UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA

FACULTAD DE CIENCIAS AGROPECUARIAS

PALMIRA
MAESTRIA EN CIENCIAS AGRARIAS CON ENFASIS EN
FITOMEJORAMIENTO
1. PROYECTO N:
MODALIDAD: Investigacin.

FECHA: 21 DE OCTUBRE DE 2008

2. TITULO: CARACTERIZACION MORFOAGRONOMICA, QUIMICA

MOLECULAR DE INTRODUCCIONES DE TOMATE TIPO CHERRY

3. DEFINICION DEL PROBLEMA

Dentro de la nueva cultura alimenticia de consumir hortalizas frescas, naturales o
mnimamente procesadas, los tomates tipo cherry han ganado cada vez ms
espacio en los mercados especializados tipo gourmet que resalta y diferencia en
precio los atributos de calidad y presentacin. Estos nuevos cultivares se han
convertido en una buena opcin para mejorar los ingresos de los productores, que
desean atender un nuevo mercado en crecimiento, el cual posee altos precios y
poca oferta.
No existen cultivares nacionales de tomate tipo cherry mejorados genticamente
y debidamente registradas ante el ICA para su comercializacin en Colombia. El
portafolio nacional en el ao 2007 ofrece a los agricultores los siguientes
cultivares: tomate hibrido cherry, tomate tipo cherry Idill, tomate tipo cherry
hibrido bean red F1 G.V.S., tomate tipo cherry hibrido bean yellow F1 G.V.S.,
cultivares hbridos importados y comercializados por Agropecuaria Internacional
ltda, quien comercializa semilla de la compaa Hazera; Importadora de Semillas
Ltda, Semillas Miguel Saenz & Cia., las cuales son empresas autorizadas para
importar y comercializar la semilla en el pas, la oferta es muy limitada, restrictiva y
condiciona a los agricultores a producir solo unas pocas variedades.
En algunos departamentos colombianos existen cultivares tipo cherry regionales
que son multiplicadas artesanalmente en las fincas para uso local. Estos cultivares
tradicionales constituyen un germoplasma de alto valor gentico que debe ser
estudiado y valorado con el fin de incorporarlos a procesos de mejoramiento
gentico con el fin de obtener cultivares nacionales de este tipo.
Las variedades silvestres tipo cherry poseen cualidades organolpticas y de
calidad culinaria que son reconocidas por los consumidores, expresan rusticidad y
amplia adaptacin que es necesario evaluar y valorar.
A pesar de sus cualidades se han realizado pocos trabajos de caracterizacin
morfoagronmica, qumica y molecular en stas, lo cual es indispensable para
identificar sus posibles usos en los programas de mejoramiento gentico del
tomate tipo cherry comercial (Nuez, 1991).
1

4. OBJETIVOS
4.1 OBJETIVO GENERAL
Caracterizar a nivel morfoagronmico, bromatolgico y molecular introducciones
de tomate tipo cherry.
4.2 OBJETIVOS ESPECIFICOS
Describir las caractersticas morfoagronmicas
lycopersicum var. cerasiforme y S. pimpinellifolium.

de

introducciones

de

S.

Distinguir las caractersticas bromatolgicas de introducciones de S. lycopersicum

var. cerasiforme y S. pimpinellifolium.
Diferenciar molecularmente con la tcnica RAMs (Random Amplified
microsatellites) las introducciones de S. lycopersicum var. cerasiforme y S.
pimpinellifolium.
5. JUSTIFICACION
Debido a que esta hortaliza est tomando una gran importancia a nivel econmico
y alimenticio en Colombia y en el mundo, el estudio busca identificar las
introducciones, valorar qumicamente, nutricionalmente, caracterizar a nivel
morfolgico y agronmico, y caracterizar molecularmente, para tener la
informacin base para el inicio de un programa de mejoramiento vegetal.
El consumo de tomate, entre sus propiedades, estimula el sistema inmune, lo cual
ayuda a detener las enfermedades degenerativas. Es recomendado adems para
el manejo de enfermedades como reumatismo, gota, arteriosclerosis, parlisis,
lceras del estmago, tuberculosis, diabetes, estreimiento, colitis, males de la
garganta y el odo; tambin disminuye el riesgo de desarrollar cncer de boca,
pncreas, cuello uterino, prstata, pulmn y estmago. El tomate es un conocido
remineralizante y desintoxicante. Adems de las toxinas que expulsa debido a su
efecto diurtico, tambin se encarga de eliminar el cido rico y reducir el
colesterol. (Ecomaz, 2007) Al iniciar los programas de mejoramiento con la
informacin obtenida en el presente trabajo se ofrecer a la poblacin una opcin
benfica nutricionalmente con caractersticas medicinales que posiblemente
permite ingresar con un producto de alta calidad y precio como opcin de
produccin para los agricultores.
El presente trabajo aportara tambin informacin til del cultivo y a la
caracterizacin y valoracin de los recursos genticos as como la creacin de un
banco de ADN de tomate tipo cherry con la informacin aportada con el uso de la
tcnica de RAMs.

6. MARCO REFERENCIAL
6.1 GENERALIDADES
El tomate tipo cherry S. lycopersicum var. cerasiforme se caracteriza por
presentar plantas vigorosas de crecimiento determinado o indeterminado. Los
frutos son de tamao pequeo que van en desde el tamao de una cereza grande
(variedad Harmony F1) hasta el tamao de una uva pequea (cherry minired F1)
presentan piel fina con tendencia al rajado, que se agrupan en ramilletes de 15 o
ms de 50 frutos, sabor dulce y agradable con frutos rojos, amarillos y de otros
colores.
Se cree que S. lycopersicum var. cerasiforme es el ancestro directo de las
variedades de tomate que se cultivan actualmente (Williams and St Clair 1993
citados por Medina y Lobo, 2001), esto basado en su presencia silvestre en
Amrica Central y por poseer un estilo acortado en las flores.
El tomate tipo cherry, como una de las especies silvestres relacionadas con el
tomate son originarias de la regin de los Andes en Suramrica, que abarca el sur
de Colombia, Ecuador, Per Bolivia y el norte de Chile (Vallejo, 1999).
6.2 CLASIFICACION TAXONOMICA
El tomate tipo cherry S. lycopersicum var. cerasiforme y S. pimpinellifolium, son
plantas dicotiledneas, hacen parte de las nueve especies silvestres del genero
Solanum, de la familia Solancea (Vallejo y Estrada, 2004).
Su actual clasificacin taxonmica es la siguiente:
Reino:
Subreino:
Divisin:
Clase:
Subclase:
Orden:
Familia:
Gnero:
Especie:
Variedad:

PLANTAE
TRACHEOBIONTA
MAGNOLIOPHYTA
MAGNOLIOPSIDA
ASTERIDAE
SOLANES
SOLANACEAE
Solanum
S. lycopersicum
cerasiforme

(Encyclopedia of Chemistry, 2008)

Reino:
Subreino:
Divisin:
Clase:
Subclase:

PLANTAE
TRACHEOBIONTA
MAGNOLIOPHYTA
MAGNOLIOPSIDA
ASTERIDAE
3

Orden:
Familia:
Gnero:
Especie:

SOLANES
SOLANACEAE
Solanum
S. pimpinellifolium

El cambio taxonmico de gnero de Lycopesicon a Solanum, empieza en 1993,

cuando Spooner, Anderson y Jansen, mediante el anlisis de sitios de restriccin
de DNA cloroplstico, identificaron que el tomate y dos de sus especies silvestres
hacan parte del genero Solanum, reconocindolo como Solanum lycopersicum.
Ms tarde en 2001, Peralta y Spooner, ratifican este cambio de gnero , a travs
de la comparacin de las secuencias de nucletidos del gen que codifica por una
de las enzimas que cataliza la produccin de almidn (enzima GBSSI) y
realizacin de un anlisis cladstico, donde observaron que todas las especies que
conformaban el anterior gnero Lycopersicon y varias especies del gnero
Solanum subgnero Potatoe, formaban parte de un mismo grupo y por ende,
confirmaron la inclusin del tomate cultivado y sus especies Silvestres dentro del
gnero Solanum seccin Lycopersicum. (Restrepo, 2007)
6.3 CARACATERIZACION MORFOLOGICA
S. lycopersicum, var. cerasiforme, es una planta perenne, que puede desarrollarse
de forma rastrera, semirrecta o erecta; presenta tolerancia a la humedad,
resistencia al tizn tardo (Phythopthora infestans) o gota, nematodos
(Meloidogyne spp) y algunos hongos foliares (Lobo, 1986; citado por Vallejo y
Estrada, 2004; Fondo para la accin ambiental, 2003).
6.3.1. Tallo
El tallo principal tiene 2 a 4 cm. de dimetro en la base y est cubierto por
vellosidades glandulares y no glandulares que salen de la epidermis; sobre el tallo
se desarrollan hojas, tallos secundarios e inflorescencias. Tiene la propiedad de
emitir races cuando se pone en contacto con el suelo, caracterstica importante
que se aprovecha en las operaciones culturales de aporque dndole mayor
anclaje a la planta. Los tallos y ramas son de consistencia herbcea, por lo cual la
planta no se sostiene por s sola, siendo necesario el empleo de tutores para su
cultivo, especialmente en variedades indeterminadas. (Jaramillo et al, 2007)
Posee un crecimiento continuo, con inflorescencias internodales cada dos o tres
hojas, el crecimiento subsiguiente se da a partir de la yema axilar de la ltima hoja,
la cual desarrolla un tallo secundario, desplazando lateralmente la inflorescencia.
(Vallejo y Estrada, 2004)
6.3.2. Hojas

Las hojas son compuestas, imparipinadas con siete a nueve folios, los cuales
generalmente son peciolados, lobulados y con borde dentado, y recubiertos de
pelos glandulares, se disponen de forma alternativa sobre el tallo, son de tipo
dorso ventral o bifacial. (Vallejo y Estrada, 2004; Jaramillo et al, 2007).
6.3.3. Flores
Las flores se agrupan en inflorescencias de tipo racimoso, es perfecta o
hermafrodita, regular e hipgina y consta de cinco o ms spalos que quedan
adheridos a fruto, incluso despus de caer, consta de seis o ms ptalos; tiene un
pistilo con cinco estambres, unidos en sus anteras y formando un tubo que lo
encierra, facilitando la autopolinizacin. S. lycopersicum, que es una variedad de
fruto pequeo puede tener hasta 40 flores por inflorescencia, se caracterizan por
el color amarillo de la flores y de tamao pequeo (uno a dos cm. de dimetro).
Las inflorescencias se desarrollan cada 2-3 hojas (Fondo para la accin ambiental,
2003; Jaramillo et al, 2007).
El tamao de las flores facilita el manejo para la hibridacin, que junto al
rendimiento de la semilla, permite una gran produccin de la semilla hibrida.
(Vallejo y Estrada, 2004)
6.3.4. Fruto
Los frutos constan de varias capas: epidermis, pulpa, tejido placentario y semillas;
son muy pequeos, de color rojo, naranja o amarillo, pueden tener formas de
pera o redonda, tiene sabor dulce, su tamao varia de 1 a 3 cm. de dimetro, con
un peso promedio de 10 g., se agrupan en ramilletes de 15 a 50 tomates.
(Jaramillo et al, 2007) Esta ltima caracterstica, permite clasificar el tomate tipo
cherry segn el tipo de recoleccin: Tomate tipo cherry para recoleccin suelto
y Tomate para recoleccin en ramo (Hernndez, 2008)
6.3.5. Raz
La raz principal es corta y dbil, races secundaras son numerosas, y races
adventicias la mayora se encuentran en los primeros 20 30 cms, de
profundidad. Dentro de la raz se encuentra la epidermis, donde se ubican los
pelos absorbentes especializados en tomar agua y nutrientes, adems el cortex y
el cilindro central donde se sita el xilema.
6.3.6. Semilla
La semilla es pequea, con un tamao de 5 x 4 x 2 mm, est constituida por el
embrin, el endospermo y la testa o cubierta seminal, la cual est recubierta de
pelos. Las semillas dentro del lculo, en sus ltimas etapas de desarrollo,
aparecen inmersas en una sustancia gelatinosa. (Jaramillo et al, 2007)
5

6.4. ANTECEDENTES
6.4.1. Estudios de caracterizacin en tomates tipo cherry
Goff y Klee (2006), analizaron S. licopersicum var cerasiforme silvestre y tomate
comercial Flora-Duke, encontraron que a excepcin de un qumico que afecta el
color, los azcares, los cidos orgnicos y compuestos voltiles (cis-3-Hexanal el
cual es esencial en la dieta humana), estn reducidos en el tomate comercial, y se
encuentran en la variedad silvestre hasta tres veces ms que en la comercial, lo
mismo sucede con los aminocidos esenciales
Florido et al (2002), trabajaron con accesiones de S. licopersicum var cerasiforme
silvestres realizando caracterizaciones morfoagronmicas y bioqumicas con el
puposito de introducir germoplasma de diversos orgenes, a fin de evaluarlos y
detectar los de mayor inters para utilizarlos como posibles parentales en
programa de mejoramiento gentico.
Pratta et al (2003), trabajaron con S. licopersicum var. cerasiforme accesin L.A.
1385, procedente del Tomato Genetics Resources Center, Department of
Vegetable Crops, University of California at Davis, CA, USA y originaria de
Quincemil, Cuzco, Per, sealaron la importancia de considerar el germoplasma
silvestre como fuente de genes para incrementar la variabilidad en el nmero de
flores por inflorescencia, peso, forma, contenido en materia seca y color (Rick
1973; Lindhout et al. 1991; Vallejo et al (1994).
Phohens, et al (2003), realizaron una caracterizacin de tomates silvestres de las
islas galpagos entre las cuales se encontraban S. lycopersicum var. cerasiforme
(3 accesiones), encontrndose caractersticas propias de taxn, mayor peso
medio de fruto en las accesiones de S. lycopersicum var cerasiforme.
Rodrguez y Parra (2005), caracterizaron variedades autctonas de tomate
cultivadas en la comunidad Valenciana en donde adems de los descriptores
mencionados en la cartilla del IPGRI, caracterizaron qumicamente
concentraciones de Acido ntrico, D-glucosa, D-fructosa, fosfato, sulfato,
Manganeso, Cinc, Aluminio y Cobre.
Medina y Lobo (2001), realizaron una investigacin con el fin de estudiar el grado
de variabilidad morfolgica de atributos cualitativos y cuantitativos de entradas
provenientes de Per, Ecuador, Mesoamrica, Mxico y otras partes del mundo,
encontrando en los materiales una amplia variabilidad cualitativa y cuantitativa,
mostrando su potencial de utilizacin en programas de mejoramiento tanto para
produccin de tomates tipo cerasiforme, como para variedades de tipo grande y de
industria.
Restrepo (2007), realiz una evaluacin de resistencia al pasador del fruto
Neoleucinodes elegantalis Guene y caracterizacin morfoagronmica de
germoplasma silvestre de S. habrochaites, S. peruvianum y S. lycopersicum
6

6.5 CARACTERIZACION NUTRICIONAL

El tomate tipo cherry es muy utilizado en la alimentacin humana, se puede
consumir en fresco, preferiblemente en ensaladas, por las caractersticas
organolpticas de este fruto, hacindolo mucho ms atractivo para el consumidor.
El consumo de tomate estimula el sistema inmune, brindando beneficios como
detener las enfermedades degenerativas, adems coayuda en el tratamiento de
reumatismo, gota, arteriosclerosis, parlisis, lceras estomacales, del estmago,
tuberculosis, diabetes, estreimiento, colitis, males de la garganta y el odo;
tambin disminuye el riesgo de desarrollar cncer de boca, pncreas, cuello
uterino, prstata, pulmn y estmago. Tambin es remineralizante, desintoxicante,
diurtico, tambin se encarga de eliminar el cido rico y reducir el colesterol.
(Ecomaz, 2007; The British tomato growers association, 2001)
El tomate es un fruto rico en vitaminas A, B1, B2, B6, C y E, y en minerales como
fsforo, potasio, magnesio, manganeso, zinc, cobre, sodio, hierro y calcio.
(Jaramillo et al, 2007) Tambin incluye protenas, hidratos de carbono, fibra, cido
flico, cido tartrico, cido succnico, cido saliclico y un alto contenido de
licopeno, el cual es un excelente antioxidante que reduce el riesgo cncer de
pulmn e infartos, adems de otras ventajas. En la tabla 1 se muestra los
respectivas concentraciones de los componentes nutricionales.
Tabla 1. Composicin nutricional del tomate tipo cherry, S. lycopersicum
contenido en 100 g.
Componente Nutricional
Valor energtico
Protena
Carbohidratos
Grasas
Calcio
Hierro
Fsforo
Vitamina A
Vitamina B
Vitamina C
Fuente: Ecomaz, 2007.

Valor
19.95 kcal
1.2 g.
3.2 g.
0.35 g.
7 mg.
0.5 mg.
27 mg.
1700 UI
0.1 mg
26.7 mg.

Los componentes nutricionales del tomate tipo cherry citados en la tabla uno
muestran algunas diferencias con los encontrados por Jaramillo et al (2007), los
cuales se basan en la composicin nutricional del tomate en general, encontrando
que los valores son muy parecidos, siendo mayores para el tomate tipo cherry en
protena y grasa.

6.5.1 Caractersticas de algunos componentes nutricionales

Segn la British tomato growers association (2001), el tomate presenta factores
nutricionales con las siguientes caractersticas benficas para la salud humana:

Vitamina A (retinol), antioxidante que es importante para la visin, la piel,

membranas mucosas, dientes, huesos, el crecimiento normal en nios,
mantenimiento del sistema inmunolgico y resistencia a enfermedades; en
nuestro cuerpo el beta-caroteno (pigmento natural que se encuentra en
abundancia en el tomate) es transformado en vitamina A. Vitamina C (acido
ascrbico), antioxidante que es importante para la formacin de clulas
normales de la sangre (ayudando a prevenir la anemia), msculos y tejidos y
evita anormalidades neurolgicas. Vitamina E, antioxidante importante en la
reproduccin y en el sistema inmunolgico.

Caratenoides, pigmento natural, cuyo mejor representante es el beta-caroteno,

el cual se encuentra en las frutas y verduras de coloracin alta, como
zanahorias, pimentones y tomate.

Licopeno, es el pigmento rojo en los tomates maduros, es un carotenoide.

Cerca del 85% de licopeno en una tpica dieta occidental se deriva solo de los
tomates maduros. Es un efectivo antioxidante que reduce el riesgo a
enfermedades crnicas como el cncer, inhibiendo la proliferacin de clulas
cancerosas, protege los linfocitos (glbulos blancos) de los daos causados
por dixido nitroso (hallado en el humo de cigarrillo), aumenta la degradacin
de la lipoprotena de baja densidad (colesterol malo), y as al reducir la
acumulacin de colesterol protege contra las enfermedades cardiovasculares.

Flavonoides, es un grupo qumico que tiene accin antioxidante y acta contra

los radicales libres, reduce el riesgo de cncer y de enfermedades
cardiovasculares; los tomates cherry en especial poseen altos contenidos se
flavonoides.

P3, un componente del muclago de la semilla, ayuda contra la trombosis y por

consiguiente con todas las enfermedades asociadas a ella.

Minerales, importantes para el metabolismo de las clulas, la buena salud y el

crecimiento, como el potasio, el cual es importante para la salud de la sangre y
Fibra, cuando se consume con semillas y piel.

Vitamina A (retinol), antioxidante que es importante para la visin, la piel,

membranas mucosas, dientes, huesos, el crecimiento normal en nios,
mantenimiento del sistema inmunolgico y resistencia a enfermedades; en
nuestro cuerpo el beta-caroteno (pigmento natural que se encuentra en
abundancia en el tomate) es transformado en vitamina A. Vitamina C (acido
ascrbico), antioxidante que es importante para la formacin de clulas
8

normales de la sangre (ayudando a prevenir la anemia), msculos y tejidos y

evita anormalidades neurolgicas. Vitamina E, antioxidante importante en la
reproduccin y en el sistema inmunolgico.

Caratenoides, pigmento natural, cuyo mejor representante es el beta-caroteno,

el cual se encuentra en las frutas y verduras de coloracin alta, como
zanahorias, pimentones y tomate.

Licopeno, es el pigmento rojo en los tomates maduros, es un carotenoide.

Cerca del 85% de licopeno en una tpica dieta occidental se deriva solo de los
tomates maduros. Es un efectivo antioxidante que reduce el riesgo a
enfermedades crnicas como el cncer, inhibiendo la proliferacin de clulas
cancerosas, protege los linfocitos (glbulos blancos) de los daos causados
por dixido nitroso (hallado en el humo de cigarrillo), aumenta la degradacin
de la lipoprotena de baja densidad (colesterol malo), y as al reducir la
acumulacin de colesterol protege contra las enfermedades cardiovasculares.

Flavonoides, es un grupo qumico que tiene accin antioxidante y acta contra

los radicales libres, reduce el riesgo de cncer y de enfermedades
cardiovasculares, los tomates cherry en especial poseen altos contenidos se
flavonoides.

P3, un componente del muclago de la semilla, ayuda contra la trombosis y por

consiguiente con todas las enfermedades asociadas a ella.

Minerales, importantes para el metabolismo de las clulas, la buena salud y el

crecimiento, como el potasio, el cual es importante para la salud de la sangre y
Fibra, cuando se consume con semillas y piel.

6.6. CARACTERIZACION DEL GERMOPLASMA

Para estimar la variabilidad en el genoma vegetal de una poblacin de individuos,
se realiza la caracterizacin estableciendo as la identidad morfolgica a travs de
la informacin codificada por los genes (Franco e Hidalgo, 2003).
Si se evala esa variabilidad gentica se debe hacer a nivel fenotpico, a travs de
la caracterizacin morfoagronmica y a nivel genotpico se realiza utilizando la
molcula de ADN, ya que se refiere a la variacin de los genes de la especie.
Siendo las tecnologas de marcadores moleculares el medio ms eficaz y ms
avanzado para entender los fundamentos de la diversidad gentica.
La aparicin de diferentes formas asociadas con diversos alelos de un gen o con
homlogos de un cromosoma puede detectarse en el ADN nuclear y en el ADN de
los organelos, este ltimo se encuentra en las mitocondrias y en los cloroplastos.
Los marcadores moleculares no estn sujetos a las influencias ambientales, las
9

pruebas con ellos pueden realizarse en cualquier momento de desarrollo de las

plantas, y tienen el potencial de hallarse en cualquier momento del desarrollo de
las plantas, y tienen el potencial de hallarse en nmero ilimitado porque abarcan
todo el genoma, lo que representa un mejor atributo. (de Vicente y Fulton, 2003).
6.6.1 Marcador Microsatlites Amplificados Aleatoriamente (RAMs)
Zietkiewicz et al (1994), propusieron un mtodo para medir la diversidad gentica
en plantas y animales usando cebadores basados en microsatlites. Esta tcnica
combina los beneficios de los microsatlites y los RAPDs (Random Amplified
Polymorphic DNA). Hantula et al (1996) seleccionaron cuatro primers (GT, ACA,
CCA, CGA) con una longitud de 18 bases incluyendo un extremo 5 degenerado
de tres nucletidos, el cual sirve de anclaje para asegurar la unin del primer al
inicio del microsatlite. Ellos denominaron a esta tcnica RAMs (Random Amplified
Microsatellites Random Amplified Polymorphic DNA).
Los RAMs se basan en la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR), el mtodo
es altamente reproducible y permite la deteccin de polimorfismo en el ADN intra e
interespecfico. Los fragmentos de ADN amplificados en la reaccin estn
compuestos de dos microsatlites que estn lo suficientemente cerca para que el
rea entre ellos se pueda amplificar por PCR (Zietkiewicz et al., 1994).
La base gentica de estos marcadores es la misma de los RAPDs, es decir, utiliza
un solo primer de secuencia arbitraria, por lo cual la secuencia blanco tambin es
desconocida; difiere de los RAPDs porque estos tienen menor tamao del cebador
que los RAMs. Al igual que los RAPDs, los RAMs detectan un solo alelo por locus.
El poder de resolucin de los marcadores genticos est determinado por el nivel
de polimorfismo que estos pueden detectar. Esto a su vez se ve afectado
principalmente por la frecuencia de mutacin en los sitios del genoma
involucrados. Como el rango evolutivo entre los microsatlites es
considerablemente ms alto que en la mayora de los otros tipos de ADN hay gran
probabilidad de hallar polimorfismo mediante los RAMs que por otras tcnicas
incluyendo los RAPDs. La fuente de variabilidad en los fragmentos obtenidos por
la tcnica RAMs no es an conocida pero hay tres posibilidades (Hantula et al.,
1996):
- Las mutaciones en el sitio de unin podran evitar la amplificacin de un
fragmento como en los marcadores RAPDs. Esto es posible pero puede ser
menos probable con los microsatlites porque la variabilidad en estos elementos
es principalmente el resultado de diferencias en el nmero de repeticiones.
- El resultado de una insercin o supresin entre el fragmento amplificado podra
originar amplio polimorfismo o ausencia de productos, dependiendo de la habilidad
de amplificacin.

10

- La variabilidad en el nmero de repeticiones del microsatlite podra determinar

el tamao del polimorfismo.
La tcnica de RAMs se basa en el uso de la Reaccin en Cadena de la
Polimerasa (PCR) lo cual le permite ser altamente reproducible permitiendo la
identificacin del polimorfismo a nivel intra e interespecifico (Hantula et al., 1996).
Segn Muoz et al (2008) las ventajas de la tcnica RAMs son que utiliza un
primer, no necesita informacin previa, amplifica dos microsatlites, cubre todo el
genoma, existe asociacin entre los grupos genticos que se forman con la
tcnica y el origen biolgico de los materiales, detecta duplicados, permite
diferenciar especies y variaciones al interior de la especie, es altamente
polimrfico y su costo es bajo comparado con tcnicas similares, en cmaras de
secuencia se pueden obtener hasta 50 bandas
7. HIPOTESIS
HO: No hay diferencias a nivel morfoagronmico, qumico y molecular entre las
introducciones de S. lycopersicum var. cerasiforme y S. impinellifolium.
H1: Hay diferencias a nivel morfoagronmico, qumico y molecular por lo menos en
una de las introducciones de S. lycopersicum var. cerasiforme y S. pimpinellifolium
8. MATERIALES Y METODOS
8.2. METODOLOGIA
8.2.1. LOCALIZACION
La siembra se realizara en el Centro Experimental de la Universidad Nacional de
Colombia Palmira (CEUNP), ubicado en el corregimiento El Carmelo, municipio de
Candelaria departamento del Valle; coordenadas 324 latitud norte y 8626
longitud oeste; con una altura de 980 msnm, temperatura promedio de 26 C, 69%
de Humedad Relativa (HR) y 1009 mm de precipitacin promedio anual.
El anlisis molecular, vitamina C, grados brix, y acidez se efectuara en el
laboratorio de Biologa Molecular ubicado en el edificio C de la Universidad
Nacional de Colombia, sede Palmira, municipio de Palmira, departamento del
Valle.
8.2.2. Obtencin de plntulas
Se utilizarn 74 introducciones de Solamun lycopersicum var. cerasiforme
procedentes de Brasil y del Banco de Germoplasma del TGRC (Tomato Genetics
Resource Center) perteneciente al Campus Davis, Universidad de California, 2
11

introducciones de S. pimpinellifolium del TGRC, dos plantas recolectadas en

campo, una en ciat y otra en Santa Helena, una colectada en Brasilia (Brasil) y
una variedades comercial de tomate cherry, semillas a las cuales se tratarn con
hipoclorito de sodio al 10% para desinfectar las semillas (IPGRI, 1996). Las
plntulas se sembrarn o trasplantarn en bandejas de germinacin de 128
alvolos con sustrato de turba, la poblacin de plantas utilizadas ser de 1620
plantas de tomate tipo cherry.
8.2.3. Lote de crecimiento.
La siembra en campo se realizar en lneas con distancias de 0.5 m entre plantas
y 1.5 m. entre lneas. Se realizar el manejo agronmico segn sus requerimientos
de fertilizacin y de manejo integrado de plagas y enfermedades. A partir del
primer racimo floral se realizar el tutorado dejando las plantas a libre crecimiento.
A travs de todo el ciclo de cultivo se llevarn a cabo observaciones y
descripciones a nivel morfolgico y agronmico teniendo en cuenta la cartilla
Descriptores del Tomate Lycopersicum spp realizada por el IPGRI (International
Plant Genetic Resources Institute), el cual es aceptado internacionalmente; se
evaluar el nivel de dao por el pasador del fruto, se realizar al tiempo registro
fotogrfico de las diferentes variables.
Para la parte correspondiente al anlisis qumico se tendr el apoyo del
Departamento de Qumica de la Universidad Nacional de Colombia sede Palmira
para realizar los anlisis correspondientes.
La evaluacin de la resistencia al pasador N. elegantalis Guene se realizar en
los frutos teniendo en cuenta seis descriptores cuantitativos y cinco niveles de
evaluacin de dao.
8.2.4. Arreglo de parcelas experimentales
Se usar un diseo experimental de Ltice en bloque de 9 x 9 con cuatro
repeticiones. El criterio de bloqueo, ser el gradiente de humedad dejado por la
lnea de riego por gravedad. La parcela total estar conformada por cinco plantas.
8.3. VARIABLES
8.3.1. Descriptores morfo-agronmicos
Las variables a evaluar sern los propuestos por el IPGRI (Anexo 3):
8.3.2. Composicin qumica
- Acidez titulable.
- Cantidad de licopeno. mg/100 g.

12

- Cantidad de vitamina C. mg./100 g.

- Slidos solubles. Grados brix. (g. de azcar /100 g. de liquido).
8.3.3. Evaluacin del pasador del fruto Neoleucinodes elegantalis Guene.
Descriptores cuantitativos
- Nmero de frutos afectados con pasador/planta
- Nmero promedio de orificios de entrada /fruto
- Nmero de frutos con orificios de salida/ planta
- Nmero promedio de larvas/fruto.
Escala de evaluacin del dao causado por pasador N. elegantalis (% de
frutos afectados):
Grado 1: 0 - 5%: Muy resistente
Grado 2: 6 - 15%: Resistente
Grado 3: 16- 20%: Ligeramente susceptible
Grado 4: 21 - 50%: Susceptible
Grado 5: 51 - 100%: Muy susceptible
8.3.4. Extraccin de ADN
Para la extraccin de ADN de la planta se utilizar el protocolo usando el kit
DNeasy plant. Anexo 4.
8.3.5. Acidez titulable
Llamada tambin normalidad del cido; se determina por titulacin o valoracin,
usando una base de normalidad la cual es conocida. Esto quiere decir que la
acidez titulable se puede determinar aadiendo una cantidad suficiente de lcali
del cual se conoce la normalidad hasta neutralizar toda la acidez o llevar el pH al
punto neutro. Esta acidez titulable no se puede predecir a partir de la
concentracin actual de iones de hidrgeno que se determina con el pH.
(Hernndez, 2001).
8.3.6. Grados Brix
Grado Brix
13

Es la medida de una sustancia soluble seca en una lquida lo que arroja un valor
aproximado del contenido de azcar. A travs de esta medida se puede obtener
indirectamente un valor objetivo del grado de madurez de la fruta.
En la prctica actual se usan refractmetros para medir el grado Brix, lo que
permite un clculo rpido y bastante preciso. Este procedimiento de medida
aprovecha el hecho que dependiendo de la cantidad de materia seca disuelta en
un lquido, cambia el ndice de refraccin del mismo.
Para efectos de medicin, se colocan gotas del lquido de prueba en el prisma de
medicin del refractmetro y se esparcen uniformemente. La refraccin de la luz,
alterada por el lquido de ensayo y/o la sustancia seca disuelta en l, se puede
leer directamente en grados Brix de una escala debidamente calibrada.
8.3.7. Vitamina C
Para la determinacin del contenido de vitamina C se realizar mtodo de HPLC,
para el clculo de cantidad de Acido Ascrbico se utilizar el procedimiento
descrito en el Anexo 5.
8.3.8. Determinacin de licopeno
Para la determinacin del carotenoide Licopeno se utilizar el procedimiento
utilizado por Cardona et al 2006 para la extraccin de licopeno en tomate chonto
descrito en el Anexo 6.
8.4. ANALISIS DE LA INFORMACION
Los descriptores cualitativos sern sometidos a un anlisis con estadstica
descriptiva. Los descriptores cuantitativos sern analizados mediante anlisis de
varianzas, comparacin de medias, anlisis multivariado de componentes
principales.
9. PERSONAS QUE PARTICIPAN EN EL PROYECTO
9.1. AUTOR. Jorge Mario Volveras Cedeo. I.A. Estudiante Maestra en Ciencias
Agrarias con nfasis en Fitomejoramiento
9.2. DIRECCION. Franco Alirio Vallejo I.A. PhD en Gentica y Mejoramiento
de Plantas
Edgar Ivn Estrada I.A. MSc Gentica y Fitomejoramiento.
9.3. COLABORADORES: Grupo de Diversidad Biolgica, a cargo del Ingeniero
Jaime Eduardo Muoz. Para la realizacin de la caracterizacin molecular con
RAMs.
14

15

10. PRESUPUESTO
DESCRIPCION

Fuente de financiacin

Total

Grupo Investigacin en Hortalizas

Colciencias (Convocatorias)

3500000

GASTOS DE PERSONAL
Jornales
GASTOS DE OPERACION
Reactivos Anlisis molecular
Compra de Equipos
(Determinador de grados brix)
Reactivos Anlisis bromatolgico

Materiales y suministros
IMPRESOS Y PUBLICACIONES
Gastos para la publicacin de
resultados de investigacin, incluye
artculos
TOTAL

Grupo Investigacin en Hortalizas

Grupo Investigacin Diversidad Biolgica
Universidad Nacional
Colciencias (Convocatorias)
Universidad Nacional
Colciencias (Convocatorias)
Grupo Investigacin en Hortalizas
Grupo Investigacin Diversidad Biolgica
Universidad Nacional
Colciencias (Convocatorias)
Grupo Investigacin en Hortalizas
Grupo Investigacin Diversidad Biolgica
Universidad Nacional
Colciencias (Convocatorias)
Grupo Investigacin en Hortalizas
Universidad Nacional
Colciencias (Convocatorias)

16000000
1000000
8000000

6000000

1500000
36000000

16

11. CRONOGRANA DE ACTIVIDADES

MESES
ACTIVIDADES
1

10

11

12

Revisin bibliogrfica
Siembra en Semillero
Transplante a campo, evaluacin molecular y qumica
Anlisis Estadstico
Publicacin

17

12. BIBLIOGRAFIA
Cardona, E; Ros, L; Restrepo, G. 2006. Extraccin del carotenoide licopeno del
tomate chonto (Lycopersicum esculentum). En: Vitae, revista de la Facultad de
Qumica Farmacutica. Vol 13. No 2. Universidad de Antioquia, Medelln
Colombia. p. 44-53.
Cox, S. 2000. I Say Tomayto, You Say Tomahto... Estados Unidos.
de Vicente, C. y Fulton T. 2003. Tecnologas de marcadores moleculares para
estudios de diversidad gentica de plantas: modulo de aprendizaje. International
Plant Genetic Resources Institute. IPGRI. Roma, Italia.
Duna, L. 1996. cherry Tomato varietal trial. ARC training. Asian Regional Center
AVRDC. Philipinas. p 5.
ECOMAZ. 2007. Tomate tipo cherry - Tomate Cerise - cherry Tomato - cherry
Tomaten. Frutas y hortalizas ecolgicas. Producciones Ecolgicas Mazimuza,
S.L. En Internet: http://www.ecomaz.com. Cortes de Baza Granada.
Encyclopedia of Chemistry. 2008.
Internet: http://www.chemie.de/

Tomato. Life Science Network Division En

Florido, M.; lvarez, M.; Lara, R.; Plana, D.; Varela, M.; Shagarodsky, T. y Moya, C.
2002. Caracterizacin morfoagronmica y bioqumica de 20 accesiones de Tomate
(Lycopersicon spp). Cultivos Tropicales, vol. 23, no. 4. Cuba. p. 61-69. Disponible
en
internet:
http://revistas.mes.edu.cu:9900/EDUNIV/03-Revistas
Cientficas/Cultivos-Tropicales/2002/4/09402410.pdf
Fondo para la accin ambiental. 2003. Consolidacin de una cadena productiva y
comercial de productos ecolgicos certificados en el rea de los departamentos de
Cundinamarca y Boyac. En: Revista
Frutas y Hortalizas. En Internet:
http://www.frutasyhortalizas.com.co
Franco, T. Hidalgo, R. (2003). Anlisis estadstico de datos de caracterizacin
morfolgica de recursos fitogenticos. Boletn tcnico No 8. Instituto Internacional
de Recursos Fitogenticos (IPGRI), Cali, Colombia, 157 p.
Fontannaz P; Kilinc, T.; Heudi O. 2006. HPLC-UV determination of total vitamin C
in a wide range of fortified food products. En: Food Chemistry. Vol 94. Suiza. p.
625-631.
Goff, S y Klee, H. 2006. Plant Volatile Compounds: Sensory Cues for Health and
Nutritional Value?. En Science. Vol. 311 Issue 5762. USA. p 815-819.

18

Hantula, J., Dusabenyyagasani, M., Hamelin, R. 1996. Random amplified

microsatellites (RAMs) a novel method for characterizing genetic variation within
fungi. Eur. J. For. Path. 26: p. 159 166.
Hernndez, M. 2008. Catalogo Tomates 2008. Rijkzwaan, Seed &Service. En
Internet: http:// www.rijkzwaan.es. Espaa. p. 15
Hernndez, R. 2001. Libro de botanica on-line. En Internet:
http://www.forest.ula.ve/~rubenhg/acidez/#acidez_titulable. Venezuela
International Plant Genetic Resources Institute. IPGRI. 1996. Descriptores para el
tomate (Lycopersicon spp.). Roma. 49 p.
Jaramillo, J.; Rodrguez, V. P.; Guzmn, M.; Zapata. M.; Rengifo, T. 2007. Manual
Tcnico: Buenas Prcticas Agrcolas en la Produccin de Tomate Bajo
Condiciones Protegidas. En Internet:
http://200.75.42.3/SitioWeb/Archivos/Publicaciones/ManualTomateFAO-MANA.pdf
Antioquia (Colombia). P. 316
Jinsin, Y. 1999. Evaluation of cherry tomato inbred lines for multiple disease
resistance. ARC training. Asian Regional Center AVRDC. China. 4 p
Lindhout, P., G. Pet, R. Jansen y H. Jansen 1991. Genetic differences in growth
within and between Lycopersicon species. Euphytica. Vol 57. p 259-265.
Medina, C.; Lobo, M. 2001. Variabilidad morfolgica en el tomate pajarito
(Lycopersicon esculentum var. cerasiforme), precursor del tomate cultivado. En:
Revista Corpoica. Vol 3. No 2. Colombia. p 39 50.
Muoz, J. E.; Cruz, A.; Morillo Y. 2008. Microsatelites amplificados al azar (RAMs)
en estudios de diversidad genetica vegetal. En: Revista Acta Agronmica. En
proceso de publicacin. Colombia.
Nuez, F F. 1991. La mejora gentica de hortalizas. En: La horticultura espaola en
la comunidad europea (L. Rallo y F. Nuez eds). Sociedad espaola de ciencias
hortcolas. Espaa. p. 483-505.
Peralta, I. E.; Spooner, D. M. 2001. Granule-bound starch synthase (GBSSI) gene
phylogeny of wild tomatoes (Solanum L. section Lycopersicum (Mill.) Wettst.
Subsection Lycopersicon. American Journal of Botany. 88 (10): 1888-190
Pratta, G.; Zorzoli, R.; Picardi, L. 2003. Efecto del germoplasma silvestre sobre
caracteres de inters agronmicos en hbridos intra e interespecficos del gnero
Lycopersicon. Revista de Investigaciones de la Facultad de Ciencias Agrarias.
Nmero III. Secretara de Investigaciones. Facultad de Ciencias Agrarias.
Universidad Nacional de Rosario. Argentina

19

Prohens, J; Blanca, JM; Nuez F. 2003.Caracterizacin de tomates silvestres de las

islas Galpagos. Biodiversidad. Actas de horticultura n 39. X Congreso Nacional
de Ciencias Hortcolas. Pontevedra. Espaa. p 114 - 116
Restrepo, E. 2007. Estudios bsicos para iniciar la produccin de cultivares de
tomate Solanum lycopersicum L. con resistencia al pasador del fruto
Neoleucinodes elegantalis (Guene). Tesis de grado. (Doctorado en Ciencias
Agrarias). Universidad Nacional de Colombia. Palmira. Facultad de Ciencias
Agropecuarias. Colombia. 111 p.
Rick, C.M. 1973. Potential genetic resources in tomato species: clues from
observations in native habitats. En: Genes, enzymes and populations. Ed. Svb,
Plenum, New York. p. 255-269.
Rodrguez, J.; Parra, J. 2005. Caracterizacin de variedades autctonas de tomate
cultivadas en la comunidad Valenciana. Espaa.
Rosa, J; Godoy, R; Oiano, J; Campos, R; Matta, V; Freire, C; Silva, A; Souza, R.
2007. Desenvolvimento de um mtodo de anlise de vitamina C em alimentos por
cromatografia lquida de alta eficincia e excluso inica. En: Cinc. Tecnol.
Aliment. Vol 27. Numero 4. Brasil. p. 837-846.
Sanabria, H. 2005. Caracterizacin morfolgica y molecular con marcadores
RAMs en rboles nativos de Psidium guajava (Guayaba) en el Valle del Cauca.
Tesis de grado (Maestra en Ciencias). Universidad Nacional de Colombia.
Palmira. Facultad de Ciencias Agropecuarias. Colombia. 96 p.
Spooner, D. M.; Anderson, G. J.; Jansen, R. K. 1993. Chloroplast DNA evidence
for the interrelationships of tomatoes, potatoes, and pepinos (Solanaceae).
American Journal of Botany. Vol 80. No. 6. p. 676-688.
The british tomato growers association. 2001. Tomato & health. Health and
Nutrition. En Internet: www.healthandnutrition.com
Vallejo, F. 1999. Mejoramiento gentico y produccin de tomate en Colombia.
Universidad Nacional de Colombia Sede Palmira. 126 p.
Vallejo, F.A; Estrada, E.I. 2004. Produccin de hortalizas de clima clido.
Universidad Nacional de Colombia - Sede Palmira. 346 p.
Zietkiewicz, E.; Rafalski A.; Labuda D. 1994. Genome fingerprinting by Simple
Sequence Repeat (SSR)-anchored Polymerase Chain Reaction Amplification.
Genomics 20: 176-183.

20

ANEXO 1. Introducciones de tomate tipo cherry procedentes de Brasil

INTRODUCCION
IAC 157
IAC 391
IAC 400
IAC 401
IAC 402
IAC 403
IAC 404
IAC 412
IAC 416
IAC 418
IAC 420
IAC 421
IAC 424
IAC 426
IAC 443
IAC 445
IAC 451
IAC 458
IAC 460
IAC 1621
IAC 1622
IAC 1623
IAC 1624
IAC 1626
IAC 1684
IAC 1685
IAC 1686

NOMBRE COMUN
Tomate alemao fruto amarillo.
Tomate red cherry
Tomate cereza Guara
Tomate cereza "ruby"
Tomate cereza alemao
Tomate cereza S. C. Rio Pardo
Tomate cereza Assis
Tomate cereza
Tomate cereza rosado
Tomata cereza Lago Unicamp
Tomate cereza
Tomate cereza alemao vermelho
Tomate tipo cherry
Tomate tipo cherry "Juliet"
Tomate cereja Milao
Tomate cereja Jundiai
Tomate cereja 14 A
Tomate cereja 14 B
Tomate cereja Perita TG 0154
Tomate cereja Alemao Doce
Tomate cereja doce rosado
Tomate cereja "Mini Pepe"
Tomate cereja
Tomate cereja
Tomate cereja 15A
Tomate cereja 15B
Tomate cereja "Mini Pepe"

FECHA DE
COLECTA
10/1999
10/1999
10/1991
02/1991
11/1991
12/1991
11/1991
10/1996
10/1996
12/1998
11/2000
11/2000
12/2000
12/2000
07/2001
07/2001
2001
2001
1993
09/2002
08/2002
06/2003
06/2003
11/2005
2006
2006
2006

21

ANEXO 2. Introducciones de tomate tipo cherry procedente del banco de

germoplasma del IPGRI
Accesiones
LA0168
LA 0292
LA 1203
LA 1206
LA 1228
LA 1268
LA 1307
LA 1311-1
LA 1314
LA 1334
LA 1385
LA 1421
LA 1428
LA 1455
LA 1461
LA 1480
LA 1543
LA 1546
LA 1549
LA 1701
LA 1705
LA 2076
LA 2078
LA 2080
LA 2085
LA 2095
LA 2131
LA 2138A
LA 2177A
LA2392
LA 2629
LA 2640
LA 2670
LA 2685
LA 2688
LA 2692
LA 2702
LA 2709
LA 2710
LA 2811

Taxon
L. esculentum var. cerasiforme
L. esculentum var. cerasiforme
L. esculentum var. cerasiforme
L. esculentum var. cerasiforme
L. esculentum var. cerasiforme
L. esculentum var. cerasiforme
L. esculentum var. cerasiforme
L. esculentum var. cerasiforme
L. esculentum var. cerasiforme
L. esculentum var. cerasiforme
L. esculentum var. cerasiforme
L. esculentum var. cerasiforme
L. pimpinellifolium
L. esculentum var. cerasiforme
L. esculentum var. cerasiforme
L. esculentum var. cerasiforme
L. esculentum var. cerasiforme
L. esculentum var. cerasiforme
L. esculentum var. cerasiforme
L. esculentum var. cerasiforme
L. esculentum var. cerasiforme
L. esculentum var. cerasiforme
L. esculentum var. cerasiforme
L. esculentum var. cerasiforme
L. esculentum var. cerasiforme
L. esculentum var. cerasiforme
L. esculentum var. cerasiforme
L. esculentum var. cerasiforme
L. esculentum var. cerasiforme
L. esculentum var. cerasiforme
L. esculentum var. cerasiforme
L. esculentum var. cerasiforme
L. esculentum var. cerasiforme
L. esculentum var. cerasiforme
L. esculentum var. cerasiforme
L. esculentum var. cerasiforme
L. esculentum var. cerasiforme
L. esculentum var. cerasiforme
L. esculentum var. cerasiforme
L. esculentum var. cerasiforme

22

ANEXO 2. Introducciones de tomate tipo cherry procedente del banco de

germoplasma del IPGRI (Continuacin)
Accesiones
LA 2841
LA 2845
LA 2871
LA 3139
LA 3158
LA 3623
LA 3652
LA 3842
LA 4133

Taxon
L. esculentum var. cerasiforme
L. esculentum var. cerasiforme
L. esculentum var. cerasiforme
L. esculentum var. cerasiforme
L. pimpinellifolium
L. esculentum var. cerasiforme
L. esculentum var. cerasiforme
L. esculentum var. cerasiforme
L. esculentum var. cerasiforme

23

ANEXO 3. Descriptores morfoagronmicos para tomate

PARTE VEGETATIVA
Caracterstica de la planta
- Altura de la planta (cm).
- Tipo de crecimiento de la planta (Indeterminado, determinado)
- Longitud del entrenudo (cm)
- Nmero de entrenudos
- Nmero de ramas primarias
INFLORESCENCIA Y FRUTO.
Los descriptores de la inflorescencia.
- Tipo de inflorescencia (simple, compuesta)
- Nmero de inflorescencias.
- Flores por inflorescencia.
- Frutos por inflorescencia.
- Color de la flor.
- Tipo de flor (longistila, brevistila).
- Dehiscencia de la antera.
Los descriptores del fruto
- Color exterior del fruto no maduro (Blanco verduzco, verde claro, verde, verde
oscuro y verde muy oscuro).
- Rayas verdes en el fruto (hombros).
- Intensidad del greenback (hombros verdes).
- Pubescencia del fruto (Escasa, intermedia y densa).
24

- Forma predominante del fruto (Achatado, ligeramente achatado, redondeado,

redondo-alargado, cordiforme, cilndrico (oblongo-alargado), piriforme, elipsoide
(forma de ciruela).

- Peso del fruto (g).

- Homogeneidad del tamao del fruto.
- Longitud del fruto (mm).
- Ancho del fruto (mm).
- Color exterior del fruto maduro (Verde, amarillo, naranja, rosado, rojo).
- Nervadura en el extremo del cliz.
- Forma del hombro del fruto.
- Longitud del pedicelo (cm.).

25

- Longitud del pedicelo desde la capa de la abscisin.

- Presencia/ausencia de pedicelo sin unin.
- Ancho de la cicatriz del pedicelo (cm.).
- Tamao de la zona corchosa alrededor de la cicatriz del pedicelo (mm).
- Grosor del pericarpio (mm).
- Color de la carne del pericarpio (interior).
- Forma del corte transversal del fruto.
- Numero de lculos.
- Forma de la cicatriz del pistilo.
- Firmeza del fruto (despus de almacenamiento).
- Maduracin con manchas.
- Escaldado.
- Agrietado radial.
- Agrietado concntrico.
- Fasciacin del fruto.
SEMILLA.
- Forma de la semilla.
- Peso de 1000 semillas (g)
- Color de la semilla.
CARACTERSTICAS AGRONMICAS.
- Numero de das a la floracin (d).
- Numero de das hasta la madurez (d).
- Uniformidad de madurez en toda la parcela.
26

- Presencia de plagas.
- Presencia de enfermedades.
- Peso de fruto.
- Frutas por planta.
- Produccin por planta.

27

ANEXO 4. Protocolo de extraccin de ADN de plantas utilizando el kit

DNeasy plant.
PASOS PARA LA EXTRACCION
1. Agregue 400 ul de buffer AP1 y 4 ul de Rnase A a un mximo de 100 mg de
tejido macerado o 20 mg de peso seco y haga vortex (no deben verse
aglomerados de tejido, en tal caso haga vortex para disolverlos)
2. Incube la mezcla por 10 minutos a 65 oC mezclar dos o tres veces durante la
incubacin invirtiendo los tubos. Este paso rompe las clulas.
3. Agregue 130 ul de bufer AP2, mezcle e incube por cinco minutos en hielo 8este
paso precipita detergentes, protenas y polisacridos).
opcional: centrifugue por cinco minutos a 14000 rpm.
4. Nota: el paso 1 al 3 se utiliza tubos de eppedor.
5. Despus de la centrifugacin , agregue el sobrenadante al Q/Ashredder mini
spin column (tubo de color morado del kit).
6. Centrifugar Q/Ashredder mini spin column 2 minutos a 14000 rpm.
7. Transfiera el sobrenadante a un tubo nuevo (tubo de eppendor) con cuidado de
no destruir el pelet.
8. Agregar 1.5 volmenes de buffer AP3/ E al sobrenadante (debe estar limpio y
mezclar con pipeta). Nota: es importante pipetear el buffer AP3/E directamente
sobre el nadante y mezclar inmediatamente.
9. Agregar 650 ul de la mezcla del paso 6 incluyendo cualquier precipitado que se
haya formado, al DNeasy mini spin column, (tubo de color blanco del kit)
centrifugue por un minuto a 8000 rpm. descarte el sobrenadante. Reutilice el tubo
para recolectar en el paso 8.
10. repita el paso 7, descarte el sobrenadante y el tubo para recolectar.
11. Colecte DNeasy mini spin column en un tubo nuevo de 2 ml (tubo del collection
kit), agregue 500 ul de buffer AW a DNeasy mini spin column y centrifugue por 1
minuto a 8000 rpm. Descarte el sobrenadante y reutilice el tubo en el paso 10.
12. Agregar 500 ul buffer AW a DNeasy mini spin column y centrifugue por 2
minuto a 14000 rpm para secar la membrana (remueva las DNeasy mini spin
column cuidadosamente para que no entre en contacto con el sobrenadante).

28

13. Transfiera la DNeasy mini spin column a un tubo de 1.5 o 2 ml y pipetee 100 ul
de buffer AE directamente sobre la membrana. Incube por 5 minutos a
temperatura ambiente y despus centrifugue por un minuto a 8000 rpm para diluir.
14. Repita el paso anterior una vez. Puede usar un tubo nuevo de microcentrifuga
o utilice el del paso anterior para combinar las dos diluciones.

29

ANEXO 5. Protocolo para determinacin de vitamina C

Preparacin de la solucin y fase mvil.
La solucin de Tris (2-carboxyethyl)-phosphine hydrochloride (TCEP HCl) a 250
lg/ml se prepara por disolucin en un matraz aforado, 125 mg de TCEP con 500 ml
de agua destilada. La solucin de acido tricloroactico (TCA) al 1% es preparado
en un matraz aforado por disolucin en un matraz aforado 5.0 g de TCA con 500
ml de agua destilada.
La fase LC-mvil se prepara as: 1.6 g de decylamina, 80 ml de acetilnitrilo, 100 ml
de solucin de acetato de sodio (0.25 M) a un pH de 5.4 y 820 ml de agua
destilada introducido en un matraz aforado de 1000 ml; el pH de la solucin se
ajusta a 5.4 con acido fosforito al 85% y 50 mg TCEP HCl es adicionado a la
solucin final.
Preparacin de la muestra
Diez gramos de liquido o slido son pesados en un matraz aforado mbar, se le
adiciona 40 ml de solucin TCEP HCl a 250 lg/ml, la suspensin es mezclada a
fondo para obtener una mezcla homognea y el matraz aforado se llena hasta la
marca con solucin TCA al 1%. La solucin resultante se bate por un minuto y se
filtra a travs de un filtro de papel. La alcuota de la solucin es diluida con la fase
mvil antes de la inyeccin en el sistema del HPLC.

30

ANEXO 6. Protocolo para determinacin de Licopeno

Pretratamiento de la muestra
Los tomates frescos se someten a un proceso de adecuacin, de modo que se
facilite el proceso de extraccin por la concentracin de los carotenoides,
especialmente el licopeno, presente en los frutos mediante la eliminacin de la
humedad o del agua contenida en estos; adems, el pretratamiento permite una
mejor manipulacin de la muestra y una mejor aplicacin del mtodo de
extraccin. Para la extraccin con solventes por etapas de licopeno de tomate
fresco los frutos maduros se licuan y posteriormente se filtran al vaco con un filtro
Bchner y se elimina el 58.26 % en peso del agua contenida en los tomates; la
pulpa concentrada es refrigerada para luego ser utilizada en la extraccin de dicho
carotenoide.
Extraccin con solventes, por etapas, de licopeno de tomate fresco
Para la determinacin de las condiciones ms apropiadas en la extraccin del
carotenoide licopeno de tomate fresco, se utiliza como solvente etil acetato, el ms
apropiado para la aplicacin de esta tecnologa en la extraccin de esta sustancia,
utilizando como medio de calentamiento un bao de aceite.
Determinacin de la temperatura ms adecuada: Se utilizan 50.0 g de pulpa de
tomate por cada 100 ml de solvente; la extraccin se lleva a cabo en una etapa
durante un tiempo de 6 horas a temperaturas de 30, 40 y 50 C, con agitacin
constante; el extracto se separa del material slido por decantacin y filtracin y
luego se almacena en un embudo de separacin para retirar la fase acuosa.
Determinacin de la relacin masa de pulpa/volumen de solvente: La cantidad de
pulpa a emplear es de 50.0 g y la relacin masa/volumen de: 1:4, las extracciones
se llevan a cabo en una etapa durante un tiempo de 6 horas, con agitacin
constante y a la temperatura ms adecuada, y los residuos slidos, as como la
fase acuosa, se separan del extracto por decantacin y filtracin.
Determinacin del mejor tiempo de extraccin: La extraccin se lleva a cabo en
una etapa durante tiempos de extraccin de 0.5, 1, 1.5, 3 y 6 horas, con agitacin
continua; la separacin de los residuos slidos y la fase acuosa se realiza como se
describe anteriormente.
Determinacin del nmero de etapas: Se utiliza solo una etapa.
Obtencin de la oleorresina
Los extractos obtenidos mediante los mtodos empleados se someten a un
proceso de eliminacin del solvente utilizando un rotavaporador, acoplado con una
bomba de vaco y a una temperatura inferior a los 40C, para evitar las prdidas
del carotenoide por oxidacin. La oleorresina obtenida se disuelve en ciclohexano
31

y se almacena en atmsfera de nitrgeno, en la nevera y en un recipiente color

mbar para protegerla de la luz y otros factores que puedan causar su
descomposicin.
Anlisis de las muestras
Las muestras obtenidas se analizan mediante espectrofotometra ultravioleta
visible UV-vis, en un espectrmetro, utilizando ciclohexano como blanco. Se toma
una alcuota de oleorresina y se disuelve en un volumen de ciclohexano hasta
completar 10.0 ml. Las absorbancias de las soluciones se miden a 476 nm,
longitud de onda a la cual la absortividad E del licopeno en ciclohexano es de
3310 (15, 16, 17). La cuantificacin del licopeno presente en la muestra inicial de
pulpa de tomate se realiza con la siguiente ecuacin:
g licopeno
A*V (mL)*104
= * 100 g
100 g de pulpa
E* m (g)
El rendimiento de la oleorresina en base a la masa total de muestra empleada, se
determina por diferencia de peso del baln de rotavaporacin antes y despus de
dicho proceso y se calcula con la siguiente ecuacin:
peso de la oleoresina
Rendimiento = * 100
peso inicial de la muestra

32