tenido mayor aceptacin, es la tecnologa del ATP bioluminiscente.
Este mtodo utiliza como principio, la capacidad de la enzima luciferasa (obtenida de
lucirnagas), que en presencia del sustrato (lucifern), y utilizando como cofactor el ATP
puede emitir luz, la cual puede ser cuantificada. La reaccin generadora de luz en la
lucirnaga es:
Lucifern + Luciferasa + ATP + Mg
pirofosfato

Luciferasa-luciferadenilato +

Luciferasa-luciferadenilato + O2

Luciferasa + oxilucifern + AMP + Luz


+ CO2

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El sustrato lucifern, es fosforilado por la enzima luciferasa en presencia de ATP, molcula


presente en todas las clulas vivas (bacterias, hongos, protozoos, animales, vegetales,
etc), la reaccin qumica final es la produccin de luz que es referida como
bioluminiscencia. Esta tcnica puede utilizarse para determinar si un equipo ha quedado
bien higienizado, ya que puede detectar cantidades pequeas de material orgnico vivo.
Los sistemas tpicos de ATP, consisten en:

Luminmetro.
Reactivos para realizar la prueba (buffer, enzima, sustrato, e hisopos).
Impresora.

Existen algunos inconvenientes para correlacionar medicines de ATP (las cuales son
expresadas en unidades relativas de luz URL), con el nmero de microorganismos:
1.
2.
3.
4.
5.

La cantidad de ATP vara de un organismo a otro.


La cantidad de ATP vara de acuerdo a la fase de crecimiento.
La presencia de biopelculas hace difcil la cuantificacin como clulas individuales.
No se diferencian clulas de origen no microbiano.
En la industria lctea existe la posibilidad de ATP libre, proveniente de los productos y
que pueden permanecer durante varios das en la superficie.
6. El ATP libre puede sobrevivir a rangos de pH cido a temperatura ambiente.
No obstante, todos estos inconvenientes se deben garantizar en los procesos de L&D.
Una limpieza efectiva que remueva los residuos alimenticios y una correcta desinfeccin
que asegure la lisis y muerte celular microbiana, soportan la razn por la cual este
sistema puede utilizarse como indicador del programa L&D.
Cundo no debe utilizarse este sistema?

Cuando se desea detectar bajos niveles de bacterias (<10 ufc).


Detectar la muerte microbiana.
Cuando se pretende correlacionar URL con el nmero de bacterias o levaduras.
En las manos de operarios, pues siempre se estn eliminando clulas epiteliales.

Como cualquier tcnica, se requiere un conocimiento del sistema para obtener datos
confiables. Es importante recordar que los monitores de ATP son la primera lnea de
defensa; usualmente en plantas con superficies sucias, se encuentran tres tipos de ATP,
por ello se debe recordar que las mediciones son del ATP total, es por esta razn que
cada planta antes de poner esta mtodo de deteccin debe estandarizar los valores de
URL que puedan diferenciar entre superficies sucias e higienizadas correctamente.

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Es importante valorar dentro de una industria aquellos sitios donde es ms difcil el


proceso de L&D, como : bandas transportadoras, mesas de corte, cuchillas, equipos como
despulpadoras, molinos, centrfugas de discos y en los servicios de alimentacin,
licuadoras y coladores.
En trminos generales, los siguientes pasos, son los necesarios para utilizar el sistema de
bioluminiscencia en una planta de proceso:

Se toma el escobilln, si la superficie est hmeda no se requiere de humedecer el


hisopo previamente en la solucin de enjuague; se pasa el hisopo por una superficie
de 10 cm2, esta rea muestreada siempre debe ser igual para reducir el error analtico.
Posteriormente se introduce el hisopo en el tubo de enjuague y se agita
vigorosamente durante 10 segundos. Se coloca el dispositivo (varilla)m de reaccin
( el cual contiene la enzima y el sustrato liofilizado, razn por la cual no reacciona ente
s), dentro del tubo del enjuague de manea que llegue hasta el fondo; posteriormente
se libera el reactivo, se mezcla e inmediatamente se introduce la varilla en el
luminmetro y se espera a que el equipo d la lectura.

Como todo sistema novedoso, tiene el inconveniente del costo, sin embargo, cuando en
un proceso se pueden tomar las medidas correctivas a tiempo, la inversin que se hace
es baja, comparada con la calidad final del producto y los costos generados de productos
elaborados en ambientes no adecuados.
7. Nivel de Riesgo:
-

2 bata de laboratorio manga larga, guantes, cofia, zapato cerrado, pantaln largo.
El materia biolgico para descartar se empaca en bolsa, se marca y entrega al
auxiliar

8. Bibliografa
-

Albarracin, F. Y.; Herrera, F. C. Texto de Laboratorio de Microbiologa de


Alimentos.1995
Alaert, C. , Escola. M. Mtodos de Anlisis Microbiolgicos de Alimentos .Madrid:
Editorial Daz de Santos. 2002.
Doyle, M. P. Beuchat, LR. Microbiologa de Alimentos. Fundamentos y Fronteras.
Zaragoza: Editorial Acribia, 2001.
Pascual, M.R. Microbiologa Alimentara: Metodologa Analtica para Alimentos y
Bebidas. Segunda Edicin. Editorial Daz de Santos. 2000
Forsythe, S.J., Hayos, P.R. Higiene de los Alimentos, Microbiologa y HACCP.
Segunda Edicin. Zaragoza: Editorial Acribia 2002.

Rojas, A. Recopilacin Guas de Microbiologa de Alimentos. Universidad de


Pamplona. 2003.

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9. Anexos

NORMAS MICROBIOLGICAS
ANLISIS ESPECIALES Y/O
ESPORDICOS

ANLISIS DE RUTINA
PRODUCTO

NORMA

EMP.
PRIVADA
EMP.
Planta agua
PRIVADA
EMP.
Planta manos
PRIVADA
EMP.
Plantas manos (agua)
PRIVADA
Planta
superficies EMP.
preproceso
PRIVADA
Planta
superficies EMP.
proceso
PRIVADA
Planta ambientes

AEROBI
MOHOS
S.
Bacill
OS
COLIFO E.
Y
E..C.S.
Salmon
aureus
us
OTROS
MESFI RMES coli LEVAD
R.
ella spp
cereus
LOS
URAS
100

--

--

30

--

--

--

--

--

100

--

--

--

--

--

--

--

--

100

--

--

--

--

--

--

--

--

50

--

--

--

--

--

--

--

100

<10

--

--

--

--

--

--

--

500

<10

--

--

--

--

--

--

--

Tabla 3. Algunos criterios microbiolgicos para ambientes en plantas procesadoras


de alimentos.