TITULO

EFECTO PROTECTOR DE LOS ESTEROIDES NEUROACTIVOS

PROGESTERONA Y DEHIDROEPIANDROSTERONA EN LA
POBLACIN NEUROGLIAL DEL HIPOCAMPO DE RATAS MACHO
ADULTAS, AFECTADAS POR EL HACINAMIENTO Y EL RUIDO.

NDICE

PG.

RESUMEN

SUMMARY

ANTECEDENTES

PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

18

HIPTESIS

19

OBJETIVO GENERAL

19

OBJETIVOS ESPECFICOS

19

DISEO EXPERIMENTAL

20

MATERIALES Y MTODOS

23

ANLISIS ESTADSTICO

36

RESULTADOS

37

DISCUSIN DE RESULTADOS

58

CONCLUSIONES

70

PERSPECTIVAS

71

BIBLIOGRAFA

72

VII

INDICE DE FIGURAS Y GRFICAS

PG.

Fig. No. 1 Diagrama de flujo

25

Fig. No. 2 Campo de agujeros

29

Fig. No. 3 Laberinto Acutico de Morris

31

Fig. No. 4 Mtodo de Conteo Puntual de Weibel.

35

Fig. No. 5 Recoleccin de la muestra urinaria.

37

Fig. No. 6 Implante Progesterona, Zona CA3 del Hipocampo

48

Fig. No. 7 Grupo Control, Zona CA1 del Hipocampo.

49

Fig. No. 8 Poblacin Microglial en Zona DG del Hipocampo

54

Fig. no. 9 Transformacin Microglial en Zona CA1 del Hipocampo

57

Grf. No.1A Liberacin de Implantes de Progesterona

38

Grf. No.1B Liberacin de Implantes de Dehidroepiandrosterona

38

Grf. No.2A Niveles de Corticosterona en grupos co ntroles

39

Grf. No.2B Niveles de Corticosterona en grupos de hacinamiento

40

Grf. No.2C Niveles de Corticosterona en grupos de ruido

40

Grf. No.3 Prueba de Morris. Cruces con la Platafo rma

43

Grf. No.4 Hole Board (Campo de agujeros). Tiemp o en Zona Central

44

Grf. No.5 Hole Board. Visitas Totales

45

Grf. No.6A Poblacin Astrocitaria en Zona CA1 del Hipocampo

47

Grf. No.6B Poblacin Astrocitaria en Zona CA3 del Hipocampo

47

Grf. No.6C Poblacin Astrocitaria en Zona DG del Hipocampo

47

Grf. No.7A Transformacin Astrocitaria en Zona CA1 del Hipocampo

51

Grf. No.7B Transformacin Astrocitaria en Zona CA3 del Hipocampo

51

Grf. No.7C Transformacin Astrocitaria en Zona DG del Hipocampo

51

Grf. No.8A Poblacin Microglial en Zona CA1 del Hipocampo

53

Grf. No.8B Poblacin Microglial en Zona CA3 del Hipocampo

53

Grf. No.8C Poblacin Microglial en Zona DG del Hi pocampo

53

Grf. No.9A Transformacin Microglial en Zona CA1 del Hipocampo

56

Grf. No.9B Transformacin Microglial en Zona CA3 del Hipocampo

56

Grf. No. 9C Transformacin Microglial en Zona DG del Hipocampo

56

VIII

RESUMEN
Antecedentes: El hipocampo es una estructura sensible al incremento de
glucocorticoides durante el estrs, el cual genera cambios bioqumicos y celulares en
esta estructura que afectan las funciones asociadas a ella, tales como la memoria
espacial y la conducta exploratoria. En este estudio hemos analizado la influencia de
los neuroesteroides progesterona (PROG) y dehidroepiandrosterona (DHEA) sobre los
efectos que el estrs por hacinamiento o ruido tienen sobre los niveles de
corticosterona (CORT), la poblacin y transformacin glial en el hipocampo, y sobre la
memoria espacial y la conducta exploratoria. Metodologa: 90 ratas macho adultas
castradas fueron sometidas a estrs crnico por hacinamiento o ruido durante 10 das,
en presencia de implantes de liberacin prolongada de PROG, DHEA vehculo
(VEHI). Los neuroesteroides liberados y la cantidad de CORT fueron analizados en
muestras de orina mediante cromatografa de lquidos de alta resolucion (HPLC). Se
realiz un anlisis morfolgico de poblacin y transformacin celular en el hipocampo
con microscopa de luz, utilizando anticuerpos dirigidos contra la protena acdica
fibrilar glial (GFAP) para astrocitos y marcaje con isolectina-B 4 para microglia.
Resultados: El incremento en los niveles de CORT debidos al estrs fue inhibido por la
PROG y DHEA liberadas por los implantes. La PROG previno el impedimento en la
habilidad de recordar claves espaciales para ubicar la plataforma en el laberinto de Morris
generados por el estrs. Ambas hormonas inhibieron el incremento en la actividad
exploratoria producido por el estrs, y DHEA increment el tiempo de permanencia en la
zona central del campo de agujeros. La PROG no produjo inhibicin sobre las reducciones
del nmero y transformacin morfolgica astrocitaria y microglial generadas por el estrs.
La DHEA disminuy estos efectos en las reas analizadas, independientemente de las
condiciones de estrs. Conclusiones: Los esteroides liberados desde los implantes

hormonales disminuyeron los niveles de CORT, ejercieron efectos ansiolticos; reflejados

en la conducta exploratoria y preservaron la memoria espacial, frente al estrs. Estos
esteroides tambien inhibieron la astrogliosis y reactividad microglial en las regiones
cerebrales analizadas de los animales estresados.

SUMMARY
Background: The hippocampus is a structure sensitive to high levels of glucocorticoids
during stress response, which generates biochemical and cellular alteration, and changes
in the related behavioral functions, such as the spatial memory and the exploratory
behavior. In this study, we analyzed the influence of the steroids progesterone (PROG) and
dehydroepiandrosterone (DHEA) on the stress-induced changes in the corticosterone
(CORT) level, number and reactivity of glial cells in the hippocampus, the spatial memory
and the exploratory behavior. Methods: 90 male adult castrated rats were exposed to
chonic stress by overcrowding and ultrasonic noise for 10 days. They were previously
implanted with PROG, DHEA or a vehicle (VEHI). Steroids and CORT levels were assesed
in the urine with high performance liquid chomatography (HPLC). The number and
reactivity of cells were measured with light microscopy morphologic analysis, using
antibodys against glial fibrilar acidic protein (GFAP) for astrocytes, and isolectine-B 4 for
microglia. Results: The stress-induced rising CORT level was inhibited by PROG and
DHEA. PROG prevented the stress-induced spatial memory impairing in the Morris Water
Maze test. Both hormones inhibited the stress-induced enhancement of the exploratory
behavior in the Hole Board, but only DHEA incremented the time elapsed in the central
zone of this field. PROG had no effects on the stress-induced reduction in the number and
reactivity of astrocytes and microglia. DHEA caused the more notable effects on the
astrocytic and microglial populations decreasing and reactivity, wthitout a relation ship with
the kind of stress.

Conclusions: Steroides delivered from the hormonal implants caused a diminution of

the CORT levels, exerting an ansiolytic effect manifested by a modified exploratory
behaviour, and also maintained the spatial memory, against stress. Astrogliosis and
microglial reactivity were inhibited too by these steroids, in the examined brain regions

from the stressed animals.

ANTECEDENTES

Estrs y glucocorticoides.
El estrs se define como una condicin en la cual un organismo enfrenta una
situacin adversiva, la cual influye en su percepcin o habilidad para controlar la
presencia o la intensidad de los estmulos adversos (Jeansok y Diamond, 2002). El
estrs activa el eje hipotlamo-pituitario-adrenal (HPA) liberando grandes cantidades
de glucocorticoides (GCs), especialmente si el estmulo es de caractersticas crnicas
(McEwen, 2000).
Algunas funciones relacionadas con el hipocampo como son el aprendizaje, la
memoria y la conducta exploratoria, son modificadas por el estrs, mediante la
activacin de glucoreceptores tipo I (mineraloreceptores) o tipo II (glucoreceptores)
localizados en esa rea (Jeansok y Diamond, 2002). Por consiguiente, el estrs se
relaciona estrechamente con los cambios celulares en el hipocampo y en
consecuencia, con cambios conductuales asociados a este rgano cerebral.
El uso de diversos estmulos adversos sirven como modelo experimental para
generar la respuesta fisiolgica de estrs. El ruido por ejemplo; ha sido ampliamente
utilizado para estudiar el comportamiento animal ante situaciones estresantes
(Mollenauer y cols., 1992), resulta de gran importancia su estudio debido a su impacto
creciente en las actividades cotidianas de los seres humanos (Cohen y Williamson,
1991), ya que al incrementar significativamente los niveles plasmticos de GCs
(Arcana y Navasivayam, 1999) o de la hormona ACTH (Van Raaij y col., 1997), induce
cambios importantes en la regulacin hormonal de los individuos.
Los modelos experimentales con animales sometidos a estrs de tipo social se

han utilizado tambin con frecuencia. Estos modelos parecen ser una analoga mucho
ms vlida de la respuesta al estrs en los h umanos ya que representan situaciones
menos ajenas a nuestra especie (Henry y cols., 1993). Se usan por ejemplo, la
confrontacin a jerarquas sociales, el hacinamiento, las vocalizaciones

ultrasnicas (USVs) como un tipo social de ruido, y los enfrentamientos o peleas con
otros individuos (Blanchard, 1991; Fokkema y col., 1995; McEwen, 2000).
Las vocalizaciones ultrasnicas (USVs) constituyen una especie de ruido social,
ya que son sonidos de alta frecuencia emitidos por los roedores ante diferentes
situaciones. Las USVs de distrs (18-24 KhZ), se han utilizado (producidas por
animales o por dispositivos electrnicos) para generar estrs en ratas (Blanchard y
col., 1991; Commissaris y col., 2000). Tambin como factores sociales estresantes se
han evaluado las condiciones de alojamiento, tales como la mezcla de machos y
hembras en ratas (Klein y col., 1992), el aislamiento y el hacinamiento en ratones (Aioi
y col, 2001) y ratas (Boranic y col., 1982; Csermely y col., 1995).
El hacinamiento, es decir, la convivencia de varios individuos en un espacio
reducido es por su parte una variable til en la in vestigacin con modelos animales, ya
que se presenta con mucha frecuencia en diferentes comunidades, y en las personas
ha sido relacionado como un factor de riesgo para la esquizofrenia (Torrey y Yolken,
1998). En ratas sometidas a estas circunstancias, se ha observado un incremento en
los niveles de los neurotransmisores serotonina y noradrenalina (Boranic y col., 1982).
Sin embargo, para que el hacinamiento produzca efectos fisiolgicos se requiere de un
tiempo de exposicin prolongado. Csermely y col. (1995) observaron que un
hacinamiento de tres meses incrementaba la concentracin intracelular de calcio, lo
cual constituye un marcador sensitivo de la homeostasis en las clulas vivas. Los
efectos de ambos factores fueron estudiados en una investigacin a largo plazo (8 a 14
meses) en la que se analiz la influencia del ruido y el hacinamiento sobre el
aprendizaje y la memoria de ratas; la estimulacin estresante increment estas
habilidades en sujetos de 10 a 12 meses de edad. Sin embargo, cuando los animales
envejecieron mostraron deterioro de estas habilidades (Bubna-Littitz y col, 1981). Estos

tipos de estrs han mostrado incrementos en los niveles de corticosterona (CORT),

siendo el GC ms comn en los roedores (Meerlo y col., 1999).

Asimismo, inducen hiperactividad del eje HPA (Ely y col., 1997), supresin de la
conducta exploratoria en las ratas (Meerlo y col., 1999), e inducen una remodelacin
neuronal del rea CA3 del hipocampo (McKittrick y c ol., 2000).
Efectos del estrs sobre las neuronas.
Los efectos nocivos del estrs sobre las neuronas hipocampales se deben a que
stas clulas poseen abundantes receptores a esteroides adrenales, y particularmente
el hipocampo es sensible y muy vulnerable a los efectos del estrs (McEwen, 2000). El
estrs psicosocial y la inmovilizacin de los animales en espacios reducidos durante el
hacinamiento, producen atrofia despus de 3-4 semanas, y resultan particularmente
afectadas las neuronas piramidales de la regin CA3 del hipocampo. Sin embargo, el
proceso de atrofia puede bloquearse al inhibir la sntesis de esteroides adrenales y los
efectos citotxicos de aminocidos excitadores (Magarinos y col., 1997). Como
resultado del estrs repetitivo, el an lisis de la ultraestructura de las fibras musgosas
terminales de neuronas de la regin CA3 del hipocampo ha revelado una deplecin de
las vesculas sinpticas. As, las fibras musgosas parecen ser las responsables de
producir la atrofia en neuronas CA3, que afecta principalmente a las dendritas apicales,
y posiblemente produce un desensamblaje del citoesqueleto dendrtico (McEwen y
Magarinos, 1997). Con la atrofia de las dendritas apicales se produce dficit
cognoscitivo especfico en el aprendizaje espacial y en la memoria (Magarinos y col.,
1997).
El hipocampo puede resultar afectado bsicamente p or dos formas de
plasticidad estructural en respuesta al estrs; 1) atrofia de las dendritas apicales de la
zona CA3 y, 2) supresin de la neurognesis en el giro dentado. Los glucocorticoides,
los aminocidos excitatorios y lo s receptores NMDA (un sub-tipo de receptores a
glutamato) estn implicados en estas d os formas de plasticidad, ambas son relevantes

para el funcionamiento del hipocampo humano frente a atrofia selectiva, acompaada

por deficiencias en la ejecucin de la memoria declarativa episdica, espacial y
contextual (McEwen, 1999; Kuroda y McEwen, 1998).

Efectos del estrs sobre los astrocitos.

Las clulas de la microglia y los astrocitos desempean importantes funciones
durante el metabolismo normal del cerebro, entre otras funciones permiten mantener la
homeostasis,

al

actuar

como

reservorio

de

substancias

precursoras

de

neurotransmisores y como un sistema de depuracin de productos del catabolismo

neuronal. Estas clulas contribuyen a la respuesta neuronal frente al estrs, y su
activacin excesiva y prolongada se ha propuesto como una de las causas asociadas a
trastornos neurodegenerativos (McEwen, 2000).
La expresin estructural de la protena acdica fibrilar glial (GFAP), determinante
de la motilidad y de la forma astrocitaria, es esencial para la interaccin neuronaastrocito, y depende principalmente de los niveles de corticosterona circulante, ya que
esta protena no est tan relaci onada con otras hormonas adrenales (Zilles y col.,
1991). Su regulacin es fundamental durante la plasticidad glial-neuronal en el proceso
adaptativo del sistema nervioso adulto, frente a las necesidades fisiolgicas (GarciaSegura y col., 1996).
Los glucocorticoides ejercen influencias potentes in vivo e in vitro, sobre la
proliferacin, maduracin, diferenciacin y funciones de los astrocitos (Aizenman y
Vellis, 1987; Kniss and Burry, 1985; Morale y col., 2001; Patel y col., 1983), y ms de
10 tipos diferentes de isoformas de proteinas incluyendo la GFAP, resultan afectados
en los astrocitos por cambios en la CORT (Magnaghi y col., 2000; Nichols, 2003; O
banion y col., 1994). Los efectos de la CORT sobre la expresin de GFAP no estn
mediados nicamente por los mecanismos neuron ales, sino que tambin pueden
ejercerse a travs de la accin directa sobre los receptores astrocitarios a la hormona
(Maurel y col., 2000), en especial por los glucoreceptores o receptores tipo II (Nichols y

col., 1990; Bohn y col., 1994; Crossin y col., 1997). Estas hormonas inhiben la
expresin de genes para GFAP (Crossing y col., 1997; Laping y col., 1994; Nichols y
col., 1990; Ocallaghan y col., 1991), y se ha observado que la adrenalectoma produce
los efectos opuestos (Gould y col., 1992; Krugers y col., 1994). Los glucocorticoides
tambin pueden inhibir la sntesis de DNA en los
6

astrocitos y por lo tanto su proliferacin (Alonso, 2001; Crossing, y cols 1997; Kniss,
1985), aunque este efecto puede ser reversible con PROG y DHEA (Crossin y col.,
1999). Adicionalmente, la CORT impide la capacidad de los astrocitos para retirar
aminocidos excitatorios de las sinapsis, lo cual e xacerba el dao ocasionado por los
mismos (Chou, 1998; Virgin y col., 1991); dificulta el control que ejercen sobre la
homeostasis de sodio y potasio (Lian y Stringer, 2004), y reduce su actividad
fagocitaria (Roldan y col., 1997). Este papel inhibitorio es opuesto al encontrado en
algunos estudios in vitro, en los que se observa un incremento del mRNA de GFAP y
de la tasa de transcripcin de la proteina (Melcangi y col., 1997; Rozovsky y col.,
1995), o incrementos en la proliferacin de astrocitos (Deniselle y col., 1999). Asi
mismo, Maurel y col. (2000) han mostrado un incremento in vivo de la protena GFAP
en el Ncleo Supra Quiasmtico (SQN) y un decrement o de esta en el hipocampo
ante la exposicin a glucocorticoides, lo que sugiere que, las respuestas de expresin
de GFAP pueden ser regionalmente especficas. Recientemente, en nuestro laboratorio
se ha encontrado evidencia de que la exposicin subaguda al glucocorticoide
prednisona (PRED) por implante subcutneo (Gonzlez-Perez y col., 2001) y por
administracin oral crnica (Gonzlez-Castaeda y col., 2002) increment la
reactividad glial en varias regiones cerebrales. Tambin se ha observado alta
reactividad astrocitaria en ratas ancianas (Bjrklund y col., 1985), lo cual puede estar
relacionado con procesos de envejecimiento cerebral asociado a la exposicin
prolongada a glucocorticoides (McEwen, 2000).

La investigacin del estrs psicolgico y su impacto sobre las clulas

astrocitarias es escasa; la mayora de los experimentos se han hecho in vivo o in vitro,
mediante la aplicacin directa de GCs. Sin embargo, recientemente Ritchie y col.
(2004),

encontraron

que

el

estrs

crnico

de

ntensidad

media

redujo

inmunoreactividad de GFAP en ratas en CA1 y CA3, y en el hilus del hipocampo.

la

Efectos del estrs sobre las clulas de la microglia.

Las clulas de la microglia representan la principal respuesta inmune cerebral,
ya que stas responden al dao neuronal a travs de diversos cambios en su
7

morfologa que inducen una hiper-ramificacin, estados reactivos y de macrfagos

cerebrales (Streit y col., 1999).
Aunque las celulas de la microglia poseen receptores para la hormona
liberadora de corticotropina (CRH), (Wang y col., 2002) y a CORT (Tanaka y col., 1997)
que participan de forma muy importante en el mecanismo de activacin del sistema
HPA, el efecto directo de los glucocorticoides sobre la microglia ha sido poco evaluado.
Por ejemplo, se ha observado que la administracin prolongada de CORT en ratas
adultas genera cambios en la proliferacin de progenitores de oligodendrocitos
(Alonso, 2000) y ms recientemente , se ha mostrado que la adrenalectoma (ADX)
genera una activacin de la microglia que puede ser revertida con CORT (Moga y col.,
2005; Nichols y col., 2005). Tambin han sido estudiados otros corticosteroides en
relacin con las transformaciones de microglia. Por ejemplo: la dexametasona genera
cambios en la proliferacin de la microglia ameboide en fetos de rata (Wang y col.,
1998). Adems, se ha ob servado cambios morfolgicos de la microglia con la
administracin neonatal de cortisona, y respecto a la generacin de isquemia (McRae y
col., 1996). En nuestro laboratorio, la administracin crnica de prednisona produjo
cambios en la cantidad de microglia marcada en la corteza prefrontal, estriado e
hipocampo en grupos experimentales tratados con altas dosis del frmaco, en
comparacin con el grupo control (Gonzalez-Castaeda y col., 2002).

La sobreactivacin celular por el estrs crnico produce incrementos en los

niveles de glutamato, algunos estudios han mostrado activacin microglial ante
incrementos de diferentes neurotransmisores (Streit y col., 1999), particularmente ante
la neurotoxicidad por exceso de glutamato (Gehmann y col., 1995) que desequilibra la
homeostasis celular, e incrementa las transformaciones citoplasmticas de la microglia
(Gonzalez-Perez y c ol., 2001). Por ltimo, los efectos de los corticosteroides sobre la

microglia no necesariamente son unidireccionales, pues se ha observado que pueden

actuar sobre stas clulas gliales como estimulantes a travs de mineraloreceptores, y
como inhibitorios a travs de los glucorreceptores (Tanaka y col., 1997) y que la
exposicin in vitro a Gcs durante
8

24 h se relaciona con su inhibicin, pero la exposicin ms prolongada resulta en

excitacin.
Efectos conductuales del estrs.
El aumento de corticosteroides inducido por el estrs produce deficiencias en el
aprendizaje y en la memoria (de Kloet y cols, 1999). En modelos con animales y en los
humanos, dependiendo de la intensidad y duracin, el estrs produce alteraciones del
hipocampo y deficiencias en la memoria (Lupien y McEwen, 1997). Los corticosteroides
son responsables de esta relacin, ya que a travs de ellos los eventos estresantes
generan modificaciones sobre la estructura y la funcionalidad del hipocampo, como por
ejemplo, la atrofia de las dendritas apicales de las clulas piramidales de CA3, lo que
dificulta el aprendizaje espacial (Brown, y col., 1999).

Por ejemplo, se ha descrito que la corticotropina y los glucocorticoides facilitan la

memoria a dosis bajas, pero la impiden a dosis altas (McGaugh y cols, 1995). En
estudios con resonancia magntica de pacientes psiquitricos y seniles en los que
existen anormalidades de corticosteroides se ha observado atrofia selectiva del
hipocampo, acompaada por deficiencias en la memoria declarativa (la capacidad
para recordar hechos o eventos con orden temporal), la memoria espacial (la
capacidad para recordar sitios especficos, recorridos y claves para guiarse en el
espacio) y la memoria contextual (la capacidad para recordar un conjunto de estmulos
como un evento espacial integrado) (McEwen, 2000).

La motivacin para explorar ambientes ha sido otra de las consecuencias de la

alteracin del eje HPA y del hipocampo, los receptores tipo I o MRs estn relacionados
con el comportamiento exploratorio de nuevos ambientes y la conducta en laberintos
acuticos, y los receptores tipo II e stn relacionados con efectos en la consolidacin y

retencin del comportamiento aprendido (Oitzl y col., 1994). Aunque ambos tippos de
receptores se activan con corticosteroides, los tipo I tienen mayor afinidad por ellos y
responden ante niveles normales de estas hormonas, mientras los tipo II se activan
principalmente ante el exceso de corticosteroides. Adems, el

deterioro del funcionamiento hipocampal reduce el aprendizaje, la memoria espacial y

la habilidad para explorar adecuadamente el ambiente (Raber, 1998).
El hipocampo juega un papel importante en las respuestas ante estmulos
novedosos. Al afectarse esta estructura se reduce la tendencia del animal a explorar
flexiblemente su ambiente y perseveran en ellos comportamientos previamente
adquiridos. La incapacidad para reaccionar a estmulos, es debido a los receptores
MRs los cuales estn relacionados con el proceso de seleccin de respuesta, y por
tanto determinan el patrn de conducta generado por un nuevo ambiente.
Se ha observado que los niveles disminuidos de CORT provocan un mayor tiempo
de recorrido de la zona central en un ambiente novedoso y un mayor tiempo de
permanencia en la misma, mientras que los niveles normales de CORT (ocupacin de
MRs) resultan en menores niveles de este patrn de exploracin (Oitzl y cols., 1994).
Sin embargo, un exceso de CORT (ocupacin de MRs y GRs) los vuelve a incrementar.
Al bloquearse los MRs, vuelve a resultar disminucin de la conducta exploratoria
central. En esta prueba, el bloqueo de GRs no tuvo efectos significativos sobre el
patrn de exploracin, tampoco impidi la consolidacin de la informacin espacial, ni
la adquisicin y evocacinde la informacin aprendida, en cambio; el bloqueo de MRs
produjo un patrn de bsqueda alterado, al parecer la funcin de MRs est involucrada
con la eleccin de la respuesta conductual. El bloqueo de ambos tipos de receptores
alter la navegacin para el aprendizaje de lugar (Oitzl y de Kloet, 1992). En general,
los estudios al respecto sugieren que los glucocorticoides, a travs de sus receptores
MR tienen una gran influencia sobre la conducta exploratoria ante eventos novedosos
(de Kloet y col., 1999).
Como puede observarse, el efecto de los GCs en la respuesta frente al estrs

es bastante amplia, esta activacin hormonal interacta de manera compleja a trvs

de neuronas y clulas gliales en el SNC con otro tipo de molculas que han sido
denominadas

neuroesteroides,

glucocorticoides.

10

los

cuales

pueden

funcionar

como

anti-

Origen y efectos de los neuroesteroides sobre el sistema nervioso.

Los neuroesteroides son compuestos sintetizados en el sistema nervioso central
y perifrico, tanto en las neuronas como en las clulas gliales, a partir del colesterol o
de precursores esteroideos importados de fuentes perifricas (Baulieu y col., 2001). En
el sistema nervioso central (SNC) existe como fuente de ellos, una concentracin
elevada de colesterol (Clemens y Weaver, 1985), independientemente de la actividad
sinttica de glndulas endocrinas p erifricas (Hu y col., 1987; Baulieu y Robel 1990;
Akwa y col., 1993a; Kabbadj y col., 1993).
La conversin de colesterol est catalizada por la enzima citocromo P450 scc,
localizada en la membrana interna mitocondrial de los tejidos esteroidognicos, y el
colesterol debe ser trasladado hasta el interior de la mitocondria para que pueda
sintetizarse la pregnenolona, -primera molcula en la sntesis de hormonas esteroides
(Costa y col., 1994; Brown y col., 1979). En diferentes estructuras sus concentraciones
pueden variar de acuerdo a circunstancias ambientales y comportamentales tales
como la presencia de estrs, reconocimiento sexual o agresividad (Baulieu y col.,
2001).
Los neuroesteroides actan mediante el mecanismo cl sico de accin de las
hormonas a travs de receptores nucleares, modulando canales inicos y actuando
sobre receptores en la membrana plasmtica al GABA A, glicina y glutamato (Baulieu y
col., 2001; Majewska y col., 1986; Lambert y col., 1987; Puia y col., 1990; Akwa y col.,
1991; Wu y col., 1990; Wu y col., 1991; Majewska, 1992). Tambin tienen una
influencia importante sobre los receptores sigma1 que modulan la movilizacin
intracelular y el flujo extracelular de calcio, asi como las respuestas mediadas por
NMDA, la liberacin de acetilcolina y la alteracinde sistemas monoaminrgicos. A
nivel comportamental, estos receptores estn involu crados con el aprendizaje y la

memoria,

la

respuesta

de

estrs,

la

depresin,

la

neuroproteccin

la

farmacodependencia (Maurice y col., 2001).

Los efectos regulatorios de los neuroesteroides sobre los receptores a
neurotransmisores constituyen un medio de comunicacin vital entre el cerebro y el
11

resto del cuerpo; origen de numerosos fenmenos psico-fisiolgicos. La sntesis

alterada de esteroides centralmente activos puede contribuir a defectos de la
neurotransmisin, causantes de diferentes trastornos (Majewska y col, 1986; Majewska
1992). En general, pero tambien de manera dependiente del contexto celular, las
formas steres de cidos grasos de neuroesteroides ejercen efectos inhibitorios
mientras que sus derivados sulfatados efectos excitatorios (Baulieu y Robel 1990;
Akwa y col., 1993a; Kabbadj y col., 1993; Baulieu, 1981, 1991).
Han sido descritos numerosos neuroesteroides (Baulieu y Robel, 1990; Baulieu,
1991), pero los principales especies son compuestos polares (Garcia-Segura y col.,
1994), entre los ms importantes estn la pregnenol ona (PREG), progesterona
(PROG) y dehidroepiandrosterona (DHEA), -progenitores de muchos otros esteroides
(Baulieu, 1981).
La DHEA es un esteroide adrenal, su derivado hidroflico sulfatado (DHEA S) es
el ms abundante en la circulacin sangunea de hum anos y primates, y posee gran
actividad en los tejidos diana perifricos como las gnadas, donde sirve como
precursor para la formacin de andrgenos y estrgenos (Ebeling y Koivisto, 1994;
Hennebold y Daynes, 1994; Luu y col., 1995). Adems , la DHEA es conocida por sus
efectos funcionales en el SNC, incluyendo la estimulacin de la memoria y el
aprendizaje, efectos neurotrficos y neuroprotectores (Wang y col., 2001).
Otro de los efectos benficos de los esteroides, particularmente de la PROG, es
su capacidad para inhibir el desarrollo de edema cerebral tras isquemia (Olmos y col.,
1989; Naftolin y col 1993); reducen la permeabilidad de la barrera hemato-cerebral y
bloquean el transporte activo de sodio por capilares cerebrales in vitro (Koenig y col.,
1995; Betz y Coester, 1990a). PREG y DHEA son precursores de hormonas sexuales y
esteroides neuroprotectores, y los efectos de ambas pueden estar mediados

parcialmente por su conversin a testosterona y estradiol gracias a la enzima

aromatasa. Esta enzima es inducida en astrocitos reactivos luego de distintas formas
de lesiones neurodegenerativas, y resulta una produccin local aumentada de
estradiol, que tiene propiedades neuroprotectoras (Veiga y col., 2003).

12

En trminos generales, el sistema nervioso incrementa la produccin de

esteroides como un mecanismo para bloquear condiciones neurodegenerativas. Este
mecanismo es el resultado de la interaccin coordinada entre las neuronas y la glia.
Los esteroides producidos por la glia regulan la funcin sinptica, modulan la ansiedad,
la cognicin, el sueo y el comportamiento, al mismo tiempo que ejercen
neuroproteccin. Adicionalmente, las clulas gliales son diana de los esteroides y
regulan algunos de los efectos de estas molculas sobre las neuronas, incluyendo la
supervivencia y regeneracn (Garcia-Ovejero y col., 2005).
Relacin de los neuroesteroides con las clulas gli ales.
En el cerebro de la rata los astrocitos y oligodendrocitos sintetizan y metabolizan
neuroesteroides (Hu y col., 1987; Akwa y col., 1993b; Kabbadj y col., 1993; Majewska,
1992; Kleinrok y col., 1994; Zwain y Yen, 1999). En el sistema nervioso perifrico
(SNP) las clulas de Schwann tambin sintetizan pregnenolona, independientemente
de la edad y del sexo (Morfin y col., 1992).
La biosntesis de neuroesteroides est regulada po r un complejo receptor
mitocondrial hetero-oligomrico, con sitios de reconocimiento de alta afinidad para las
carboxamidas de isoquinolina, las imidazopiridinas, benzodiacepinas y las 2-arilindolacetamidas (Morfin y col., 1992). Este complejo se expresa abundantemente en
las clulas gliales y tiene un ligando endgenoputativo, el pptido inhibidor de unin a
diazepam, que tambin es abundante en clulas gliales donde estimula la
esteroidognesis (Morfin y col., 1992; Korneyev y col., 1993),
En general, los astrocitos parecen ser las clulas ms importantes en la
expresin de esteroides en el SNC, en especial de PROG y DHEA (Zwain y Yen,
1999). Pueden liberar progesterona y una gran variedad de neuroesteroides a las

clulas vecinas, y ejercen un efecto modulador sobre el sistema nervioso -resultante

de las interacciones neurona-glia. La progesterona, participa de modo muy importante
en la plasticidad sinptica que ordinari amente se produce en el hipotlamo a travs
del ciclo ovrico (Akwa y col., 1993b), y en modular la

13

reorganizacin del citoesqueleto astrocitario en respuesta a otras hormonas gonadales

(Prez y col., 1993; Luqun y col., 1993).
Una vez liberados los neuroesteroides, estos afectan tambin el comportamiento
de las clulas gliales. Se ha observado por ejemplo un efecto inhibitorio de la PROG y
la DHEA sobre los astrocitos, ya que DHEA aplicada de manera crnica y aguda
impide el incremento en la expresin de GFAP, que normalmente se produce por la
denervacin del bulbo olfatorio (Hoyk y col., 2004), adems in vitro, la DHEA disminuye
la proliferacin astroglial (Bolota y col., 1987). Sin embargo, la administracin del
neuroesteroide a ratas recin nacidas, produjo un incremento a largo plazo en el
tamao y la cantidad de astrocitos GFAP-inmunoreactivos en el hipocampo, antes y
despus de la pubertad (Shirayama y col., 2005). Por su parte, la PROG inhibi el
crecimiento astrocitario in vitro (Jung y col., 1992) y se observ inhibicin de
astrogliosis y dficit funcionales luego de lesiones cerebrales (Djebaili y col., 2005),
probablemente a travs de sus acciones sobre la respuesta de clulas inflamatorias
(Grossman y col., 2004) gracias al efecto de varios de sus metabolitos (Ciriza y col.,
2004).
En cuanto a la microglia, la DHEA in vitro tuvo efectos inhibitorios sobre clulas
microgliales y su respuesta inmunolgica (Wang y col., 2001), adems, inhibi la
viabilidad celular de clulas de microglia, en proporcin inversa a la cantidad de
glucosa en el medio de cultivo (Yang y cols., 2000). In vivo; la DHEA redujo la
activacin microglial en el sistema dopaminrgico nigroestriado de ratas (TomasCamardiel y col., 2001). Asimismo, se observ un efecto inhibitorio en algunas de las
protenas sintetizadas, tales como el componente interfern gama de la respuesta
microglial (Bargers y col., 2000) y el factor de necrosis tumoral TNF en astrocitos y
microglia (Di Santo y col., 1996). Por su parte la PROG no inhibi las respuestas

inmunes de la microglia (Bruce-Keller y col., 2000), pero si impidi su transformacin

(Fujita y col., 1996), sin embargo; en estudios anteriores se observ que la PROG no
tuvo efecto sobre cultivos mixtos de astrocitos y microglia, pero inhibi la proliferacin
microglial en cultivos deestas clulas aisladas (Ganter y col.,

14

1992). Finalmente, DHEA y PROG redujeron la acumulacin de tejido glial alrededor de

una lesin en el tejido nervioso (Garcia-Estrada y col., 1999).
Estrs y neuroesteroides.
El medio ambiente esteroideo del cerebro influencia su estructura y su funcin.
Asi pues, el estrs incrementa los niveles de glucocorticoides, y en diferentes regiones
cerebrales la concentracin de neuroesteroides se modifica por su efecto (Majewska,
1992). La alteracin en las concentraciones normales de neuroesteroides o de su
metabolismo provoca a su vez trastornos funcionales y trficos en el sistema nervioso
(Baulieu EE. 1997, 1998; Robel y Baulieu, 1995).
En general, durante el estrs agudo puede observarse disminucin de algunos
neuroesteroides, pero normalmente ocurre un aumento cuando el estrs es prolongado
(Obut y col., 2004). Adems, puede suced er el efecto inverso, ya que algunos
neuroesteroides como la DHEA ejercen un efecto inhibidor sobre el incremento de
CORT producido por el estrs (Obut y col., 2002), en especial sobre el estrs crnico y
no el agudo (Obut y col., 2003).
El incremento de neuroesteroides debido al estrs ha sido observado en PREG
y PROG en la corteza e hipocampo de ratas ante la exposicin a CO 2
(Barbaccia y col., 1994; Shimada y col., 1998), en PREG y ALOP en la corteza frontal
de ratas expuestas a nado forzado (Vallee y col., 2000), en los niveles de PROG central
de crias ante la separacin de la madre en ratas (Kehoe y col., 2000), en PREG pero no
de la DHEA ante estrs psicosocial (Shimada y Yago, 2000), y en los niveles generales
de neuroesteroides ante la combinacin de estrs social crnico y choques elctricos
(Serra y col., 2000).
Adicionalmente, las hormonas del eje HPA, CRH y ACTH incrementaron de

manera significativa los niveles de PREG y DHEA en el cerebro y sangre en ratas

(Torres y Ortega, 2003). Sin embargo, es posible encontrar tambin una relacin
inversa entre los niveles de estrs y de neuroesteroides, ya que se ha observado que,
en ratas jvenes recin destetadas sometidas a estrs por aislamiento social
15

durante 30 das, se produjo un decremento en la concentracin de neuroesteroides en

plasma, corteza e hipocampo, al igual que un incremento en los niveles de CORT y
una disminucin en la funcin de los receptores GABA A (Serra y col., 2000). Los
resultados opuestos pueden obedecer a la utilizacin de diferentes procedimientos
experimentales para la generacin del estrs, sin embargo, lo ms frecuente es la
relacin del estrs con el aumento de neuroesteroides en el SNC.
En relacin al estrs, la DHEA produce efectos neuroprotectivos al disminuir la
neurotoxicidad por anlogos del glutamato y los cor ticoides, posiblemente acta como
antiglucocorticoide (Herbert, 1998), pues se ha observado que protege las clulas
hipocampales en cultivo del dao inducido por estrs oxidativo (Bastianetto y col.,
1999), y del dao generado por la presencia de CORT (Kimonides y col., 1999) y
aminocidos excitatorios (Kimonides y col., 1998) . El efecto anti glucocorticoide, se
infiere tambin de experimentos en los que la DHEA bloquea el incremento en la
actividad de la triptfano hidroxilasa en el mesencfalo y corteza de ratas resultante del
estrs por ruido (Singh y col., 1994); antagoniza por ejemplo los efectos de la
inmovilizacin repetida sobre la prdida de peso corporal, los niveles de GRs en
glandulas adrenales y la generacin de radicales libres (Hu y col., 2000) y provoca
efectos ansiolticos en ratones, en el laberinto elevado en cruz (Melchior y Ritzmann
1994a). En contraposicin, tambin se ha observado que aunque la DHEA fortaleci la
potenciacin primaria hipocampal en ratas sin estrs, no tuvo este efecto benfico en
ratas estresadas (Diamond y col., 1999).

Por su parte, la PROG tiene un papel ansioltico ante diferentes situaciones de

estrs, el incremento en la expresin de mRNA para c-fos luego de estrs por
inmovilizacin fue menor en el hipocampo y corteza de ratas en proestro y estro, en
comparacin con ratas en diestro y ratas machos, lo que sugiere que estas estructuras

son activadas diferencialmente por el estrs, dependiendo de los niveles de PROG

(Figueiredo y col., 2002). Adems; la PROG inhibe de manera confiable las
consecuencias provocadas por la inmovilizacin, efecto que puede bloquearse por los
antagonistas de receptores a GABAA, (picrotoxina y bicuculina), pero no por el
antagonista de benzodiacepinas (flumazenil) (Reddy y Kulkarni, 1996).
16

A pesar de sus acciones ansiolticas ante situaciones de estrs, tambin puede

generar efectos secundarios en individuos controles, esta hormona disminuy el
consumo de alcohol en ratas estresadas por aislamiento social (Mediratta y col., 2003),
y en ausencia de estrs produjo un incremento del consumo total de lquidos.
Adicionalmente, la PROG inhibi la respuesta inmune humoral y celular frente a estrs
por inmovilizacin, pero por si misma suprimi esta respuesta en ratas no estresadas.
Este efecto compensatorio frente al estrs parece estar modulado por su accin sobre
receptores GABAA, pero su accin inmunosupresora requiere un mecanismo
alternativo en los sujetos no estresados (Mediratta y col., 2003).
En trminos generales, el incremento en los niveles de neuroesteroides frente a
situaciones estresantes juega un papel importante en los mecanismos homeostticos
que regulan la inhibicin de los receptores GABA A durante la respuesta de estrs
(Higashi y col., 2005). Sin embargo; la disminucin observada algunas veces en los
neuroesteroides por el estrs, puede deberse a una disminucin en la actividad de el
eje HPA, como un mecanismo para reducir el incremento de GCs (Serra y col., 2004).

17

PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

En los vertebrados, el estrs eleva los niveles sricos de glucocorticoides (GCs)

y estimula el eje hipotlamo hipofisiario (HPA) causando efectos adversos sobre el SN,
evidenciados por una reorganizacin en las regiones que poseen una alta densidad de
receptores a glucocorticoides, como el hipocampo. Las alteraciones cerebrales pueden
ser transitorias o permanentes, segn afecten cerebros inmaduros o adultos
respectivamente. Los efectos son ms severos cuando suceden durante el desarrollo
cerebral temprano y el hipocampo resulta especialmente afectado, puesto que ste
forma parte del sistema de retroalimentacin negativa hacia el eje HPA y est
estrechamente relacionado c on la conducta exploratoria, la memoria explcita,
episdica y la memoria espacial, las cuales se afectan notablemente.

Por lo anteriormente descrito; analizar la reactividad astrocitaria y microglial en el

hipocampo de ratas, como consecuencia de la exposicin crnica a estrs por
hacinamiento o ruido y bajo la influencia protectora de neuroesteroides progenitores
(progesterona dehidroepiandrosterona), liberados desde implantes subcutneos.
Es el motivo del presente estudio en el cual tambin se analizaran las manifestaciones
cognoscitivas; expresadas por la conducta exploratoria, memoria y aprendizaje
espacial.

18

HIPTESIS
Los neuroesteroides progenitores progesterona dehidroepiandrosterona ejercen
efectos neuroprotectores en el hipocampo de ratas estresadas por hacinamiento o
ruido, y estos efectos benficos se manifiestan sobre la citoarquitectura glial y el
comportamiento de los animales.

OBJETIVO GENERAL
Analizar el efecto del estrs por hacinamiento o ruido sobre parametros
conductuales y sobre la citoarquitectura glial en ratas macho adultas.

OBJETIVOS ESPECIFICOS
1

Establecer los efectos del estrs por hacinamiento o ruido sobre el aprendizaje
espacial y la memoria de ratas adultas jvenes, bajo la influencia
neuroprotectora

de

los

esteroides

neuroactivos

progesterona

dehidroepiandrosterona.
2

Analizar los efectos del estrs en presencia y ausencia de neuroesteroides,

sobre la citoarquitectura glial de las zonas CA1, CA3 y DG del hipocampo de las
ratas.

19

DISEO EXPERIMENTAL
Sujetos de experimentacin
Ratas macho Swiss-Wistar adultas con 2 meses de edad y 250 y 280 g de peso.
Grupos de estudio:
a) Grupo 1 (VEHI): ratas castradas con implante subcutneo (sc) de un a cpsula
de silicona con aceite de ssamo (vehculo solo), (n =30).
b) Grupo 2 (PROG): ratas castradas con implante subcutneo (sc) de un a cpsula
de silicona con progesterona (8 mg/rata), ( n =30) (Luqun-S y col., 1993).

c) Grupo 3 (DHEA): ratas castradas con implante subcutneo (sc) de un a cpsula

de silicona con dehidroepiandrosterona, (8 mg/rata), (n=30).
Divididos en subgrupos de 10, los animales fueron sometidos a tres distintas
situaciones durante 10 das:

Control (C): condiciones estndar de mantenimiento y ruido nor mal del bioterio
(30-40 dB).

Hacinamiento (H): alojamiento en 45 cm /rata en condiciones estndar de

bioterio.

Ruido (R): sometidas a estrs por ruido con tonos de ultrafrecuencia de 22 kHz
(USVs) y 80-90 dB de intensidad durante 8 h diarias.

20

Descripcin de variables:

a) Independientes:
Condicin estresante (Hacinamiento o ruido).
Tipo de neuroesteroide liberado desde el implante subcutneo (progesterona
dehidroepiandrosterona).
b) Dependientes:
Conducta exploratoria y memoria espacial.
Citoarquitectura de clulas gliales en las zonas CA1, CA3 y DG del hipocampo de
la rata.

Tipo de estudio:
Experimental
Longitudinal con cortes transversos
Cuantitativo.

21

Criterios de inclusin:
1. Ratas macho Swiss-Wistar con 2 meses de edad y 250-280 g de peso.
2. Ratas que se recuperaron satisfactoriamente de los procedimientos quirrgicos
durante los experimentos.

Criterios de exclusin:
1. Animales que resultaron lesionados y/o que se infecten durante los diferentes
procesos experimentales.

Criterios de eliminacin:
1. Cerebros que no se fijaron adecuadamente durante la perfusin intravascular.

2. Animales en los que se observ alguna patologa durante el proceso de

perfusin.
3. Animales en los que no se localiz la cpsula de silicona en el espacio
subcutneo dorsal, para la liberacin prolongada del vehculo o los esteroides.

22

MATERIALES Y METODOS
Descripcion general del estudio.
Se utilizaron 90 ratas machos adultos Swiss-Wistar jvenes con peso corporal
inicial de 250-289 g, mantenidas con ciclos de luz y oscuridad de 12:12 h, a 22 3 C
de temperatura, humedad relativa del ambiente entre 50 y 55%; alimentadas ad
libitum con dieta balanceada para roedores (Ralston-Rations USA) y agua potable. Se
utilizaron ratas macho para controlar las variaciones en los niveles de esteroides
generados por el ciclo reproductivo de las hembras. Las ratas fueron castradas para
evitar la interferencia de los esteroides gonadales sobre el experimento, ya que
muchos de ellos tienen la misma va metablica y pueden variar los niveles generados
por el implante. Se dejaron pasar 21 das post-castracin antes de iniciar el estudio.
Ese da 21 se recolect la orina total de 6 PM a 8 PM, para determinar los valores
basales de corticosterona, progesterona y DHEA mediante cromatografa de lquidos
(HPLC) (Fig. 1 del diseo experimental).
La totalidad de animales fueron distribuidos en grupos: Implante vehculo
(n=30), 2) implante de progesterona (n=30), 3) implante con DHEA (n=30). El vehculo
de difusin de las hormonas fue aceite de ssamo. En este se diluyeron las hormonas
(8 mg/rata). La mezcla se deposit en el nterior de cpsulas permeables de silicona
implantadas subcutneamente (Gmez-Pinedo U. y col., 2001). El procedimiento
quirrgico de implantacin de las cp sulas de silicona con vehculo o cada uno de los
esteroides se realiz bajo anestesia ligera por inhalacin con cloroformo, tratando de
provocar el estrs mnimo a los animales (Gmez-Pinedo U. y col., 2001).

Divididos en grupos de 10, los animales fueron sometidos a tres distintas situaciones
durante 10 das.

1) Control: 10 ratas de cada tipo de implante estuvieron sometidas a en

2

condiciones de alojamiento de 240cm /rata y con el ruido ambiental del

bioterio.
23

2) Hacinamiento: 10 ratas de cada tipo de implante fueron alojadas en una

2

misma jaula con un espacio de 45 cm /rata y bajo las mismas condiciones

estndar de bioterio.
3) Ruido: 10 ratas de cada tipo de implante fueron sometidas a 8 h diarias
durante 10 das, a tonos de ultrafrecuencia de 22 kHz (USVs) y 80-90 dB de
intensidad. Un da antes y durante todo el periodo de estrs por ruido
Se recolect para todos los grupos orina cada 48 h para la determinacin de la
concentracin de corticosterona por HPLC y los mismos esteroides con el mtodo de
Juricksay y Telegdyde (2000) ligeramente modificado, para luego iniciar los estudios de
comportamiento.
Se determin la ansiedad (comportamientos de autoproteccin), excitabilidad
(cambios en los umbrales de respuesta motora ante la estimulacin novedosa) y
conducta exploratoria (frecuencia y patrones de exploracin del ambiente novedoso)
mediante la prueba del campo de agujeros durante un da (Hole-Board). Al da
siguiente se iniciaron los ensayos para determinar el aprendizaje espacial y la retencin
de memoria, que dur 2 das utilizando elparadigma del laberinto acutico modificado
de Morris (Morris, 1984).
Posteriormente, los animales fueron inyectados con una dosis intra-peritoneal
(ip) subletal de pentobarbital sdico, y se hizo perfusin intracardaca con
paraformaldehdo para fijar su cerebro. Para ello, se hizo pasar solucin salina lavadora
para eliminar el exceso de sangre, seguida por solucin de paraformaldehdo al 4%.
Posteriormente se realiz una craneotoma, se extrajeron los cerebros y se colocaron
en la misma solucin fijadora durante 24 h. Se seleccion el rea del hipocampo til
para los estu dios de microscopa, de la cual se tom una seccin la cual fue
procesada mediante latcnica histolgica convencional (deshidratacin, aclaracin)

hasta su inclusin enparafina, a fin de obtener cortes de 20 m de espesor. Los cortes

fueron destinados al procedimiento inmunocitoqumico con anticuerpos dirigidos para la
identificacin de astrocitos (anticuerpos anti-GFAP), anlisis histoqumico de la
microglia utilizando is olectina-B4 de Griffonia simplicifolia.
24

Diseo experimental

Castracin
21
das

Implantes
(8 mg hormona/implante)

n=30 VEHI

n=30 PROG

da

RECOLECCIN
DE ORINA

n=30 DHEA
7

da

n= 30

da

Condiciones durante 10 das.

10 control
10 hacinamiento
10 ruido

-70C

Prueba del campo de agujeros

Prueba del laberinto acutico de Morris
Perfusin

Anlisis por
cromatografa
de lquidos

Anlisis de
citoarquitectura
microglial

Anlisis de
citoarquitectura
astrocitaria

Figura 1. Diseo experimental en diagrama de flujo.

25

Procedimientos quirrgicos:
1. Castracin:
Los animales fueron anestesiados por va ip con pentobarbital sdico a una dosis
de 50 mg/kg de peso y se colocaron en decbito dors al, en la zona de los conductos
deferentes se hizo una incisin lineal de 1 cm en la piel del escroto de cada testculo,
que se expuls de su bolsa escrotal para liberar el epiddimo; se localiz el paquete
vascular y mediante hemostasia por trombosis se desprendi cada testculo. La herida
se cerr con 2 puntos de seda trenzada 3-0.
2. Implante subcutneo de cpsulas de silicona.
21 das despus de la castracin los animales fueron anestesiados por inhalacin
de cloroformo. Se afeit el dorso y a nivel del espacio interescpulo-vertebral se hizo
una incisin cutnea longitudinal de 1 cm y bajo di seccin roma con pinzas de
mosquito largas, (mediante movimientos repetidos de apertura y cierre) se form un
tnel subcutneo en el cual se coloc una cpsula d e silicona conteniendo el vehculo
o cada uno de los neuroesteroides disueltos en aceite de ssamo. La herida quirrgica
fue cerrada mediante dos puntos separado s con seda 3-0. Al trmino del periodo de
prueba los animales fueron sacrificados por perfusin, asegurando la localizacin e
integridad del implante.
Las cpsulas de silicona fueron elaboradas con un t ubo semipermeable de silicona
(Sani-Tech) de 1.8 cm de longitud, 3.12 mm de dimetro interno y 3.92 mm de dimetro
externo, y rellenados con acite de sesa mo ms los 8mg del esteroide correspondiente,
los extremos fueron sellados con pegamento de silicona de grado mdico (Medical
Adhesive 8919). Con el propsito deasegurar la rpida liberacin de los
neuroesteroides las cpsulas fueron preincubada s a 37 C en solucin salina al 0.9%

(sigma S-9625) con 0.01% de albmina srica bovina para lograr la saturacin de las
paredes y bajo agitacin suave durante 12 h.

26

Cromatografa de lquidos.
La cuantificacin de los neuroesteroides corticosterona, progesterona y DHEA se
realiz a partir de los valores resultantes de una curva de estandarizacin con niveles
conocidos de estas hormonas disueltas en metanol, mediante determinacin
cromatogrfica de sus tiempos de retencin y el re a bajo la curva de sus respectivos
picos. El anlisis de correlacin de las concentraciones del estndar y el rea bajo la
curva de los picos arrojados por el cr omatgrafo, permiti la determinacin de una
lnea del mejor ajuste con una ecuacin lineal cuyos valores de pendiente y cruce con
el eje de las ordenadas sirvieron para convertir los valores del rea bajo la curva de los
picos de las muestras, en valores de concentracin expresados en ng/l. El
procedimiento de extraccin y medicin de los esteroides para cuantificacin de la
corticosterona en orina se llev a cabo siguiendo el procedimiento descrito por
Juricksay y Telegdyde (2000) modificado de la siguiente manera: se hizo pasar 1 ml de
la orina a travs de un cartucho de extraccin C18 (Waters Assoc., Milford, MA USA)
para retener los esteroides, estos fueron eluidos, es decir, extrados del cartucho en
viales de vidrio con tapa recubierta de tefln utilizando 5 ml de metanol, este fue
evaporado mediante una corriente de nitrgeno en bao de 40-45 C y se agreg
tampn acetato pH 4.6. Esta solucin se incub con 50 l de la enzima glucoronidasa
de Helix Pomatia (Merck KGsA, Darmstadt, Germany) a 37 C durante 48 h. Una vez
completada la incubacin esta solucin nuevamente se pas a travs de cartuchos de
extraccin C18 y los esteroides fueron nuevamente eludos con 5 ml de metanol. Por
ltimo se concentr el volumen bajo corriente de nitrgeno hasta 100 l. De esta
muestra se extrajeron 10 l que se introdujeron automticamente a travs de una microi
nyeccin, en el cromatgrafo de lquidos.

Se corrieron las muestras en una columna no polar (Altech) CP SIL 5CB de

30mm x 0.32 x 0.25 m, para aminas, hidrocarburos, pesticidas, fenoles y compuestos
sulfurados. La temperatura fue de 30 C, El tiempo total del corrimiento fue de 35 min.

27

Comportamiento animal.
1. Actividad exploratoria en el campo de agujeros:
Para evaluar la actividad exploratoria de un animal en un ambiente novedoso,
as como la excitabilidad y ansiedad se utilizo el campo de agujeros, el cual es un cubo
hueco de acrlico negro de 60x60x60 cm. 5 cm por encima del piso de la caja est una
plataforma (tabla de agujeros) con 36 aguj eros de 3.5 cm de dimetro, repartidos en
una matriz de 6x6 (ver fig.2). La tabla de agujeros est dividida por una lnea
imaginaria en una seccin perifrica (la lnea de agujeros del permetro de la tabla), y
una central de 4x4 agujeros. Para iniciar la prueba, el animal se puso en el centro de la
tabla de agujeros y durante 10 min. fue video-filmado su comportamiento, para
posteriormente registrar los siguientes parmetros a travs del software del analizador
RatMove (patente en trmite ):

---Tiempo en que el animal permanece en el rea cen tral o en el rea perifrica de la

tabla,
-

Tiempo total de movimiento e inmovilidad,

Nmero de agujeros centrales, perifricos y totales visitados,

Frecuencia relativa de visitas (nmero de visit as por minuto de movimiento).

Distancia recorrida

Velocidad promedio de la distancia recorrida

28

Fig. No.2 Campo de agujeros (Hole Board).

Se consider visitado un agujero cuando la rata introdujo su cabeza hasta que
la superficie de la tabla le ocult los ojos (Lordi y col, 2000). Todos los sujetos
realizaron la prueba el mismo da entre las 9:00 y las 11:00 h.

2. Laberinto acutico de Morris:

Para medir la capacidad del individuo para modificar su comportamiento, a partir
de la experiencia con estmulos espaciales se uso el laberinto de Morris el cual consiste
de una piscina circular con 180 cm. de di metro y paredes con 37 cm. de altura
pintada de negro y dividida en cuatro cuadrantes imaginarios, sta se llen con agua
(20 3 C), hasta una altura de 25 cm. y en su interior fue sumergida una plataforma

de escape cilndrica de color negro con 12.5 cm. de dimetro y 22 cm. de

29

altura (invisible para la rata) y esta tuvo una ubicacin fija en uno de los cuadrantes
durante todo el experimento (Fig. 3). La tarea consisti en que la rata deba nadar en el
laberinto hasta localizar la plataforma, las primeras veces por accidente; sin embargo,
en las sesiones posteriores deba reconocer su sitio de ubicacin para poder
localizarla, en este caso; con la ayuda de indicadores visuales, a manera de claves
espaciales externas. Las funciones cerebrales implicadas para ejecutar esta tarea
dependen bsicamente de la actividad hipocamp al.
Para este estudio se sigui la metodologa descrita por de Quervain, Roozendaal
y McGaugh (1998) con ligeras modificaciones. Los experimentos estn basados en dos
tipos de ensayos; uno de entrenamiento y otro de prueba. El ensayo de entrenamiento
consisti en depositar la rata en el agua desde uno de los cuatro sitios de partida de la
periferia (uno por cada cuadrante) y esperar hasta un mximo de 60 s para que
encontrara la plataforma. El tiempo desde que la rata fue depositada en el agua hasta
que localiz la plataforma fue considerado como latencia de escape y su latencia
mxima fue de 60 s , si una vez completado este tiempo no localizaba la plataforma
oculta se le gui hasta ella y all se le dej permanecer durante 20 s. Enseguida la rata
fue retirada, secada y se le dej permanecer en la caja con los otros animales durante
30 s, mientras empezaba el siguiente ensayo, y as sucesivamente; hasta completar 8
ensayos consecutivos para cada rata ese mismo da, distribuyendo de manera
balanceada los sitios de partida entre los cuatro cuadrantes, de manera que cada rata
inici su navegacin dos veces desde cada cuadrante, sin seguir un patrn ordenado.
Adems de la latencia de escape, durante el entrenamiento fue registrado el tiempo
que la rata naveg en el cuadrante donde se encuentra la plataforma, en el cuadrante
opuesto, su velocidad y la distancia recorrida.

Para el ensayo de prueba fue retirada la plataforma y se introdujo a cada sujeto

una vez en la piscina, en un cuadrante lateral (ni el de la plataforma, ni el opuesto). Se
le permiti nadar durante 60 s. y fue retirado del laberinto. Fue registrado el tiempo que
la rata permaneci navegando en el cuadrante donde estuvo

30

la plataforma y en el cuadrante opuesto, la distancia recorrida y la velocidad promedio,

as como las veces que cruz el sitio donde se encontraba la plataforma. La prueba se
llev a acabo 24 h despus del ltimo ensayo de entrenamiento, entre las 7:00-10:00
am., fue videofilmada y posteriormente calificada por el sowftware de RatMove.

Dimetro 180 cm.

Plataforma
de escape
Profundidad

Nivel de agua 25 cm.

37 cm

Fig. No.3. Laberinto Acuatico de Morris.

III

II

IV

31

Histologa del Hipocampo

Los animales fueron anestesiados mediante una dosis subletal ip de
pentobarbital sdico (50 mg/kg). Se les practic toracotoma amplia para exponer el
corazn, a nivel torcico se pinz la arteria aorta descendente y despus de seccionar
la aurcula derecha, a travs del ventrculo izquierdo, bajo presin de una columna de
3

120 cm de agua y a temperatura corporal (37C) se hizo pas ar durante tres min. 150
ml de una solucin de lavado compuesta por 0.9% de cloruro de sodio con 10,000 UI
de heparina y 1 gr de procana/litro.
Despus de hacer pasar la solucin de lavado, el cerebro fue perfundido con
200 ml de una solucin de paraformaldehdo al 4% en amortiguador fosfato 0.1M pH
7.3. Posteriormente se realiz la craneotoma y el cerebro se postfij en la misma
solucin fijadora por 24 h a 4 C. Los tejidos fuer on deshidratados en una serie de
alcoholes de concentracin creciente y posteriormente fueron incluidos en parafina
para realizar cortes coronales de 20 m.
Anlisis

inmunocitoqumico para cuantificar proliferacin microglial y

astrocitaria.
A fin de analizar los efectos del estrs y los neuroesteroides, sobre la citoarquitectura
glial de las zonas CA1, DG y CA3 del hipocampo de la rata, se realizaron los
siguientes procedimientos:
De los cerebros parafinados, provenientes de ratas sacrificadas al finalizar la
prueba de retencin de memoria (20 das despus de colocar los implantes) fueron
obtenidos cortes coronales seriales de 20 m de espesor del hipocampo dorsal
comprendidos entre 4.0 y 7.0 mm anterior a lambda (Paxinos y Watson, 1982).

Para la prueba inmunocitoqumica, todos los anticuerpos (ac) fueron disueltos

en una solucin tampn de fosfato salino (PBS) 0.1 M pH 7.3 con 1% de albmina

32

srica bovina y 0.2% de Tritn X-100. Esta misma solucin fue utilizada para todos los
lavados del tejido que se hicieron despus de cada etapa de incubacin.

1. Cuantificacin de la microglia.
Para la identificacin de la microglia se utiliz solectinaI-B 4 (griffonia
simplicifolia) acoplada con peroxidasa, en dilucin de 10x10

-4

mg/ml, disuelta en PBS

(1:100). Se inactivaron las peroxidasas endgenas mediante incubacin de los cortes

en 10% de metanol disuelto en PBS, con 0.3% de H 2O2 durante 20 min a temperatura
ambiente, luego los tejidos fueron lavados mediante cambios con PBS (2x5 min).
Despus se incubaron durante 10 min en una solucin tampn catinica (cloruro de
calcio 0.1 mM, cloruro de magnesio 0.1 mM y cloruro de manganeso 0.1 mM). Los
tejidos fueron incubados con la isolectina-B 4 durante 18-20 h a 4 C con movimientos
suaves y en la oscuridad. Al finalizar la incubacin las preparaciones fueron lavadas en
PBS (3x15 min). El revelado de la reaccin se hizo mediante ncubacin de los cortes
en una solucin compuesta por 0.03% de 33-diaminobencidin (DAB), 0.1% de H 2O2, y
sulfato de nquel al 1% durante 10-15 min para formar un precipitado visible de color
purpura.

2. Anlisis de la astrogliosis.
Para el marcaje de la protena acdica fibrilar glial (GFAP), presente en los
astrocitos y que por lo tanto permite observarlos, el ac primario fue policlonal generado
en conejo contra GFAP de bovino (inmungeno) en dilucin 1:800, la incubacin se
realiz durante una noche a 4C, el ac secundario (ac de enlace) fueron IgG generadas
en cerdo contra IgG de conejo en dilucin 1:250 y la incubacin fue durante 2 h a
temperatura ambiente. Los tejidos luego fueron incubados en el complejo PAP de

conejo en dilucin 1:250 durante 1.5 a 2 h a temperatura ambiente y en la oscuridad. El

producto de la reaccin tisular se revel con una solucin de DAB-H 2O2 al 0.07% y
0.1% respectivamente, durante 10-15 min (coloracin marrn).

33

Durante el estudio, los cortes de tejido fueron montados sobre portaobjetos y se

cubrieron con una pelcula de parafilm para formar un lecho capilar que distribuya
uniformemente la solucin y evite la evaporacin. Finalmente los cortes se
deshidrataron en series crecientes de alcohol y se montaron con Entellan (Merck) para
su anlisis con microscopa de luz.

1 Anlisis de la reactividad glial.

1. Cuantificacin estereolgica de la poblacin gli al.
Para la cuantificacin del nmero de clulas gliales en las estructuras
hipocampales se utiliz el mtodo del fraccionador ptico modificado de West, (1999).
El conteo fue ejecutado en uno slo de los hemisferios del hipocampo. Cada 40 cortes
(factor 1 = nmero de cortes entre muestr eo f1=40). Se muestrearon campos de
observacin con un rea de 61900 m (rea de campo) en el analizador ptico Leica
Q5001W (Leica Imaging Systems, Ltd. Cambridge, UK) conectado al microscopio de
luz. De esta rea se contaron las c lulas de un rea de 22500 m (rea de conteo).
Cada rea de campo inicial fue al eatoriamente seleccionada y el tamao del
desplazamiento de un rea de campo a otra se determin por movimientos de x=150
m, y=150 m. La fraccin contabilizada ser entonces un factor f2 = rea de
campo/rea de conteo.Tambin es necesario tener en cuenta la altura del disector del
microscopio hdis = 15m para obtener un tercer factor f3 = ancho del corte/hdis. Se
obtuvo entonces la sumatoria de clulas contadas C, y se multiplic por los tres
factores fraccionados f1, f2 y f3 (Ntotal= C f1 f2 f3) para obtener el nmero estimado de
clulas por rea en uno de los h emisferios.

2. Anlisis de transformacin citoplasmtica astrocitaria.

34

Se analizaron 400

clulas por rea cerebral para c ada grupo con ayuda de

una rejilla estereolgica

segn el mtodo de conteo puntual de Weibel (1979).

Dibujada en el analizador de imgenes, la rejilla c onsisti en cinco crculos

concntricos con 90 m de separacin entre ellos. Se fij el ncleo de la clula en el
centro de los anillos, y se contaron los cruces que sus prolongaciones (en un solo
plano de foco) tengan con los anillos, en la medida en que sean continuas (Fig. 4).
Cuando la prolongacin citoplasmtica se interrumpe, se realiza el conteo hasta dicha
interrupcin.

Fig. No. 4. Mtodo de conteo puntual de Weibel (Rejilla de Weibel).

35

ANLISIS ESTADSTICO
Los resultados obtenidos de las diferentes tcnicas cuantitativas fueron
analizados con la prueba estadstica de ANOVA de doble va para comparar todos los
grupos entre s, seguida de la prueba de Tukey para las comparaciones post-hoc de
los valores de medias, con un nivel de confianza de p<0.05 para definir como
significativas las diferencias. Adicionalmente, aquellas variables dependientes que
mostraron una interaccin significativa entre los factores analizados, fueron sometidas
a pruebas t de Student entre pares de medias para analizar ms especficamente los
cambios significativos. Dado el alto nmero de combinacione s de parejas entre grupos
para las comparaciones t post-hoc, se tom como nivel de significancia un p<0.01 para
esta ltima prueba.

36

RESULTADOS
Liberacin de las hormonas en los implantes
La liberacin de las hormonas contenidas en los implantes subcutneos fue
determinada a travs de cromatografa lquida de alta precisin (HPLC) para
progesterona (PROG) y dehidroepiandrosterona (DHEA) en muestras de orina
recolectadas cada 24 h durante 10 das (Fig. 5). Los resultados de PROG indican que
hubo una liberacin constante y estable de la hormona a niveles muy superiores
comparada con los niveles de grupos con implante DHEA o vehculo (VEHI) (Ver grf.
1A). El anlisis estadstico mostr un fuerte impacto del factor Implante p=0.000 y el
factor de grupo p=0.000, (p0.001), el cual no fue observado para la interaccin
(p=0.002). De manera similar, la cuantificacin de DHEA arroj niveles muy superiores
de esta hormona en los grupos implantados con la misma, en comparacin con los
grupos implantados con PROG o VEHI (grf. 1B). Igualmente, la significancia del
impacto del factor implante fue bastante alta p=0.000 y el factor grupo p=0.000 y la
interaccin no tuvo impacto significativo p=0.002 (p0.001).

Figura 5. Recoleccin de la muestra urinaria

37

PROGESTERO NA .

CP
HP
RP
500

Implante = 0.000
Grupo
= 0.000
Interaccin= 0.002

Vehiculo

ng/ul de Progesterona Urinaria

400

300

200

100

10

Tiempo (das)

B
500

DHEA

VEHI
CID
HID

Implante
= 0.000
Grupo
= 0.000
Interaccin= 0.002

RID

ng/ul de DHEA Urinaria

400

300

200

100

-100

10

Tiempo (das)

Grfica No.1. Niveles urinarios de hormonas de losimplantes utilizados, a lo largo de los das de
estrs. El eje Y indica los niveles urinarios de la hormona en ng/ul, y el eje X los das durante los cuales
se llev a cabo la exposicin al estrs. Los resultados indican niveles estables de liberacin de
PROG (A) y DHEA (B), significativamen te superiores en comparacin con los grupos con
implantes vehculo quienes mostraron cantidades insignificantes de la hormona respectiva. Los
nombres de los grupos estn abreviados segn e l tipo de condicin estresante y el tipo de implante*. Las
barras indican el intervalo de confianza del 99%.

CIV: Control Implante Vehculo; CIP: Control Implante Progesterona; CID: Control Implante DHEA; HIV: Hacinamiento Implante

Vehculo; HIP: Hacinamiento Implante Progesterona; HID: Hacinamiento Implante DHEA; RIV: Ruido Implante Vehculo; RIP: Ruido
Implante Progesterona; RID: Ruido Implante DHEA.

38

Cuantificacin de los niveles de corticosterona uri narios.

La corticosterona (CORT) urinaria fue cuantificada con HPLC para evidenciar los
niveles de estrs de cada uno de los grupos. El factor de grupo mostr un impacto
significativo p=0.000 (p0.001) en todos los das de estrs, lo cual demuestra la
efectividad de los estmulos estresantes. En los grupos control no se dieron diferencias
significativas entre los diferentes tipos de implante, p=0.999 lo cual indica que los
grupos sin estrs mantuvieron niveles basales de CORT independientemente del tipo
de implante subcutneo utilizado en ellos (grfica 2A). En contraste, en los grupos de
hacinamiento fue posible observar como el grupo VEHI mostr un incremento de los
niveles de CORT en los das 8 y 10 que fue prevenido por los implantes hormonales en
los otros dos grupos PROG y DHEA, los cuales mantuvieron niveles basales de CORT
(grf. 2 B y 2C). En el anlisis estadstico se observ que los niveles de CORT fueron
significativamente superiores en el grupo de hacinamiento con implante VEHI en
comparacin con PROG y DHEA, y significativamente superiores que los grupos
control en los das 8 y 10 (p0.001).

Control

Corticosterona Urinaria ng/ul

500

CIV
CIP
CID

400

300

200

100

4
6
Tiempo (das)

10

Grfica No. 2A. Niveles urinarios de CORT a lo largo de los das de estrs. Los grupos control

(grupos no estresados) no mostraron diferencias significativas en sus niveles de CORT a pesar

de los diferentes implantes. El eje Y muestra los niveles de CORT urinaria expresados en ng/ul, y el
eje X los das durante los cuales se llev a cabo la exposicin al estrs.

39

Hacinamiento

Corticosterona Urinaria ng/ul

500
HIV
HIP

400

HID

300

200

100

Dias

10

Grfica No. 2B. Niveles urinarios de CORT a lo largo de los das de estrs en los grupos de
hacinamiento. Se observan niveles basales de CORT en grupos implantados con PROG y DHEA
en comparacin con el grupo implantado con VEH I, en el cual el hacinamiento gener un
incremento significativo de CORT a partir del da 8. El eje Y muestra los niveles de CORT urinaria
expresados en ng/ul, y el eje X los das durante los cuales se llev a cabo la exposicin al estrs .

Ruido
500

RIV *

Corticosterona Urinaria ng/ul

RIP
RID

400

300

200

100

Dias

10

Grfica No. 2C. Niveles urinarios de CORT a lo largo de los das de estrs en los grupos sometidos
a ruido. El grupo implantado con VEHI mostr un incremento inmediato de los niveles de CORT
que se mantuvo constante. En contraste, para los grupos implantados con PROG y DHEA se
observ un retardo en dicho incremen to y una disminucin de los niveles de CORT hacia el final
del periodo de estrs. El eje Y muestra los niveles de CORT urinaria expresados en ng/ul, y el eje X los
das durante los cuales se llev a cabo la exposicin al estrs.Las barras indican el intervalo de confianza
del 95%.
CIV: Control Implante Vehculo; CIP: Control Implante Progesterona; CID: Control Implante DHEA; HIV: Hacinamiento

Implante Vehculo; HIP: Hacinamiento Implante Progesterona; HID: Hacinamiento Implante DHEA; RIV: Ruido Implante
Vehculo; RIP: Ruido Implante Progesterona; RID: Ruido Implante DHEA.

40

De manera similar, de acuerdo al anlisis post-hoc para el factor de implante, en

los grupos de ruido se observ un incremento de CORT en el grupo VEHI en
comparacin con los grupos con hormonas PROG y DHEA los das 0 y 10 (p0.001).
Esto indica que los implantes hormonales retrasaron el incremento de CORT, que se
produjo a partir del da 2, y que redujeron los niveles del glucocorticoide hacia el final
del periodo de estrs en el da 10. El mismo anlis is para el factor de grupo, mostr
que estos niveles de CORT eran significativamente superiores para los grupos de ruido
comparacin con los grupos controles los das 4, 6 y 8 (p0.001), y en comparacin
con los grupos de hacinamiento los das 2, 4 y 6 (p0.001).

Laberinto Acutico de Morris.

Con esta prueba se evaluaron las habilidades en el comportamiento de las ratas
con respecto al aprendizaje espacial durante la fase de entrenamiento y la memoria
espacial, es decir su capacidad para retener el aprendizaje, durante la fase de prueba.
El entrenamiento
Durante la fase de entrenamiento de todos los grupos independientemente del
tipo de implante y la condicin estresante a la que fueron sometidos, mostraron una
ejecucin similar en la que se observaron curvas de aprendizaje apropiadas para el
desempeo de la prueba en cuanto a su latencia de escape, tiempo de nado en el
cuadrante de la plataforma y en el cuadrante opuesto. No se encontraron diferencias
significativas en cuanto a las medidas de distancia recorrida y velocidad promedio. La
ausencia de impacto de los factores de grupo e implante, as como de la interaccin
entre los mismos, sugiere que las condiciones estresantes y los implantes no tuvieron
un efecto importante sobre el aprendizaje espacial.

41

La prueba
En la fase de prueba, se encontraron efectos importantes del factor de implante
y de la interaccin de ambos factores (Grfica 3). La prueba post-hoc mostr que en
trminos generales el efecto del factor implante es atribuible a que los grupos con
progesterona tuvieron medias significativamente superiores a VEHI (p0.001) y DHEA
(p0.001). Las comparaciones directas entre los grupos independientes efectuadas a
travs de la prueba t mostraron que los grupos con implante VEHI expuestos a
hacinamiento y ruido, tuvieron un decremento en su capacidad de consolidacin de
memoria espacial en situaciones de estrs, en comparacin con los individuos del
grupo control (p0.001), evidenciada por una menor cantidad de cruces con el rea
donde se encon traba la plataforma durante el entrenamiento. Sin embargo, los grupos
con PROG en las mismas situaciones de estrs, mantuvieron un puntaje de cruces con
la plataforma similar al del control, que fue significativamente superior al de los grupos
con el mismo tipo de estrs pero con implante VEHI. Esto sugiere un efecto protector
de PROG sobre las alteraciones de la memoria espacial que puede producir el estrs,
ya que adems no se observaron efectos de PROG sobre el grupo control en
comparacin con VEHI.
Los grupos estresados expuestos a DHEA por el contrario, mostraron puntajes
similares a los de VEHI, es decir, que la hormona no tuvo un efecto sobre su
capacidad para recordar la ubicacin de la plataforma; pero adems, la DHEA
disminuy esta habilidad en los sujetos en condiciones de control, es decir que por si
sola tuvo un efecto inhibitorio sobre la memoria espacial (grf. 3).

42

Prueba de Morris
Cruces con la plataforma
3,0

Grupo
p=0.002
Implante p=0.000
Interaccin p=0.001

Control
Hacinamiento
Ruido

2,5
**

Frecuencia

2,0
**
**

1,5

1,0

*
*

0,5

0,0

VEHI

PROG

DHEA

Grfica 3. Frecuencia de cruces con el rea de la plataforma durante la fase de prueba del
Laberinto Acutico de Morris.El estrs deterior la ejecucin de los grupos H y R con implante
VEHI. Esta situacin fue impedida con el implante P ROG, que mejor la ejecucin en las
situaciones de estrs sin afectar la del grupo control. DHEA disminuy los puntajes basales del
grupo control y no mostr efectos sobre los grupos estresados en comparacin con VEHI. El eje
Y muestra la frecuencia absoluta de ocasiones en las que durante la fase de prueba, las ratas pasaron
por el lugar donde previamente se encontraba la plataforma. El eje X muestra los grupos sometidos a
distintos tipos de estrs e implantes hormonales. Las barras sealan el error estndar.

Campo de agujeros.
Los puntajes que evalan excitabilidad (tiempo de m ovilidad e inmovilidad) no
mostraron diferencias entre los tipos de estrs o de implante, al igual que la distancia
recorrida y la velocidad promedio. Sin embargo, si se observaron alteraciones en los
niveles de ansiedad en cuanto al tiempo en la zona central y en los patrones de

exploracin medidos con las visitas totales.

43

Para su proteccin, los roedores tienen la tendencia a permanecer en la

periferia y salir poco hacia el centro de los espacios que exploran, de manera que el
tiempo en reas centrales es considerado un indicad or de ansiedad ya que los
animales tranquilos tienden a explorar ms estos es pacios.
Los resultados indican que las situaciones de estrs tuvieron poco o ningn
efecto sobre el tiempo que los grupos pasaron en el rea central (grf. 4), como se
puede inferir por el bajo impacto del factor de grupo. Por otra parte el factor implante
tuvo un impacto significativo (p=0.016) para el cual, el anlisis post-hoc mostr que
DHEA tuvo tiempos significativamente superiores a progesterona y control (p<0.001).
Esto indica que los implantes DHEA generaron probablemente un estado ansioltico lo
suficientemente potente como para permitir a los sujetos un mayor tiempo de recorrido
en el rea central en comparacin con aquellos con implante VEHI y PROG.

Hole Board
Tiempo en zona central
160

Control
Hacinamiento
Ruido

Grupo:
p= 0.196
Implante:
p= 0.016
Interaccin: p= 0.682

140

120

Segundos

100
80
60
40
20
0

VEHI

PROG

DHEA

Grfica No. 4. Tiempo que pasaron las ratas en la z ona central de la tabla de agujeros. Las situaciones
de estrs no mostraron un efecto importante sobre la ansiedad evaluada por el tiempo de
estancia de las ratas en la zona central. Sin embargo, para el factor implante, los grupos con
PROG mostraron niveles similares a los VEHI, mientras que aquellos con DHEA mostraron

menores niveles de ansiedad al recorrer por ms tiempo el centro de la tabla. El eje Y muestra el
tiempo en segundos que las ratas pasaron el rea central. El eje X muestra los grupos sometidos a
distintos tipos de estrs e implantes hormonales.Las barras muestran el error estndar.

44

En cuanto a los patrones de exploracin, cada uno de los factores por separado
no tuvo un impacto significativo, sin embargo se pudo observar en la interaccin una
significancia limtrofe (p=0.069) (grf. 5). El post-hoc con la prueba t, mostr que el
ruido, pero no el hacinamiento en la condicin VEHI, increment el nmero de visitas
totales en comparacin con el control. Este incremento fue disminuido de manera
limtrofe (p=0.055) por PROG y de manera significativa (p0.01) por DHEA.

Hole Board
Visitas totales
60

Grupo:
p= 0.650
Implante: p= 0.467
Interaccin: p= 0.069

Control
Hacinamiento
Ruido

50

Frecuencia

40

30

20

10

VEHI

PROG

DHEA

Grfica No. 5. Frecuencia de visitas totales en la Tabla de Agujeros. Las situaciones de estrs
mostraron una tendencia al incremento de las visitas totales en los grupos con VEHI,
especialmente para ruido. Esta tendencia se vio inhibida por DHEA y probablemente por PROG.
El eje Y muestra la frecuencia absoluta de visitas totales, mientras que el eje X muestra los grupos

sometidos a distintos tipos de estrs e implantes hormonales.Las barras indican el error estndar.

45

Anlisis celular
Poblacin astrocitaria
El nmero de astrocitos inmunorreactivos para GFAP fue registrado con el
mtodo del fraccionador ptico (West, 1999) en el hipocampo Zonas CA1, CA3 y DG.
El efecto ms obvio es la reduccin del nmero de a strocitos inmunrreactivos a
anti-GFAP en los grupos implantados con DHEA en todas las reas analizadas (grf.
6A), y por este motivo el efecto del factor implante fue significativo en cada una de
ellas (p0.001). Adicionalmente, CA3 (p0.001) y GD (p0.05) mostraron un impacto
significativo del factor grupo (grf. 6B y 6C), pero solo CA3 tuvo una interaccin
importante entre los dos factores (p0.001). La prueba de Tukey para el CA3, seal
que la influencia del factor grupo estaba determinada por una disminucin en el
nmero de clulas inmunorreactivas (fig 6) en los grupos de hacinamiento (p0.05) y
ruido (p0.001). En los sujetos con implantes de VEHI, (fig. 7) los cambios generados
por las condiciones de estrs por hacinamiento mostraron una disminucin en el
nmero de clulas microgliales.

46

Poblacin Astrocitaria en Zona CA3 del Hipocampo

Poblacin Astrocitaria en Zona de CA1 del hipocampo

400

400

Control
Hacinamiento

Grupo p = 0.889
Implante p = 0.000
Interaccin p = 0.762

Ruido
*

N o . d e c lu la s

300

200

100

** ** **
0

VEHI

PROG

DHEA

Control
Hacinamiento
Ruido

Grupo
p = 0.000
Implante p = 0.000
Interaccin p = 0.000

N o . d e c lu la s

300

* **

200

100
** ** **
0

VEHI

PROG

DHEA

Grfica No. 6. Total de astrocitos estimados por

hemisferio con el mtodo del fraccionador ptico. El
Poblacin Astrocitaria en Zona GD del
Hipocampo

eje Y muestra la frecuencia absoluta de clulas

contabilizadas, mientras que el eje X muestra los
grupos sometidos a distintos tipos de estrs e

Control
Hacinamiento
140
120

Ruido

**

implantes hormonales. En todas las reas

Grupo p = 0.025
Implante p = 0.000
Interaccin p = 0.151

analizadas se observ una fuerte reduccin del

nmero de clulas inmunorreactivas para GFAP

N o . de c lulas

100

con el implante de DHEA. A: en CA1 slo el

80

factor implante tuvo un efecto importante

60

debido a la reduccin en DHEA. B: en CA3 el

40

factor grupo seala una reduccin del nmero

20

** **

de astrocitos en los grupos estresados,

**

especficamente para hacinamiento en la

VEHI

PROG

DHEA

condicin VEHI, sin embargo en la condicin

DHEA, ambos grupos estresados manifestaron
esta reduccin. C:

en DG tal disminucin se present

exclusivamente
para el estrs por hacinamiento. Las barras
indican el
error estndar.

47

Figura No. 6.
A) Implante PROG Grupo Control (40X). Zona
CA3 del Hipocampo.
B) Implante PROG Grupo Hacinamiento
(40X) Zona CA3 del Hipocampo. Mostr
una reduccin en la poblacin astrocitaria
comparada con el grupo control y el grupo
de ruido.
C) Implante PROG Grupo Ruido (40X).
Zona CA3 del Hipocampo. Mostr una
reduccin astrocitaria en comparacin con
el grupo control.

48

20 m

20 m

*
*
*

*
*

Figura 7. Imgenes de microscopia de luz para recue nto de la poblacin microglial.

La imagen muestra el nmero celular por campo en un aumento de 20x en cortes coronales de
20 m. El

* corresponde a la densidad poblacional. A) Se muestra un corte coronal del grupo

control con implante de VEHI en la zona CA1 del hipocampo, el cual presenta un nmero
abundante de clulas de microglia con grandes prolongaciones citoplasmticas, esta
morfologa es indicativa de que las clulas se encontraban en reposo. B) Se muestra la zona
CA1 del hipocampo del grupo de animales estresados por hacinamiento, e implantados con
aceite de ssamo contenido en la cpsula de silicon a (VEHI) result un nmero disminuido de
clulas de microglia con pocas prolongaciones citoplasmticas, -morfologa indicativa de que
las clulas sufrieron un proceso de desramificacin por haberse activado.

49

La Transformacin Astrocitaria
La transformacin astrocitaria fue evaluada mediante el conteo del total de
cruces de las prolongaciones continuas de los astrocitos con los crculos concntricos
de la rejilla de Mtodo de Conteo Puntual de Weibel, en las mismas estructuras
cerebrales.
*
Los resultados muestran una tendencia comn en la q ue ambos factores, grupo
e implante, as como la interaccin entre ambos, mostraron un impacto significativo
(p0.001) en cada una de las reas analizadas (grf. 7 ).
En trminos generales lo que puede observarse del impacto de ambos factores
y la interaccin, es una tendencia generalizada para las tres reas analizadas en la
que DHEA produjo una disminucin de la reactividad astrocitaria en todas las
condiciones experimentales de estrs (p0.001), pero especialmente en la condicin
de ruido. Por su parte, la progesterona no tuvo un efecto significativo sobre la
reactividad de los astrocitos expuestos a situaciones de estrs, sin embargo
decrement de manera importante la misma variable en el grupo control, dejndolo a la
par con el nivel de los grupos estresados (p0.001).

50

Transformacin
Astrocitaria en
Zona CA1del
Hipocampo

Control

No. de Intersecciones

Transformacin Astrocitaria en
Zona CA3 del Hipocampo
Control

0
.
0
Grup 0
o= 0
Implante = 0.000
Interaccin=0.000

Hacin
amient
o
Ruido
6

Implante = 0.000

Ruido

Interaccin=0.000

Grupo = 0.000

Hacinamiento

No. de Intersecciones

**

**

*
***

Vehculo

PROG

DHEA

Vehculo

PROG

DHEA

Vehculo

C
8

Transformacin Astrocitaria en
Zona DG del Hipocampo.
Control

Grupo =

Ruido

Interaccin= 0.000

Hacinamiento

Implante =

0.000

0.000

No. de intersecciones

* *
4

*
2

**
**

PROG

DHEA

distintos tipos de estrs e implante hormonal. Se

observa una influencia significativa de los
Grfica No. 7. Transformacin de las
prolongaciones astrocitarias. El eje Y
muestra la media de la frecuencia de
cruces con los crculos concntricos de la
rejilla de Webel por clula, mientras que el
eje X muestra los grupos sometidos a

factores de grupo e implante, as como de la

interaccin entre ambos. La DHEA disminuy
las prolongaciones astrocitarias en todas las
reas analizadas, mientras que la progesterona
las redujo en la situacin control y no tuvo
efecto en las situaciones de estrs. Las barras
indican el error

estndar.

51

Poblacin microglial
El nmero de clulas de microglia inmunorreactivas para anti-Isolectina B 4
tambin fue contado con el mtodo del fraccionador ptico (West, 1999) en el
hipocampo (CA1, CA3 y DG).
Los resultados mostraron que las clulas de microglia en aquellos grupos
implantados con DHEA tuvieron una inhibicin en el metabolismo de las glucoproteinas
que pertenecen al glucocalix de la menbrana de las celulas microgliales lo que no nos
permite tener una inmunorreactividad para anti-Isolectina B 4, por lo cual no fue posible
observalas en los cortes de los cerebros en los grupos implantados con DHEA y por
ello no se indican en las grficas ni se incluyeron en el anlisis estadstico, pues
sesgaran fuertemente el peso del factor implante.
Para el resto de los sujetos, el factor de grupo tuvo un efecto significativo en
todas las zonas analizadas, ya que los sujetos sometidos a estrs por hacinamiento
mostraron una reduccin en el nmero de clulas de microglia inmunorreactivas. Segn
el anlisis post-hoc, esta tendencia fue esta dsticamente significativa para todas las
zonas (p0.05) en el caso del estrs por hacinamiento, pero no en el caso de ruido, con
excepcin de DG en donde el grupo de ruido tambin sufri un decremento significativo
(p0.05) (grf. 8), (fig. 8).
Por su parte, el factor de implante, solo tuvo una influencia limtrofe en CA1
(p=0.067), lo cual se deriva de un incremento en la cantidad de clulas observadas en
los grupos con progesterona al compararlos con los grupos vehculo. Sin embargo, en
las dems reas (CA3 y DG) este efecto no fue estadsticamente significativo. La
influencia principal de este fenmeno parece obedecer al incremento de la reactividad
celular del grupo control bajo el implante de progesterona. Ninguna de las reas
analizadas tuvo una interaccin signif icativa entre factores, aunque CA1 tuvo un nivel

limtrofe (p=0.079).
En trminos generales lo que puede observarse es una tendencia al decremento
de la reactividad astrocitaria bajo la condicin VEHI para el grupo de

52

hacinamiento, pero no para el de ruido (con excepcin del DG). Esta relacin entre las
diferentes condiciones de estrs parece mantenerse en los grupos con PROG, pero en
niveles ms altos, sobre todo para el grupo control.

Poblacin Microglial en Zona CA1del Hipocampo

18

Grupo
p = 0.004
Implante p = 0.067
Interaccin p = 0.079

Control
16

Hacinamiento
Ruido

14

N o . de clulas

12

**

10
8
6

**

2
0

VEHI

PROG

Poblacin Microglial en Zona CA3 del Hipocampo

18
Control
Hacinamiento
Ruido

16

Grupo
p = 0.023
Implante p = 0.602
Interaccin p = 0.400

14

N o . de clulas

12

**

10
8
6

**
*

4
2
0

VEHI

PROG

Poblacin Microglal en Zona DG del

Hipocampo

hemisferio. El eje Y muestra la frecuencia absoluta

de clulas contabilizadas, mientras que el eje X

Grupo
p = 0.016
Implante p = 0.395
Interaccin p= 0.277

Control
Hacinamiento
Ruido

muestra los grupos sometidos a distintos tipos de

estrs e implante hormonal. Se observa una

No. de clulas

Grfica No. 8. Total de microglia estimada por

tendencia generalizada en la que para el factor

4

**
*

de grupo, la condicin de hacinamiento

decrement de manera significativa el nmero

de clulas contabilizadas. Por su parte el

**

VEHI

PROG

impacto del factor implante se debe en su mayor

parte al incremento que produjo PROG sobre las
clulas contabilizadas en el grupo control en
comparacin con VEHI . Las barras
indican el error estndar.

53

C
Figura 8.
Poblacin Microglial en Zona DG
del Hipocampo.
A) Grupo Control Implante Vehculo (40X).
Zona DG del Hipocampo. Ratas no
estresadas.
B) Grupo Control Hacinamiento (40X). Zona
DG
del
Hipocampo.
El
factor
Hacinamiento disminuy la poblacin
microglial.
C) Grupo Control Ruido (40X). Zona DG del
Hipocampo. El factor Ruido ocasiona una
reduccin muy importante en la
poblacin microglial.

54

Transformacin microglial
La transformacin microglial fue evaluada mediante el conteo del total de cruces
de las prolongaciones continuas de la microglia con los crculos concntricos de la
rejilla de Mtodo de Conteo Puntual de Weibel, en las mismas estructuras cerebrales.

Puede observarse en la grfica 9 que todas las estr ucturas evaluadas

mostraron un impacto significativo del factor grupo. En trminos generales las
condiciones estresantes mostraron una reduccin significativa (p0.001) en la
transformacin microglial comparadas con el control, de manera que la inhibicin fue
ms pronunciada en el grupo de hacinamiento que en el grupo de ruido en todas las
reas (p 0.001). El factor implante slo tuvo una influencia importante en CA3 y en
DG y de manera general esto parece deberse al incremento en la transformacin
microglial mostrado por el grupo control bajo la influencia del implante VEHI.
En todas las estructuras cerebrales analizadas la interaccin entre los dos
factores result significativa, lo cual permiti el anlisis t de pares especficos de
grupos. De esta manera pudo observarse que el las condiciones estresantes generaron
una reduccin de la transformacin microglial en comparacin con el grupo control bajo
la influencia del implante VEHI. Este efecto fue observado de manera significativa en
todas las reas del hipocam po para la condicin de hacinamiento, pero nicamente en
CA1 para la condic in de ruido. Por su parte los grupos estresados implantados con
progesterona, tuvieron tambin una reduccin significativa en comparacin con su
propio control PROG, similar a la reduccin observada para los grupos estresados en
la condicin VEHI. El impacto ms importante bajo la influencia de la progesterona fue
el incremento de la transformacin microglial en la condicin control para todas las

reas (ver fig. 9).

55

Transformacin Microglial en
Zona CA1del Hipocampo

16

Control
Hacinamiento

14

Ruido

p= 0.000
Grupo:
Implante: p= 0.107
Interaccin: p=0.004

No. de Interacciones

12

10

6
4
2
0

VEHI

PROG

B
16
14

Transformacin Microglial en
Zona CA3 del Hipocampo
Control
Hacinamiento
Ruido

Grupo: p= 0.000
Implante: p= 0.027
Interaccin: p=0.000

Interseccin de microglia

12
10
8

6
4
2
0

VEHI

PROG

Grfica No. 9. Transformacin de las

C

Transformacin Microglial en
Zona DG del Hipocampo
Grupo: p= 0.000
Implante: p= 0.017

16
Control

Interseccin de microglia

14

prolongaciones microgliales. El eje Y muestra la

Hacinamiento

Interaccin:

Ruido

p=0.000

media de la frecuencia de cruces con los crculos

concntricos de la rejilla de Webel por clula,

12

mientras que el eje X muestra los grupos

10

sometidos a distintos tipos de estrs e implante

hormonal. Se observa una reduccin de la

transformacin en todas las reas en los

grupos estresados bajo la influencia del

implante VEHI y PROG, especialmente en la

condicin de hacinamiento. Adems, la PROG

VEHI

PROG

increment de manera significativa la

transformacin microglial exclusivamente en
ausencia de estrs, en todas las reas
analizadas. Las barras indican el error estndar.

56

Figura 9.
Transformacin Microglial en Zona CA1
del Hipocampo.
A) Grupo Control Implante Progesterona
(100X). Zona CA1 del Hipocampo. El
ImplantedePROG aumentala
transformacin microglial.
B) Grupo Hacinamiento Implante Progesterona
(100X). Zona CA1 del Hipocampo. El
Hacinamiento disminuy la transformacin
microglial.
C) Grupo Ruido Implante Progesterona (100X).
Zona CA1 del Hipocampo. El Ruido
disminuy la transformacin microglial .

57

DISCUSIN
Liberacin desde los implantes.
Los implantes hormonales utilizados produjeron un grado de liberacin
constante y suprafisiolgico a travs del experimento (aproximadamente entre 300 y
400 ng/ul de orina). As mismo, el grado de liberacin fue casi el mismo para los dos
tipos de implante, lo cual apoya la confiabilidad del mtodo.Los niveles de cada
implante, al parecer no se vieron afectados en gran medida por las condiciones de
estrs, ya que no hubo diferencias importantes en los niveles de liberacin de las dos
hormonas ante hacinamiento y ruido. Esto podra indicar que las condiciones
estresantes no tuvieron un impacto importante sobre los niveles urinarios de los
neuroesteroides, sin embargo, dado que el grado de liberacin fue claramente
suprafisiolgico, es posible que la influencia del incremento de CORT generado por la
respuesta biolgica de estrs no alcance la potencia necesaria para modificar la dosis
generada por los implantes.

Intensidad del estrs.

Tal como se haba reportado previamente en otros estudios similares con ruido
por USVs (Commissaris y cols., 2000) y hacinamiento en ratas (Csermely y cols.,
1995), las condiciones experimentales generaron una respuesta de estrs, aunque en
este trabajo estuvo medido por una clara elevacin de los niveles de CORT, y se
produjo en un tiempo mucho ms corto, qu e sigui diferente curso temporal,
dependiente de cada situacin experimental. Por esta razn se puede afirmar que el
modelo de estrs social seleccionado para este estudio fue el adecuado para alcanzar
los fines propuestos; inducir la elevacin moderada, -pero sostenida de CORT, para

analizar los efectos de este incremento sobre la integridad celular del hipocampo y su
manifestacin sobre habilidades cognoscitivas. La cuantificacin de este parmetro
permiti comprobar la validez de las condiciones estresantes creadas artificialmente y
constituy un indicador confiable de la potencia
58

del estrs y de la activacin del eje HPA al igual que en otros estudios (Bhatnagar y
Vining, 2003).
En la situacin de control, puede observarse que en ausencia de estrs, no
hubo cambios importantes en los niveles de CORT para cualquiera de los tipos de
implante. Esto significa que PROG y DHEA no tuvieron un efecto importante sobre los
niveles basales de CORT, y que las condiciones de alojamiento se relacionaron con
niveles normales de activacin del eje HPA. Esta diferencia puede estar relacionada
con el hecho de que los efectos antiglucocorticoides de estos neuroesteroides se
encuentran relacionados con la modulacin de receptores gabargicos, los cuales se
ven especialmente afectados ante el incremento de glucocorticoides y la activacin de
receptores tipo II (Higashi y col., 2005).

En los animales sometidos al hacinamiento se produjo un incremento lento y

paulatino de los niveles de CORT de aquellos con implante VEHI, de manera que en el
octavo da de estrs, mostraron una elevacin significativa con respecto a los controles sin
estrs y a los animales hacinados bajo la influencia de PROG y DHEA. Esto sugiere que
los dos neuroesteroides, ejercieron un rol inhibitorio sobre el incremento de CORT
producido por el hacinamiento, lo cual se encuentra en coherencia con otros experimentos
que demuestran el papel anti-glucocorticoide de ambos (Herbert, 1998; HIgashi y col.,
2005; Hu y col., 2000; Kimonides y col., 1999; Mediratta y col., 2003). El incremento de
CORT por hacinamiento, tambin ha sido mostrado previamente en diferentes especies
animales (Boranic y cols., 1982; Hessing y cols., 1993; Csermely y cols., 1995; Aioi, 2001),
aunque tales efectos por lo general requieren de un tiempo de hacinamiento ms
prolongado (Csermely y cols., 1995 ; Hessing y cols., 1993).

En los grupos sometidos a ruido se observ una rpida elevacin de los niveles

de CORT en las ratas con implante VEHI, lo cual se encuentra en coherencia con otros
estudios en los que las USVs funcionan como un estmulo estresante potente
(Blanchard y cols., 1991; Commissaris y cols., 2000). Esta elevacin alcanz su nivel
mximo en el da 2 y se mantuvo estable a lo largo de todo el tiempo de exposicin al
estrs. En los grupos implantados con PROG o DHEA se produjo tambin un
59

incremento en los niveles de CORT, pero este fue diferente de la elevacin del grupo
VEHI en dos aspectos bsicos: 1. El incremento fue ms lento, de manera que puede
observarse un retraso de esta respuesta. 2. Esta elevacin fue revertida hacia el final
de la exposicin al estrs. Como se mencion anteriormente, este efecto de inhibicin
de los niveles de CORT es ya conocido, en especial en circunstancias en las que e
glucocorticoide se encuentra lo suficientemente elevado como para activar recptores
tipo II (Higashi y col., 2005; Hu y col., 2000; Kimonides y col., 1999; Mediratta y col.,
2003). Este patrn de elevacin de la respuesta deCORT en los grupos PROG y
DHEA, en el que se observa un retraso, una elevacin pronunciada y una reversin de
los niveles del glucocorticoide pudiera explicarse por el hecho de que los
neuroesteroides implantados mantienen una regulacin de incrementos fisiolgicos
moderados de CORT como se observ en la respuesta de la hormona ante el
hacinamiento, a travs de la regulacin de receptores gabargicos que pueden inhibir
el eje HPA. Sin embargo, una vez superado un umbral de activacin, se pierde la
capacidad de regulacin y se da va libre al incremento. Una vez presente la activacin
del eje HPA pueden dispararse los mecanismos de autorregulacin que tiene este
sistema de respuesta al estrs, de manera que el efecto conjunto de esta estrategia
adicionada a la presencia de los neuroesteroides anti-glucocorticoides, puede tener un
resultado sinrgico que finalmente termine por inhibir el incremento de CORT.

Por otra parte, la mayor potencia del estrs por ruido puede explicarse con base
en el carcter unimodal de esta estimulacin aversiva, ya que la va auditiva constituye
una herramienta fundamental para la supervivencia de roedores y posee una va
neuronal muy especfica con niveles de habituacin muy bajos, dada su importancia
adaptativa. Lo anterior ha sido demostrado en experimentos con roedores, en los que
las USVs artificiales pueden desencadenar comportamientos de defensa (Beckett y
cols, 1996) similares a los inducidos por estimulacin qumica o elctrica en la

sustancia gris periacueductal (carreras, saltos y congelamiento), y el colculo superior

(estrechamente relacionado con la funcin auditiva) (Savvas y cols, 2000). Adems, en
ratas el colculo inferior parece estar relacionado con la conducta de defensa, pues su
estimulacin genera incrementos en la locomocin, exaltacin y saltos, as como

60

incrementos en la presin sangunea y la frecuencia cardaca. (Commissaris y col,

2000; Brandao y cols., 1994; Maisonette y cols., 1996). De otro lado, el hacinamiento
provoca estmulos polimodales con la intervencin de diferentes vas sensoriales
inespecficas, lo que puede facilitar su enfrentamiento a nivel fisiolgico y
comportamental. Posiblemente la herencia filogentica haya conferido a los roedores la
capacidad para desdencadenar respuestas fisiolgicas dirigidas a minimizar o abolir
sus manifestaciones orgnicas frente al estrs por hacinamiento cuando no est
comprometida su supervivencia, mientras que la respuesta ser diferente cuando el
hacinamiento se acompaa por restriccin de agua yalimento, suciedad de la cama y
los enfrentamientos para establecer jerarquas, as; en el primer caso solo resulta una
alteracin moderada de la respuesta fisiolgica. Adems, aunque el hacinamiento es
un estmulo utilizado con frecuencia, se ha visto que entre otros diferentes tipos de
estrs; hacinamiento, aislamiento, inmovilizacin y nado forzado, los dos ltimos
provocaron mayores efectos adversos, lo cual cuestion la capacidad estresante de los
dos primeros (Nagaraja y Jeganathan, 1999), o al menos sugiere que los estmulos
estresantes de caractersticas sociales pueden provocar efectos ms sutiles y difciles
de detectar.

Es importante sealar que en este estudio se recolect la orina de un modo

distinto a como regularmente se hace en otros estudios de comportamiento o de
nutricin. En este experimento los sujetos se mantuvieron juntos todo el tiempo, - para
evitar el sesgo que hubiera podido resultar por el aislamiento en jaulas metablicas
individuales que tienen un dispositivo en el fondo para recolectar las heces y la orina
por separado, por lo que as puede calcularse la cantidad de alimento ingerida. Dadas
las condiciones experimentales propuestas para este estudio no fue posible utilizar las
referidas jaulas, el que se haya realizado la recoleccin conjunta de las muestras de
orina podra explicar la variabilidad intraensayo observada, ya que la determinacin de

los niveles de CORT se hizo a partir de mezclas de orina provenientes de distintos

animales.

61

En nuestro conocimiento, este es el primer estudio en reportar una inhibicin in

vivo por parte de implantes hormonales de PROG y DHEA sobre los niveles de CORT
generados por estrs de caractersticas sociales.
Memoria espacial.
El laberinto acutico de Morris es una de las prueb as ms usadas para evaluar el
aprendizaje y la memoria espacial en roedores. Este tipo de memoria, por su relacin
con el hipocampo, constituye una analoga del sistema de memoria declarativa tan
importante para los humanos. En general, intenta detectar alteraciones en el
aprendizaje, es decir durante la fase de entrenamiento, para evaluar la funcin
mnemnica de adquisicin del hipocampo; y cambios en la memoria, durante la fase
de prueba, con el fin de medir la funcin de consolidacin.
Los hallazgos de este estudio revelaron un dficit en los procesos de
consolidacin o memoria espacial, ya que las diferencias se observaron durante la fase
de prueba, mientras que en la fase de entrenamiento, los sujetos de los diferentes tipos
de implante y condiciones de estrs mostraron los mismos niveles de aprendizaje. Esto
significa que los procesos de memoria de trabajo en el hipocampo no se vieron
afectados por las manipulaciones experimentales. En cambio, el proceso de
consolidacin evaluado al da siguiente con la prueba del laberinto de Morris, mostr
un impacto significativo en el nmero de cruces con la plataforma para el factor de
implante y el factor de interaccin.
El resultado observado es que las ratas VEHI expuestas a las condiciones
estresantes mostraron una disminucin en el nmero de cruces con el lugar de la
plataforma durante el nado, es decir, que recordaban menos el lugar que aprendieron

el da anterior durante el entrenamiento. Muchos estudios demuestran que el estrs

produce dficit en la memoria y el aprendizaje espacial (Lupien y McEwen, 1997;
McEwen y cols, 1998; Raber, 1998; de Kloet y cols, 1999; McEwen, 1999; de Kloet,
2000; McEwen, 2000), y los resultados aqu observados resultan coherentes con los

62

efectos sobre la memoria espacial por parte de otras manipulaciones experimentales

similares, como el estrs social crnico durante 21 das (Ma y cols., 2000), el
hacinamiento en Drosophila (Barth y Heisenberg, 1997), ruido de 105 dB en ratas
(Arnsten y Goldman-Rakic, 1998) y ruido grabado de trfico en humanos (Belojevic y
cols., 1992).
Por el contrario, en la condicin de PROG, los grupos expuestos a las situaciones
estresantes no mostraron una ejecucin distinta a las ratas control, lo que sugiere que
este neuroesteroide ejerci un efecto benfico o protector sobre los procesos de
consolidacin de memoria en el hipocampo que se ven afectados por el estrs por
hacinamiento o ruido por USVs. Como se mencion anteriormente, la PROG ha
mostrado un efecto ansioltico en diferentes situaciones experimentales de estrs
(Figueiredo y col., 2002; Mediratta y col., 2003), y en este estudio decrement de
manera significativa los niveles de CORT. Por lo tanto, su efecto protector sobre la
ejecucin en la prueba de memoria espacial del Laberinto Acutico de Morris, puede
relacionarse con su papel anti-glucocorticoide y su impacto en la reduccin de los
niveles de CORT.

De otro lado, en los sujetos expuestos a DHEA, los grupos estresados no

mostraron cambios significativos en comparacin con la condicin VEHI, mientras que
el grupo control tuvo una reduccin importante en el nmero de cruces con la
plataforma. Esto sugiere que la DHEA, a pesar de generar una inhibicin sobre los
niveles de CORT, no tiene un efecto protector sobre la memoria en el hipocampo
afectado por hacinamiento o ruido ultrasnico, y adems, que ante la ausencia de
estrs, genera un decremento en la habilidad de memoria espacial, efecto que adems
debe ser independiente de los niveles de CORT, pues estos se vieron ihibidos en los
sujetos con implante de DHEA. Diamond y col., (1999) encontraron algo similar, al

observar que la DHEA no potencializaba los cambios electrofisiolgicos necesarios

para la memoria espacial en el hipocampo de ratas sometidas a estrs, sin embargo,
contrario a los resultados del presente experimento, este mismo estudio mostr que en
la situacin sin estrs, la DHEA si promovi dichaactividad electrofisiolgica.

63

Aunque en general la DHEA se ha relacionado con el aumento de la memoria y

el aprendizaje (Wang y col., 2001), Wolf y col., (1998) encontraron un decremento en la
ejecucin de pruebas de memoria declarativa (funcin hipocampal) en humanos, lo
cual contradice tambin la idea de un efecto directo anticorticoide o antiestrs sobre las
funciones de memoria mediadas por el hipocampo. Adems, Breuer y cols., (2002)
encontraron que en mujeres ancianas los niveles de DHEA tenan una relacin inversa
con las habilidades cognoscitivas en diferentes test de memoria, lo que sugiere que
este tipo de hormonas pueden tener un efecto distinto que en las poblaciones jvenes,
tal vez en relacin a un mecanismo relacionado con estrs. Por ltimo, los efectos de
los neuroesteroides en lo re ferente a aprendizaje y memoria en respuesta al estrs se
extienden a reas como la li beracin de acetilcolina y la alteracin de sistemas
monoaminrgicos (Maurice y col., 2001) los cuales pueden tener un efecto importante,
pero que no fueron evaluadas en este estudio.
Conducta exploratoria.
El campo de agujeros fue diseado para medir la conducta exploratoria de ratas y
ratones. La parte central del campo de agujeros funciona de manera similar al rea
central de la prueba de campo abierto; en ella las ratas con mayor ansiedad prefieren
la zona perifrica a la central, al parecer con el propsito de resguardarse, aunque este
comportamiento tambin puede indicar un dficit de atencin (Lordi y cols., 2000). Por
lo tanto, para este estudio era de esperarse que los animales efectuaran una menor
cantidad de visitas centrales, en comparacin con las perifricas, lo cual depende de
las situaciones previas a las que hayan estado expuestos. Por otro lado, el tiempo de
movilidad refleja la excitabilidad de los individuos, variable que puede verse afectada
por los niveles de estrs (de Kloet y cols., 2000).

En este estudio, los puntajes obtenidos para tiempo de movilidad e inmovilidad,

visitas centrales y perifricas, as como distancia y velocidad del recorrido, no
mostraron diferencias significativas entre ellas. Sin embargo, los grupos con implante

64

DHEA pasaron una mayor cantidad de tiempo en el re a central de la tabla de agujeros en

comparacn con las ratas VEHI y PROG. Este incremento se asocia normalmente a
estados ansiolticos, pero en este caso no puede atribuirse la causa a dicha variable, ya
que el bajo impacto del factor grupo y de la interaccin, hacen este efecto independientede
las condiciones de estrs, adems, el grupo de PROG tambin mostr niveles reducidos
de CORT, y sin embargo los sujetos no incrementaron el tiempo de permanencia en la
zona central. Una explicacin alternativa tiene que ver con sistemas de atencin a
estimulacin novedosa, proceso tambin asociado con el hipocampo. Lordi y cols, (2000)
sugieren que la disminucin del tiempo en la zona central, puede estar en relacin con un
decremento en los niveles de atencin, mientras que Wolf y col., (1998) encontraron que la
DHEA potencia las tareas relacionadas con la atencin. Es entonces posible suponer que
la DHEA haya incrementado los procesos atencionales que dirigen la conducta
exploratoria, de manera que las ratas pasaran una mayor cantidad de tiempo en el rea
central. Sin em bargo, habra que sugerir, que este efecto se limita a factores atencionales,
pues la conducta exploratoria, es decir el nmero de agujerso visitados, en el rea central y
perifrica fue igualmente distribuda en todas las situaciones estresantes y los diferentes
implantes.

Tambin se observaron diferencias importantes en la cantidad de visitas totales. El

ruido, pero no el hacinamiento, increment de manera significativa la cantidad de visitas
totales y este efecto fue revertido por la PROG y la DHEA. Este efecto no puede atribuirse
a un componente motor, ya que los tiempos de movilidad e inmovilidad fueron iguales para
todas las ratas. Por el contrario, puede decirse que est relacionado con un factor de
estrs, ya que las ratas bajo condiciones de ruido tuvieron niveles de CORT ms altos en
comparacin con las de hacinamiento. En la mayora de estudios de estrs, se ha
reportado disminucin de la conducta exploratoria tanto con el uso de modelos de estrs
agudo y no social (Boranic y cols., 1982; Hessing y cols., 1993; Csermely y cols., 1995;

Takeda y cols., 1999; Tsuji y cols., 2000; Adamec, 2001; Aioi, 2001), como con diferentes
modelos de estrs social en distintas especies (Manuck y cols., 1991; Heinrichs y cols.,
1994; Boissy y cols., 1998; Meerlo y cols., 1999; Habib y cols., 2000; McCabe, 2000;
Kovach y cols., 2001). Sin embargo, un estudio de Osborn

65

y col. (1998), mostr un incremento de la exploracin en ratas sometidas a tratamiento

con CORT.
Es necesario aclarar, que la mayora de estos experimentos evaluan la
exploracin utilizando el laberinto elevado en cruz y el laberinto de campo abierto, los
cuales miden principalmente niveles de ansiedad, y no la conducta exploratoria por si
misma. Es probable que la diferencia en estos resultados se deba a que el campo de
agujeros evala un rango de dimensiones ms amplio y ofrece un ambiente novedoso
ms enriquecido que las otras pruebas. Aunque el ca mpo de agujeros no haba sido
hasta ahora probado para evaluar el efecto de la CORT sobre la conducta exploratoria,
es posible observar que en otros intentos por medir el comportamiento exploratorio en
circunstancias diferentes, como la exposicin a un ambiente novedoso con ratas
desconocidas, la CORT gener un incremento en el nivel de exploracin (Haller y col.,
1997). Por este motivo, el efecto inhibitorio de la PROG y la DHEA puede entonces
atribuirse a sus efectos ansiolticos a travs de la reduccin de los niveles de CORT, al
menos en lo que respecta a la conducta exploratoria.

Astrocitos
El efecto ms evidente en las clulas astrocitaria s fue la fuerte inhibicin que
ejerci la DHEA sobre la poblacin y la transformacin de los astrocitos en todas las
condciones experimentales y en todas las reas anal izadas. Tal efecto inhibitorio de la
DHEA sobre la proliferacin astrocitaria y la expresin de GFAP ha sido previamente
reportado in vitro (Bolota y col., 1987) e in vivo (Hoyk y col., 2004), de manera que los
presentes resultados encajan en el marco experimental que relaciona la DHEA con las
clulas astrocitarias.
En la poblacin astrocitaria de CA3 y DG, asi como en la transformacin

astrocitaria de CA1, CA3 y DG, pudo observarse un impacto significativo del factor
grupo, pues con el implante VEHI, la cantidad de astrocitos registrados fue menor en
las condiciones de estrs, en comparacin con el control. Aunque un papel excitatorio
de la CORT sobre los astrocitos haya sido descrito en algunos experimentos in vitro

66

(Rozovsky y col., 1995; Melgani y col., 1997) e in vivo (Bjorklund y col., 1985), la
mayora de la evidencia experimental se encuentra en coherencia con el presente
estudio, en cuanto a que la CORT tiene efectos inhibitorios sobre las clulas
astrocitarias (Crossing y col., 1997; Laping y col., 1994; Nichols y col., 1990;
Ocallaghan y col., 1991), particularmente con la implementacin de estrs crnico de
intensidad media (Rithcie y col., 2004) y de manera especfica para el hipocampo
(Maurel y col., 2000).
Ante los efectos inhibitorios del estrs, la PROG no mostr un efecto protector, lo
cual contradice los resultados de (Crossing y cols., 1999), quienes revirtieron con
PROG y DHEA la inhibicin astrocitaria producida con CORT. A pesar de haber logrado
una reduccin de los niveles de CORT, en este estduio la PROG no impidi la inhibicin
astrocitaria, esto sugiere que la inhibicin de las clulas astrocitarias en el grupo de
PROG puede estar asociada a su efecto directo sobre los astrocitos, pues ellos son los
principales productores de PROG en el SNC (Zwain y Yen, 1999) y se ha demostrado
que la hormona tiene un efecto inhibitorio sobre la proliferacin y la transformacin de
estas clulas (Jung y col., 1992; Ciriza y col., 2004; Grossman y col., 2004; Dhebaili y
col., 2005). Tambin podra suponerse que el efecto de la inhibicin esta relacionado
con la interaccin entre PROG y los niveles del glucocorticoide que se alcanzaron
previamente a la reduccin por parte de la progesterona, ya que algunos estudios in
vitro que estudiaron los efectos de CORT y PROG sobre cultivos de astrocitos han
reportado que el resultado puede ser totalmente opuesto dependiendo de la cantidad,
densidad y tipo de clulas presentes, y por lo tanto se hipotetiza que la presencia de
clulas con receptores a las hormonas, que compiten por los ligandos presentes,
pueden determinar en que direccin reaccionan los astrocitos (Bohn y col., 1994;
Rozovsky y col., 1995).

Finalmente, fue posible observar que adems de la falta de proteccin, la PROG

mostr decrementos importantes en la transformacinde los astrocitos en condiciones
control, esta alteracin de la PROG podria ser explicada por el impacto inhibitorio que

67

tiene la hormona sobre los astrocitos, descrito anteriormente, y ha sido objeto de

reportes similares, por parte de otros experimentos en los cuales el grupo control tuvo
efectos secundarios (Mediratta y col., 2003).
Microglia.
De manera similar a lo observado en los astrocitos, la DHEA inhibi la
inmunorreactividad de astrocitos en el hipocampo en todas las condiciones
experimentales de estrs. Las clulas contabilizadas fueron tan pocas que se decidi
excluirlas del anlisis estadsitico por el sesgo q ue podran producir. La inhibicin de
DHEA sobre las clulas de microglia tambin ha sido demostrada in vitro (Yang y col.,
2000; Wang y col., 2001) e in vivo (Tomas-Camardiel y col., 2001).
De manera general, en las ratas con implate VEHI, pudo observarse una
reduccin significativa de la reactividad y la poblacin microglial en el grupo de
hacinamiento, esto sugiere un efecto inhibitorio de los corticosteroides sobre la
poblacin y transformacin microglial, que ha sidoobservado en otros estudios (Wang y
col., 1998; Moga y col., 2005; Nichols y col., 2005). No existe evidencia experimental
directa que permita explicar el hecho de que los sujetos expuestos a ruido con altos
niveles de CORT no mostraron una inhibicin de la reaccin microglial. Sin embargo,
con base en experimentos en los que se ha observado un rol excitatorio de los
corticosteroides sobre la microglia (Tanaka y cols., 1997; Gonzalez-Perez y col., 2001;
GonzalezCastaneda y col., 2002) es posible hipotetizar que el elevado nivel de
corticosteroides haya generado paralelamente un desequilibrio sobre el medio ambiente
neuronal y que la microglia se haya activado en consecuencia para compensar tal
efecto, de manera que al ser evaluada, el decremento inicial queda compensado y no
se observan cambios aparentes. Asi mismo (Brooke y Sapolsky 2002), han reportado
tambin efectos bidireccionales de los glucocorticoides sobre la reaccin microglial;

inhibicin para estrs agudo yexcitacin para estrs crnico. Estos resultados sugieren
que los niveles de estrs generados por el hacinamiento tuvieron un rol inhibitorio sobre
la poblacin y la transformacin microglial del hipocampo,

68

mientras que el alto nivel de estrs generado por ruido pudo haber estimulado las
clulas microgliales y compensado el efecto.
La inhibicin de la microglia observada en el hacinamiento de VEHI, no fue
revertida con el implante de PROG. A pesar de que la hormona disminuy los niveles
de CORT, las clulas microgliales no mostraron cambios en su respuesta de inhibicin.
Aunque el impacto del factor implante fue significativo solo de manera limtrofe para
algunas de las reas evaluada, este resultado puede obedecer al efecto directo que
tiene la PROG sobre la microglia, pues ha sido reportada la inhibicin de esta hormona
sobre la transformacin microglial (Ganter y col., 1992; Fujita y col., 1996; GarciaEstrada y col., 1999).

69

CONCLUSIONES

Actividad gonadal.
-

Los neuroesteroides progesterona y dehidroepiandosterona inhibieron el incremento de

corticosterona en ratas, despus de 10 das de estrs por hacinamiento o ruido
ultrasnico.

El ruido result el factor estresante ms potente.

Comportamiento.
-

La progesterona ejerci efectos neuroprotectores frente a las alteraciones en la

memoria espacial, generadas por el estrs en las ratas mostrando efectos ansiolticos;
reflejados en la conducta exploratoria.

Por el contrario, la dehidroepiandrosterona no mostr efectos benficos en las ratas

estresadas y en las controles disminuy la habilidad de memoria espacial.
Anlisis Celular.

La progesterona y la DHEA inhibiern la poblaciny reactividad astrocitaria, en las

regiones cerebrales analizadas de los animales estresados.

En los animales con la influencia de progesterona se observ una poblacin microglial

disminuida en todas las regiones analizadas del cerebro de ratas estresadas por
hacinamiento, sin variacin de la morfologa.

70

PERSPECTIVAS Y LIMITACIONES
Un vez concluido este trabajo se propone continuar con la lnea de investigacin,
utilizando

estresores

temprana

edad

en

roedores

castrados

intactos,

(aproximadamente de un mes) como el ruido ultrasnico, hacinamiento o la presencia

de un predador, y aplicar despus de esto pruebas de comportamiento para evaluar
aprendizaje y memoria espacial, as como citoarquitectura glial y neuronal (al 50% de
los animales de experimentacin). Despus de un mes, volver a someter a los mismos
estresores al resto de la poblacin experimental, as como a las mismas pruebas para
evaluar la respuesta a la exposicin temprana del estrs.

Con lo anterior podemos plantear un modelo experimental para el estudio de las

consecuencias de estrs en la poblacin infantil que continuamente se ve sometida a
diferentes tipos de estresores (principalmente ruido y hacinamiento) en etapas muy
tempranas de su vida y que posteriormente pueden modificar su capacidad
cognocitiva.
Una de las limitaciones en este trabajo, fue no haber podido identificar la
microglia en los grupos de animales que fueron implantados con DHEA, en donde se
utilizaron diferentes marcadores, entre ellos; anticuerpos monoclonales anti-OX-42,
receptor de complemento C3Rbi para marcar selectivamente las clulas de la microglia
entre todas las otras clulas gliales del SNC, consiste en la utilizacin de este Ac,
-antagonista del CR3, (Flaris 1993). Este Ac es utilizado para identificar alteraciones en
la distribucin y morfologa de las clulas de microglia, despus de una lesin cerebral,
en el

caso de dao isqumico,estos

Ac OX-42 identifican una condicin

inmunorreactiva de clulas de microglia morfolgicamente transformadas, que se

observan bastante arborizadas y sus procesos son semejantes a los que tpicamente

se distinguen en la microglia en reposo, (McRae 1998). Despus de modificar la

concentracin del Ac primario, y el tratamiento previo desenmascararte no resultaron lo
efectos esperados, ya que no se observ ningn tipo de marcaje.

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