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NDICE DE MATERIAS
1. INTRODUCCIN ................................................................................. 2
1.1. Objetivo general................................................................................. 4
1.2. Objetivos especficos ......................................................................... 4
2. REVISIN BIBLIOGRFICA ................................................................ 5
2.1. Descripcin botnica.......................................................................... 5
2.2. Distribucin geogrfica ...................................................................... 6
2.3. Citogentica del gnero Leucocoryne................................................ 7
2.4. Poliploida en la mejora vegetal ......................................................... 8
2.4.1. Caractersticas de la colchicina...................................................... 11
2.4.2. Mtodos para determinar ploidia.................................................... 14
2.4.2.1. Determinacin por caracteres citolgicos ................................... 14
2.4.2.2. Determinacin por su morfologa y desarrollo............................. 14
2.4.2.3. Cariologa.................................................................................... 14
2.4.2.4. Citometra de flujo....................................................................... 15
3. MATERIALES Y MTODOS................................................................
3.1. Material .............................................................................................
3.1.1. Ubicacin del ensayo .....................................................................
3.1.2. Material vegetal..............................................................................
3.1.3. Equipos de invernadero .................................................................
3.1.4. Equipos de laboratorio ...................................................................
3.2. Mtodo ..............................................................................................
3.2.1. Aplicacin de colchicina .................................................................
3.2.2. Polinizacin....................................................................................
3.2.3. Germinacin de semillas................................................................
3.2.4. Determinacin de ploidia................................................................

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4. PRESENTACIN Y DISCUSIN DE RESULTADOS .........................


4.1. Resultados de polinizacin dirigida...................................................
4.2. Resultados de polinizacin natural ...................................................
4.3. Efecto de la colchicina sobre la geminacin de semillas ..................
4.4. Anlisis de ploidia .............................................................................

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5. CONCLUSIONES ................................................................................ 40
6. RESUMEN ........................................................................................... 41
7. ABSTRACT.......................................................................................... 42
8. LITERATURA CITADA ........................................................................ 43

1. INTRODUCCIN

Dentro de las etapas del mejoramiento gentico encontramos la variacin, la


que se refiere a las distintas combinaciones genticas que se hallan en los
organismos de una poblacin o al conjunto gentico de variabilidad
encontrado en ella. La variacin es una etapa importante porque es la base
sobre la cual se har una seleccin de aquellos genotipos que tengan la
mejor expresin en caracteres medibles. En ausencia de variacin el
mejorador debe aumentarlas mediante la mutacin o buscarla en los lugares
de origen de las especies que se van a mejorar.

En el mejoramiento gentico de plantas, se hace necesario el uso de


diversas tcnicas genticas, por lo que muchos autores se han dedicado con
inters a la investigacin de la citogentica, basados en el uso de poliploidia
que presentan las especies cultivadas y/o sus ancestros o especies
silvestres. La poliploidia tiene significacin especial en el fitomejoramiento,
ya que influye en el incremento de la diversidad gentica en el reino vegetal.
La poliploidia ofrece al genetista la oportunidad de lograr cambios en los
caracteres de una planta al alterar en nmero cromosmico, dentro de las
clulas individuales. Tambin ha sido un factor importante en la evolucin de
las especies vegetales. El uso de la poliploidia recibi gran impulso por parte
de los fitogenetistas cuando se descubri que la Colchicina podra ser
utilizada para aumentar o duplicar el nmero de cromosomas.

La induccin de poliploidia supone la interrupcin de la secuencia normal de


acontecimientos en la divisin nuclear.

Palabra revisada de Diccionario de Botanica (FONT, 1953).

Por definicin, un organismo poliploide posee ms de dos juegos completos


de cromosomas en sus clulas somticas, y el tipo de poliploide est
determinado por el nmero de juegos y por las relaciones genticas que
existen entre ellos.

Es una serie poliploide presente en la naturaleza se encuentran niveles de


ploidia 2x, 3x, 4x, 5x, etc., presentando generalmente la especie con el
nmero cromosmico ms alto, mayor vigor, por un aumento del tamao
individual de la clula, aunque este aumento no siempre se extiende a
rganos y tejidos (STEBBINS, 1971).

La duplicacin cromosomal se puede obtener por adicin de complementos


cromosmicos de dos especies, o por duplicacin natural del nmero de
cromosomas, y de acuerdo a su origen se denominan alotetraploide y
autotetraploide respectivamente.

La induccin de un poliploide puede realizarse de diversas maneras: golpes


de fro o calor, radiaciones o agentes qumicos como l oxido nitroso, el etilmercurio y la sulfanilamida. Sin embargo la colchicina es el agente ms
efectivo (ELLIOT, 1964).

La colchicina inhibe, en la divisin celular, el mecanismo del huso y propicia


la formacin de clulas con el doble o ms del doble del nmero de
cromosomas. La sustancia bloquea el ensamblaje de los microtbulos del
huso mittico, con esto, se impide el ordenamiento y la segregacin de los
cromosomas, pero no su ciclo de duplicacin y condensacin.

En consecuencia mediante la tcnica de la colchicina se puede inducir


plantas poliploide en forma sencilla, para el caso del gnero Leucocoryne, se
pretende desarrollar un mtodo para duplicar el nmero de cromosomas de
Leucocoryne purpurea (2n = 10) y Leucocoryne sp. (2n = 18), con el
propsito de obtener rganos ms grandes como flores, bulbos o varas;
aumento del vigor de la planta y hbitos de floracin ms tardos, obteniendo
de esta manera plantas con mayor potencial ornamental y econmico.

1.1.

Objetivo general:

Desarrollar un mtodo de aplicacin de colchicina in vivo en dos especies de


plantas de Leucocoryne, 2n = 10 y 2n = 18, para la obtencin de individuos
con el nmero cromosmico duplicado 4n.

1.2.

Objetivos especficos:

Evaluar una tcnica de induccin de plantas poliploides durante el


proceso de meiosis.

Determinar la concentracin ptima de colchicina para la obtencin de


plantas poliploides.

Cuantificar el efecto del tratamiento con colchicina en la germinacin


de las semillas de Leucocoryne.

2. REVISIN BIBLIOGRFICA

2.1.

Descripcin botnica:

MANSUR et al. (2002) seala que el gnero Leucocoryne comprende un


grupo de plantas herbceas y bulbosas, endmicas de Chile, est formado
por cerca de 14 especies, las cuales se distinguen por su alta variabilidad
gentica en cuanto a forma y aroma de sus flores.
El gnero Leucocoryne pertenece a la familia Alliaceae, subfamilia Aliodeae,
tribu Brodiaceae (DAHLGREN, CLIFFORD y YEO, 1985), aunque ha sido
clasificado como Liliaceae (ENGLER, 1964, citado por ZELLNER, 1972) y
Amaryllidaceae (HUTCHINSON, 1934, citado por ZELLNER, 1972). La
clasificacin taxonmica basada en las caractersticas morfolgicas, es difcil
ya que existen poblaciones de este gnero que presentan gran variabilidad
de forma y colorido tanto en los tpalos como en los estaminodios
(ZELLNER, 1972).

El gnero Leucocoryne se caracteriza por poseer gran cantidad de raicillas


filiformes de color blanco, que nacen del disco basal del bulbo. El bulbo es
esfrico o piriforme y est cubierto por membranas o fibras de color castao.
Las hojas son lineares, angostas y estriadas en nmero de dos a cuatro.
Desarrollan una umbela por escapo floral y poseen un tubo floral formado por
los tpalos creciendo en su parte inferior y por seis lacinias en dos series, las
que son muy semejantes entre s (ZELLNER, 1972).

La fase de reproduccin sexual normalmente se produce cuando el


meristema apical del disco desarrolla a expensas de sustancias de reserva

acumuladas en un tallo floral, que al rasgarse en su extremo se remata por


una inflorescencia en umbela (MAROTO, 1989).

MANSUR et. al. (2004) determin que muchas especies del gnero
Leucocoryne, tiende claramente hacia la polinizacin cruzada y a la
autoincompatibilidad, lo que podra explicar su alto nivel de variabilidad
gentica.

2.2.

Distribucin geogrfica:

El gnero Leucocoryne es endmico de Chile.

Todas las especies se

distribuyen a lo largo de gran parte del territorio nacional, desde Iquique


(Norte del pas, I Regin) a la provincia del Bo-Bo (VIII Regon). En la zona
norte se encuentra desde una altura de 500 800 m sobre el nivel del mar en
las quebradas, sobreviviendo gracias a las abundantes neblinas, al igual que
en las cercanas de Antofagasta y Tocopilla, a partir del ro Elqui hasta el ro
Maipo, las poblaciones se extienden desde la cordillera de la Costa hasta la
cordillera de Los Andes.hacia, al sur del pas las poblaciones de Leucocoryne
slo crecen en los cordones montaosos de la costa a una altura de 400
800 m. Desde el Valle de Copiap hasta el ro Elqui, debido a las condiciones
climatolgicas

ms

favorables,

se

presenta

la

mayor

abundancia

poblacional., A partir del ro Maipo al sur decrece considerablemente la


presencia del gnero, y en la provincia del Bo-Bo slo es posible encontrar
la especie L. alliacea, formando parte del sotobosque (ZELLNER, 1972).

Leucocoryne purpurea Gay. (ANEXO N1), habita en la zona costera de la IV


Regin, abunda en el sector comprendido entre la Baha de Tongoy y el
Parque Nacional Fray Jorge.

Las flores son de color prpura, que se

intensifica hacia la base (ZELLNER, 1972).

2.3.

Citogentica del gnero Leucocoryne:

CAVE (1939) realiz el primer estudio cariolgico en Leucocoryne ixioides, y


reporto que posea un cariotipo de 2n = 18.

Las observaciones citolgicas realizadas en ejemplares de la mayora de las


especies conocidas de Leucocoryne, han permito establecer que un grupo de
especies posee un cariotipo 2n = 10, en tanto un segundo grupo posee un
cariotipo 2n = 18 (BAHAMONDES y LABARCA, 1994; GRAU 1992; PALMAROJAS, ZEPEDA y LABARCA, 1991; CROSA 1988; CAVE, 1939), estas
observaciones fueron confirmadas por (ARANEDA, SALAS y MANSUR,
2004), incluyendo otras poblaciones no definidas taxonomicamente, de
distintas zonas geogrficas, las que presentaron los mismos nmeros
cromosmicos de 2n = 10 y 2n = 18, distribuyndose equitativamente y
encontr una especie con nmero cromosmico de 2n = 14.

CROSA (1988) seala que el cariotipo 2n=18 sera explicable por

la

poliploidizacin a partir de especies 2n=10, sugiriendo la ocurrencia de una


hibridacin de especies ancestrales de numero cromosmico 2n = 10
originando individuos tetraploides 2n = 20. En stos habra ocurrido una
disminucin del nmero cromosmico debido a la fusin cntrica entre
cromosomas acrocntricos.

MORENO y ARANCIO (2001) plantean que de acuerdo a antecedentes


morfolgicos, estos indican la existencia de flujo gentico entre L. purpurea y
L. coquimbensis que habra generado F1 semifrtiles.

stos en una

retrocruza con los parentales habran formados individuos frtiles y


semifrtiles de las individuos mezclados.

SALAS y MANSUR (2004)

establecieron que se produce un flujo gentico entre poblaciones donde

coexisten individuos de distintos niveles de ploidia originando hbridos


nterespecficos con un nmero cromosmico intermedio 2n = 10, 2n =14, 2n
=18 y 2n = 22, produciendo una poliploidia natural en estas poblaciones.

2.4.

Poliploidia en la mejora vegetal:

En las clulas somticas se encuentran dos juegos de cromosomas


homlogos, cada uno de los cuales proviene de sus progenitores masculino y
femenino respectivamente, denominndose esta condicin como diploide. En
algunas especies, las clulas somticas presentan ms de dos juegos de
cromosomas, recibiendo el nombre de poliploides. La poliplodizacin es un
proceso, no un evento (DE WET, 1981)

Los diploides son 2x, los triploides 3x, los tetraploides 4x, los pentaploides 5x
y as sucesivamente. Los miembros que se encuentran en un nivel superior
a los diploides, son llamados poliploides en conjunto (ELLIOT, 1964).

Los genomas de acuerdo a su dotacin cromosmica, pueden ser:


Autopoliploide, en que los n juegos cromosmicos son homlogos (AAAA) y
Alopoliploides, en que los juegos cromosmicos pueden ser total o
parcialmente no homlogos y que se definen como Alopoliploides genmicos
(AABB)

Alopoliploides

segmentales

(AsAsAtAt),

respectivamente

(STEBBINS, 1971; GRANT, 1981).

La poliploidia tiene importancia respecto a campos tan diversos como la


citogentica, la fisiologa, la reproduccin vegetal, la citotaxonoma y la
biogeografa (GRANT, 1989).

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La poliplodia se constituye como el rasgo ms conspicuo de la evolucin


cromosmica en las plantas superiores (STEBBINS, 1971). Una alta
proporcin de las especies de las plantas superiores son poliploides. Segn
AVERETT (1981), en las primeras aproximaciones seala que el 36% de las
angiospermas son poliploides, pero entre un 70 y 80% pueden presentar
poliploidia en su historia evolucionaria. Posteriormente otros clculos estiman
que los porcentajes seran, 49% de las Dicotiledneas, 60 % de las
Monocotiledneas y el 52% de las Angiospermas (GRANT, 1989).

l trmino poliploidia se refiere a una relacin aritmtica especial entre los


nmeros cromosmicos de organismos emparentados que poseen diferentes
nmeros (GRANT, 1989).

El efecto ms inmediato y universal de la poliploidia en las plantas es un


aumento del tamao y masa celular. Este hecho no necesariamente origina
un aumento en el tamao total de planta, y usualmente el efecto de
gigantismo debido a poliploidia puede estar restringido a flores y semillas.
Puede cambiar tambin la forma y textura de hojas y ptalos, que
usualmente son ms gruesos y firmes que en los progenitores diploides
(STEBBINS, 1971). Otro efecto descrito es la disminucin de la velocidad de
crecimiento, como consecuencia de un aumento en la duracin del ciclo
celular, aunque esto no parece ser universal, pues en algunas especies con
distintos niveles de ploidia, los tiempos de ciclo no varan significativamente
(REES, 1972).

Los

diversos

tipos

de

plantas

cultivadas

muestran

diferencias

de

adaptabilidad a la induccin de poliploides. Las plantas con un nmero bajo


de cromosomas tienen una mayor probabilidad de responder bien a la
duplicacin que aquellas plantas con nmeros altos de cromosomas. En la

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duplicacin de cromosomas es ms probable que se tenga xito con plantas


algamas que con plantas autgamas; las probabilidades de xito con
poliploides son mayores en plantas que se cultivan por sus partes
vegetativas, que en aquellas que se cultivan por su semilla (ELLIOT, 1964).

Los poliploides generalmente tienen una fertilidad inferior a la de sus


prototipos diploides. En ciertos cultivos hortcolas o de flores, en que los
costos de la semilla son de poca consideracin en relacin con la belleza y la
vistosidad de flores ms grandes, la reduccin en la fertilidad no es un factor
crtico (ELLIOT, 1964).

La aplicacin prctica de la tcnica de la colchicina propuesta por


(BLAKESLEE et al., 1937, citado por HANCOCK, 1997), abri el camino para
la produccin de poliploides en cantidades virtualmente ilimitadadas.

Hacia 1979 se han duplicado con xito el nmero cromosmico alrededor de


150 especies, utilizando colchicina (DEWEY, 1979).

HANCOCK (1997) seala que durante el siglo XX, la colchicina ha sido


utilizada en distintas investigaciones para duplicar el nmero cromosmico
en numerosas especies cultivadas.

Indicando por ejemplo, la induccin

poliploides en manzana, uvas, peras, duraznos, arndano agrio y frutillas, la


duplicacin de cromosomas en varias especies de flores, como las petunias,
maravillas, lilium entre otras, en hortalizas como lechugas, aj, papas, etc. y
en cultivos industriales como centeno, tabaco, algodn y remolacha
azucarera.

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2.4.1. Caractersticas de la colchicina.

La Colchicina puede utilizarse para duplicar el nmero de cromosomas. ste


producto tiene influencia en la produccin de poliploida, al impedir el
desarrollo de los husos acromticos y paredes celulares sin afectar la divisin
de los cromosomas. Producto de esto, el nmero cromosmico aumenta de
diploide a tetraploide, an

cuando todos los cromosomas permanecen

dentro de una clula individual (POEHLMAN, 1965).

Segn POEHLMAN (1965), la Colchicinaes es un alcaloide extrado de las


semillas o de las races del Colchicum autumnale, es una sustancia soluble
en agua y por consiguiente fcil de utilizar.

En concentraciones

relativamente bajas pueden ser soportadas por muchas plantas sin resultar
txica (BRAUER, 1969).

Su frmula qumica es la siguiente: C22H25NO6 con un peso molecular de


339,4 Es un polvo amarillo plido con un punto de fusin de 157C. Se
oscurece a la luz, muy soluble en alcohol y cloroformo; soluble en agua, y se
utiliza en gentica vegetal (POEHLMAN, 1965).

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Figura 1. Estructura molecular de la colchicina.

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CUBERO (1999), seala que el sistema consagrado desde hace mucho


tiempo es la utilizacin de colchicina, sustancia que produce una mitosis
anormal (llamada c-mitosis) al anular la formacin del acromtico, esencial
en la separacin de los cromatidios hermanos en anafase, y as mismo como
consecuencia la del tabique celular, que debera dividir, en dos hijas la clula
inicial. Ello hace que en vez de emigrar dos 2n cromtidas a cada polo para
formar posteriormente, por la replicacin del ADN, sendas clulas hijas con
2n cromosomas cada una, quedan 4n cromatidios en el centro de la clula
original. Dichas cromatidias completan luego su proceso normal de
reduplicacin, convirtindose en 4n cromosomas. La clula es pues,
tetraploide, y lo ser tambin el individuo que eventualmente llegue a formar.

Segn ALLARD (1967), la colchicina es el agente ms efectivo para la


duplicacin cromosomal. sta al ser aplicada a las plantas en una pasta de
lanolina, embebida en un algodn que se mantiene en contacto con el tejido
meristemtico o mediante cualquier otro procedimiento, no se generan
filamentos del huso en muchas clulas, los cromosomas no se alinean en el
plano ecuatorial, si no, que se dividen sin moverse hacia los polos.
Posteriormente los cromosomas pasan por una telofase normal, formando
una membrana alrededor del ncleo con doble nmero de cromosomas.
Mientras se mantenga en la clula una concentracin crtica de colchicina, la
duplicacin se repite varias veces hasta que despus de tres o cuatro das
pueden existir varios centenares de cromosomas. Por el contrario, si la
colchicina se aplica por poco tiempo vuelve a formarse el huso y se detiene
la duplicacin. Generalmente, slo las clulas con nmero tetraploides, o en
algunos casos octaploides, son capaces de reproducirse y dar lugar a
sectores de tejidos a partir de los cuales se puede perpetuar la raza
poliploide, en programas de mejoramiento gentico.

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2.4.2. Mtodos para determinar ploidia

2.4.2.1.

Determinacin por caracteres citolgicos

Es posible identificar tejidos u rganos poliploides a travs de sus clulas las


que suelen ser mayores o de diferente forma, particularmente los estomas y
los granos de polen (CUBERO, 1999).

FRANDSEN (1967) indica la relacin entre ploidia y nmero de cloroplastos


por clula estomtica, calculando la densidad promedio tanto para plantas
diploides coma para plantas tetraploides.

Las plantas diploides tienen

estomas ms densos y de dimetro ms pequeo que las plantas


tetraploides.

Las plantas tetraploides generalmente tienen granos de polen ms grandes


que las plantas diploides y mayor cantidad de poros (CRAMER, 1999).

2.4.2.2.

Determinacin por su morfologa y desarrollo

El poliploide suele presentar gigantismo, aunque no siempre; existe un nivel


de ploidia por encima del cual ya no hay mas aumento de tamao. Suelen
ser de menor velocidad de desarrollo que los diploides (CUBERO, 1999).

2.4.2.3.

Cariologa

El material elemental de la cariologa es el conjunto de cromosomas de una


clula en divisin. Un cariotipo proporciona informacin sobre el nmero de
cromosomas o nmero diploide (2n) (SPOTORNO, 1985).

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CRAMER (1999) plantea que el estudio cariolgico se puede realizar en


clulas madres del polen, as como tambin en puntas de races en activo
crecimiento.

CHONG y OZIAS-AKINS (1992) consideran que el conteo de cromosomas


en clulas meristemticas es el mtodo inequvoco para la determinacin del
nmero de cromosomas y nivel de ploidia de una especie.

2.4.2.4.

Citometra de flujo.

La citometra de flujo permite medir el contenido de DNA de un aislado del


ncleo. Si los ncleos se tien con un marcador especfico para DNA se
puede determinar el tamao relativo del genoma de los individuos en estudio.
Cuando los niveles de ploidia del testigo son conocidos y se miden de esta
manera, se pude deducir el nivel de ploidia del individuo en estudio. La
ventaja de esta tcnica es la rapidez y el procesamiento de datos mediante
un software (OLLITRAULT-SAMMARCELLI et al., 1993).

Un citmetro de flujo tpico analiza dos parmetros pticos bsicos de las


partculas en suspensin, o sea, emisin de dispersin frontal y lateral de la
fluorescencia de diferentes longitudes de ondas (DOLEZEL, LUCRETTIN y
MACAS, 1995).

La Citometra de flujo del ADN (COSTICH et al., 1993), es un mtodo rpido


y directo de conocer la ploidia de una planta a partir de la cantidad de ADN
existente en sus clulas, sin embargo, se necesita de un equipamiento
especial.

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3. MATERIALES Y MTODOS

3.1. Material:

3.1.1. Ubicacin del ensayo

El ensayo se realiz en el Laboratorio de Fitogentica y el invernadero fro de


la Facultad de Agronoma de la Pontificia Universidad Catlica de Valparaso,
ubicada en la provincia de Quillota, V regin, cuyas coordenadas geogrficas
son 3250 Latitud Sur y 7113 Longitud Oeste.

3.1.2. Material vegetal

El material vegetal empleado en este estudio, se obtuvo de plantas que se


encuentran en la coleccin de germoplasma de la Facultad de Agronoma de
la Pontificia Universidad Catlica de Valparaso y que corresponde a las
especies Leucocoryne purpurea y Leucocoryne spp. (Alcones), genotipo que
an no es clasificado taxonmicamente y se denomina segn su lugar de
colecta (ARANEDA et al., 2004).

Leucocoryne sp. es un ecotipo recolectado en la localidad de Alcones


ubicada en km 370, ruta cinco norte, Comuna de Ovalle, Provincia de Limar
(38 46 S 71 35 O). Presenta un color azulado en las lacinias y en el pice
de los estaminodios, donde el color es ms intenso (ANEXO N1).

Las plantas se identificaron y fueron distribuidas al azar en un invernadero


fro.

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CUADRO 1.

Listado de material vegetal y plantas tratadas del gnero


Leucocoryne.

Material Vegetal

Nmero

Nmero total

Nmero de plantas

cromosmico

plantas

tratadas

L. sp. (tipo Alcones)1

2n = 18

306

154

L. purpurea

2n = 10

230

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Para las presentaciones de cuadro, el ecotipo L. sp. recolectado en la localidad


Alcones se designa Tipo Alcones.

3.1.3. Equipos de invernadero

Sustrato 50% arena y 50% tierra de hoja esterilizada con vapor.

Maceteros de plsticos de 15 cm. de dimetro.

Contenedores de polietileno de 1 l.

Herramientas de jardinera.

Harneros, etiquetas de identificacin.

3.1.4. Equipos de laboratorio.

Solucin de colchicina al 0,05% y 0,1%.

Agua destilada.

Pinzas y bistur.

Placas Petri.

Papel filtro y algodn.

Balanza analtica.

Pipeta.

Esptula.

Guantes quirrgicos.

Mascarilla.

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3.2.

Mtodo:

3.2.1. Aplicacin de colchicina.

Se prepararon dos soluciones de colchicina con diferentes concentraciones:


0,05% y 0,1%.

Se utilizaron plantas de Leucocoryne que se encontraban en estado de


prefloracin, especficamente aquellos escapos o botones florales en estado
temprano de desarrollo cuya longitud aproximada era 3 mm.

CAVE (1939) seala que aparentemente la reduccin de las clulas del polen
ocurre cuando el tallo floral an no emerge del bulbo. Pero las observaciones
cariolgicas desarrolladas en Laboratorio de Fitogentica de la Facultad de
Agronoma de la Pontificia Universidad Catlica de Valparaso, indican que
fenolgicamente la emergencia a ras de suelo del escapo floral coincide
fisiolgicamente a la ocurrencia de meiosis.

La tierra alrededor del escapo fue removida para realizar pequeas


incisiones superficiales con un bistur y favorecer de esta forma la posterior
penetracin de la solucin de colchicina.

Se utiliz papel filtro cortado en forma rectangular con dimensiones de 5 x 4


cm para formar un cilindro que, posteriormente fue colocado envolviendo el
escapo. Sobre la parte superior del cilindro, se coloc una mota de algodn.
Se aplic 1 ml de solucin de colchicina sobre la parte superior del cilindro y
se marc el cilindro con una cinta de color indicativo de la dosis aplicada. El
escapo se mantuvo con colchicina durante 12 hr y luego se retir el cilindro.

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3.2.2. Polinizacin

Los cruzamientos fueron dirigidos en forma intraespecfica y entre plantas


tratadas con las mismas dosis de colchicina. Del total de plantas tratadas se
poliniz el 20%. Este procedimiento, se realiz para asegurar una mejor
polinizacin en las plantas tratadas, ya que existe una tendencia en el genero
Leucocoryne a la auto incompatibilidad.

El resto de las plantas se dejo actuar la polinizacin natural de la especie


esperando que se cumpla la tendencia natural a formar poliploides. Cabe
destacar que en el invernadero donde florecieron las plantas tratadas, existen
una gran cantidad de plantas del genero Leucocoryne de distintas especies
asegurando una gran diversidad de polen, existente en el medio.

El protocolo de polinizacin manual ha sido definido como parte del proyecto


de mejoramiento gentico para plantas del gnero Leucocoryne en la
Facultad de Agronoma de la Pontificia Universidad Catlica de Valparaso
que se resume en las siguientes etapas:

Emasculacin de la flor escogida como parental femenino, la cual consiste en


hacer una incisin usando unas pinzas desde el pice hasta un nivel medio
del tubo floral, abriendo el corte para proceder a remover los estambres,
tomndolas con las mismas pinzas. Proceso que se ejecuta en estado de
botn floral con tpalos coloreados (segn la especie o ecotipo) con el pice
de los mismos levemente abiertos, en esta etapa los estambres se
encuentran viables sin polen maduro en las anteras.

Remocin de anteras maduras desde la flor escogida como parental


masculino.

Utilizando el mismo procedimiento anterior de corte del tubo

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floral, para extraer las anteras o bien introduciendo las pinzas por la boca del
tubo para tomar las anteras y jalando hacia arriba suavemente para
extraerlas, procedimiento que se realiza usando estados avanzados del
desarrollo floral para asegurar madurez de las anteras y la dehiscencia.

Posteriormente se deposita el polen sobre el estigma de la flor parental


femenina. Con la antera extrada de la flor parental masculina, tomada con
pinzas, se procede a tomar el estigma de la flor parental femenina hasta
dejarlo de una coloracin amarilla, que revela la presencia de abundante
polen. Luego se pliegan los tpalos hacia el centro y se coloca una cinta de
enmascarar para evitar la entrada de insectos polinizantes que distorsionen
el tratamiento.

3.2.3. Germinacin de semillas

Todas las semillas se obtuvieron de frutos maduros (secos). Las semillas


fueron seleccionas por uniformidad de tamao, se contaron y guardaron en
sobres de papel.

Las semillas se pusieron a germinar sobre placas Petri cubiertas con papel
absorbente empapados con agua destilada. Las placas se almacenaron en
una cmara sin luz y con temperatura constante de 15C, las perdidas por
evaporacin fueron repuestas cada dos das, una semilla se considera
germinada cuando emerge la radcula, los conteos de semillas germinadas
se realizaron cada dos das, y la germinacin de toda la poblacin se asumi
cuando ninguna de las semillas germin luego de seis das consecutivos.

Test de germinacin.

22

Se utiliz la ecuacin ocupada por (DE LA CUADRA, 2002):


p = A [1 exp{-k(t t0)}]
Donde:
p: porcentaje de germinacin en el tiempo t.
A: porcentaje final de germinacin.
t0: tiempo estimado de germinacin de la primera semilla.
k: medida de extensin de tiempo de germinacin.

El transplante se realiz a mediada que las semillas alcanzaron una longitud


de radcula de 2 mm. Se colocaron en maceteros y se llevaron a invernadero
para su desarrollo. Las plantas fueron regadas una vez por semana hasta
que alcanzaron una altura aproximada de 10 cm, coincidente con 1 cm2 de
rea foliar para ser analizadas.

3.2.4. Determinacin de ploidia

El tejido utilizado para el anlisis de citometra de flujo, corresponde a una


pequea porcin de hoja de tamao mnimo de 1cm2, las hojas se obtuvieron
en dos estados de las plantas, ya que el anlisis tambin se realiz en dos
etapas:
El anlisis de ploidia mediante citrometra de flujo, se basa en la iluminacin
de la muestra con una lmpara de mercurio, la que excita las molculas
teidas con DAPI, las que emiten fluorescencia, que es captada por un foto
multiplicador que convierte la fluorescencia en pulsos electrnicos, los cuales
son digitalizados y convertidos en nmeros binarios y almacenados en
histogramas unidimensionales.

23

En la etapa preliminar, ste se realiz sobre hojas jvenes, de plntulas


obtenidas de semillas. Este primer anlisis incluy ambas especies, pero no
todos los tratamientos ya que en dos de ellos (0.05 colchicina+polinizacin
dirigida y 0.1colchicina+polinizacin dirigida) las plntulas no sobrevivieron
despus del transplante o las hojas no alcanzaron el tamao mnimo
requerido para ser analizadas.

Posteriormente se hizo crecer los bulbillos obtenidos de la primera etapa,


estos

se

cosecharon

se

mantuvieron

en

cmara

segn

las

recomendaciones de manejo propuestas por OHKAWA et. al. (1996).


Concluido el receso se plantaron durante una temporada de crecimiento con
el objeto que los bulbos acumulen reservas y aumenten su tamao Una vez
completada la temporada de crecimiento fueron nuevamente llevadas a una
cmara de receso vegetativo.

En la segunda etapa, en el anlisis se utiliz hojas obtenidas de plantas postjuvenil obtenidas de bulbos plantados en maceteros individuales crecidas en
invernadero. Este anlisis se realiz solo para la especie Leucocoryne
purpurea, ya que se obtuvieron mayor nmero de bulbos y los resultados de
duplicacin fueron mejores.

Las plantas se analizaron mediante Citometra de Flujo en la Empresa


PLANT CYTOMETRY SERVICES domiciliada en Europalaan 74 - 5481 JG
Schijndel, Holanda. El protocolo de anlisis de citometra de flujo utilizado por
la empresa Plant Cytometry Services. Esta explicado en el (ANEXO N2)

Las plntulas fueron cosechadas vaciando los maceteros sobre una serie de
harneros de diferente tamiz, para separar los bulbos de la parte area. Los
bulbos fueron almacenados en sobres de papel y llevados a cmara a 20C.

24

por

cuatro

meses.

Posteriormente

fueron

plantados

en

maceteros

independientes con el objeto de aumentar su tamao y asegurar su viabilidad


en ensayos posteriores.

Las hojas primarias fueron colocadas en un sobre de papel absorbente


humedecido con agua destilada, cada sobre fue etiquetado e introducido en
bolsas de plsticos hermticas, en grupos de diez plantas por bolsa. stas
bolsas fueron enviadas en sobres con cojinetes de aire para evitar ser
aplastadas, el transporte fue por medio un servicio de Courier internacional.

25

4. PRESENTACIN Y DISCUSIN DE RESULTADOS.

4.1.

Resultado polinizacin dirigida:

Los resultados de la polinizacin intraespecfica y de plantas tratadas con la


misma dosis de colchicina se indican en el Cuadro 2 y 3.

CUADRO 2.

Porcentaje de cruzamientos exitosos, para los genotipos y


distintas dosis colchicina.

Genotipo

L. spp. (Alcones)
L. spp. (Alcones)
L. spp. (Alcones)
L. purpurea
L. purpurea
L. purpurea

Cruzamientos Porcentaje de
Dosis
Total
Colchicina Cruzamientos
exitosos
xito
(%)
0.05
19
12
63%
0,1
18
4
22%
Testigo
20
12
60%
0,05
7
6
86%
0,1
11
10
91%
Testigo
20
17
85%

Los porcentajes de xito varan entre 22% a 91%, encontrndose en la


especie Leucocoryne purpurea, los mayores valores.
CUADRO 3.

Nmero promedio de semillas por fruto para los genotipos con


polinizacin dirigida, con distintas dosis de colchicina.

Genotipo

L. spp. (Alcones)
L. spp. (Alcones)
L. spp. (Alcones)
L. purpurea
L. purpurea
L. purpurea

Dosis
Nmero
Colchicina de frutos
(%)
0,05
12
0,1
4
Testigo
12
0,05
6
0,1
10
Testigo
17

Nmero total
de semillas

Nmero promedio
de semillas/fruto

83
29
211
345
554
966

6,9
7,3
17,6
57,5
55,4
56,8

26

Los valores promedio de semillas por fruto, al igual que los porcentajes de
xito muestran alto valores para la especie Leucocoryne purpurea,
respondiendo esta especie mejor a la polinizacin intraespecfica.

4.2.

Resultados polinizacin natural:

El anlisis de los resultados de las plantas tratadas que se dejaron polinizar


libremente, se presentan en el Cuadro 4.

CUADRO 4.

Nmero promedio de semillas por fruto para los genotipos con


polinizacin libre, con distintas dosis de colchicina.

Genotipo

L. spp. (Alcones)
L. spp. (Alcones)
L. spp. (Alcones)
L. purpurea
L. purpurea
L. purpurea

Dosis
Colchicina
(%)
0,05
0,1
Testigo
0,05
0,1
Testigo

Nmero
de frutos

Nmero total
de semillas

Nmero promedio
de semillas/fruto

108
63
178
53
46
156

1216
200
2749
639
792
4774

11,3
3,2
15,4
12,1
17,2
30.6

El nmero promedio de semillas/fruto para polinizacin libre, vara entre 3,2 y


17,2 y muestra valores ms bajos, comparados con el promedio de
semillas/fruto de polinizacin dirigida, en la especie L. purpurea.

En

Leucocoryne spp. (Alcones), encontramos el ms bajo promedio de

semilla/fruto, y mantiene la tendencia comparado los valores de polinizacin


dirigida.

27

4.3.

Efecto de la colchicina sobre la germinacin de semillas:

Las curvas de germinacin se ajustaron por regresin lineal simple a la


ecuacin exponencial p = A [1-exp{k(t-t0)}] y los valores de los coeficientes de
determinacin (R2) se encuentran en un rango que varia entre 0,93 a 1,0
indicando que las curvas se comportan de forma similar (Cuadro 5)
CUADRO 5.

Valores de coeficiente de determinacin (R2) obtenidos de


curvas de germinacin ajustadas por regresin lineal simple.

Genotipo
L. spp. (Alcones)
L. spp. (Alcones)
L. spp. (Alcones)
L. spp. (Alcones)
L. spp. (Alcones)
L. purpurea
L. purpurea
L. purpurea
L. purpurea
L. purpurea

Tratamiento
0,05% colchicina + polinizacin dirigida
0,05% colchicina + polinizacin libre
0,1% colchicina + polinizacin dirigida
0,1% colchicina + polinizacin libre
Testigo
0,05% colchicina + polinizacin dirigida
0,05% colchicina + polinizacin libre
0,1% colchicina + polinizacin dirigida
0,1% colchicina + polinizacin libre
Testigo

R2
0,96
0,99
0,96
0,98
0,97
0,93
0,99
1
0,99
0,93

El porcentaje final de germinacin (A), tiempo en dias, estimado de


germinacin de la primera semilla (to), extensin en la poblacin del tiempo
de germinacin (k), y velocidad de germinacin de la mitad del total de
semillas que germinan (1/tA/2), se presentan en el Cuadro 6.

28

CUADRO 6. Efecto de la colchicina y tipo de polinizacin sobre los


parmetros que describen la curva de germinacin.
Genotipo
L. spp.
(Alcones)
L. spp.
(Alcones)
L. spp.
(Alcones)
L. spp.
(Alcones)
L. spp.
(Alcones)
L. purpurea
L. purpurea
L. purpurea
L. purpurea

Tratamiento
0,05% colchicina +
polinizacin dirigida
0,05% colchicina +
polinizacin libre
0,1% colchicina +
polinizacin dirigida
0,1% colchicina +
polinizacin libre
Testigo

Total de
semillas

A(%)1

to 2

K2

1/tA/2 2

22 b

5,29 a

0,20 ab

0,11 a

24 b

6,51 a

0,21 a

0,10 a

30 ab

7,07 a

0,20 ab

0,10 a

30 ab

6,01 a

0,16 b

0,10 a

62 a

7,64 a

0,26 a

0,10 a

28 c

5,91 a

0,25 ab

0,11 a

33 bc

4,13 a

0,28 a

0,15 a

36 bc

4,90 a

0,26 a

0,13 a

38 b

4,84 a

0,17 b

0,11 a

83
1216
29
346
200

0,05% colchicina +
polinizacin dirigida
0,05% colchicina +
polinizacin libre
0,1% colchicina +
polinizacin dirigida
0,1% colchicina +
polinizacin libre
Testigo

345
639
554

792
88 a
5,23 a
0,30 a
0,13 a
L. purpurea
200
1
Valores seguidos con letras iguales no presentan diferencias significativas con P<0.05
segn Test de diferencia entre dos proporciones.
2
Valores seguidos con letras iguales no presentas diferencias significativas con P<0.05
segn Intervalo de confianza.

Los porcentajes de germinacin para Leucocoryne spp. (Alcones) muestran


que existen diferencias significativas entre el testigo y dos de los
tratamientos, pero no existe diferencia entre ellos.

Para

Leucocoryne purpurea, los porcentajes de germinacin del testigo

presentan diferencias significativas en todos los tratamientos, y tambin


existen diferencias entre los tratamientos.

Respecto a los tratamientos con colchicina existe un efecto sobre el


porcentaje final de germinacin, siendo ms efectivo en Leucocoryne
purpurea donde todos los tratamientos disminuyen en forma significativa

29

respecto al testigo, mientras que para Leucocoryne spp. (Alcones) el


porcentaje final del testigo es ms bajo respecto a Leucocoryne purpurea y
slo se diferencia en dos de los tratamientos, donde la dosis de colchicina
corresponde a 0,05%, para polinizacin libre y polinizacin dirigida.

Trabajos anteriores sealan que uno de los efectos recurrentes en el uso de


la colchicina es el comportamiento errtico, con disminucin de la fertilidad
de las plantas y la viabilidad de la semilla (BREMER-REINDERS y BREMER,
1952).

En

tetraploides

inducidos

por

colchicina

en

Eustoma

grandiflorum

encontraron que su nica caracterstica negativa era su baja fertilidad de


semilla de un 2%, pero indican que esta caracterstica se puede revertir con
cruzamientos dirigidos y seleccin (GRIESBACH y BHAT, 1990)

Los valores del tiempo estimado de germinacin de la primera semilla (to) o


de latencia, estadsticamente, no muestran diferencias significativas entre los
tratamientos y el testigo, para ambas especies estudiadas, siendo menor los
valores que presenta Leucocoryne purpurea, sin embargo, las dos especies
presentan comportamientos homogneos en el tiempo de germinacin de la
primera semilla.

El parmetro k

muestra valores similares, slo presentan diferencias al

comparar el testigo con respecto al tratamiento 0,1% de colchicina y


polinizacin libre, tanto para Leucocoryne purpurea como para Leucocoryne
spp. (Alcones), los valores de k indican la duracin del tiempo entre la
germinacin de la primera y la ltima semilla, por lo tanto, los valores de
estos tratamientos se traducen en mayor desuniformidad en la emergencia

30

de las plntulas. Una mejor forma de visualizar este parmetro es mediante


las curvas de germinacin (Figura 2 y 3).

Los efectos sobre la tasa de desarrollo han sido descritos por (HANCOCK,
1997) y seala que existe una disminucin de la velocidad de crecimiento
como consecuencia de un aumento en la duracin del ciclo celular. Esto no
parece ser universal, pues en otras especies con distintos niveles de ploidia,
los tiempos de ciclo no varan significativamente (REES, 1972).

31

0,7

0,6

Germinacin, p (%)

0,5

0,4

0,3

0,2

0,1

0
0

10

15

20

25

30

Tiempo, t (das)
Testigo

0.05% colchicina + polinizacin dirigida

0.1% colchicina + polinizacin dirigida

0.05% colchicina + polinizacin libre

0.1% colchicina + polinizacin libre

FIGURA 2.

Curva de germinacin promedio descrito por el modelo


exponencial p = A [1-exp{k(t-t0)}] para todos los tratamientos
estudiados en Leucocoryne spp. (Alcones).

32

1
0,9
0,8

Germinacin, p (%)

0,7
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0
0

10

15

20

25

30

Tiempo, t (das)
Testigo

0.05% colchicina + polinizacin dirigida

0.1% colchicina + polinizacin dirigida

0.05% colchicina + polinizacin libre

0.1% colchicina + polinizacin libre

FIGURA 3.

Curva de germinacin promedio descrito por el modelo


exponencial p = A [1-exp{k(t-t0)}] para todos los tratamientos
estudiados en Leucocoryne purpurea.

33

4.4.

Anlisis de ploidia:

Los resultados obtenidos del anlisis de citometra de flujo, se realiz slo


para el grupo de plntulas que lograron sobrevivir posterior al transplante, ya
que se produjo una importante prdida de individuos en esta etapa.

El Cuadro 7 indica los resultados de citometra de flujo, para plntulas


obtenidas de semillas, donde incluyen las dos especies estudiadas y los
niveles encontrados. La citometra de flujo entrega niveles de ploidia para
individuos diploides (2n), tetraploides (4n) y mixaploides (2n 4n) y se
presentan a continuacin.

Solo se logro duplicacin del nmero de cromosomas en Leucocoryne

purpurea. En Leucocoryne spp. (Alcones) se produjo una duplicacin parcial


logrando solo individuos mixaploides. Los individuos mixaploides presentan
niveles intermedios de ploidia entre diploides y tetraploides. Todos los
mixaploides analizados presentan entre 10% y 20% de cromosomas
duplicados.

El nmero de plantas analizadas para la especie Leucocoryne spp. (Alcones)


es bajo, debido a que se produjo una gran prdida de plantas en el estudio
de germinacin, y un bajo establecimiento post transplante, lo que se puede
deber a que solo se logra duplicacin parcial originando semillas inviables o
plntulas de tipo quimeras, estas no logran desarrollar la totalidad de sus
tejidos.

34

35

Es imposible comparar si se cumple lo sealado por (ALLARD, 1967),


respecto a la adaptabilidad de las plantas cultivadas a la induccin de
poliploides, que aquellas plantas con nmero bajo de cromosomas es ms
probable que respondan bien a la duplicacin que aquellas plantas con
nmeros altos de cromosomas.

Esto indicara que Leucocoryne purpurea 2n = 10 tiene mayor probabilidad


de duplicacin cromosomal, pero es necesario un estudio ms acabado de

Leucocoryne spp. (Alcones) 2n = 18 para afirmar que esta situacin se


presenta en este estudio.

Estos propuestos si se cumplen en los estudios realizados en Lilium donde


destacan que la diferencia en sensibilidad al tratamiento con colchicina entre
genotipos puede ser muy grande (VAN TUYL, 1989)

Por otro lado (GRANT, 1989) seala que los poliploides contienen mucha
duplicacin de material gentico en los ncleos, pueden tolerar, a menudo, la
prdida de uno o ms pares de cromosomas. Esto lleva a series poliploides
modificadas que terminan con lo que se ha denominado como reduccin de
la poliploidia, lo que puede explicar que solo se logra encontrar individuos
mixaploides.

Leucocoryne purpurea presenta duplicacin parcial y total del nmero de


cromosomas, pero las plantas tetraploides no sobrevivieron, ya que el
anlisis de citometra de flujo fue destructivo y solo sobrevivieron las plantas
no analizadas, las que fueron cosechadas en el momento que la primera hoja
muere.

36

Debido a que Leucocoryne purpurea presento mejores porcentajes de


duplicacin, las plantas que sobrevivieron y lograron formar un bulbito fueron
analizadas despus de alcanzar un tamao adecuado, logrado en dos
temporadas de crecimiento, lo que nos asegurara la obtencin de individuos
vivos con su nmero cromosmico duplicado.

En el Cuadro 8, se presentan los resultados del segundo anlisis de


citometra de flujo, realizado sobre hojas obtenidas de bulbos jvenes, para
la especie L. purpurea.

Los niveles de ploidia para el genotipo Leucocoryne purpurea, van desde un


alto porcentaje de plantas diploides, hasta la duplicacin parcial, encontrando
plantas triploides y mixaploides en bajos porcentajes; y obteniendo
individuos duplicados al nivel de tetraploides y hexaploides, pero tambin en
porcentajes bajos.

En la Figura 4 se presentan los histogramas de los niveles diploides y


tetraploides.

La

intensidad

de

la

fluorescencia

esta

correlacionada

directamente a la cantidad de DNA que es teido con DAPI.

Ambas concentraciones de colchicina lograron generar duplicacin parcial y


total del nmero de cromosomas, siendo los mejores porcentajes de
individuos mixaploides y de individuos tetraploides de un 5.15%, con una
concentracin 0.05%.

37

38

200
RN1

RN2

160

counts

120

80

40

0
0

200

400

600

800

1000

FL 2 DAPI

50
RN1

40

counts

30

20

10

0
0

200

400

600

800

1000

FL 2 DAPI

FIGURA 4. Histograma del contenido relativo de DNA obtenido mediante


citometra de flujo, de Leucocoryne purpurea, para plantas (a) 2n y (b)
4n.

39

Respecto a otros estudios (HALINAR, 1990), seala que cuando se realiza


duplicacin de cromosomas utilizando tratamientos con colchicina, en
general est condicionado a xito o fracaso, y a menudo resultan quimeras o
mixaploides inestables ms que

conversiones verdaderos tetraploides

estables; por lo cual no se aconseja depender solo de colchicina , si no que


tambin se debera poner a prueba el uso de otros agentes antimitticos
como los herbecidas oryzalin y trifluralin, puesto que son menos toxicos y
tienen mejor afinidad para las clulas de las plantas (CHAUVIN et al., 2003).

Comparando los tipos de polinizacin, se obtuvieron mejores porcentajes en


cuando se dejo actuar la polinizacin natural, ya que en los individuos
obtenidos de cruzamientos solo encontramos duplicacin parcial.

Lo que se tendra relacin con lo postulado por (GRANT, 1981 y STEBBINS,


1971), que

factores tanto internos como externos involucrados en la

generacin y posterior establecimiento de poliploide natural. Bsicamente, es


fundamental que se de la combinacin de tres condiciones. La primera es la
existencia de especies diploides que posean diferentes genomas o
subgenomas. La segunda es que exista hibridacin natural entre estas
especies, la tercera es que sean plantas perennes de vida larga, aumentando
la posibilidad de duplicaciones cromosmicas somaticas, o bien que sean
plantas anuales autocompatibles para as aumentar las posibilidades de
unin de gametos no reducidos.

Lo que nos indica que las plantas duplicadas exitosamente, se puede haber
debido a un proceso de autopolinizacion. Sin embargo, esto contrastara con
la tendencia de la especie a la autoimcompatibilidad, que presenta la
especie. (MANSUR et al., 2004).

40

Estos resultados indican la limitancia de desarrollar un programa de


produccin de poliploides, con el mtodo propuesto es este estudio, ya que
solo seria valido en los genotipos donde la autoimcompatibilidad no es
importante, siendo este un grupo menor dentro el gnero.

Por otro lado resultara interesante realizar un estudio de la frecuencia de


produccin de gametos no reducidos, por una parte, de los que se producen
por aplicacin de colchicina u otro agente antimittico y por otro lado, a las
distintas especies, para poder determinar su real tendencia ha producir
poliploidia. Estos estudios se han desarrollados en programas de
poliploidizacin de Lilium (HALINAR, 1990).

41

5.

CONCLUSIONES

El mtodo de aplicacin de colchicina utilizado en plantas del gnero

Leucocoryne logra una duplicacin total o parcial del nmero de


cromosomas, influyendo en cierto grado en el proceso de meiosis, sin
embargo no se puede determinar el momento exacto de aplicacin, sin un
estudio citolgico de la meiosis.

Ambas concentraciones utilizadas, 0.05 y 0.1 de colchicina, producen


modificacin del nmero cromosomal y no resultan txicas para la planta.
Pero los porcentajes obtenidos de individuos tetraploides son muy bajos.

La colchicina afecta el porcentaje final de germinacin (A) y la extensin del


tiempo de germinacin (k), es decir, afecta la viabilidad de las semillas y la
tasa de desarrollo de stas.

La polinizacin natural o libre favorece la formacin de individuos


tetraploides, sin embargo no seria interesante aplicar el mtodo en un
programa extensivo de poliploidizacin, ya que es contrario a la tendencia del
gnero por la autoimcompatibilidad.

42

6.

RESUMEN

La duplicacin de cromosomas mediante la utilizacin de colchicina, sigue


siendo una tcnica atractiva y viable en el mejoramiento de plantas
ornamentales.
El gnero Leucocoryne endmico de Chile presenta gran potencial
ornamental como flor de corte y planta de maceta, por lo tanto se estudi un
mtodo de aplicacin de colchicina in-vivo para obtener plantas tetraploides.
En este estudio, se utilizaron dos dosis de colchicina 0,1% y 0,05% y se
aplicaron en prefloracin, sobre escapos florales en estados tempranos de
desarrollo durante 12 horas. Una proporcin de estas plantas se polinizaron
mediante cruzamientos dirigidos y el resto fueron dejadas para que actuara la
polinizacin natural de la especie. A las semillas obtenidas se les practic un
test de germinacin utilizando el modelo de regresin lineal simple descrito
por la ecuacin exponencial p = A [1-exp{k(t-t0)}] y se evalu el nivel de
ploidia mediante citometra de flujo.
Se concluy que el mtodo de aplicacin y las dosis de colchicina utilizadas
lograron duplicar total o parcialmente en nmero de cromosomas y que
existe un efecto detrimental en la germinacin de semillas.

43

7. ABSTRACT

Induction of polyplody in plants of the Leucocoryne genus.


Chromosome duplication using colchicine continues to be an attractive and
viable technique in the breeding of ornamental crops.
The Leucocoryne genus, endemic to Chile, has great potential for ornamental
use as both cut flowers and pot plants. Therefore a method for the application
of colchicine in-vivo to obtain tetraploid plants was studied.
In this study two colchicine doses, 0.1% and 0.05%, were applied before
flowering to Leucocoryne scapes in early stages of development, for 12
hours. Some of these plants were pollinated manually under supervised
crosses and the rest were left to pollinate naturally. The seeds were then
tested for germination using a simple linear regression model described by
the exponential equation p = A [1-exp{k(t-t0)}], and the ploidy level was
evaluated using flow cytometry.
It was concluded that the application method and the colchicine doses utilized
were able to partially or completely duplicate the chromosome number and
that there was a detrimental effect on seed germination.

44

8.

LITERATURA CITADA

ALLARD, A. 1967. Principios de la mejora gentica de las plantas.


Barcelona, Omega. 498p.
ARANEDA, L.; SALAS, P.; MANSUR L. 2004. Chromosome numbers in the
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48

ANEXOS

49

ANEXO 1. (a) Leucocoryne spp. (Tipo Alcones). (b) Leucocoryne purpurea.

50

ANEXO 2. Protocolo de anlisis de citrometra de flujo, utilizado por Plant


Cytometry Services.
ISOLATION OF NUCLEI.
Starting with a certain amount of fresh plant material (preferably young
leaves), the first step is to isolate the nuclei from the plant cells and keep
2
them intact in a solution.To reach this, leaf material (a few cm /20-50 mgr)) is
"chopped" with a sharp razor blade in an icecold buffer, in a plastic petri disc.
DNA buffer (stored at 4 C) a little modified after.(ARUMUGANATHAN AND
EARLE 1991)
5 mM Hepes
10 mM Magnesium sulphate heptahydrate
50 mM Potasium chloride
0,2 % Triton X-100
2% DTT (Dithiothreitol)
4 mgr/liter DAPI
pH 8
DAPI is a fluorescent dye which selectively complexes with double-stranded
DNA to give a product that fluoresce at 465 nm. DAPI has specific DNAbinding properties with preference for adenine-thymine (AT)-rich sequences.
After chopping, the buffer (ca. 2 ml.), containing cell constituents and large
tissue remnants, is passed through a nylon filter of 40 micrometer mesh size.
With this method it is possible to get thousands of nuclei from a leaf of a few
cm2.
FLOW CYTOMETRY.
The solution with stained nuclei is send through the flowcytometer. The
fluorescence of the stained nuclei, passing through the focus of a lightbeam
from a high-pressure mercurylamp, is measured by a photomultiplier and
converted into voltagepulses. These voltagepulses are electronically
processed to yield integral and peak signals and can be processed by a
computer. When the samples are run with the appropriate filter-settings for
excitation and emission, DNA histograms can be produced.
MATERIAL.
Flowcytometer: PAS II (Partec GmbH, Otto Hahnstrasse 32, D-4400 Mnster,
Germany) with a high pressure mercury lamp, OSRAM HBO 100 long life
Filtercombination with DAPI:

51

Heat protection filter KG-1


Excitation-filters: UG-1and BG-38.
Dichroic mirrors: TK 420 and TK 560.
Emission-filter: GG 435
DNA histograms are performed on a normal PC.
Software: Flows 2.00 (development and distribution by Plant Cytometry
Services)

52

CUADRO 7. Niveles de ploidia, nmero de semillas y plantas obtenidas post


transplante, para los distintos tipos de polinizacin y
concentracin de colchicina, en los genotipos L. purpurea y
L.spp.

Genotipo

Dosis de
colchicina

Tipo de
polinizacin

Numero
total de
semillas

Plantas
obtenidas

L. spp.
(Alcones)

0.05

Dirigida

83

L. spp.
(Alcones)

0.05

Libre

1216

13

L. spp.
(Alcones)

0.1

Dirigida

29

L. spp.
(Alcones)

0.1

Libre

346

L. spp.
(Alcones)

Testigo

Libre

L. purpurea

0.05

L. purpurea

Plantas
analizadas

Plantas
diploides 2n

5 (100%)

50

16

14 (87,5%)

200

36

5 (100%)

Dirigida

345

19

2 (66,7%)

0.05

Libre

639

103

3 (50%)

L. purpurea

0.1

Dirigida

554

111

66

46 (69,7%)

L. purpurea

0.1

Libre

792

131

33

18 (54,5%)

L. purpurea

Testigo

Libre

200

21

5 (100%)

Plantas
Tetraploides
4n

3 (50%)

2 (6%)

53

CUADRO 8.

Genotipo

Niveles de ploida, numero de bulbos totales, plantas


analizadas, para los distintos tipos de polinizacin y
concentracin de colchicina, en el genotipo L. purpurea.

Dosis de
colchicina

Tipo de
polinizacin

Plantas
Plantas
Plan
Numero
Plantas
Triploides Tetraploides hexap
total de Plantas
4n
bulbos analizadas diploides 2n 3n
6n

L. purpurea

0.05

Dirigida

18

10

10 (100%)

L. purpurea

0.05

Libre

61

50

46 (92%)

L. purpurea

0.1

Dirigida

32

21

21 (100%)

L. purpurea

0.1

Libre

48

39

35 (89,7%)

L. purpurea

Testigo

Libre

17

5 (100%)

1 (2%)

1 (2%)

2 (5,15%)

1(

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