TECNICAS DE ANALISIS, PRUEBAS DE ANDEN

PRUEBA DE REDUCTASA
Azul de metileno

PRUEBA DE LA REDUCTASIMETRIA EN LECHE

Fundamento
La mayora de los grmenes de la leche elaboran reductasas que modifican el
potencial de xido-reduccin de la misma. Para demostrar ese fenmeno basta
aadir a la leche una sustancia que se decolore al pasar de la forma oxidada a
la forma reducida. La rapidez con que cambia de color est en funcin de la
poblacin bacteriana y, por ello, puede ser un ndice del grado de
contaminacin de la leche. El colorante ms empleado es el azul de metileno,
pero tambin se pueden utilizar la resazurina y el cloruro de 2, 3, 5, trifeniltetrazolium, ya que son colorantes fcilmente absorbibles por las clulas vivas.
En general se admite que la decoloracin es ms rpida cuanto mayor es el
nmero de microorganismos en la leche. Sin embargo, las bacterias presentan
distinta habilidad para reducir el azul de metileno, as elStreptococcus
liquefaciens, los grmenes del grupo coliaergenos y los de la putrefaccin
(Bacillus subtilis) se muestran muy activos. Las clulas somticas presentes en
la leche tambin influye mucho en la velocidad de decoloracin, sobretodo los
leucocitos.
Material

Tubos de ensayo con tapones estriles.

Bao mara estufa a 37C.

Pipetas graduadas

Reactivos

Solucin de azul de metileno. Preparar una solucin madre diluyendo

unos gramos de azul de metileno en alcohol de 96 hasta conseguir la
saturacin.

Para preparar la solucin de trabajo tomar 2.5 mL de la solucin madre y

adicionar 97.5 mL de agua destilada estril.

Procedimiento

Agitar la leche y agregar 10 mL de leche a un tubo de ensayo.

Aadirle 0.5 mL azul de metileno, evitar el contacto con la leche.

Tapar los tubos e introducirlos en bao mara a 37C.

Realizar dos ensayos simultneos para cada muestra.

Leer los resultados al cabo de 10 minutos y a la hora.

Observaciones e Interpretacin

La presencia de microorganismos en la leche y por su accin reductora, se

produce una modificacin del color del azul de metileno, pasando de color azul
intenso a azul claro, pudiendo desaparece totalmente de acurdo a la carga
microbiana presente. Una leche con un contenido bajo en microorganismos, no
modifica el tinte azul del colorante o tarda mucho tiempo en modificarlo. Ser
considera que en la leche natural fresca el tiempo de decoloracin del
colorante en la prueba de la reductasimetra debe ser superior a las dos horas,
mientras que en la certificada debe ser superior a las cinco horas, dada la
mayor calidad higinica de los productos obtenidos en las granjas diplomadas.

METODOLOGA
MATERIAL
Solucin de azul de metileno al 1%.
Tubos de ensayo con torunda y capuchn estriles.

1 vaso de pp.
1 pipeta graduada de 10 ml estril a 110 C.
1 pipeta graduada de 5 ml. estril a 110 C.
EQUIPO
Estufa
PROCEDIMIENTO
1. En un tubo estril se colocan 5 ml de leche se le aaden 10 gotas de
azul de metileno, se tapa con una torunda de alcohol e invertir el tubo una o
dos veces para mezclar la leche con el colorante.
2. Se i n cu b a a 38 C e n l a e stuf a.
3. Se efectan observaciones cada 15 minutos durante 7 horas,
anotando el porcentaje de decoloracin y el tiempo que tarda en ser
decolorado al azul de metileno.
INTERPRETACIN DE RESULTADOS
Se pueden calcular aproximadamente los resultados de la prueba del azul del
metileno de la siguiente forma:

Tiempo de decoloracin

5 horas
2 a 4 horas
Menos de 2 horas

Nmero
estimado
d e bacterias por mL
100 000 a 200 000
200 000 a 2 000 000
2 a 10 millones

Calidad de la leche

Buena
Buena a regular
Mala

RESULTADOS:
Tiempo de decoloracin:_________________________

4.1. PRUEBA DE LA REDUCTASA.

En un tubo de ensayo, grande y estril, se vierten aspticamente 20 ml de
leche (dentro de las 4 horas siguientes a la extraccin de la muestra) y 1 ml de
solucin de azul de metileno, obtenida por mezcla de 5 ml de su solucin
alcohlica saturada con 195 ml de agua. Se tapa el tubo y se calienta 5 a
37C, luego se invierte varias veces para asegurar la distribucin uniforme de

la crema y se incuba a 37-38C en posicin vertical, invirtiendo cada media

hora y protegido de la luz solar o elctrica. Se mide el tiempo desde que se
inicia la incubacin hasta que por lo menos los 4/5 de la leche se han
descolorado. La leche cruda y la pasteurizada deben resistir mas de 5 horas
sin descolorarse y la destinada a la pasteurizacin, por lo menos 3 horas.
Segn otra tcnica, se colocan en un tubo con tapa atornillada (en las Pruebas
de reductasa todo el material usado debe ser estril) 10 ml de leche y 1 ml de
una solucin de 1 tableta con 8,8 mg de tiocianato de azul de metileno en 200
m1 de agua destilada estril. El tubo, llevado a 36C, se tapa y se invierte 3
veces. Si despus de 30 minutos de incubacin a 36C la mezcla sigue azul,
se sigue 1, 2 o ms horas hasta que 4/5 del volumen estn descolorados.

PRUEBA DE ALCOHOL
Alcohol

PRUEBA DEL ALCOHOL

Fundamento
Cuando se aade a la leche una cierta cantidad de alcohol etlico se produce
una deshidratacin, parcial o total, de ciertos coloides hidrfilos, que puede
desembocar en su desnaturalizacin, y con ello a la prdida de su equilibrio y
floculacin. Este resultado slo se alcanza con un cierto grado alcohlico de la
mezcla final, por debajo del cual las leches trmicamente estables no floculan,
mientras que la leche anormal, esto es la trmicamente inestable, flocula. Todo
sucede como si existiera un paralelismo entre la resistencia al calentamiento y
la estabilidad en presencia del alcohol. Es posible, por consiguiente, traducir en
grado alcohlico la resistencia necesaria a un procedimiento dado de
calentamiento. Por lo que todas las leches estables en presencia de esta
cantidad de alcohol resistirn el calentamiento correspondiente.
Basndose en este principio se ha ideado un mtodo simple de control o de
seleccin, que consiste en mezclar de golpe volmenes iguales de leche cruda
y de una solucin acuosa de alcohol etlico de concentracin conocida. La
eleccin de esta ltima vara segn la modalidad de calentamiento
(pasterizacin, esterilizacin, etc.) a que ha de someterse la leche. La mezcla

se agita en fro y se observa, preferentemente despus de haberla extendido

sobre una superficie de color oscuro o negra. Si no se produce floculacin
alguna, la leche resistir perfectamente el calentamiento correspondiente al
grado de la solucin alcohlica. Si se observa floculacin, la leche no se
mantendr estable durante el calentamiento. La concentracin de la solucin
alcohlica, generalmente fijada a 68% cuando se ensayan leches para la
pasterizacin, y debe elevarse hasta 72 o ms (a veces hasta 74) cuando se
trata de seleccionar leches para la esterilizacin. La mayor frecuencia de
reacciones positivas con leche normal, excluye el empleo de etanol ms
concentrado para realizar esta prueba.
Material

Pipetas de 2 mL y de 5 mL.

Tubos de ensayo de 10 mL.

Reactivos

Alcohol de 68 (se prepara llevando 72 mL de alcohol etlico neutralizado

de 95 hasta 100 mL con agua destilada).

Alcohol de 72 (se prepara llevando 76 mL de alcohol etlico neutralizado

de 95 hasta 100 mL con agua destilada).

Procedimiento

Poner en dos tubos de ensayo 2 mL de leche y aadir 4 mL de alcohol a

68 y de alcohol 72, respectivamente.

Una vez cerrado invertir varias veces el tubo de ensayo para permitir
una buena homogenizacin de la muestra.

Observaciones e Interpretacin

Las leches cidas inestables en presencia de calor, se coagulan en la prueba

del alcohol. Las leches con un equilibrio salino incorrecto o al menos la mayora
de stas, se coagulan en las mismas condiciones. Conviene sin embargo,
subrayar que el paralelismo entre la estabilidad trmica y la inestabilidad en
presencia del alcohol slo se da en el caso de leches cuyo equilibrio salino
queda destruido por un exceso de cationes (particularmente leches demasiado
ricas en calcio). En cambio, las leches cuya inestabilidad trmica depende de
un exceso de aniones se mantienen estables en la prueba del alcohol, pero
estas leches son sumamente raras y en la prctica puede utilizarse esta prueba
para eliminar aquellas con un equilibrio salino incorrecto. Las leches que
contienen un exceso de albmina por causas fisiolgicas (como por ejemplo los
calostros) patgenas (en el caso de las mastitis), se coagulan siempre cuando
se les aade alcohol, incluso cuando su equilibrio cido-base es normal y
cuando no han sufrido fermentacin lctea.
Aunque no existe siempre una correspondencia absoluta entre la inestabilidad
trmica y la inestabilidad al alcohol (ya que se trata de procesos diferentes),
esta prueba permite descubrir una gran mayora de las leches que no podran
soportar el calentamiento en general ni la esterilizacin en particular, ya que
incluso algunas muestras de leche fresca, normales en todos los aspectos dan
a veces un resultado positivo.
PUNTO CRIOSCOPICO
(Crioscopo)
Punto Crioscpico
Punto de congelacin (de la leche). Su determinacin constituye uno de los
procedimientos ms exactos para averiguar su posible adulteracin con agua
(aguado).
La adicin de agua a la leche altera el punto de congelacin de sta, al diluirse
las
concentraciones de los compuestos disueltos en el agua de la leche (lactosa,
cloruros). El descenso del punto de congelacin es proporcional a la
concentracin de solutos en el agua; dando lugar, la adicin de agua, a una
disminucin de la concentracin de solutos.
Es necesario establecer, previamente, el valor promedio del punto de
congelacin de la leche normal en la regin donde se produce la leche a
analizar.

Siendo:
A: porcentaje de agua aadida
PC1: El punto de congelacin de la leche normal
PC2: El punto de congelacin de la leche analizada
Considerando 520, el punto cero.
Punto Crioscopico dentro del rango 0,530 a 0,570

TECNICAS DE ANALISIS PARA DETERMINAR PROPIEDADES QUMICAS

HUMEDAD
a) Dean Stark
Destilacin directa o destilacin azeotrpica

Alimentos o homogneos, voluminosos.

Fue inventado por E.W. Dean y D.D. Stark en 1920 para determinar el
contenido de agua en el petrleo.
El mtodo presenta un precisin de 0.1 ml

Fundamento: consiste en realizar una destilacin a reflujo con solventes no

miscibles con el agua, de mayor punto de ebullicin y menos peso especfico
que esta (ej. Tolueno, heptano, xileno).

Material a utilizar:
1) Papel de filtro.
2) Soporte.
3) Nueces y pinzas.
4) refrigerante.
5) Colector con llave de tefln graduado.
6) Matraz fondo redondo.
7) Soporte para apoyo del matraz.
8) Mangueras para entrada y salida de agua.
9) Manta calefactora.
10) Disolvente n-heptano.--> voltil de punto de ebullicin prximo al del
agua, e inmisible con la misma, esto quiere decir que no se puede mezclar con
el agua.
Tambin se pueden usar tolueno y xileno.
11) Pera, pelada y pesada 5 gramos=mililitros.
12) Perlas de vidrio para introducir dentro del matraz.
13) Balanza analtica.
14)Clips. Para sujetar el refrigerante y el colector.
15) Grafito para colocar en las uniones de los tubos.
Procedimiento:
1) Pesar 5 gramos de alimento y se trocea, (el alimento tiene que estar
pelado).
2) El alimento va al matraz de fondo redondo.
3) Se coloca con el alimento el n-heptano que segn el procedimiento tiene
que
ser 120 ml. (observar bien el material que no tenga fisuras).
4) Se introducen en el matraz las perlas de vidrio o trozos de plato poroso o
pedazos de porcelana. (Para estabilizar la ebullicin y el movimiento brusco
que
esto provoca).
5) Comienza el proceso de destilacin, cuando los vapores del disolvente al
alcanzar la temperatura de ebullicin arrastran al agua y al enfriarse ambos
condensan y se separan.
6) Este enfriamiento es a causa del movimiento de agua circulante, al ingresar
al
refrigerante, y provoca la separacin del n-heptano con el vapor de agua
que
sale del alimento.
7) ste es recogido en el colector separndose del disolvente, y mostrando una

marcada diferencia de color (agua transparente, disolvente orgnico un color

turbio que denota la separacin) disolvente queda por encima del agua pues
es
menos denso que ste.
8) El proceso se da por concluido cuando el nivel de agua recogido en el
vstago
permanece fijo.
9) Hacemos la diferencia tomando el dato recogido del vstago.
Ejemplo: Si el dato recogido es 3,80ml--> el procedimiento es as :
5,00 ml es a 100%
3,80 ml es X % = 3,80x100/5= 76%
- Este 76 % es la cantidad de agua recogida en 5 miligramos de pera pelada10) Cmo el agua se puede separar bien del disolvente este se puede volver a
reutilizar.
Clculos:

%de humedad=

(V +0.1)
100
P

Dnde:
V= Volumen de la muestra (mL)
P= Peso de la muestra (g)

CENIZAS (KLEMM)
Mtodo por incineracin.
Fundamento: se basa en la destruccin de la materia orgnica presente en la
muestra por calcinacin dejando solo la materia inorgnica.
Material, insumos y equipo:
1. Balanza analtica, sensibilidad 0.1 mg
2. Crisoles o cpsulas de porcelana, slice o platino
3. Desecador con deshidratante adecuado (slicagel con indicador, oxido de
calcio
u otro)

4. Mufla regulada a 550 25 C

5. Material usual de laboratorio.
6. Perxido de hidrgeno al 30%
Procedimiento:
1. Efectuar el anlisis en duplicado
2. Pesar al 0.1 mg en una cpsula previamente calcinada y tarada (m0) 2
gramos de muestra homogeneizada (m1).
3. Pre calcinar previamente la muestra en placa calefactora, evitando que se
inflame, luego colocar en la mufla e incinerar a 550 C por 8 horas, hasta
cenizas blancas o grisceas. Pre enfriar en la mufla apagada y si no se logran
cenizas blancas o Grisceas, humedecerlas con agua destilada, secar en el
bao de agua y someter nuevamente a incineracin.
4. Dejar enfriar en desecador y pesar (m2)
5. Mezclar cuidadosamente y completamente la muestra con la arena,
mediante la
varilla de vidrio.
6. Determinacin de las cenizas en una mufla a temperaturas de 500 y 600C.
7. El agua y sustancias voltiles son evaporadas. Mientras que las orgnicas
son incineradas en presencia del oxgeno del aire para producir CO2 y xido de
nitrgeno, la mayora de los minerales son convertidos a xidos (Sulfato,
fosfato, cloruro y silicato).
Clculo

Dnde:
m3m 1
%ceniza=
x 100
m1
= peso
m2en vaco del vidrio (g)
m2

CARBOHIDRATOS (Lane y Eynon)

= peso de la muestra (g)

Determinacin de azucares reductores y totales.

m3

= masa de la capsula (g) mas la muestra despus del secado

Fundamento: Las muestras se someten a una hidrolisis acido fuerte para

desdoblar los almidones y obtener glucosa. Antes de su anlisis, la muestra
debe diluirse.

Reactivos:
1. Solucin de Fehling A (34,639 g de CuSO45H2O en 500 ml de agua)
2. Solucin de Fehling B (173 g de tartrato de sodio y potasio, y NaOH en 500
ml de agua)
3. Azul de metileno (1%)
4. Solucin patrn de glucosa al 1%
5. Solucin diluida de glucosa (50 mg/ml), preparada a partir de la solucin
patrn de glucosa (1%)
6. Solucin de acetato bsico de plomo al 30%
7. Oxalato de sodio o potasio en polvo
8. Solucin de HCl 1:1
9. Solucin de NaOH 6 N.

Procedimiento:
A.- Estandarizacin de la solucin de Fehling:
1. Colocar la solucin diluida de glucosa en una bureta.
2. Colocar en una fiola de 250 ml 5 ml de solucin de Fehling A y 5 ml de
solucin de Fehling B. Aadir 2 o 3 gotas de solucin de azul de
metileno.
Diluir con aproximadamente 20 ml de agua destilada y agregar perlas
de
vidrio.
3. Llevar a ebullicin la solucin de Fehling y agregar lentamente la
solucin
de glucosa sin dejar de calentar, hasta que desaparezca la coloracin
azul.
En el momento en que desaparece el color del indicador, en los bordes
del
fondo de la fiola se puede observar cierto tono rojizo.
Nota: durante todo el tiempo en que se aade la solucin de glucosa, la
solucin
de Fehling debe mantenerse en ebullicin.
B.- Preparacin de la solucin clarificada de azcares:
1. Pesar una cantidad de muestra tal que en la solucin final clarificada, la

concentracin de azcares reductores sea de 2 a 5 mg/ml (para gastar

entre
10 y 25 ml de dicha solucin por cada 10 ml de solucin de Fehling).
2. Homogeneizar la muestra con 50 ml de etanol al 80% (v/v) y traspasar
cuantitativamente a un matraz aforado de 250 ml; aforar con etanol
(80%),
mezclar bien y filtrar.
3. Tomar una alcuota de 25 ml de la solucin filtrada y colocarla en una
matraz aforado de 250 ml. Diluir con 50 ml de agua destilada y aadir unos
pocos mililitros de solucin de acetato de plomo (30%), hasta lograr la
precipitacin completa (en el caso de jugos, pulpas y mermeladas de frutas
es
suficiente aadir 1 o 2 gotas de la solucin de acetato de plomo al 30%).
Mezclar bien y filtrar.
4. Agregar al filtrado oxalato en polvo en pequeas porciones (una cantidad
muy pequea tomada con la punta de una esptula para evitar el profusin
de
oxalato) hasta eliminar el exceso de acetato de plomo. Mezclar y filtrar
descartando los primeros mililitros. El filtrado debe quedar perfectamente
transparente.
C.- Determinacin de azcares reductores (originalmente presentes):
1. Tomar una alcuota de 25 ml, colocarla en un matraz aforado de 100 ml,
aforar con agua, mezclar bien y colocar la solucin en una bureta. Colocar
en
una fiola de 250 ml 5 ml de solucin de Fehling A y 5 ml de solucin de
Fehling B.
2. Aadir 2 o 3 gotas de solucin de azul de metileno. Diluir con
aproximadamente 20 ml de agua destilada y agregar perlas de vidrio.
Llevar a ebullicin la solucin de Fehling y proceder igual a como se hizo
durante la estandarizacin de la solucin de Fehling.
D.- Determinacin de azcares totales:
1. En un vaso de precipitados de 100 ml, colocar una alcuota de 25 ml de
solucin clarificada.
2. Agregar 5 ml de solucin de HCl (1:1) y calentar a 70 C durante 5 minutos.
3. Enfriar a temperatura ambiente y con ayuda de un potencimetro llevar a
pH 8,2 utilizando una solucin 6N de NaOH (en caso de no disponer de un
potencimetro,
aadir 2 o 3 gotas de fenolftalena y titular lentamente
con la solucin de hidrxido de sodio hasta el cambio de viraje del
indicador, luego aadir lentamente, gota a gota HCl (1:1) hasta la
desaparicin del color rosado). Una vez alcanzado el pH indicado, pasar la
solucin cuantitativamente a un matraz aforado de 100 ml, aforar con
agua, mezclar bien y colocar la solucin en una bureta.
4. Colocar en una fiola de 250 ml 5 ml de solucin de Fehling A y 5 ml de

solucin de Fehling B. Aadir 2 o 3 gotas de solucin de azul de metileno.

Diluir con aproximadamente 20 ml de agua destilada y agregar perlas de
vidrio. Llevar a ebullicin la solucin de Fehling y proceder igual a como se
hizo durante la estandarizacin de la solucin de Fehling.
Nota: los azcares no reductores son calculados restando al contenido de
azcares totales, el contenido de azcares reductores. Para convertir este
valor
en contenido de sacarosa, se debe considerar la suma de
los pesos moleculares de la glucosa y la fructosa (360 g/mol) y el de la
sacarosa (342 g/mol).
Clculos:

azucar ( mg ) por 100 ml de disolucion=

factor x 100
valoracion(ml)

PROTEINA (Micro-Kejendhal)

 TECNICAS DE ANALISIS PARA DETERMINAR PROPIEDADES

FISICOQUIMICAS.
DENSIDAD
Lactodensmetro
Determina la densidad de la leche en g/mL y oscila entre 1.028 1.034 g/mL

PH (POTENCIONETRO)
Se basa en la medicin electromtrica de la actividad de los iones
hidrogeno presentes en una muestra.

ACIDEZ (TITULACION)

Consiste en determinar la acidez por medio de una titulacin acido-base

con una solucin de lcali estandarizado, expresando los resultados de la
acidez titulable como el equivalente en masa de cido ctrico.

Acidez titulable
La acidez titulable corresponde al nmero de mililitros de solucin 0.1N de
NaOH, necesarios para neutralizar 100ml de muestra. El grado de acidez
corresponde a la suma de todas las sustancias de reaccin cida contenidas en
la leche.

TECNICAS DE ANALISIS PARA DETERMINAR PROPIEDADES

TERMODINAMICAS DEL MANGO.
ACTIVIDAD DE AGUA (HIGROMETRO)

El primer higrmetro fue inventado por el fsico francs Guillaume

Amontons. ste lo present en 1687 en la Academy of Sciences,

Se determina a partir del contenido de humedad de la muestra en
equilibrio (bajo condiciones de vacio).
Clculos:

AW =

p
p0

Donde:
p: presin de vapor de agua en la sustancia
p: presin de vapor del agua pura a la misma temperatura.