espectroscopa

Contribucin a la determinacin de
carotenoides en piensos mediante
espectroscopia visible
lopez Hernandez Ma J; Simal lozano;
Varela Tato Ma.

. En este trabajo se propone la utilizacin de la espectrofotometra visible para la determinacin

de carotenoides en piensos, tras su fraccionamiento previo mediante cromatografa en
columna.

Introduccin
Los CAROTENOIDES constituyen un grupo importante de compuestos solubles en lipidos, los cuaJes en su mayora, son responsables de los colores
amarillo y rojo de las plantas y animales FENNEMA
(1982).
Segn BADUI DERGAL (1981), estos compuestos participan con la clorofila en la absorcin de la
luz en el proceso de fotosntesis.
En la naturaleza existen en forma libre en el tejido vegetal disueltos en Ipidos pero tambin formando complejos con las proteinas, carbohidratos, grasas, producindose distintos colores y modificando
. la estabilidad segn la interaccin.
.
Deben de dividirse en dos grandes grupos: CAROTENOS y XANTOFILAS (formas oxigenadas de
los carotenos tales como aldehdos, alcoholes, cidos carboxlicos y epxidos).
Los carotenoides son hidrocarburos en los que
la molcula bsica deriva dellSOPRENO que se reDepartamento de Qumica Analtica.

Nu!riCi~n y Bromatologa.

Universidad de Santiago de Compostela.

tcnicas de LABORATORIO. n 139

pite normalmente ocho veces, existiendo isomeros,

a, (3, 'Y. Las unidades de isopreno esta n en el centro
de la molcula y de forma invertida BADUI DERGAL
(1981).
Las unidades de isopreno (fig. 1) permiten explicar el color intenso que va de amarillo al rojo y
prpura BRAVERMAN (1980).
El ms comn de todos estos compuestos es el
(3-caroteno (C40 H56) que posee dos anillos de ionona, unidos a travs de una cadena intermedia isoprenoide con diez dobles ligaduras conjugadas que
contribuyen a la estabilidad y color de los carotenoides. Asi, por ejemplo la epoxidacin o la prdida de
la conjugacin de los enlaces produce colores amarillos, mientras que el cambio hacia rojo se produce
por el aumento de la conjugacin de dobles enlaces.
La diferencia entre los ismeros a y (3 es la posicin de un doble enlace, mientras que el 'Y solo posee un grupo cclico cerrado.
Las xantofilas se encuentran generalmente asociadas a los carotenos, poseyendo una estructura
muy parecida al (3-caroteno, pero con la diferenca
de posseer uno o dos grupos hidroxilos, que pueden esterificarse con varios cidos grasos BADUI
DERGAL (1981) por tanto las x3ntofilas pueden dividirse en dos grandes grupos: monohidroxipigmen-

429

espectroscopa

tos (MHP) Y dihidroxipigmentos (DHP). Ver Figuras

2 y 3.

Parece ser que una de las funciones principales de los carotenoides es la FOTOPROTECCION,
esto es la proteccin de las clulas y tejidos contra
los efectos dainos de la luz, observndose este
efecto no slo en plantas verdes si no tambin en
microorganismos y animales.

1_6. Justificacin de la presencia de los

carotenoides en piensos
El BOE de 30 de Mayo de 1977 recoge la Orden
del Ministerio de Agricultura de 4 de Marzo de 1977
sobre la incorporacin a alimentos para animales,
con objeto de influir en la coloracin de animales o
sus productos, de los PIGMENTANTES relacionados
a continuacin:

''';:-'.) ~:..:l[:,~uES

-Aoo-8'-carotenal
e.::.(er t:dii80 del CidO
carotenoco.

~apo-8'

XANTOFILAS

Capsantna
Citranaxantina (slo en aves)
Cantaxantina
Luteina
Criptoxantina
Violaxantina
Zeaxantina
Hojas de marigol (slo en aves)
Pimentn (slo en aves)

Autorizndose para ellos una cantidad mxima

de 80 p.p.m. (A partir del 14 de Abril de 1986 (BOE
14 abril 86) la cantaxantina tambin est permtida
en salmones y truchas en dosis mximas de 200
ppm.)
Estos pigmentos rojo-anaranjados anteriormen
te descriptos, forman parte de la alimentacin de peces con objeto de obtener lotes de truchas asalmonadas.
El empleo de alimentos secos concentrados y
compuestos es reciente es piscicultura. Se va introduciendo progresivamente despus de haberse de~ .... j-ril.-1' kl .... !-, !p'itmef\~B Sr' :d2.~?r:!'::' ~. 2':30 de ::;;::';-;-C,iL

Parte experimental
Separacin de la muestra. Cromatografa
de columna
Fundamento
-lONON"

~-IONONA

o<.-CAROTENO

Para identificar los carotenoides en piensos, se

emplea un mtodo rpido y sencillo descrito por la
AOAC (1984), basado en la utilizacin de columnas
cromatogrficas tras la extraccin con disolventes
orgnicos.
Material y aparatos

"I

- Columnas: columnas de vidrio de 300 x 12,5 mm

con soporte de lana de vidrio para retener la fase
estacionaria.

l'-CAROTENO

Material de uso corriente en laboratorio.

Reactivos

, eH,
,

eH e - eH

ISOPkENO

Figura 1

430

CH

'

- Acetona PROBUS
- Hexano PANREAC
- Solucin extractan te: Hexano-acetona-alcohol
absoluto-totueno (10:7:6:7).
- Adsorbente 1: Silica Gel 60-Tierra de diato-

tcnicas de LABORATORIO. n 139

I
I

espectroscopa

'O

,
H

ocoe" 1

1i0

rUCOXAIITIIIA
n,hi'I""x'pi,'n",,V> {"'II")

OH
CRIPTOXA){TlJIA

0'

Figura 2

""

LUTEnlA
11 j Ii Idroll ip i """" nt n i ""1')

meas (1:1)
- Adsorbente 11: Magnesia activada-Tierra de
diatomeas (1:1).
- Solucin metanlica de hidrxido de potasio
al 40% p/v: se disuelven 40 g. de potasa en metanOI, se enfria, y se diluye hasta 100 mi con metanol.
- Solucin de sulfato de sodio al 10% p/v: se
disuelven 10 g de sulfato de sodio anhidro en 100
mi de agua.
r]'JY';:'ni8~

a) Carotenos: Hexano-Acetona (96-4).

b) Monohidroxipigmentos (MHP): Hexano-Acetona
(90-10).
c) Dihidroxipigmentos (DHP): Hexano-Acetona
(80-20).
d) Xantofilas totales (XT): Hexano-Acetona Metanol
(80-10-10).
Preparacin de la muestra. Extraccin
Se pesan 2 g de muestra triturada en un matraz
de 100 mi, aadiendose 30 mi de la solucin extractamente y agitando un minuto. Posteriormente, se
realiza la saponificacin en caliente: Se aaden 2
mi de potasa metanlica, se agita 1 minuto y se coloca en un bao termostatizado a 56C durante 20
minutos, mateniendo refrigerado el cuello del matraz para evitar prdidas de solvent.e.
Enfriada la muestra, se deja en la oscuridad una
hora, se aaden 30 mi de hexano y se diluye con
sulfato sdico al 10%, agitando despus. Antes de
efectuar la cromatografa, se deja en la oscuridad
1 hora.
Separacin. Cromatografia en columna
Se ,introduce en la columna en la parte inferior
un tapo n de lana de vidrio, y se le aade absorbente I hasta una altura de 12 cm. Se aplica vacio y se

tcnicas de LABORATORIO. nO 139

0'
, ,

".'0
CAPSAMTIMA

r,,\' i',...,x'

I';~.n"'''ln

(""1')

Figura 3

aade ms adsorbente hasta 7 cm ms. En la parte

superior de la columna se colocan 2 cm de sulfato
de sodio anhidro sobre el adsorbente y se apelmaza.
Para efectuar la separacin de los CAROTENOS,
se pipeten sobre la columna 5 mi de la parte sobrenadante y se coloca la columna sobre el matraz quitasato, aplicando vacio, de forma que caigan 2-3 gotas por segundo. Se aade el eluyente de los carotenos, hasta que la banda de carotenos se recoja
en el matraz. Se determina la adsorbancia inmediatamente.
En la columna quedan las XANTOFILAS; para
eluirlas y separar los MHP de los DHP se procede
de la siguiente forma: sobre la columna cromatognifica se aade el eluyente de los MHp, acetonahexano (10:90), y se aplica vacio. La banda de los
MHP se debe mover a la cabeza de las otras bandas; cuando la elucin de los MHP se ha completado, (25 mi) se determina la absorbancia. Para determinar los DHP, se procede como en el caso anterior, usando como eluyente la mezcla de hexanoacetona (80-20).
Para evaluar las xantofilas totales, se pipetean
5 mi de la parte sobrenadante del matraz que contiene la muestra, sobre 7 cm de adsorbente 11, el uyen los carolenos con hexano-acelona (90-10) y tras

431

espectroscopa

estos las xantofilas totales con hexano-acetonametano (80-10-10) y se completa a 25 mI.

Anlisis cuantitativo:
Mtodo espectrofotomtrico
Fundamento:
Se basa en la determinacin espectrofotomtrica de los carotenoides obtenidos del extracto anterior, por lectura a 436 nm de las fracciones de carotenos, asi como MHp, DHP Y xantofllas totales la lectura se efecta a 474 nm.
Material y aparatos
Espectofotometro HITACHI de doble haz visibleuv, modelo 100-60.
-

Registrador H ITACH I MODELO 561 - 4203.

Cubetas de vidrio de 1 cm. de espesor.

Tabla I
Columna de silicagel-60
tierra de diatomeas
(50:50)

MHP
ppm
1 66
2 55
3 53
4 55
5 69
6 57
7 60
8 63
9 57
X, 59,4
S, 5,2
S, 2,9

Columna de magnesia
activadatierra de diatomeas
(50:50)
XANlDFILAS TOTALES
ppm
63
61
58
57
64
59
61
61
54
X, 59,8

Reactivos
Patrn colorimtrico: 1-fenilazo-2-naftol (SUDAN
1), propuesto por la AOAC (1984).
Solucin stock: se disuelven 0,1241 g. en 500 mi
de acetona-isopropanol (1:1).
Solucin de trabajo: se diluyen 20 mi de solucin stock en 500 mi de acetona isopropanol (1:1).
Procedimiento
Se efecta registro grfico de las soluciones extractivas anteriores, entre 550 y 390 nm, sealando
las longitudes de onda a la que aparece los mximos de absorcin, y determinando la cantidad de
carotenoides presentes en la muestra, por lectura
a las longitudes de onda de 436 y 474 nm segn se
trate de carotenos o xantofilas.

Precisin
Se ha efectuado el estudio de la precisin de ambos mtodos, encontrando los siguientes resultados
en una misma muestra nueve veces como se indica en la tabla. 1.
Cuando se efecta la separacin en columna de
silicagel-tierra de diatomeas en la que se separan
MHP y DHp, la precisin es menor, por lo que se re-

432

comienda efectuar la evaluacin de xantofilas totales, efecutando el anlisis por triplicado.

Muestras
Se han analizado catorce muestras de piensos
de truchas as como cinco de piensos de aves existentes en el mercado.
Los resultados obtenidos aparecen en las tablas
11 y 111.
Mediante el empleo de la columna de
silicagel-60 tierra de diatomeas, se fraccionan las
xantofilas en MHP y DHp, siendo en los piensos de
truchas mayoritarios los MHP y en los de ave, por
el contrario, es mayoritaria la fraccin de DHP.
La baja precisin de este mtodo no lo hace recomendable para la determinacin cuantitativa, si
bien indica la naturaleza de los carotenoides presentes en la muestra.
Por otra parte, el uso de de columna cromatogrfica de magnesia activada-tierra de diatomeas,
y posterior determinacin espectofomtrica seala
que las muestras en las que se han encontrado carotenoides se corresponden con la fraccin de las

tcnicas de LABORATORIO n 139

espectroscopa

Tabla"

Tabla 111

CONTENIDOS EN CAROTENOIDES
DE PIENSOS
FRACCIONES: CAROTENOS, MHP y DHP
COLUMNAS DE SILlCAGEL 60-TIERRA DE
DIATOMEAS

CONTENIDO GLOBAL DE CAROTENOS

Y XANTOFILAS
COLUMNA DE MAGNESIA ACTIVADA-TIERRA
DE DIATOMEAS

XANWFILAS
MUESTRA

CAROfENOS
436 ppm. 474

1
2

:C

::;

a:
f-w
o

(j)

o(j)

zw
:

fB

;;:
w
o

4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19

SUMA
lDTAL
ppm M74 pp.m. pp.m.

0,084 22
0,146 39 0,034
() 2/.1 ':;3
0,024 3
0,071 9 0,029

22
48

53
4

MUESTRA

3
13

vJ

::;

a:
f-W

(j)

o(j)
z

w
:

0,159 42 0,019
0,061 16
0,042 11 0,042 11
0,014
0,020

2 0,018
2 0,018
0,06
0,047
0,031

2
2
8
6
4

16
22
4
4
8
6
4

xantofilas, no encontrndose en ningn caso, valores superiores a los permitidos por la legislacin.

Nota importante
Se recomienda efectuar el anlisis de las muese tras en breve perodo de tiempo, ya que se ha com-

. probado que durante el almacenamiento de las mismas disminuye de manera notable el contenido de
carotenoides.

tcnicas de LABORATORIO. n 139

(j)

;;:

w
o

FRACCION DE
CAROTENO
436
ppm.

FRACCION DE
XANTDFILAS
474
ppm.

1
2

0,093
014'>

25
3~

,j

4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14

0,145
0,012
0,070

60
2
9

0,175
0,057
0,057

46
15
15

15
16
17
18
19

0,026
0,027
0,038
0,037
0,027

3
4
5
5
4

Conclusiones
1 La determinacin espectofotomtrica global
de carotenoides de las muestras se efectua trs su
fraccionamiento en carotenos y xantofilas totales mediante una columna de magnesia activada-tierra de
diatomeas, recomendndose efectuar el anlisis por
triplicado, ya que el mtodo presenta un Cv~5%. La
separacin en MHP y DHP realizada sobre la columna de Silicagel 60-tierra de diatomeas, con un Cv%
muy superior permite obtener datos sobre la presencia de MHP y DHp, que facilitan la interpretacin de

espectroscopa

la cromatografa en capa fina.

2' De las 19 muestras analizadas, correspondientes a piensos de trucha y aves de corral, 5 de
ellas presentan ausencia de stos pigmentos, oscilando los niveles encontrados entre 2 y 60 ppm. no
sobrepasando ninguna de ellas los limites permitidos por la legislacin, que se situa en 80 ppm (excepto contaxantina, 200 ppm de piensos de truchas).

Referencias
-

A.O.A.C. (1984) Oflicial Methods 01 Analysis. Arlington.

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(lupa binocular) KYOWA (Japn) modo SE-3.

BADUI DERGALS (1981) Qumica de los alimentos. Ed.

Alhambra.
.
BOE de 30 de Mayo de 1977. Orden del Ministerio de
Agricultura por el que se actualizan las sustancias incorporadas a alimentos para animales. de 4 de Marzo
de 1977.
BOE de 14 de Abril de 1986. Orden del Ministerio de
Agricultura, Pesca y Alimentacir de 23 de Abril de 1986
sobr~ autori~acjn de sustancias que intervienen en
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BRAVERMAN, J.B.S. (1980) Introduccin a la bioqumIca de los alimentos Editorial Manual Moderno S.A
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'
.
FENEMA, O.R. (1982) Introduccin a la ciencia de los
alimentos. Tomo 111. ED. Reverte. Barcelona.

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Direccin ..
........... Tel.
C.P.

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Provincia

(Los socios de las Asociaciones Astronmicas debern indicar

en el cupn o en carta, /a Entidad a la cual pertenecen),

434

tcnicas de LABORATORIO nO 139