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Orgnica

Gua de Prcticas de Microbiologa General y Aplicada

PRACTICA N 7
AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS AMILOLTICOS Y PRODUCCIN DE AMILASA
EN CULTIVO SUMERGIDO
Las amilasas constituyen el segundo grupo de enzimas microbianas de mayor
produccin industrial. El aislamiento de microorganismos productores de amilasas
(amilolticos) constituye un tema importante de la microbiologa agroindustrial, puesto
que es la base para la disponibilidad de nuevas cepas que puedan ser utilizadas en
produccin industrial.
Las amilasas son enzimas extracelulares que actan hidrolizando almidn a maltosa (amilasa; actuando desde los extremos de la molcula), dextrinas (-amilasa; actuando
en las zonas internas de la molcula y produciendo extremos reductores) y glucosa
(glucoamilasa; actuando desde los extremos). Generalmente los microorganismos
producen -amilasa y/o glucoamilasa.
Uno de los ambientes desde donde se aslan estos microorganismos es el suelo. Los
microorganismos amilolticos constituyen un grupo microbiano llamado zimgeno; los
cuales a diferencia de los autctonos su nmero aumenta en virtud de la incorporacin
a este ambiente de un sustrato en particular, pero su nmero desciende con el
agotamiento del sustrato.
La produccin industrial de amilasa se realiza principalmente mediante fermentacin
sumergida, aunque existe tambin la posibilidad de producirla por fermentacin en
sustrato slido. Tanto bacterias como hongos son utilizados como microorganismos
productores de amilasa. En el primer caso se emplean especies del gnero Bacillus, y en
el segundo especies principalmente del gnero Aspergillus.
OBJETIVOS.-

Utilizar el sistema de enriquecimiento in situ para aumentar la poblacin

microbiana zimgena y aumentar la probabilidad de aislamiento de
microorganismos amilolticos.

Realizar la identificacin aproximada de los microorganismos con mayor

potencial y verificar su produccin en cultivo sumergido en frascos agitados.

MATERIALES
Parte I
-

Muestra de suelo enriquecido.

4 placas Petri estriles.
1 frasco de tapa de rosca o Erlenmeyer con 90 ml de agua destilada estril.
2 tubos con 9.9 ml de agua destilada estril.
3 tubos con 9 ml de agua destilada estril.
2 pipetas de 1 ml estriles.
1 Erlenmeyer con 60 ml de medio de aislamiento para hongos.
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Parte II
- Caja de vidrio o plstico con yodo metlico.
- Aguja de Klle.
- Lminas porta y cubre-objetos.
- 2 tubos en cua con APD.
Parte III y IV
- 1 Tubo con 5 ml de agua destilada estril.
- 1 Erlenmeyer de 250 ml con 80 ml de medio de produccin de amilasas.
- Centrfuga.
- 2 Tubos de centrfuga de 15 ml.
- Sustrato para amilasa.
- 4 Pipetas de 1 ml.
PROCEDIMIENTO
Parte I
a. Enriquecimiento in situ
1. Seleccionar en un jardn un rea de 1 m2 (1 m de lado).
2. De existir pasto en el rea seleccionada proceder a retirarlo.
3. Remover el suelo hasta 8 cm de profundidad.
4. Agregar uniformemente en toda el rea 100 g de almidn.
5. Mezclar completamente con el suelo hasta 8 cm de profundidad.
6. Humedecer con agua.
7. Mantener el rea hmeda (pero no anegada) durante 15 das.
8. Cada 4 das agregar 500 g de almidn y repetir los pasos 5 a 7.
b. Muestreo (a realizar la noche anterior a la prctica)
1. Elegir un frasco de boca ancha, lavarlo bien y enjuagarlo cuidadosamente con
alcohol (incluyendo la tapa).
2. Con una esptula o cuchara desinfectada con alcohol, tomar suelo (debajo de
los primeros 2 cm) hasta un total mnimo aproximado de 100 g.
3. Colocar la tapa y guardar el frasco en un lugar fresco, pero no refrigerado.
c. Aislamiento
1. Mezclar cuidadosamente la muestra de suelo.
2. Pesar 10 g de la muestra y agregarlos al frasco o Erlenmeyer que contiene 90
ml de agua destilada estril y rotularlo como dilucin 10 0.
3. Agitar el frasco durante 10 min.
4. Realizar las diluciones indicadas en el esquema siguiente:
5. De las diluciones 10-3, 10-5, 10-6 y 10-7 tomar 1 ml y agregarlo a una placa Petri
estril.
6. Adicionar a cada placa Petri aproximadamente 15 ml de agar de aislamiento.
7. Incubar las placas a 30C durante 5-7 das.
8. Proceder con la parte II.

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Agregar a cada placa agar de aislamiento licuado; mezclar suavemente y

posteriormente dejar solidificar.

Parte II
1. Colocar las placas Petri dentro de una caja de vidrio o plstico (con tapa
hermtica) conteniendo yodo metlico hasta que el medio adquiera un color
morado.
2. Las colonias de microorganismos amilolticos presentarn un halo incoloro.
3. Elegir la colonia que presente el mayor halo de hidrlisis (incoloro).
4. Realizar un trasplante de la colonia elegida a dos tubos en cuas de APD. Incubar
los tubos a 30 C hasta la siguiente sesin de prcticas.
5. Realizar una observacin microscpica de la colonia elegida. En base a la
observacin realice un intento de identificacin.
Parte III
Inculo
Agregue 3-5 ml de agua destilada estril a uno de los tubos en cuas de agar con el
microorganismo aislado. Realice una suspensin y determine la concentracin de
esporas (ver anexo).

Cultivo sumergido
1. Inocule 6 x 106 esporas del microorganismo correspondiente a un Erlenmeyer
conteniendo 80 ml del medio de produccin.
2. Incube el Erlenmeyer en un bao con agitacin a 30C y 140 movimientos por
minuto por 7 das.
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3. Filtre cuidadosamente el contenido del matraz utilizando papel de filtro de

paso medio pre-presado para retener la biomasa (la determinacin de biomasa
se realizar por diferencia de peso seco). Coloque el papel filtro en una placa
Petri y deje secar por 120 minutos a 85 C.
4. Coloque el filtrado en un frasco o tubo estril y guarde en congelacin hasta el
momento de realizar los anlisis.
Parte IV
Determinacin de la actividad de amilasa (prueba de Fehling)
1. En un tubo de ensayo agregar 2ml del reactivo de Fehling A y 2ml del reactivo de
Fehling B.
2. Verter 3ml del filtrado a temperatura ambiente.
3. Introducir el tubo en bao mara durante 3 minutos.
4. Observar y dibujar los resultados.

CUESTIONARIO
Presente un informe describiendo y analizando los resultados obtenidos en cada una
de las partes del experimento.

ANEXO
Conteo de esporas
1. Utilizando la solucin de Tween 80, prepare una suspensin de esporas en
forma asptica. Utilice el asa de Klle para desprender la mayor cantidad de
esporas de los conidiforos.
2. Mezclar la suspensin de esporas con ayuda de una bagueta previamente
esterilizada.
3. Tomar una alcuota y colocarla en la cmara de Neubauer, en el borde del
cubre objeto. La suspensin entrar a la cmara por capilaridad y debe
distribuirse homogneamente. Cuide de no sobrecargar la cmara.
4. Coloque la cmara en el microscopio y enfoque la zona cuadriculada central a
bajo aumento. La zona cuadriculada central est marcada con doble lnea,
cuenta con 25 cuadrados medianos cada uno de los cuales est dividido en 16
cuadrados pequeos.
5. Ajuste el microscopio a mayor aumento y la intensidad de la luz de manera que
las esporas sean claramente visibles dentro de la zona cuadriculada.
6. Dependiendo de la abundancia de esporas, cuente todas las esporas visibles en
la zona cuadriculada central (los 25 cuadrados medianos) o 5 de ellos
(preferiblemente escoger uno de cada ngulo y el cuadrado del centro). Incluya
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en el conteo aquellas esporas que se encuentren sobre las lneas, pero cuide de
no contarlas ms de una vez.
7. Para los clculos considere que el volumen de la zona cuadriculada central es
de 0.1 mm3.
El nmero de esporas en esta zona multiplicado por 10 da el nmero de
esporas en 1 mm3 de la suspensin. Este nmero multiplicado por 1000 da el
nmero en 1 cm3 o ml de la suspensin de esporas.
8. Por tanto, si se contaron los 25 cuadrados medianos de la zona central,
multiplique este nmero por 104 para obtener el total de esporas por mililitro.
En cambio, si slo se cont 5 cuadrados medianos, el nmero obtenido debe
multiplicarse por 5 x 104 para obtener el nmero de esporas por mililitro de
suspensin.

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