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EFECTO DE LA TEMPERATURA

Objetivos:

Determinar la temperatura ptima en la cual la actividad enzimtica


de la pepsina es mxima.

Determinar que la actividad enzimtica en un ensayo depender de la


energa cintica de las molculas y de la estabilidad de la enzima
pero estas reacciones se aceleraran por efecto de la temperatura.

Como vimos en el punto anterior se presentaran dos respuestas


diferentes en una aumenta la velocidad de reaccin (enzima
permanece relativamente estable); en la otra disminuye la velocidad,
pero en ambos casos la obtencin de productos depender del tiempo
que transcurre, la T ptima depender del tiempo y de factores como
la fuerza inica.

Materiales y equipos:
Gradillas y tubos de ensayo.
Pipetas de vidrio.
Solucin de albumina [250mg/dl].
Solucin de pepsina 0,01g/dl.
HCl, 1N.
Agua destilada.
Espectrofotmetro.
Bao Mara 37C.

Mtodo y Procedimiento:

Se prepararon dos bateras de tubos:

Primera batera:

Tubo N

1a
2
3a
B

H2O mL

3.5
3.5
3.5
4

HCl 1N

0.5
0.5
0.5

--

Albumina mL

5
5
5
5
Segunda batera:

Tubo N
1b
2b
3b
--

Pepsina mL

1
1
1
--

Se pre-incubaron los 6 tubos a 37 C por 5 minutos siguiendo el


siguiente orden y temperatura.

Tubos N
1a y 1b
2a y 2b
3a
3b
Temperatura C
0(hielo)
37
37
100

Se mezcl el contenido de los tubos 1a, 2a y 3a con sus respectivos


tubos 1b, 2b y 3b.

Tubo N
Mezcla 1a+1b
Mezcla 2a+2b
Mezcla 3a+3b
Temperatura C

0(hielo)
37
37
Luego se incub los tres tubos a las siguientes temperaturas por 5
minutos.

Se ley las absorbancias en el espectrofotmetro a 420 nm y


se hall la actividad enzimtica por diferencia entre la lectura
del tubo blanco (B) menos las lecturas de los respectivos
tubos.

Resultados:

Actividad enzimtica(y) vs. T(x)


0.3
0.25
0.2

Actividad enzimtica(y) vs.


T(x)

0.15
0.1
0.05
0
T 0C

T 37C

T 100C

Discusin
Como hemos podido observar en los resultados obtenidos la
grfica que esbozamos en base a los datos obtenidos por las
absorbancias de los diferentes tubos donde el blanco (B) no
contena enzima y en base a su absorbancia fuimos restndole
las absorbancias de cada uno de los diferentes tubos

obteniendo medidas adecuadas segn lo visto en la teora ya


que debamos encontrar la temperatura de trabajo ptima para
la pepsina, por otra parte al colocar el tubo 3b que contena
solamente la enzima a una T de 100C esperbamos que al
combinarlo con el tubo 3a y ponerlos a bao mara a una T de
37C la absorbancia final nos resultase como la del tubo blanco
(B) puesto que dicha enzima pudo haberse desnaturalizado a
dicha temperatura de 100C pero debido a que solo fue
expuesta a dicha temperatura por un periodo de 5 minutos
pudo no haber una desnaturalizacin completa de la enzima o
alguna de ellas no debieron haberse desnaturalizado pudiendo
observar la actividad residual de la enzima o como algunos
textos dicen que ciertas enzimas pueden volver a
regenerarse y su actividad se renueva en un periodo de
tiempo, dicha regeneracin sera el resultado de una
reorganizacin al menos parcial de la molcula restablecindose
la estructura de los sitios activos que habran sido alterados por
la desnaturalizacin.

Conclusiones
Como podemos observar la actividad enzimtica ser mayor a
una T de 37 C entonces esta ser la temperatura ptima para
la actividad enzimtica.
Al aumentar la temperatura, la actividad enzimatica aumenta
sin embargo, ese mismo aumento de temperatura acelera
tambin la inactivacin de la enzima por desnaturalizacin
trmica. Para muchas enzimas la regin de inactivacin trmica
extensiva est muy prxima de la temperatura ptima.

EFECTO DEL TIEMPO

Objetivos:

Determinaremos la variacin del sustrato en el transcurso del tiempo


de la reaccin de la actividad enzimtica.
Determinar que la obtencin de productos depender del tiempo que
transcurre la reaccin.

Materiales y equipos:
Gradillas y tubos de ensayo.
Pipetas de vidrio.
Solucin de albumina [250mg/dl].
Solucin de pepsina 0,01g/dl.
HCl, 1N.
Agua destilada.
Espectrofotmetro.
Bao Mara 37C.

Mtodo y Procedimiento:

Se prepararon la siguiente serie de tubos:

Tubo N

1
2
3
4
5
6

H2O mL

4.5
3.5
3.5
3.5
3.5

HCl 1N

0.5
0.5
0.5
0.5
0.5

Albumina mL

5
5
5
5
5

Pepsina mL

Primero incubamos los tubos por 5 minutos a 37C.


Llevamos al espectrofotmetro el tubo 1 y leemos su
absorbancia a 420 nm, nuestro tiempo de reaccin ser el de 0
minutos para este tubo.
Luego aadimos 1ml de pepsina al tubo 2, mezclamos bien por
inversin y lo llevamos a incubar a 37C por 2 minutos, para
sacarlo rpidamente y llevarlo a leer inmediatamente a 420nm
al espectrofotmetro.
De igual manera aadimos 1ml de pepsina al tubo 3,
mezclamos bien por inversin y llevamos a incubar a 37C esta
vez por 4 minutos, para sacarlo rpidamente y llevarlo a leer
inmediatamente a 420nm.
Lo mismo aadimos 1ml de pepsina al tubo 4, mezclamos bien
por inversin y llevamos a incubar a 37C pero esta vez por 6

minutos, para sacarlo rpidamente


y llevarlo a leer
inmediatamente a 420nm al espectrofotmetro.
Por ltimo aadimos 1ml de pepsina al tubo 5, mezclamos bien
por inversin y llevamos a incubar a 37C esta vez por 8
minutos, para sacarlo rpidamente
y llevarlo a leer
inmediatamente a 420nm al espectrofotmetro.
Construimos una grfica del tiempo vs la absorbancia.

Absorbancia (y) VS Tiempo (x)


0.45
0.4
0.35
0.3

Absorbancia (y) VS
Tiempo (x)

0.25
0.2
0.15
0.1
0.05
0
t 0

t 2

t 4

t 6

t8

Luego construimos una segunda grafica restando a la


Absorbancia del tubo 1 las lecturas de cada uno de los otros
tubos y con estos valores graficamos con el tiempo de reaccin
correspondiente.

Actividad cataltica (y) VS Tiempo (x)


0.18
0.16
0.14
0.12

Actividad cataltica (y) VS


Tiempo (x)

0.1
0.08
0.06
0.04
0.02
0
t 2

t 4

t 6

t8

Discusin
Como hemos podido observar en los resultados obtenidos con
respecto en una primera parte a la relacin que existe entre la
absorbancia y el tiempo transcurrido, gracias a los valores
obtenidos nos hemos podido dar cuenta que la absorbancia va
disminuyendo en el tiempo al evaluar los distintos tubos que
contenan la misma cantidad de sustrato y enzima siendo el
factor tiempo el que nos permiti hacer dicha evaluacin,
siendo esta una relacin apropiada que se condice con lo que
esperbamos tericamente, cabe sealar que en el tubo uno
solo haba la presencia de sustrato ms no de enzima, lo cual
nos permiti ser utilizada como blanco, al no haber actividad
cataltica, para el diseo de nuestra segunda grfica en la cual
evaluamos la actividad cataltica con respecto al tiempo, la cual
es consecuencia de la primera grfica por ende el resultado fue
el apropiado ya que la primera grfica fue la esperada
tericamente.
Conclusiones
La grafica de absorbancia vs tiempo nos permite ver que la
concentracin del sustrato en los tubos disminuye en el tiempo,
ya que por la LEY DE BEER sabemos que a menor concentracin
de sustrato habr una menor absorbancia, pues las molculas
del sustrato al estar disminuyendo harn que se capte menor
cantidad de luz.

La grafica de la actividad cataltica vs tiempo nos permite


visualizar que dicha actividad va aumentando en el tiempo, ya
que como pudimos observar en la primera grafica el sustrato va
ir disminuyendo en el tiempo lo que nos hace dar cuenta que la
enzima est realizando mayor actividad conforme avanza el
tiempo.
Existe una relacin inversa entre la absorbancia y la actividad
cataltica con respecto al tiempo.

CUESTIONARIO
1. Por qu en la curva de la actividad (VS) concentracin
de la enzima no se obtiene una lnea recta?
La velocidad de la reaccin es directamente proporcional a la
concentracin de la enzima a cualquier concentracin de
substrato. Por ejemplo, si la concentracin de enzimas es
disminuida a la mitad, la velocidad inicial de la reaccin (v0) es
reducida tambin a la mitad de la original, por tanto se obtiene
una lnea recta en la grfica de la actividad vs la concentracin.
Ahora por otra parte se nos pregunta por qu no se obtendra
una lnea recta en la grfica y esto se podra deber a que la
actividad cataltica de las enzimas depende estrictamente de la
conformacin de la protena enzimtica, es decir de su
estructura
tridimensional.
Por
ello,
los
cambios
conformacionales suelen ir asociados a cambios en la eficacia
cataltica de las enzimas.
La linealidad se puede ver afectada tambin por la cantidad de
sustrato y que esta haya sido limitante en la reaccin, esto
quiere decir que el sustrato llego a agotarse.
Cuando existe un inhibidor dentro de la reaccin la linealidad en
el grfico se ver alterada as tambin como cuando existan
activadores presentes en la reaccin.
Los inactivadores tales como metales pesados en la mezcla de
la reaccin tambin alteraran el orden de la grfica.
2. Qu le ocurre a las enzimas cuando son sometidas a
temperaturas superiores a los 65C?
Puesto que la estructura proteica es la que determina la
actividad enzimtica, cualquier causa que perturbe esta
estructura puede llevar a una prdida de actividad. Aunque el
rango general de temperaturas adecuadas para las reacciones
enzimticas es muy estrecho, los cambios ligeros suelen tener
una considerable influencia. La temperatura ptima para la

mayora de las reacciones enzimticas est, con pocas


excepciones, entre 30C y 40C, en que la actividad es mxima.
Al aumentar la temperatura, la velocidad de reaccin aumenta
y, para casi todas las enzimas, un incremento de 10C duplica e
incluso triplica la velocidad de reaccin.
Por otro lado, sin embargo, ese mismo aumento de
temperatura acelera tambin la inactivacin de la enzima por
desnaturalizacin trmica. Para muchas enzimas la regin de
inactivacin trmica extensiva est muy prxima de la
temperatura ptima.
Las enzimas muestran, a menudo, una marcada fragilidad
trmica. Cuando se calientan a temperaturas superiores a los
50C la mayora de las enzimas, pero no todas, se denaturan.
Habitualmente la desnaturalizacin a alta temperatura es
irreversible, debido a que se rompen las fuerzas dbiles de
enlace al aumentar la vibracin trmica de los tomos
componentes, fenmeno que daa la estructura tridimensional.
La mayora de las enzimas son, pues, muy termolbiles y
habitualmente es suficiente aplicar una temperatura de 40 a
80C por 2 a 5 minutos, a fin de destruir su actividad.
3. Existen enzimas que son capaces de mostrar actividad
a temperaturas superiores a los 70?cite varios
ejemplos.
Una de las respuestas de los microorganismos hipertermfilos
para adaptarse a altas temperaturas, es la produccin de
enzimas
termoestables
llamadas
extremo-enzimas
con
actividad ptima a temperturas mayores de 70C. Pequeos
cambios de aminocidos en puntos clave permiten que la
protena se pliegue en forma diferente, proporcionndole
estabilidad o resistencia al calor.
Entre ellas tenemos:
AMILASAS: degradan el almidn.
Alfa-amilasas.
Pululanasa tipo 1.
Pululanasa tipo 2.
Ciclo dextrina glucosil-transferasa.
CELULASAS: Hidrolizan la celulosa en glucosa.
Endogluconasa.
Exogluconasa.

Beta-glucosidasa.
Producen alcohol.
Xilanasas.
Endoxilanasa.
PROTEASAS: Hidrolizan las protenas a pptidos y aminocidos.
Sern proteasa.
Pirolisina.
Tiol proteasa.
cido proteasa termosina.
Carboxi-peptidasa.
Termo lisina.
Aqualisina.
Caldolisina.
Archaelisina.
Vibriolisina.
LIPASAS: Hidrolizan lpidos en cidos grasos y glicerol.
ADN polimerasas: Claves en la replicacin de la informacin
celular, sintetizan una nueva cadena de ADN de 5a 3 a partir
de ARN.
HIDROLASAS: Hidrolizan el galacto-manano en monosacridos.
Beta- manasa.
Beta- manosidasa.
Alfa-galactosidasa.
OXIDOREDUCTASAS
Piruvato oxidoreductasa.
Aldehdo oxidoreductasa.
Indolpiruvato oxidoreductasa.
DIHIDROGENASAS
Glutamato dehidrogenasa.
Sulfuro dehidrogenasa.