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UNIVERSIDAD NACIONAL DEL NORDESTE

Comunicaciones Cientficas y Tecnolgicas 2003


Resumen: E-068

Caracterizacin del veneno de Philodryas patagoniensis


del Nordeste de Argentina.
Peichoto, Mara E.1 - Leiva, Laura C.1 - Acosta, Ofelia2
Maruak, Silvana2 - Ruz, Raquel2 - Teibler, Pamela2
1. Ctedra de Qumica Biolgica I - Facultad de Cs. Exactas y Naturales y Agrimensura - UNNE.
Av. Libertad 5450 - (3400) Corrientes - Argentina.
E-mail: lcleiva@exa.unne.edu.ar
2. Dpto. de Clnicas - Facultad de Cs. Veterinarias - UNNE.
Sargento Cabral 2139 - (3400) Corrientes - Argentina.
Tel./Fax: +54 (03783) 425753 / 420854 - E-mail: patmed@vet.unne.edu.ar
ANTECEDENTES

Se conoce muy poco sobre la composicin y actividades biolgicas del veneno de Philodryas patagoniensis. Se
sabe que es una culebra opistoglifa que se adapta fcilmente a varios ambientes, incluso peridomiciliarios, gracias a que
acepta una variada alimentacin. Los ejemplares adultos llegan a medir ms de un metro de longitud. Su distribucin
geogrfica abarca: Brasil, Bolivia, Paraguay, Argentina y Uruguay (Peters and Orejas-Miranda, 1970; Rocha and
Molina, 1987). Es semiarborcola (Rocha and Molina, 1987). Segn Sazima and Haddad (1992), puede tambin ser
terrcola, siendo bastante comn encontrarla en lugares descampados.
Reportes de mordeduras en humanos por esta culebra son escasos (Fowler and Salomo, 1994; Nishioka and
Silveira, 1994; Araujo and dos Santos, 1997).
Al igual que en los casos de mordeduras por P. olfersii, los signos y sntomas locales producidos por
mordeduras de P. patagoniensis pueden ser confundidos con los producidos por mordeduras de especies de Bothrops, lo
que es necesario evitar para impedir la aplicacin del antiveneno especfico, que podra desencadenar efectos
perjudiciales sobre la salud del individuo (Nishioka and Silveira, 1994).
No habiendo estudios previos sobre la composicin del veneno de Philodryas patagoniensis, en este trabajo se
presenta la caracterizacin del veneno de esta culebra que habita la regin nordeste de Argentina.
MATERIALES Y METODOS

Veneno de Philodryas patagoniensis


El veneno se obtuvo a partir de serpientes adultas (90 120 cm de longitud) del Serpentario del Zoolgico de
la ciudad de Corrientes.
La extraccin del veneno se realiz introduciendo una micropipeta de 100 l en cada colmillo, siguiendo el
procedimiento de Ferlan et al. (1983). El veneno crudo fue desecado, homogeneizado y conservado a -20 C. Para la
realizacin de los ensayos, el veneno se disolvi en solucin salina amortiguada con fosfato 0.1 M (pH 7.2). La pequea
cantidad de material insoluble, que puedo formarse, se separar por centrifugacin, obtenindose un sobrenadante
lmpido que se destin para los ensayos.
Estimacin de la concentracin de protenas
El contenido de protena fue estimado a partir de la medida de la absorbancia a 280 nm en una cuba de 1 cm,
asumiendo que la absorbancia de 1 mg/ml de veneno crudo es de 1.183.
Caracterizacin del veneno: -Ensayos in vitro
Actividad proteoltica
La actividad proteoltica fue determinada sobre casena de leche bovina (Fluka Biochemika), mediante una
modificacin del mtodo de Friedrich y Tu (1971) como descripto por Lomonte y Gutirrez (1983). El procedimiento
realizado fue el siguiente: a 2.0 ml de solucin de casena al 1% en solucin salina amortiguada con fosfato 0.1 M (pH
7.2) se le aadi 1.0 ml de solucin de veneno de concentracin determinada. La mezcla se incub a 37 C durante 30
minutos, y la reaccin se detuvo mediante la adicin de 4.0 ml de cido tricloroactico al 5%. Luego de un perodo de
30 minutos a temperatura ambiente, los tubos se centrifugaron, y la absorbancia del sobrenadante se determin en un
espectrofotmetro Cam Spec M330, empleando una longitud de onda de 280 nm. Se utiliz un blanco en el cual fue
omitida la solucin de veneno. La actividad proteoltica se expres en unidades/mg, para lo cual se dividi el cambio de
absorbancia en 30 minutos por los mg de veneno presentes en el tubo, multiplicndose la relacin anterior por 100.
Retraso del tiempo de coagulacin de Trombina
A 200 l de fibringeno humano 4 mg/ml (fibringeno humano tipo I, Sigma) se le adicionaron alcuotas de 50
l de soluciones conteniendo las siguientes cantidades de veneno: 4.65, 9.3 y 18.6 g. Las mezclas fueron preincubadas a 37 C durante 10 minutos. Luego se agreg, a las mezclas de reaccin, 50 l de trombina humana (Sigma)
10 NIH unidades/ml; y los tiempos de coagulacin fueron registrados con un cronmetro (Assakura et al., 1994).

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Actividad fibrinoltica
Se trabaj con un cogulo de fibrina obtenido a partir de mezclas de plasma de cinco carneros, empleando
citrato de sodio como anticoagulante. El plasma se diluy al 1/2 con el buffer Tris-HCl 0.05 M (pH 7.5), conteniendo
Sulfato de amonio 0.07 M, Cloruro de Sodio 0.09 M y Cloruro de Magnesio 0.69 mM. Se transfirieron 22 ml de la
solucin de plasma/buffer a placas plsticas (13 x 8 cm). Se adicionaron 2.2 ml de solucin de Cl2Ca 0.25 M y 132 l
de trombina humana (Sigma) 10 NIH unidades/ml. Se incub a 37 C por una hora. Se perforaron orificios de 2 mm de
dimetro manteniendo una distancia de 1.5 cm entre un pozo y otro. Se adicionaron 10 l de las muestras
correspondientes en cada uno de los pozos. Se incub por 18 horas a 37 C. La Concentracin Fibrinoltica Mnima
(CFM) fue definida como la concentracin (mg/ml) de veneno que indujo un rea de 12 mm de dimetro (Rojas et al.,
1987).
Electroforesis SDS-PAGE
Se realiz electroforesis del veneno de Philodryas patagoniensis en gel de poliacrilamida en presencia de
dodecil sulfato de sodio (SDS-PAGE), por el mtodo de Laemmli (1970) usando 15% de gel de poliacrilamida. Los
geles fueron teidos con Coomassie Blue R250.
-Ensayos de toxicidad en animales
Potencia letal del veneno
Ratones blancos de la Cepa CF-1 de 18-20 g de peso corporal distribudos en grupos de cuatro, fueron
inyectados por va intraperitoneal con veneno entero, disuelto en buffer PBS (pH 7.2) en dosis que fueron
incrementndose en un factor de 1.5. El volumen inyectado fue de 0.1 ml. Los ratones control, recibieron 0.1 ml de
buffer PBS (pH 7.2). La supervivencia fue observada a las 48 hs y la DL50 (Dosis Letal 50) y sus lmites de confianza
fueron estimados mediante el mtodo de Spearman-Karber (World Health Organization, 1981).
Actividad edematizante
Se utiliz el mtodo de Yamakawa et al. (1976). Grupos de 4 ratones de 18 a 20 g de peso corporal fueron
inoculados en almohadilla plantar drmica con 50 l de solucin conteniendo diferentes cantidades de veneno, el
miembro contrario fue inoculado con 50 l de buffer PBS (pH 7.2). Una hora despus de la inyeccin, los ratones
fueron anestesiados con hidrato de cloral i.p. 300 mg/kg y sacrificados por dislocacin cervical. Luego se cortaron
ambos miembros inoculados para ser pesados en balanza analtica. El edema fue expresado en porcentaje como
incremento de peso del miembro inoculado respecto al opuesto. La Dosis Mnima Edematizante (DME) fue definida
como la menor cantidad de veneno que causa un 30% de incremento en el peso, comparado con el control.
Actividad hemorrgica
La actividad hemorrgica fue cuantitativamente determinada por el mtodo de la piel de Kondo et al. (1960) y
modificada por Gutirrez et al. (1985). Las soluciones a testear (100 l) fueron inyectadas en la piel de la espalda de
ratones. Dos horas despus de la inyeccin, las pieles fueron removidas, y los dimetros de las manchas hemorrgicas
fueron medidos sobre la superficie interna. La mnima cantidad de protena que produjo una mancha hemorrgica de 10
mm2 fue tomada como la Dosis Mnima Hemorrgica (DMH).
RESULTADOS

-Ensayos in vitro
Actividad proteoltica
La actividad proteoltica fue testeada usando soluciones de diferente concentracin del veneno. Los valores del
cambio de absorbancia obtenidos ( Abs 280) fueron graficados en funcin del logaritmo de la concentracin del
veneno. La relacin lineal obtenida (r = 0.992) nos permiti determinar la actividad proteoltica. El veneno de P.
patagoniensis mostr un alto valor de actividad proteoltica (143 U/mg de veneno) cuando fue testeado sobre casena
bovina.
Retraso del tiempo de coagulacin de Trombina
La actividad fibringenoltica del veneno de P. patagoniensis fue estimada mediante el retraso del tiempo de
coagulacin de trombina. La coagulacin de fibringeno por trombina fue significativamente retardada cuando el
fibringeno fue incubado con soluciones de veneno antes del ataque de la trombina. El retraso del tiempo de
coagulacin de fibringeno por trombina fue proporcional a la cantidad de veneno presente en cada solucin. La
cantidad de protena que caus un cambio de 20 a 60 segundos sobre el tiempo de coagulacin de trombina fue de 9.53
g.
Actividad Fibrinoltica
La actividad fibrinoltica fue testeada usando soluciones de diferente concentracin del veneno. Los valores de
los dimetros de los halos de fibrinlisis fueron graficados en funcin del logaritmo de la concentracin del veneno. La
relacin lineal obtenida (r = 0.949) nos permiti determinar la CFM, encontrndose un valor de 1.50 mg/ml.

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Electroforesis SDS-PAGE
Bajo condiciones reductoras y no reductoras, el veneno de P. patagoniensis mostr las mismas cadenas
polipeptdicas constituyentes sobre SDS-PAGE.
Perfiles electroforticos de los venenos crudos de
Philodryas patagoniensis y Crotalus durissus
terrificus.
A- Electroforesis en gel SDS-poliacrilamida 12% del
veneno crudo de Crotalus durissus terrificus (lnea 2),
marcadores de peso molecular (lnea 1). BElectroforesis en gel SDS-poliacrilamida 12% del
veneno crudo de Crotalus durissus terrificus (lnea 3),
veneno crudo de Philodryas patagoniensis
en
condiciones no reductoras (lnea 2), veneno crudo de
Philodryas patagoniensis en condiciones reductoras
(lnea 1).

-Ensayos de toxicidad en animales


Potencia letal del veneno
La Dosis Letal 50 hallada para el veneno de P. patagoniensis fue de 2.93 g/g, limites de confianza del 95 %:
2.31 a 3.71 g/g.
Actividad edematizante
El veneno de P. patagoniensis exhibi intensa actividad edematognica, cuando fue testeado mediante el
ensayo de la almohadilla plantar. Los incrementos porcentuales en peso del pie derecho comparado al izquierdo fueron
evaluados 1 hora despus de la inyeccin del veneno y fueron proporcionales a la cantidad de veneno inyectado; la
relacin lineal obtenida (r = 0.9837) nos permiti determinar la DEM, obtenindose un valor de 0.26 g.
Actividad hemorrgica
El veneno de P. patagoniensis exhibi fuerte actividad hemorrgica cuando fue testeado mediante el ensayo de
la piel. Los dimetros de las manchas hemorrgicas fueron evaluados 2 hs despus de la inyeccin y fueron
proporcionales a la cantidad de veneno inyectado; la relacin lineal obtenida (r = 0.995) nos permiti determinar la
DHM, encontrndose un valor de 0.035 g.
DISCUSION DE RESULTADOS

El veneno de Philodryas patagoniensis estudiado mostr tener una elevada actividad proteoltica sobre casena
bovina. Si comparamos su actividad proteoltica con la correspondiente a la de Bothrops alternatus (20 U/mg) (Ruz et
al., 2001), especie de Bothrops responsable de la mayora de los accidentes ofdicos en Corrientes, podemos deducir que
el veneno de P. patagoniensis es mucho ms proteoltico que el de Bothrops alternatus.
El retraso del tiempo de coagulacin de trombina demuestra que el veneno degrada fibringeno in vitro
volvindolo incoagulable por la trombina. Tambin, a travs de este ensayo, se pudo probar que el veneno no coagula
fibringeno purificado, ya que no se pudo observar la formacin de cogulo durante el tiempo (10 minutos) que el
veneno fue pre-incubado con fibringeno a 37 C. Por lo tanto, el veneno no tiene actividad thrombin-like, la cual
convierte fibringeno a fibrina. Mientras que ensayos realizados con venenos de especies de Bothrops, mostraron
formacin de cogulos, ya que estos venenos poseen enzimas thrombin-like (Gen et al., 1989).
A travs del ensayo en placa, se pudo demostrar que el veneno de P. patagoniensis, adems de degradar el
fibringeno, tambin es capaz de degradar fibrina. Esta actividad tambin se puede evidenciar en venenos de especies
de Bothrops (Gen et al., 1989).
En la electroforesis SDS-PAGE del veneno de P. patagoniensis se observan bandas de PM del orden de 30 a
60 kD, compatibles con protenas de peso molecular detectadas en el veneno de otra especie de Philodryas
(metaloproteasas de peso molecular 47; 45 y 58 kD y serinoprotreasa de 36 kD presentes en el veneno de P. olfersii;
Assakura et al., 1994).
Con respecto a la letalidad, si nosotros comparamos las DL50 de P. patagoniensis y P. olfersii, ambos venenos
exhiben la misma toxicidad (aproximadamente 3 g/g), la cual es comparable a la correspondiente a muchos venenos
bothrpicos (Weinstein and Kardong, 1994).
El veneno de P. patagoniensis mostr tener una actividad edematizante mucho ms grande que la exhibida por
venenos de especies de Bothrops de Argentina: B. jararaca, B. jararacussu,B. neuwiedii y B. alternatus, los cuales
presentan valores de DEM de 0.85 g, 1.5 g, 2.05 g y 4.00 g, respectivamente (Acosta et al, 1998).
Tambin se pudo demostrar que el veneno de P. patagoniensis exhibe una considerable actividad hemorrgica.
La DHM encontrada para este veneno es mucho ms pequea que la correspondiente al veneno de P. olfersii (DHM =
1.2 g) (Assakura et al., 1994). Tambin podemos comparar su actividad hemorrgica con la correspondiente a

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Bothrops alternatus (yarar grande) (DHM = 3.6 g) (Acosta et al., 1998), especie de Bothrops responsable de la
mayora de los accidentes ofdicos en el Nordeste de Argentina. De estas comparaciones, podemos presumir que la
mordedura por esta culebra provocar efectos hemorrgicos importantes sobre las vctimas.
CONCLUSIONES

El veneno de Philodryas patagoniensis exhibi elevadas actividades proteoltica, fibrinoltica, fibringenoltica


y edematizante. Metaloproteasas y serinoproteasas son probablemente las enzimas responsables de tales actividades
biolgicas.
Los resultados ponen en evidencia la toxicidad del veneno de esta culebra, pudiendo ocasionar lesiones graves
en el individuo accidentado.
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