Extraccin de compuestos bioactivos

Se pes 1.5 g de la muestra a analizar (fruta fresca, concentrado de fibra diettica

total), se le aade 30 ml de metanol / agua (50:50) a pH 2.0 acidificado con cido
clorhdrico, posteriormente se procede a licuar durante 1 minuto, con una potencia
de 600 watt a 29000 rpm. A continuacin se lleva a centrifugacin por 15 minutos a
5000 rpm. Se separa el sobrenadante y el residuo se lo somete a una segunda
extraccin con acetona / agua (70:30), repitindose el licuado y la centrifugacin.
Posteriormente estos sobrenadantes se mezclan y se los lleva a un bao
termosttico a 50C para precipitar otros componentes, se almacenan en
congelacin a -12C hasta realizar los anlisis de capacidad antioxidante. (CALIXTO,
S. FULGENCIO, D. JIMNEZ, A. 2003).
MTODO ABTS
Inicialmente el ABTS es oxidado por medio del persulfato de potasio (K2S2O8) para
formar el catin radical ABTS+ que es cuantificable a una longitud de onda de 734
nm. El ABTS+ es un catin radical estable debido a su capacidad de deslocalizar el
electrn desapareado entre los tomos de nitrgeno de su estructura. De esta
manera, el ABTS+ puede reaccionar con el compuesto antioxidante (empleando el
reactivo Trolox como antioxidante estndar), ocasionando la formacin del ABTS
(incoloro) y la oxidacin del compuesto antioxidante. Entre mayor es la CA del
compuesto, mayor es la decoloracin generada sobre el ABTS+ debido a que se
cuantifica la decoloracin del cromforo ABTS+ ocasionada por el proceso de
reduccin. (OSMAN, A..; WONG, K.; FERNYHOUGH, A. 2006).
Segn la metodologa el radical ABTS+ se obtiene tras la reaccin de ABTS (7 mM)
con persulfato potsico (2,42mM, concentracin final) incubados a temperatura
ambiente (25C) y en la oscuridad durante 16 h. Este reactivo se mantiene estable
por 2 a 3 das si se guarda en la oscuridad. Una vez formado el radical ABTS + se
diluye con etanol hasta obtener un valor de absorbancia comprendido entre 0,70
(0,02) a 734 nm y 25C. La absorbancia se mide cada 30 s despus de la adicin
de 1.0 ml de la solucin ABTS+ a 100 l de muestra, homogenizada durante 30s en
forma continua durante 6 minutos. La disminucin de la coloracin es expresada
como el porcentaje de inhibicin de ABTS, la cual es comparada con una curva
estndar del antioxidante sinttico de referencia, trolox (20-200mol/l). Los
resultados se expresan como mol de trolox equivalente por gramo de muestra
fresca.
MTODO DE FOLIN & CIOCALTEAU
El mtodo de FolinCiocalteau es utilizado para determinar los Polifenoles Totales
utilizando el reactivo Folin - Ciocalteu (solucin de cido fosfomolbdico y cido
fosfowolfrmico) que oxida los compuestos polifenlicos a fenolatos en medio
alcalino, formando un complejo de molibdeno tungsteno de color azul.
Se mezcl 20l de muestra, 1L solucin Folin & Ciocalteau (0,2 N) y 500 l de
Na2CO3 (75 g/l). La mezcla es homogenizada y calentada a 45 C, se mide la
absorbancia a 765 nm. La absorbancia final de cada muestra es comparada con una
curva estndar de cido glico (40-200 mg/l).Los resultados fueron expresados
como mol equivalentes de cido galico (GAE) por gramo de muestra fresca 22.

Metodologa experimental
Preparacin de las muestras: Se trabaj con frutas sanas y firmes que
fueron lavadas con agua destilada; el aguaymanto entero fue licuado
durante 30 segundos; la papaya de monte se cort en mitades para eliminar
el muclago interno y se procedi a licuar durante 1minuto; las tunas fueron
peladas y licuadas durante 30 segundos; el tomate de rbol fue separado en
cscara, pulpa y pepas; cada uno de stos fue licuado durante 1 minuto;

todas las frutas fueron inmediatamente usadas para la preparacin de

extractos.
Preparacin de los extractos:
A. Fenoles totales y capacidad antioxidante con los mtodos DPPH
y ABTS: Para todas las muestras se pes 2,5 gramos de muestra y se
aadi 12,5 mL de metanol; se homogeniz la muestra con un agitador
magntico durante 15 minutos y se almacen el extracto durante 24 horas
a 4C en oscuridad; luego, se procedi a centrifugar el homogenizado
durante 20 minutos a 5000 rpm; el sobrenadante se guard para anlisis
posteriores y el precipitado fue eliminado.
Para los ensayos con DPPH, se tom alcuotas del extracto obtenido: para
aguaymanto, tomate de rbol y tuna se tom 150 mLy para papaya de
monte 50 mL.
Para los ensayos de ABTS, se tom 50 mLdel extracto de aguaymanto y
papaya de monte y 150 mLdel extracto de tuna y tomate de rbol.
B. Vitamina C: Los extractos para la determinacin de vitamina C en frutas
se prepar segn Luximon-Ramma. (Luximon-Ramma, A.; Bahorun, T. and Crozier, A.
2003. Antioxidant actions and phenolic and vitamin C contents of common Mauritian exotic fruits.
Journal of the Science of Food and Agriculture. 83. 496-502.)
2.5 Determinacin de la actividad antioxidante
2.5.1 Medicin de la actividad antioxidante
La actividad antioxidante no puede ser medida directamente, pero puede determinarse por los efectos del
compuesto antioxidante en un proceso de oxidacin controlado. Segn Clarkson, (1995), la medicin de
una muestra oxidante, pueden usarse intermediarios o productos finales para valorar la actividad
antioxidante.
La actividad antioxidante de una muestra no puede ser determinada basndose solo en un ensayo de
prueba. En la prctica se realizan muchos modelos de test in vitro (tabla 1) para evaluar la actividad
antioxidante de la muestra de inters; sin embargo, es necesario considerar que los modelos presenten
diferentes variaciones puede dificultar un poco la comparacin de los resultados entre un mtodo y otro.
Con base a las reacciones qumicas, la gran mayora de los ensayos para determinar de capacidad
antioxidante pueden ser divididos en dos categoras: (1) Ensayos basados en la reaccin por transferencia
de tomos de hidrgeno (HAT) y (2) Ensayos basados en la reaccin por transferencia de electrones (ET)
(Huang et al., 2005).
Tabla 1. Clasificacin de los modelos de ensayo in vitro segn su modo de reaccin ET o HAT

Los ensayos basados en la transferencia de electrones (ET) involucran una reaccin redox con el oxidante
como un indicador del punto final de reaccin.
La mayora de los ensayos basados en HAT monitorean una reaccin cintica competitiva, generalmente
estn compuestos de un generador de radical libre sinttico, una prueba molecular oxidable y un
antioxidante. Los ensayos basados en HAT y ET fueron desarrollados para medir la capacidad de atrapar
radicales libres, en lugar de la capacidad preventiva antioxidante de una muestra (Huang et al., 2005). En
la figura 7 se muestran las reacciones especficas para los ensayos basados en la transferencia de
electrones y en la transferencia de tomos de hidrgeno.
En los ltimos aos se han adoptado un amplio rango de ensayos espectrofotomtricos para medir la
capacidad antioxidante de los alimentos, muestras biolgicas y extractos vegetales. Usualmente los
ensayos antioxidantes in vitro utilizan un captador de radicales libres y son relativamente sencillos de

realizar. Entre los ensayos de captacin de radicales libres, el mtodo DPPH es el ms rpido, es simple
(no incluye muchos pasos) y de menor costo en comparacin con otros modelos. Por otro lado, el ensayo
de decoloracin ABTS+ se puede aplicar a antioxidantes hidroflicos y lipoflicos (Alam et al., 2012).
Por lo anterior, estos dos mtodos son los ms utilizados.
Ensayo ABTS+ (Acido 2,2-azino-bis-3-etilbenzotiazolin-6-sulfonico)
La generacin del radical ABTS+ constituye la base de uno de los mtodos espectromtricos que han
sido aplicados para medir la actividad antioxidante total de soluciones o sustancias puras y mezclas
acuosas. El ensayo original de ABTS+ estaba basado en la activacin de la metilmioglobina con
perxido de hidrgeno en presencia de ABTS para producir un radical catin, en presencia o ausencia de
antioxidantes. Este fue criticado debido a que la reaccin rpida de los antioxidantes, contribuye a la
reduccin del radical ferrilmioglobina. Unformato ms apropiado para el ensayo consiste en la tcnica de
decoloracin, en la cual el radical es generado directamente en una forma estable antes de la reaccin con
los antioxidantes (Re et al., 1999).
La tcnica mejorada para la generacin del radical catin ABTS+, implica la produccin directa del
cromforo ABTS+ verde-azul a travs de la reaccin entre ABTS y el persulfato de potasio (K2S2O8).
Este presenta tres mximos de absorcin a las longitudes de onda de 645 nm, 734 nm y 815 nm. La
adicin
de los antioxidantes al radical pre-formado lo reduce a ABTS. De esta manera el grado de decoloracin
como porcentaje de inhibicin del radical catin ABTS+ est determinado en funcin de la
concentracin y el tiempo; asi como del valor correspondiente usando el Trolox como estndar, bajo las
mismas condiciones.
2.6 Contenido de fenoles totales por el reactivo de Folin-Ciocalteu (F-C)
El ensayo de Folin-Ciocalteu (F-C) es un mtodo comnmente utilizado en el rea de agroqumica e
industrias alimenticias, por su simplicidad, por la disponibilidad comercial del reactivo y por ser un
procedimiento ya estandarizado (Singleton et al., 1999). Inicialmente, fue aplicado al anlisis de protenas
tomando como ventaja la actividad del reactivo frente al residuo de protena, tirosina (que contiene un
grupo fenol). Muchos aos despus este ensayo se extendi al anlisis de fenoles totales en vino y desde
entonces se le ha encontrado muchas aplicaciones.
El reactivo de F-C utiliza un mecanismo de reaccin de oxidacin/reduccin, que no es especfico para
fenoles. De hecho, el ensayo de F-C mide la capacidad para reducir el reactivo de cido
fosfomolibdico/fosfotungstico a un complejo azul que es monitoreado espectrofotomtricamente, donde
el molibdeno es reducido en el complejo y se da la reaccin de transferenciencia de electrones entre el
Mo(iv) y el reductor como se muestra en la figura 10 (Huang et al.,2005). El mtodo implica la oxidacin
de fenoles en solucin alcalina por el heteropolianin molibdotungstofosfrico amarillo y la medicin
colorimtrica
del molibdotungstofosfato azul resultante. Este complejo azul tiene su mxima absorcin dependiendo de
su composicin fenlica, adems del pH de las soluciones implicadas (Cicco et al., 2009).
En el ensayo F-C original, se usa el buffer de carbonato para ajustar el pH y el punto final de reaccin se
alcanza a los 120 min aproximadamente a temperatura ambiente. Aunque es un tiempo demasiado extenso
y dificulta la implementacin de un anlisis de rutina, an es utilizado por algunos investigadores. En
diferentes trabajos se ha variado concentracin del reactivo, alcalinidad y temperatura, buscando una
reduccin significativa del tiempo necesario para llegar a un estado estacionario. Magalhes et al., (2010)
adapt el mtodo, en el cual se varia la alcalinidad, al reemplazar el buffer de carbonato por una solucin
de hidrxido de sodio logrando disminuir el tiempo de reaccin a 4 min y conseguir resultados altamente
confiables. Al final se debe tener muy presente la concentracin alcohlica en la mezcla, puesto que
segn Singleton et al., (1999) el incluir solventes diferentes al agua en las muestras, algunas veces puede
interferir la formacin de la solucin azul.

Soluciones Osmticas
2. Pesado de edulcorantes: Se pesaron los dos edulcorantes utilizados Sacarosa (350 g) y Miel de abeja
(433 g).
3. Pesado de agua: La cantidad de agua utilizada fue de 150 g para el jarabe de sacarosa y 67 g para el
jarabe de miel de abeja. La cantidad de jarabe para cada tratamiento fue de 500 g.

Soluciones ternarias
La solucin osmtica ternaria (sacarosa/ sal/ agua) utilizada en cada corrida experimental fue preparada
mezclando cantidades necesarias de sacarosa (40, 50 y 60 g/100g solucin) y cloruro de sodio (3, 6 y 9
g/100g), ambos de grado comercial, con adicin apropiada de agua destilada de acuerdo al diseo
experimental utilizado.
Preparacin de los edulcorantes
Jarabe de sacarosa: Se diluyeron 200 g de azcar comercial en agua destilada hasta alcanzar 30o Brix. El
pH final 6,0.
Jarabe de miel: Se diluyeron 200 g de miel de abejas en agua destilada hasta alcanzar 30o Brix. El pH
final 4,0.
Crema de miel: Extrada del panal en su estado natural con 75o Brix y pH 4,5.