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DETERMINACIN CUANTITATIVA DE PROTEINAS

INTRODUCCION:
Se han descrito muchos mtodos diferentes para la determinacin
cuantitativa de protenas. Estos mtodos difieren entre s en
sensibilidad, existencia de interferencias, exactitud y sencillez. La
seleccin del mtodo adecuado se realiza considerando las
caractersticas de las muestras que se desea analizar, que pueden ser
extractos de tejidos o clulas animales o vegetales, lquidos biolgicos
de inters en bioqumica clnica (suero, orina), muestras obtenidas en el
curso de la purificacin de una protena, fracciones de una columna
cromatogrfica, muestras de una protena pura, etc.
En general los mtodos utilizados para la determinacin cuantitativa de
protenas consisten en la determinacin absorciomtrica directa o en
ensayos de tipo colorimtrico, turbidimtrico o fluoromtrico.
Absorciometra de protenas
La mayora de las protenas presentan un mximo de absorbancia a 280
nm aproximadamente, debido principalmente a la presencia de residuos
de triptfano y tirosina, y en mucha menor proporcin fenilalanina. Los
residuos de histidina, cistena y cistina tambin presentan bandas de
absorbancia en el ultravioleta cercano, pero se encuentran a menores
longitudes de onda y son de menor intensidad. La posicin exacta del
mximo de absorbancia, as como el coeficiente de extincin molar de
una protena depende de su composicin aminoacdica. Por consiguiente,
solamente para soluciones de una protena pura, conocida, cuyo
coeficiente de extincin se ha determinado previamente, se puede
calcular la concentracin a partir de su absorbancia.
Se han efectuado estimaciones de la concentracin total de protenas en
mezcla a partir de la absorbancia a 280 nm (A280) o usando la razn
A280/A260 (mtodo de Warburg), que permite corregir el error debido a
la contaminacin por cidos nucleicos, los cuales presentan un mximo
de absorbancia a 260 nm. Las protenas tambin absorben fuertemente
a longitudes de onda menores a 240 nm, debido principalmente a la
contribucin de los residuos de aminocidos aromticos, as como de los
enlaces peptdicos (bajo los 220 nm). La literatura describe mtodos
para efectuar estimaciones de concentracin utilizando la absorbancia en
esta regin. Sin embargo, todas estas estimaciones pueden llevar a un
error considerable debido a la presencia de contaminantes o a una
composicin aminoacdica atpica.

Ensayos colorimtricos
Los ensayos ms usados son los de Biuret, de Bradford, de Lowry y el
ensayo usando cido bicinconnico (BCA). Los ensayos de Biuret y de
Bradford se utilizarn en el presente prctico. El ensayo de Lowry es de
sensibilidad algo menor que el de Bradford (0,025 - 0,5 mg/ml), sin
embargo es ms confiable, pero es ms complicado.
Cuantificacin de protenas por el mtodo de Biuret
El reactivo de Biuret (sulfato cprico en medio alcalino), reacciona con
compuestos que contienen dos o ms enlaces peptdicos dando una
coloracin violeta. El color desarrollado se debe a un complejo de
coordinacin entre el Cu+2 y cuatro tomos de nitrgeno que provienen
de dos cadenas peptdicas. El mtodo de Biuret sirve para la
determinacin de concentraciones entre 10 y 100 mg/ml.
Los dipptidos y los aminocidos (excepto serina y treonina) no dan esta
reaccin. Interferencias: pptidos, Tris, sacarosa y pigmentos biliares
tambin generan el color, sales de amonio y sacarosa afectan el color.
PARTE EXPERIMENTAL
1. ENSAYO DE BIURET
MATERIALES
- Preparacin Reactivo de Biuret:
Colocar 1,5 g de sulfato de cobre (CuSO 4 x 5 H2O) y 6 g de tartrato de
sodio y potasio (NaKC4H4O6 x 4 H2O) en un vaso de 1000 ml. Agregar
alrededor de 500 mL de agua destilada y agitar hasta disolucin.
Agregar lentamente y agitando constantemente, 300 mL de hidrxido de
sodio 2,5 N. Las dos soluciones deben estar a temperatura ambiente.
Agregar 1,0 g de ioduro de potasio y agitar hasta que est totalmente
disuelto. Diluir a 1000 mL y guardar en frasco de polietileno. Este
reactivo es estable indefinidamente. (Se entregar preparado).
- Espectrofotmetro.
- Solucin patrn de albmina 80 g/L
PROCEDIMIENTO
CURVA DE CALIBRACION
Atencin: realice el ensayo de la muestra en forma paralela a la curva
de calibracin. - Disponga de seis tubos y coloque en ellos los
volmenes de solucin que se indican en la tabla:

Tubo

Material

Agua

Muestra

Biuret

Concentracin

referencia

destilada

(L)

(mL)

(mg/mL)

(L)

(L)

15

10

10

15

20

Blanco

20

Muestra

20

NOTA: Debe calcular la concentracin de protenas en cada tubo.


Luego de agregar el reactivo de Biuret deje desarrollar color durante 30
min, luego mida A540 contra el blanco.
Cuantificacin de protenas por el mtodo de Bradford
Este mtodo utiliza la propiedad del colorante azul de Coomassie G-250
de unirse a las protenas. El colorante libre presenta un mximo de
absorcin a 465 nm mientras que cuando est unido a protenas ste se
encuentra a 595 nm. El colorante parece unirse ms fuertemente a
residuos de arginina y lisina lo cual puede llevar a variacin en la
cuantificacin de distintas protenas (ver Tabla). El colorante no se une a
arginina o lisina libre o a pptidos menores a 3 kDa.

El rango lineal del ensayo estndar de 1 ml es de 1251000 g/mL para


BSA y de 1251500 g/ml para gama globulinas. En general se utiliza

para cuantificar entre 10 y 100 g de protena en el tubo. La curva de


calibracin es ligeramente curva. El mtodo de Bradford se lineariza
midiendo la razn de absorbancias entre 595 y 450 nm.
Interferencias: Detergentes y lcalis reducen el color. Se recomienda
medir entre los 5 y 10 minutos de reaccin, debido a que el color no es
estable en el tiempo, ya que la protena y el complejo colorante-protena
precipita debido al medio cido. Este efecto es especialmente
significativo a las concentraciones mayores de protenas. Por otra parte
el complejo protena-colorante tiende a unirse a las cubetas tindolas,
por lo cual se recomienda un lavado final con etanol.
ENSAYO DE BRADFORD
MATERIALES
Preparacin Reactivo de Bradford:
Disolver 100 mg de azul de Coomassie G-250 (Sigma) en 50 mL de
etanol 95% (siempre queda un ligero residuo insoluble). Agregar
lentamente 100 ml de cido fosfrico 85% p/v y luego completar a 1000
ml con agua destilada. Dejar el reactivo en reposo todo un da y luego
filtrar. El reactivo debe filtrarse toda vez que presente residuo o que el
blanco de reactivo medido contra agua presente una absorbancia mayor
a 0,5. (Se entregar preparado).
-Solucin patrn de albmina 1 mg/mL
- muestra
-Espectrofotmetro.
PROCEDIMIENTO
En forma similar a lo descrito para el ensayo de Biuret, disponga de
siete tubos y coloque en ellos los volmenes de solucin que se indican
en la tabla:
Realice el ensayo de la muestra en paralelo al de los estndares.

CURVA DE CALIBRACION

TUBO
Agua (L)

6
20

M
---

Estndar(L)

7,5

10

15

20

---

---

Muestra (L)
R. Bradford
(mL)
Conc.
Protena

--1

--1

--1

--1

--1

--1

20
1

NOTA: Debe calcular previamente el volumen de agua a agregar


los tubos 1-5 y la concentracin de protena en cada tubo.
- Luego de agregar el reactivo de Bradford, mezcle en Vortex y espere al
menos 5 minutos antes de medir A595 contra el blanco (tubo 6).
BIBLIOGRAFIA
Methods in Enzymology Vol. 3 pg. 447
Bradford, M.M., Analytical Biochemistry 72, 248 - 254 (1976)
The Protein Protocols Handbook (2002) Segunda edicin Ed. John M.
Walker Humana Press Nueva Jersey Estados Unidos.