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PRACTICA ESTUDIO DE LA DIVERSIDAD MICROBIANA EN UN

MICROAMBIENTE
OBJETIVOS.
Mediante el empleo de una columna de Winogradsky, el estudiante lograr:
Aplicar e interpretar los conocimientos de las diferentes tcnicas utilizadas
para la caracterizacin de microorganismos.
Diferenciar los grupos microbianos presentes en un microambiente.
Comparar los microorganismos que crecen a lo largo de la columna en
diferentes tiempos.
Relacionar la diversidad microbiana presente en un microambiente con
algunas de sus caractersticas fisiolgicas.
Explicar las causas que originan la sucesin de microorganismos
observada.
INTRODUCCIN.
A diferencia de los estudios realizados por Luis Pasteur y Roberto Koch sobre
cultivos puros, dos famosos microbilogos: Sergei N. Winogradsky (18561953) y Martinus Willem Beijerinck (1851- 1931), fueron los primeros en
estudiar las relaciones entre diferentes tipos de microorganismos en un
mismo hbitat.
El estudio de las comunidades microbianas en condiciones de laboratorio
puede realizarse fcilmente en una columna de Winogradsky, la cual simula
un microecosistema o microambiente que ilustra cmo los microorganismos
ocupan microespacios altamente especficos de acuerdo con sus
necesidades vitales, tales como: requerimientos de carbono, energa y
oxgeno, as como la interdependencia, de forma tal que la actividad
metablica de un microorganismo posibilita el crecimiento de otros y
viceversa. Estas columnas, que llevan el nombre del microbilogo ruso que
las utiliz por primera vez, son sistemas completamente autoreciclables.
Las columnas de Winogradsky se preparan con muestras de suelo
colectadas en ambientes hmedos, las cuales son enriquecidas con
compuestos orgnicos e inorgnicos y finalmente son expuestas a una
fuente de luz natural. En ellas se observa que despus de 3 4 semanas de
incubacin aumenta la cantidad de los distintos tipos de microorganismos,
mismos que de acuerdo con sus caractersticas fisiolgicas se establecen en
las diferentes zonas a lo largo de la columna, lo que se conoce como
sucesin. De esta forma, el resultado es una columna estratificada (zonas
de diferente color) tanto en el suelo como en el agua, donde cada estrato se
relaciona con un proceso qumico-biolgico.
En la zona inferior de lodos se desarrollan organismos fermentadores que
producen alcohol y cidos grasos como subproductos de su metabolismo.
Estos productos de "desecho" constituyen el sustrato para el desarrollo de
bacterias reductoras de sulfato, las cuales como resultado de su
metabolismo liberan sulfuros que difunden a la zona superior oxigenada
creando un gradiente en el que se desarrollan bacterias fotosintticas que

utilizan el azufre. Por encima de esta zona pueden desarrollarse las


bacterias prpura que no utilizan el azufre y que obtienen su energa de
reacciones luminosas, pero que emplean cidos orgnicos como fuente de
carbono para su sntesis celular.
Finalmente, en la zona aerobia crecen las Cianobacterias y algas las cuales
como producto de su metabolismo liberan oxgeno. Tambin pueden crecer
bacterias que oxidan compuestos del azufre y 2 del nitrgeno hasta sulfatos
y nitratos respectivamente. Todos estos grupos sintetizan su materia
orgnica a partir del CO2.
ACTIVIDADES GENERALES.
1. Preparar una columna de Winogradsky.
2. Tomar muestras a distintos niveles de la columna para describir las
variaciones en la composicin microbiana a diferentes tiempos.
3. Relacionar la sucesin microbiana que se establece en la columna con los
requerimientos de carbono, energa, oxgeno y metabolismo a lo largo del
tiempo, durante 5 semanas.
4. Realizar cultivos en Agar Manitol Salado, Agar Mc Conkey y Agar SIM para
confirmar presencia de microorganismos gram positivos, gram negativos, y
bacterias productoras de sulfuro
4. Integrar los resultados obtenidos en los diferentes tiempos del muestreo.
PREPARACIN DE LA COLUMNA
Material Por grupo:
4.0 g. CaCO3 (o cscara pulverizada de un huevo)
300 a 500g de muestra de suelo o barro de un arroyo, lago, pantano o
costa de mar o ro (sedimento superficial o subsuperficial).
1 500 mL de agua de estanque, ro o asequa.
1 recipiente alto de boca ancha, de paredes trasparentes, rectas y sin
bordes.
1 yema de huevo cocido.
3 tornillos o clavos de hierro.
Papel peridico finamente cortado.
3 m de cordn de nylon o hilo camo.
8 portaobjetos con muesca en uno de los extremos.
1 varilla de vidrio de aprox. 20 cm.
1 esptula.
Mtodo
1. Colectar una cantidad de suelo, lodo o barro ricos en materia orgnica.
Remover las piedras, ramas o partculas grandes del material en estudio.
2. Adicionar al suelo 1 g de cada una de las sales, el papel finamente
cortado y el huevo desmenuzado. Mezclar hasta homogenizar
completamente.

3. Colocar la mezcla en un recipiente adecuado hasta ocupar 1/3 del


volumen total. Compactar el suelo con la ayuda de una esptula a fin de
eliminar las burbujas de aire (Fig. 1)
4. Mezclar la muestra de agua con el medio mineral en proporcin de 1:1.
5. Aadir la solucin anterior a la muestra de suelo hasta llegar a una altura
de aproximadamente de 3 a 5 cm abajo del borde. Tener cuidado de no
resuspender la muestra compactada, para ello inclinar la botella y resbalar
el agua lentamente por las paredes.
6. Agitar la solucin con una varilla de vidrio para eliminar burbujas de aire
(Fig 1).
7. Registrar el aspecto final de la columna (color del sedimento y del
lquido).
8. Tomar 8 portaobjetos y hacerles unas muescas (Fig. 2A). Sobre ellas
amarrar un extremo del hilo camo de tal forma que se pueda jalar el
portaobjetos con el otro extremo (figura 2B).
9. Colocar los 8 portaobjetos en una posicin vertical a diferentes niveles,
cuatro sobre el sustrato inclinados contra la pared del recipiente dejando
que el extremo de hilo suelto quede suspendido fuera de la botella y cuatro
en los primeros 10 cm de la superficie. (Fig. 2C).
10. Colocar dos clavos (uno galvanizado y uno no galvanizado) al fondo,
sobre el sustrato amarrados de un hilo.
11. Marcar el nivel de agua y cubrir la boca de la botella con el plstico auto
adherible. Hacer algunas perforaciones para reducir la evaporacin. Puede
ser necesario reponer agua para mantener el nivel original.
12. Incubar a temperatura ambiente (25 a 30C) cerca de una ventana para
que reciba iluminacin.

FIGURA 1. Forma de montar la columna de Winogradsky.

FIGURA 2. Secuencia de pasos para colocar los portaobjetos con muesca en


la columna de Winogradsky

PRACTICA CALIDAD DEL AIRE


La perturbacin de un ecosistema se puede producir de tres formas por
introduccin de materia o energa; por extraccin de materia o energa; y
por la alteracin mecnica in situ. Desde esta perspectiva una
contaminacin es una perturbacin por introduccin de energa o materia, y
esta puede ser inorgnica u orgnica, y viva o no viva.
Precisamente segn la naturaleza del agente contaminante se suele
distinguir entre contaminacin fsica (calor, radiacin y ruido);
contaminacin qumica (metales, plaguicidas, hidrocarburos, etc.); y
contaminacin biolgica (virus, bacterias, hongos, paracitos, etc.) (ALBERT,
1990).
Se habla de dos tipos de contaminacin atmosfricos, puntuales y zonales,
segn la localizacin de emisin consiste en un foco, como la chimenea de
una fbrica, o una superficie de emisin, como una ciudad. Tambin puede
ser fuentes fija (calefaccin) o mviles (transportes).
Sea cual sea el tipo, las fuentes de emisin de contaminantes se puede
agrupar en categoras tales como: eliminacin de residuos slidos
(incineradoras municipales y vertederos de cielo abierto) y Varias (incendios
forestales, quema de residuos agrcolas, etc.). (FERNANDEZ, 2001)
METODOLOGIA
Tcnicas y anlisis de laboratorio
Las muestras de aire para el anlisis microbiolgico, fueron colectadas
mediante la aspiracin con jeringas y descargando el contenido en matraces
de vidrio de un volumen de 250 ml conteniendo medio con BHI para ser
transportadas al laboratorio y ser analizadas.

Presencia de bacterias
Despus de realizar las 50 aspiraciones del aire con una jeringa de 20
descargando cada aspiracin en el matraz con medio BHI se llevaron
matraces a incubacin 37C por 24 a 48 horas. Pasado el tiempo
incubacin se realiz 3 diluciones en caldo peptona al 1% hasta 10 -3
cada dilucin se repico en medios Citramide, Mac Conkey .
Se llev a incubacin por 24 horas a 37C.

cc,
los
de
De

Presencia de fung
Despus de realizar las 50 aspiraciones del aire con una jeringa de 20 cc,
descargando cada aspiracin en el matraz con medio BHI se llev los
matraces a incubacin 37C por 24 a 48 horas. Pasado el tiempo de
incubacin se realiz 3 diluciones en caldo peptona al 1% hasta 10-3 . De
esta ltima dilucin se repico en medio Sabouraud glucosa al 4%. Se llev a
incubacin por 3 das a temperatura ambiente