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3B-2
GUIA DE PRCTICAS
HISTOTECNOLOGA
F-GA-04A-3
PRACTICA N 1
HISTOTECNOLOGA: BIOSEGURIDAD Y TOMA DE MUESTRAS
Marco Terico
Es la ciencia que estudia los fundamentos tcnicos y la secuencia de manipulaciones
necesarias para llevar a cabo el anlisis de los tejidos de los seres vivos.
Bioseguridad es un concepto amplio que implica una serie de medidas orientadas a
proteger al personal que labora en un laboratorio, visitantes y al medio ambiente que
pueden ser afectados como resultados de la actividad Histotecnolgica
La calidad es un modelo de gestin y un estilo de direccin implantado en los
laboratorio de Histotecnologa.
Muestra Histolgica es toda muestra de tejidos obtenida de un individuo o animal sano
con la finalidad de investigar su estructura y composicin normales.
Competencia Especfica
Explica los fundamentos de las tcnicas histotecnolgicas como metodologas
cientficas coadyuvantes en el diagnstico histopatolgico
Propone procedimientos de Bioseguridad y Calidad como elementos fundamentales en
Histotecnologa.
Material y Mtodos
Rtulos de Bioseguridad.
Microscopio Binocular.
Bao de Flotacin
Micrtomo de Rotacin Manual.
Lmina Histolgica de Piel
Lmina Histolgica de Cerebro.
Lmina Histolgica de Hgado.
Acido Clorhdrico QP
Formaldehido al 40%
Alcohol Absoluto
Acido Pcrico
Piezas Anatmicas Completas fijadas
Instrumental y Material de diseccin
Procedimiento
Observa y esquematiza los procedimientos en Histotecnologa, desde la toma de
muestras hasta la lmina histolgica.
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Fuentes de Informacin
Carson F. Histotechnology. Chicago: ASCP; 2006.
Garcia Del Moral R. Laboratorio de anatoma patolgica. Mxico D.F.: McGraw Hill;
2010.
Prophet E, Mills B, Arrington J, Sobn L. Mtodos histotecnolgicos. Washington,
D.C.: ARP; 2009.
PRACTICA N 2
FIJACIN DE TEJIDOS
Marco Terico
Es la interrupcin de los procesos degradativos que aparecen tras la muerte celular,
tratando de conservar la estructura y composicin tisular lo ms cercanamente posible
a como se encontraba en el organismo vivo.
Competencia Especfica
Describe diversos tipos de fijadores como elementos fundamentales en la obtencin de
Histogramas.
Explica los fundamentos de los diferentes procedimientos de fijacin en
Histotecnologa.
Material y Mtodos
Agua Destilada.
Formaldehdo al 40%.
Alcohol Absoluto
Acido Pcrico
Acido Actico Glacial
Cloruro de Mercurio.
Dicromato Potsico.
Sulfato Sdico.
Piezas Anatmicas Completas
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Equipo de Diseccin
Alcoholimetro
Procedimiento
Observa y ejecuta los procedimientos de Fijacin en diversos tipos de tejidos.
Prepara fijadores especficos para cada tipo de coloracin segn el tipo de anlisis a
realizar.
Cuestionario
1.
2.
3.
4.
Fuentes de Informacin
Lillie R. Biological stains. 8 ed. Baltimore: Waverly; 2008.
Sheehan D, Hrapchak B. Histotechnology. 2 ed. Columbus: Battelle; 2006.
Troyer H. Histochemistry. Boston: Little, Brown And Company; 2006.
FORMOL SALINO
Se utiliza para prevenir el choque osmtico que provoca el empleo de disoluciones de
formaldehdo en agua destilada.
Preparacin: Disolver 9 gramos de Cloruro de Sodio en 1000 mL de Formalina al 10%
FORMALINA NEUTRA
Se utiliza para neutralizar el exceso de cido Frmico generado por la oxidacin
espontnea del Formaldehdo.
Preparacin: Aadir a la solucin de Formalina al 10% una pequea cantidad de
Carbonato Clcico insoluble que quedaba depositado en el fondo del recipiente.
FORMOL TAMPONADO
Se utiliza para prevenir el choque osmtico que provoca el empleo de disoluciones
formaldehdo en agua destilada, as como el deposito de Pigmento Formlico que
ocurre a pH inferior a 6.
Preparacin: Como amortiguador se emplea el tampn fosfato calibrado n pH 7,0 7,2
Formalina Pura: 100,0 mL
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FORMOL CIDO
Se utiliza para fijar tejido nervioso en la preparacin de algunas tcnicas de
Impregnacin Argntica.
Preparacin: Aadir una parte de cido Actico Glacial a 99 partes de Formalina al
10%. Con ello se consigue un pH en torno a 2.
FORMOL CLCICO
Se utiliza en tcnicas de Histoenzimologa, ya que los iones de calcio estabilizan las
molculas enzimticas, cuando es empleado a 4 C.
Preparacin: Aadir Cloruro Clcico al 1 por 100 a una solucin de Formalina Neutra o
Tamponada al 10%.
BOUIN
cido Pcrico 2%(750 mL) + Formol (250 mL) + cido Actico Glacial (50 mL)
ZENKER
Zenker Stock = Cloruro Mercrico (5gr) + Dicromato Potsico (2,5 gr) + Sulfato Sdico
(1gr) + H2O (1L)
Solucin de Trabajo de Zenker = Zenker Stock (95mL) + Formaldehido 40% (5mL)
PRACTICA N 3
PROCESAMIENTO DE TEJIDOS
Marco Terico
Las muestras para estudio Anatomopatolgico pueden ser procesados de muy diversas
maneras, en funcin de:
La naturaleza de la muestra
Tipo de estudio a a realizar
El Procesamiento de Tejidos para estudios Antomo Patolgicos consiste en:
Deshidratacin.-: Es el proceso que tiene por finalidad la eliminacin completa del
agua de la muestra tisular para que el tejido pueda embeber ( absorber ) otros
reactivos que no sean Hidrosolubles.
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Agua Destilada
Alcohol Absoluto
Xilol
Parafina
Estufa
Alcoholimetro
Sulfato de Cobre
Cubetas de Procesamiento
Pipetas
Piezas Anatmicas Completas
Equipo de Diseccin
Cassettes Plsticos para Inclusin en Parafina
Procedimiento
Acondiciona estaciones de procesamiento histotecnolgico para diversos tipos de
tejido.
Observa y ejecuta los procedimientos de Deshidratacin, Aclaramiento e
Impregnacin.
Cuestionario
1.
2.
3.
4.
Fuentes de Informacin
Garcia Del Moral R. Laboratorio de anatoma patolgica. Mxico D.F.: McGraw Hill; 2010.
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Bateria de Procesamiento
Agua Corriente
Alcohol al 60%
Alcohol al 70%
Alcohol al 80%
Alcohol al 96%
Alcohol Absoluto I
Alcohol Absoluto II
Alcohol Absoluto III
Xilol I
Xilol II
Xilol III
Parafina I
Parafina II
Parafina III
15
1 hora
1 hora
1 hora
1 hora
1 hora
1 hora
1 hora
1 hora
1 hora
1 hora
1 hora
1 hora
1 hora
PRACTICA N 4
MICROTOMIA
Marco Terico
Es la ciencia que se encarga de estudiar, analizar e interiorizar los fundamentos de
funcionamiento y uso del Micrtomo, as como los procesos y accesorios relacionados.
PARTES
Todos los Micrtomos poseen idnticos principios bsicos de funcionamiento:
Portabloque
Portacuchilla
Mecanismo de Avance
Existen 6 tipos de Micrtomos:
Micrtomo de Balanceo
Micrtomo de Rotacin
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Micrtomo de Deslizamiento
Micrtomo de Congelacin
Criostato
Ultramicrtomo
Competencia Especfica
Describe los procedimientos de Microtoma como elemento fundamental en la
obtencin de Histogramas.
Explica los fundamentos de los distintos procedimientos de Microtoma en
Histotecnologa.
Material y Mtodos
Procedimiento
Observa los procedimientos de Microtoma en Histotecnologa.
Ejecuta los procedimientos de retallado, enfriamiento, fijacin de bloque, orientacin
del portabloque y portacuchilla, debastado y seccin.
Cuestionario
1.
2.
3.
4.
Fuentes de Informacin
Sheehan D, Hrapchak B. Histotechnology. 2 ed. Columbus: Battelle; 2006.
Troyer H. Histochemistry. Boston: Little, Brown And Company; 2006.
Vacca L. Laboratory manual of histochemistry. New York: Raven; 2006.
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PRACTICA N 5
COLORANTES Y COLORACIONES
Marco Terico
Se define un COLORANTE como: Sustancia lquida que puesta en contacto con un
tejido, se une a l, de forma perdurable, transmitiendole su color
CLASIFICACIN DE LOS COLORANTES SEGN SUS GRUPOS CROMOFOROS
Se distinguen 8 grupos de Colorantes:
A) Colorantes derivados del Xanteno
B) Colorantes derivados del Benceno
C) Colorantes derivados del Naftaleno
D) Colorantes derivados de la Acridina
E) Colorantes derivados de Antraquinona
F) Colorantes derivados del Difenilmetano
G) Colorantes derivados de las Ftalocianinas
H) Colorantes derivados de Iminas Quinnicas
CLASIFICACIN DE LOS COLORANTES SEGN SUS GRUPOS AUXOCROMOS
Se distinguen 5 grupos de Colorantes:
A. Colorantes Bsicos
B. Colorantes cidos
C. Colorantes Neutros
D. Colorantes Indiferentes
E. Colorantes Metacromticos
Competencia Especfica
Describe los procedimientos de la preparacin de reactivos, insumos y colorantes como
elemento fundamental en la obtencin de histogramas
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Agua Destilada
Cristales de Hematoxilina
Eosina Yellow
Oxido Rojo de Mercurio
Alumbre Potsico o Amonio
Alcohol Etlico
Material de Vidrio
Cocinilla Electrica
Procedimiento
Observa y ejecuta los procedimientos de preparacin de reactivos, insumos y
colorantes.
Acondiciona diversas bateras de coloracin.
Cuestionario
1.
2.
3.
4.
Fuentes de Informacin
Prophet E, Mills B, Arrington J, Sobn L. Mtodos histotecnolgicos. Washington, D.C.:
ARP; 2009.
Lillie R. Biological stains. 8 ed. Baltimore: Waverly; 2008.
Sheehan D, Hrapchak B. Histotechnology. 2 ed. Columbus: Battelle; 2006.
HEMATOXILINA DE HARRIS
PROCEDIMIENTO TECNICO
Hematoxilina ( cristalizada )
1 gr
Etanol absoluto
10 mL
Disolver calentando suavemente
Alumbre Potasico o Amonico
20 gr
Agua destilada
200 mL
Disolver en caliente. Aadir la solucin de Hematoxilina y llevar a ebullicin. Cuando
comienza a hervir se aade:
Oxido Rojo de Mercurio
0,5 gr
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EOSINA
Solucin Matriz: 1 gramo de eosina Y hidrosoluble en 20 mL de Agua Destilada, aada
80 Ml de Etanol al 95%
Solucin Diaria: A una parte de Soluci Matriz aada 3 partes de Etanol al 80% y 0,5 mL
de cido Acetico Glacial por cda 100 mL del colorante
ROJO DE CONGO
01 gramo de Rojo de Congo en 100 mL de Agua Destilada
FUCSINA BASICA
Al 1%: 01 gramo de Fucsina Basica en 100 mL de Agua Destilada
ESCARLATA DE BIEBRICH
01 gramo de Escarlata de Biebrich en 100 mL de Agua Destilada
VERDE CLARO
Solucin Matriz: 0,2 gramos de Verde Claro, SF amarillento en 100 mL de Agua
Destilada, aada luego 0,2 mL de cido Actico Glacial
Solucin Diaria: 10 mL de la Solucin Matriz de Verde Claro en 50 mL de Agua Destilada
CARBONATO DE LITIO
Solucin al 0,5%: 0,5 gramos de Carbonato de Litio en 100 mL de Agua Destilada
Solucin Saturada: 1,54 gramos de Carbonato de Litio en 100 mL de Agua Destilada
HEMATOXILINA FERRICA DE WEIGERT
Solucin Matriz
A: 01 gramo de Hematoxilina en 100 Ml de Etanol al 95% Solucin Matriz B: 4,0 mL de
Cloruro Ferrico al 29%, 95 mL de Agua Destilada y 01 mL de cido Clorhdrico
Concentrado.
SOLUCIN DIARIA DE HEMATOXILINA FERRICA DE WEIGERT
Partes
iguales (100mL) de soluciones matrices A y B. La solucin diaria de la Hematoxilina
Ferrica de Weigert puede usarse por aproximadamente dos semanas.
SOLUCIN DE YODO
Solucin de Gram: 01 gramo de Yodo, 02 gramos de Yoduro de Potasio en 300 mL de
Agua Destilada
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PRACTICA N6
COLORACIN DE PAPANICOLAO
Marco Terico
La Coloracin de Papanicolaou, se denomina as en honor a George Papanicolaou,
quien en el ao de 1941, publica una tcnica de coloracin que permite correlacionar
cambios citolgicos vaginales con el ciclo menstrual de las mujeres y el diagnostico de
casos asintomticos de neoplasia intrauterina.
Es un mtodo de tinciones policromticas que consta de una Tincin Nuclear y una
Tincin Citoplasmtica.
Tiene 2 ventajas:
1. Ncleo ntido, con buena definicin del detalle, pudiendo evidenciarse el patrn de
cromatina.
2. Citoplasma de aspecto transparente, que permite apreciar los grados de
diferenciacin celular y actividad metablica.
La Coloracin de Papanicolaou utiliza 3 colorantes:
1. Hematoxilina
2. Orange G
3. EA-50
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Agua Destilada
Solucin de Trabajo de Hematoxilina de Harris
Solucin Orange G
Solucin de EA50
Xilol
Laminas Fijadas con Extendidos Crvico Vaginales
Alcohol: 100%, 96%, 80%, 70%
Cubetas de Coloracin
Canastillas de Coloracin
Blsamo de Canad
Procedimiento
Observa el procedimiento Histotecnolgico de la Coloracin de Papanicolao
Acondiciona la batera de coloracin de Papanicolao.
Ejecuta la Coloracin de Papanicolao.
Cuestionario
1.
2.
3.
4.
Fuentes de Informacin
Garcia Del Moral R. Laboratorio de anatoma patolgica. Mxico D.F.: McGraw Hill;
2010.
Prophet E, Mills B, Arrington J, Sobn L. Mtodos histotecnolgicos. Washington,
D.C.: ARP; 2009.
Lillie R. Biological stains. 8 ed. Baltimore: Waverly; 2008.
COLORACIN DE PAPANICOLAOU
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>=15
3.-Hematoxilina de Harris
5.-Alcohol Acido 1%
21
7.-Agua Amoniacal
10
10.-Orange G
30
12.-EA50
30
30
15.-Alcohol Absoluto
30
16.-Alcohol Absoluto
30
17.-Xilol
18.-Xilol
Resultados:
Se observan clulas de los diferentes estratos del epitelio vaginal y del endo y
exocervix, con diferentes tonalidad de coloracion, Eosinfilas y Cianfilas. Se pueden
observar las caracteristicas estructurales del ncleo color violeta asi como
determinadas pigmentaciones en los citoplasmas.
PRACTICA N7
COLORACIN DE HEMATOXILINA EOSINA
Marco Terico
HEMATOXILINA DE HARRIS
Es la Hematoxilina mas utilizada en la coloracin rutinaria de los ncleos celulares,
debido
a) Su estabilidad (se conserva entre 6 y 12 meses)
b) Su facilidad de manejo.
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Agua Destilada
Solucin de Trabajo de Hematoxilina
Solucin de Trabajo de Eosina
Xilol
Alcohol: 100%, 96%, 80%, 70%
Cubetas de Coloracin
Canastillas de Coloracin
Blsamo de Canada
Procedimiento
Observa el procedimiento Histotecnolgico de la Coloracin de Hematoxilina Eosina.
Acondiciona la batera de coloracin de Hematoxilina Eosina.
Ejecuta la Coloracin de Hematoxilina Eosina.
Cuestionario
5. Cul es la funcin de la solucin de Hematoxiiina?
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60
2.- Xilol
3.- Xilol
6.-Alcohol 96
7.-Alcohol 80
8.-Alcohol 70
9.-Agua Destilada
10.-Hematoxilina
11.-Agua Destilada
30
30
10
30
16.- Eosina
30
18.- Alcohol 70
19.- Alcohol 80
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24
20.- Alcohol 96
23.- Xilol
24.- Xilol
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Procedimiento
Observa el procedimiento Histotecnolgico de la Coloracin Rojo de Congo.
Acondiciona la batera de coloracin Rojo de Congo.
Ejecuta la Coloracin Rojo de Congo.
Cuestionario
1.
2.
3.
4.
Fuentes de Informacin
Lillie R. Biological stains. 8 ed. Baltimore: Waverly; 2008.
Sheehan D, Hrapchak B. Histotechnology. 2 ed. Columbus: Battelle; 2006.
Troyer H. Histochemistry. Boston: Little, Brown And Company; 2006.
Tcnica
Etapa Tiempo
Desparafinar en forma tpica los cortes y rehidratar.
Enjuagar en agua destilada. 1 min.
Teir en solucin de hematoxilina segn Gill III o Gill II 5 min.
Enjuagar en agua corriente del grifo 5 min.
Teir en solucin de rojo Congo 10 min.
Enjuagar en agua destilada
Diferenciar en solucin de KOH 30 - 40 segundos
Enjuagar en etanol del 96 % 30 segundos*
Enjuagar en etanol del 96 % 30 segundos*
Deshidratar en etanol del 100 % 1 min*
Deshidratar en etanol del 100 % 1 min*
Aclarar en Neo-Clear 5 min.
Aclarar en Neo-Clear 5 min.
Montar con Neo-Mount
Resultado
Ncleos azul obscuro
Amiloide al trasluz rosa a rojo
Amiloide bajo luz polarizada metacromasia verde
Tejido conjuntivo rojo claro
PRACTICA N10
COLORACIN PARA CARBOHIDRATOS: REACCIN DE PAS
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Marco Terico
La histoqumica es la aplicacin de reacciones qumicas y bioqumicas en la tcnica
histolgica, con el fin de localizar y determinar de manera cientfica ciertas sustancias
o su actividad.
En todas estas reacciones o bien se tie la sustancia que buscamos o los colorantes
reaccionan qumicamente con ella, como es el caso del PAS.
Los hidratos de carbono o glcidos son polialcoholes oxidados (polihidroxicetonas o
polialdehidos). Los polisacridos son glcidos formados por la unin de muchas
molculas de monosacridos (mas de 10). Entre los polisacridos adems de los
polisacridos simples como el glucgeno destacan los polisacridos complejos.
Los polisacridos complejos se dividen en 3 grandes grupos:
Mucopolisacaridos que pueden dividirse en :
Mucopolisacaridos neutros
Mucopolisacaridos cidos
Mucoprotenas
Mucolpidos.
Competencia Especfica
Describe los procedimientos de la Reaccin PAS como elemento fundamental en la
obtencin de Histogramas
Explica los fundamentos de los distintos procedimientos de la Reaccin del cido
Peridico de Schiff.
Material y Mtodo
Agua Destilada
Acido Peryodico
Reactivo de Schiff
Fucsina Bsica
Acido Clorhdrico Concentrado
Metabisulfito Sdico
Xilol
Laminas con Tejidos Desparafinados
Alcohol: 100%, 96%, 80%, 70%
Cubetas de Coloracin
Blsamo de Canad
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Procedimiento
Observa el procedimiento Histotecnolgico de la Reaccin del cido Peridico de
Schiff.
Acondiciona la batera de la Reaccin del cido Peridico de Schiff.
Ejecuta la Reaccin del cido Peridico de Schiff.
Cuestionario
1.
2.
3.
4.
Fuentes de Informacin
Garcia Del Moral R. Laboratorio de anatoma patolgica. Mxico D.F.: McGraw Hill; 2010.
Prophet E, Mills B, Arrington J, Sobn L. Mtodos histotecnolgicos. Washington, D.C.:
ARP; 2009.
Lillie R. Biological stains. 8 ed. Baltimore: Waverly; 2008.
PROCEDIMIENTO TCNICO DEL PAS
Fijacin:
o Formol al 4 % o Lquido de Carnoy o Bouin.
o cido Peridico0.5 % p/v.
o Reactivo de Schiff:
Fucsina bsica (CI: 42510) 1g.
Agua destilada... 200 ml.
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Tcnica de Tincin:
Desparafinar e hidratar (xilol y decrecientes alcoholes)
cido peridico 0.5 % 5 min.
Lavar en agua (d).
Reactivo de Schiff.. 15- 30 min.
Aclarar en 3 baos de agua sulfurosa 2 min. Cada uno.
Lavar en agua corriente
Colorante de contraste
Lavar con agua corriente.
Deshidratar, aclarar y montar.
PRACTICA N12
COLORACIN PARA TEJIDO CONECTIVO: TRICRMICA SEGN MASSON
Marco Terico
Las coloraciones trcromas permiten visualizar de forma selectiva fibras musculares,
fibras colgenas, fibrina y eritrocitos por el empleo combinado de tres soluciones
colorantes diferentes. Los mtodos originales se emplearon sobre todo para la
diferenciacin de fibras colgenas y musculares. La seleccin de los colorantes
empleados, que se diferencian por su tamao de molcula, produce una coloracin
diferenciada de los distintos componentes tisulares.
La tincin de Masson-Goldner ofrece las siguientes ventajas: el mtodo puede
realizarse con material fijado en formol; previa tincin nuclear con hematoxilina
frrica de Weigert se tien los componentes tales como musculatura, citoplasma y
eritrocitos con azofloxina y solucin de anaranjado G.
Seguidamente se contratie el tejido conectivo con solucin de verde luz SF.
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Competencia Especfica
Describe los procedimientos de la Coloracin Tricrmica segn Masson como elemento
fundamental en la tincin de Tejido Conectivo
Explica los fundamentos de los distintos procedimientos de la Coloracin Tricrmica
segn Masson.
Material y Mtodo
Cortes parafnicos de 3-5 m de espesor
Solucin 1: Solucin de azofloxina 500 ml
Solucin 2: Solucin de cido fosfovolfrmico-anaranjado G 500 ml
Solucin 3: Verde luz SF en solucin 500 ml
Solucin 4: cido actico 10% 500 ml
Procedimiento
Observa el procedimiento Histotecnolgico de la Tincin para Tejido Conectivo:
Tricrmica segn Masson
Acondiciona la batera de coloracin Tricrmica segn Masson
Ejecuta la Coloracin Tricrmica segn Masson
Cuestionario
5.
6.
7.
8.
Fuentes de Informacin
Prophet E, Mills B, Arrington J, Sobn L. Mtodos histotecnolgicos. Washington, D.C.: ARP;
2009.
Lillie R. Biological stains. 8 ed. Baltimore: Waverly; 2008.
Sheehan D, Hrapchak B. Histotechnology. 2 ed. Columbus: Battelle; 2006.
PROCEDIMIENTO DE LA COLORACIN PARA TEJIDO CONECTIVO: TRICRMICA DE
MASSON
Etapa - Tiempo
Xileno 5 min.
Xileno 5 min.
EtOH 100% 30 segundos
EtOH 100% 30 segundos
EtOH 96% 30 segundos
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Material y Mtodo
Agua Destilada
Acido Peryodico
Cristales de Fenol
Fucsina Acida
Hematoxilina
Acido Clorhdrico Concentrado
Metabisulfito Sdico
Xilol
Laminas con Tejidos Desparafinados con probada infeccin al M. tuberculosis
Alcohol: 100%, 96%, 80%, 70%
Cubetas de Coloracin
Blsamo de Canad
Procedimiento
Observa el procedimiento Histotecnolgico de la Coloracin ZN.
Acondiciona la batera de la Coloracin Ziehl Nieelsen.
Ejecuta la Coloracin Ziehl Nieelsen.
Cuestionario
1. Cul es la funcin del Acido Perydico?
2. A que nivel acta la Hematoxilina?
3. Cul es la funcin de la Fucsina Acida?
4. Qu tonalidad adquiere la estructura del M. tuberculosis?
Fuentes de Informacin
Lillie R. Biological stains. 8 ed. Baltimore: Waverly; 2008.
Sheehan D, Hrapchak B. Histotechnology. 2 ed. Columbus: Battelle; 2006.
Troyer H. Histochemistry. Boston: Little, Brown And Company; 2006.
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50 cc agua destilada
5 cc etanol absoluto
3. Hematoxilina
4. Alcohol cido 1%:
Alcohol de 70
cido Clorhdrico
El procedimiento es el siguiente:
1. Desparafinar e hidratar los cortes
2. cido peridico 5%, 10 min
3. Lavar con agua destilada
4. Fucsina fenicada, 15 min
5. Decolorar en alcohol cido al 1%
6. Lavar con agua destilada
7. Hematoxilina, 10 min
8. Azulidificar con, por ejemplo, carbonato de litio
9. Deshidratar, aclarar y montar preparaciones
Resultados
BAAR: Rojo.
Ncleos: Azul.
PRACTICA N15
INMMUNOHISTOQUMICA: INMUNOFLUORESCENCIA DIRECTA E INDIRECTA
Marco Terico
INMUNOHISTOQUMICA
Tcnicas de Inmunofluorescencia
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Microscopio de Fluorescencia
Laminas con Tejidos seccionados en Criostato
Sueros de Pacientes con Enfermedades Autoinmunes
Acetona
PBS
Antisuero Primario Conjugado (Fluorescena)
Cmara Hmeda
PBS Glicerol Gelatina
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Procedimiento
Observa el procedimiento Histotecnolgico en Inmunofluorescencia
Ejecuta los procedimientos en Inmunofluorescencia
Cuestionario
1. Cul es la funcin del Acido Perydico?
2. A que nivel acta la Hematoxilina?
3. Cul es la funcin de la Fucsina Acida?
4. Qu tonalidad adquiere la estructura del M. tuberculosis?
Fuentes de Informacin
Sheehan D, Hrapchak B. Histotechnology. 2 ed. Columbus: Battelle; 2006.
Troyer H. Histochemistry. Boston: Little, Brown And Company; 2006.
Vacca L. Laboratory manual of histochemistry. New York: Raven; 2006.
TCNICA DE INMUNOFLUORESCENCIA DIRECTA (tejido congelado)
PROCEDIMIENTO TCNICO
1.-Se realizan cortes en el criostato de aproximadamente 5 micras de espesor.
2.-Se delimita mediante un circulo realizado con un lpiz de diamante alrededor de
cada seccin, la superficie de incubacin con los anticuerpos ( utilizar portaobjetos
diseados especficamente para metodologas Inmunohistoqumicas ).
3.- Fijar en acetona fra a -20C entre 5 y 15 minutos
4.- Secar los cortes al aire
5.- Realizar 3 lavados en PBS de 10 minutos c/u.
6.- Drenar el exceso de PBS y secar alrededor del circulo usando un pauelo de papel.
7.- Cubrir la seccin con el Antisuero Primario Conjugado, a la dilucin ptima
determinada previamente. La incubacin se realizar en cmara hmeda a
temperatura ambiente y durante 30 minutos.
8.- Realizar otros 3 lavados como en el paso 3 y secar igualmente en torno al circulo.
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Observaciones
La tcnica de Inmunofluorescencia se usa fundamentalmente en el diagnostico de la
patologa renal y de determinadas lesiones cutneas.
TECNICA DE INMUNOFLUORESCENCIA INDIRECTA
PROCEDIMIENTO TCNICO
Modo de Operar
1.-Diluir en PBS el suero que se desee probar. Para la mayor parte de auto anticuerpos
puede emplearse una dilucin a 1/10, para detectar Anticuerpos frente a los Islotes de
Langerhans y se debe emplear el suero sin diluir.
2.-Incubar las secciones de tejido elegidas con el suero problema, durante 30 minutos
a temperatura ambiente o bien toda la noche a 4C.
3.-Realizar 3 lavados en PBS de 10 minutos cada uno.
4.-Drenar el exceso de PBS.
5.-Incubar con el conjugado de Inmunoglobulina anti Ig Humana y Fluorocromo a la
dilucin optima durante 30 minutos en cmara hmeda.
6.-Decantar el antisuero y realizar 3 lavados con PBS de 10 minutos cada uno.
7.-Montar en medio hidrosoluble especfico para Inmunofluorescencia
Resultados
Marcaje con FITC: Fluorescencia verde manzana
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