PONTIFICIA UNIVERSIDAD CATLICA DE VALPARAISO

FACULTAD DE INGENIERA
ESCUELA DE INGENIERA BIOQUIMICA

ICB 540
PRODUCCION DE METABOLITOS
ASPARAGINASA

Introducc
in
Disc.
Bibliog,
Conclusi
n
Referenci

10%

70
Alumnos:

50%

60

30%

65

10%

50

Pamela Cortes
Claudia Malla
Nayadet Rodrguez

Profesor: Claudia Altamirano

Julio Berrios
Abril 2015

INDICE
CAPITULO 1
INTRODUCCIN

CAPITULO 2
2.1 RELEVANCIA Y APLICACIN
2.2 PROYECCIONES DE LA PRODUCCION
2.3 PROCESO DE PRODUCCION

CAPITULO 3
CONCLUSIONES

REFERENCIAS
BIBLIOGRAFIA

ANEXOS
ANEXO 1
MECANISMO DE ACCION ASPARAGINASA
ANEXO 2
DIFERENTES FUENTES BACTERIANAS PARA ASPARAGINASA
ANEXO 3
EVOLUCION TEMPORAL DE LA APARACION DE ASPARAGINASA II
ANEXO 4
USO INDUSTRIAL DE ACRYLAWAY EN EL MUNDO

INDICE DE TABLAS
Tabla 1: Diferentes Fuentes bacterianas para asparaginasa

INDICE DE FIGURAS
Figura 1: Esquema mecanismo de reaccin asparaginasa
Figura 2: Evolucin temporal de la aparicin de asparaginasa II en cultivos.
Figura 3: Uso industrial de Novozymes Acrylaway en el mundo al ao 2013.

CAPITULO 1
INTRODUCCIN
La asparaginasa es la enzima que desamida la asparagina (aminocido no esencial),
hidrolizndola hasta cido asprtico y amonio. Esta enzima se encuentra presente tanto
en plantas como en mamferos y est distribuida ampliamente en microorganismos, como
bacterias, hongos y levaduras (Imada et al., 1973). Aun cuando la asparaginasa no tiene
un rol central en el metabolismo, es importante sealar que ha adquirido relevancia
debido al descubrimiento de su uso teraputico en el tratamiento de la leucemia
linfoblstica aguda. En un gran nmero de casos, el tratamiento con asparaginasa permite
una eliminacin completa de la enfermedad, catalogando la enzima como una droga
bioqumica efectiva (Gallagher et al., 1989).

No obstante la administracin de asparaginasa de origen bacteriano puede causar

hipersensibilidad a largo plazo, dando lugar a reacciones alrgicas y anafilaxia, por lo que
para disminuir estos efectos se ha intentado emplear enzimas de diferentes fuentes
biolgicas, poniendo al descubierto importantes aspectos de la regulacin, funcin,
estructura y mecanismos catalticos (Reynolds and Taylor, 1993).

La propiedad antitumoral de la asparaginasa se descubri originalmente en el suero de

cobayo 1953, pero el uso de este tratamiento se desestim por su alto costo de
produccin. Actualmente ha sido derivada de una gran variedad de fuentes bacterianas
pero los nicos dos productos que presentan un extenso uso en tratamientos clnicos son
aquellas enzimas derivadas de E. coli y Erwinia (Park Y et al., 1981).

CAPITULO 2
2.1 RELEVANCIA Y APLICACIN
La asparaginasa es una enzima que hidroliza la asparagina en amonio y cido asprtico,
y la glutamina en cido glutmico y amonio (Schrey et al., 2011), el esquema se puede
observar en la Figura 1 delvase anexo 1. Aunque sabemos que la funcin es simple y la
asparagina es un aminocido no esencial, tiene repercusin importante en el tratamiento
de la leucemia, siendo considerada como un elemento central en el tratamiento de la
leucemia linfoblstica aguda (LLA) peditrica (Schrey et al., 2011; Merryman et al., 2012;
Wang et al., 2003), adems puede utilizarse como esquemas de terapia en linfomas no
Hodgkin o leucemia mieloblstica aguda (Eguiguren et al., 1992).

La asparaginasa acta como agente antineoplsico, es decir en clulas que presentan

una alteracin de la proliferacin y, muchas veces, de la mitosis. Las clulas neoplsicas
no pueden sintetizar asparagina, debido a la ausencia de asparagina sintetasa (Keating et
al., 1993), por lo cual al no ser capaces de producir este aminocido, dependen
principalmente de la asparagina del plasma circundante. Con esta referencia podemos
notar una de las pocas diferencias especficas que podemos reconocer entre clulas
normales y cancerosas. Entonces como la mayora de las clulas normales sintetizan
asparagina, no son afectadas por una deficiencia inducida de esta sustancia.

La hidrlisis de la asparagina resulta en un agotamiento continuo, por esta razn, la

prctica teraputica ms comn consiste en inyectar por va intravenosa enzima libre con
el fin de disminuir la concentracin en sangre de asparagina y as afectar selectivamente
a las clulas neoplsicas (Mitchell et al., 1994), por esto podemos decir que bajo
determinado entorno las clulas cancerosas no tienen posibilidad de sobrevivir, y con el
tiempo esto conlleva a una remisin del cncer.

Sin embargo durante el tratamiento la mayora de los pacientes presentan reacciones de

hipersensibilidad a la asparaginasa de origen bacteriano, utilizado a largo plazo (Reynolds
and Taylor, 1993). Por consiguiente nos parece primordial la bsqueda de otras fuentes de

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asparaginasa, como microorganismos eucariotas, que pueden conducir a una enzima con
menos efectos adversos.

La asparaginasa en E. Coli demostr que tiene actividad antitumoral y que su produccin

mediante sistemas microbianos ha atrado la atencin debido a su naturaleza rentable y
ecolgica (Broome, 1961; Mashburn and Wriston, 1964). Consideramos que la leucemia
es una enfermedad de gran incidencia actualmente, por lo que la cobertura para este tipo
de tratamiento debiese ser ms amplia. Esto debido a que hay regiones del mundo que no
tienen acceso a dichos tratamientos y si se quieren implementar es conveniente, desde el
punto de vista econmico, utilizar asparaginasa producida por E. Coli, para evitar costos
involucrados en llevar a cabo una nueva investigacin y estudios clnicos.

La asparaginasa es adems utilizada en otras areas como la industria de los alimentos.

La acrilamida es una amida insaturada altamente reactiva, a la cual se le asocia un
considerable riesgo de cncer. En el 2002 se demostr que la formacin de este
monmero se realiza a temperaturas superiores a los 120C en diferentes alimentos
derivados de los cereales como tambin en papas que contiene altos niveles de
carbohidratos,

dndose lugar la reaccin entre asparagina y azucares reductores

mediante la reaccin de Maillard (Tareke et al., 2002; Capuano 2009).

Debido a ello se gener una preocupacin mundial sobre sus posibles riesgos para la
salud. Durante 2007 a 2009 la comisin Europea recomend a los estados miembros
monitorear los niveles de acrilamida en los alimentos y en 2011 entreg una serie de
recomendaciones para reducir los niveles de este compuesto (Ec (European Comision),
2011).

Son numerosos los artculos que promueven las asparaginasas de diferentes orgenes
como medio para evitar la formacin de acrilamida llevando la asparagina hacia cido
asprtico y evitando as que ocurra la posterior reaccin con carbohidratos (Kuilman and
Wilms, 2007). As se puede ver su uso en productos horneados (De Boer et al., 2014),

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tambin en papas francesas (Pedreschi et al., 2008) y en galletas (Anese et al., 2011).
Pensamos que esto demuestra que la asparaginasa es un mtodo efectivo en la
reduccin de acrilamida, pareciendo ser la estrategia ms eficaz en productos de
caractersticas mencionadas anteriormente puesto que se aplica antes de la exposicin a
las altas temperaturas y reduciendo en gran cantidad la acrilamida, evitando as cambios
de pH o temperatura durante la preparacin, que van en desmedro de las propiedades
organolpticas del alimento.

Por otro lado se han propuesto usos ingeniosos a la asparaginasa, como en el campo de
la extraccin petrolera. Las poliacrilamidas son utilizadas como aditivos en muchas etapas
del proceso de perforacin, produccin, transporte y procesamiento de crudo siendo muy
efectivas en su aplicacin y con caractersticas deseables para las diferentes tareas, en
especial en recuperacin mejorada de crudo y como fluido de perforacin. Sin embargo
luego de utilizadas, la viscosidad, que es una de las caractersticas principales de estos
polmeros,

comienza a ser un problema., pPara ello se ha propuesto el uso de

asparaginasa la cual puede degradar las poliacrilamidas reduciendo la viscosidad en

fluidos que las posean, en especial la proveniente de Aspergillus oryzae (Gupta, 2012).

2.2 PROYECCIONES DE LA PRODUCCION

La bsqueda de nuevos microorganismos que puedan sintetizar esta enzima y con
menores efectos adversos podr ser de ayuda en el tratamiento del cncer (De Moura
Sarquis et al., 2004). Debido a que las reacciones de hipersensibilidad, se consideran
como un evento txico de mayor frecuencia, siendo menores estas reacciones con la
asparaginasa proveniente de Erwinia (Wang et al., 2003; Scherey et al., 2011). La nica
manera de continuar con este esquema de terapia es el cambio de asparaginasa
producida de E. coli a la producida por otros microorganismos como Erwinia, o
combinarlas en el tratamiento.

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En cuanto a la industria de los alimentos, Conocemos que la industria de los
alimentosesta se est abriendo paso hacia productos ms saludables y funcionales. La
acrilamida, compuesto txico, se genera en diferentes alimentos muy populares como el
caf, en pases desarrollados solo el consumo de este otorga el 25% de la acrilamida
consumida total (Pavessi, 2014). La asparaginasa se utiliza de modo eficaz desde 2007
con la aparicin de Acrylaway y otras asparaginasas comerciales, podemos dar cuenta
que mientras siga creciendo el mercado alimentario de productos horneados su demanda
aumentar. La solucin es actualmente utilizada en ms de 30 pases en una amplia
gama de productos. Creemos que esto demuestra el alza que ha tenido desde su
aparicin y la importancia de la asparaginasa, principalmente desde que la EFSA y la FDA
recomendaron a la industria alimentaria ser conscientes de los niveles de acrilamida en
sus productos y la aplicacin de nuevas tecnologas para reducirlos (FDA, 2013).

2.3 PROCESO DE PRODUCCION

En 1953 se observ que el suero de cobayo caus regresin de algunos tipos de tumores
en ratones y ratas. Ocho aos ms tarde, el agente antitumoral en el suero de cobaya fue
identificado como asparaginasa (Broome, 1961), siendo ste el primer proceso de
obtencin de asparaginasa para el tratamiento de tumores. El anlisis revel que una
unidad Internacional (UI) de asparaginasa es la cantidad que va a liberar un micromol de
NH de asparagina. La dosis humana, puede requerir 1.000.000 UI o ms por da por
persona, significando que para la produccin de tales dosis sera necesario extraer el
suero de ms de 30.000 cobayos por da por persona (Roberts and Hill, 1968). Creemos
que el costo que generaba el tratamiento por persona, considerando tanto la cantidad de
animales de los que se deba extraer el suero y el costo de procesar el mismo para una
dosis diaria, era excesivamente alto, por lo tanto este mtodo no era rentable.

Durante los siguientes aos hasta la actualidad la asparaginasa ha sido derivada de una
gran variedad de fuentes bacterianas (vase anexo 12), pero a pesar de la amplia
distribucin de las asparaginasas, no todas son tiles para fines teraputicos, pues
solamente presentan actividad anti linfoma las enzimas de enterobacterias (Imada et al.,
1973). En la prctica, solo asparaginasa II de E. Coli y la de Erwinia chrysanthemi son

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utilizadas (Park et al., 1981). Las preparaciones comerciales de asparaginasa ms usadas
hoy en da son ciderolase, elspar, medac, oncaspar, erqinase (Ortuo and y Durn, 2012).

La produccin de asparaginasa II por E. coli se lleva a cabo en cultivos continuos en un

medio de fermentacin durante la transicin de crecimiento aerbico a anaerbico (Cedar
and Schwartz, 1968). El curso temporal de la aparicin de la enzima bajo estas
condiciones se muestra en el anexo 23. Luego las clulas de E. coli son recogidas del
cultivo para obtener un extracto acuoso que contiene asparaginasas, purificando y
concentrando el extracto por precipitacin fraccionada y cromatografa. Todo esto se
realiza en un medio de fermentacin que contiene una fuente de nutrientes asimilable de
carbono, y para proveer de una fuente de nutriente de nitrgeno se utiliza una peptona
preferiblemente producida por la digestin pancretica de la casena, la cual se vende
bajo la marca comercial NZ amina Tipo B (Mashburn and Wriston, 1964).

Por otro lado la produccin de asparaginasas de Erwinia se prepara a gran escala en

cultivos por lote y en una columna de cromatografa de intercambio inico. Se requiere un
gran nmero de etapas para alcanzar la pureza necesaria, con cromatografa de
intercambio inico por lote. La prctica comercial actual implica el crecimiento de un
cultivo de clulas, y luego una extraccin de protena cruda empleando interrupcin
alcalina y precipitacin con cido. El extracto resultante se somete entonces a la
adsorcin y elucin de CM-celulosa. Luego sigue una etapa de precipitacin de cido ms
y etapas de cromatografa utilizando CM y medios DEAE-celulosa (Goward, 1994).
Podemos apreciar que la seguidilla de etapas hace que sea un proceso con una mano de
obra intensa para la obtencin pura de asparaginasa, requirindose de cuidados y
precisiones para que sea un proceso fiable y factible. Adems creemos que las prcticas
que se realizan en el presente son para obtener mayores cantidades de asparaginasa a
partir de determinadas cantidades de microorganismos, reducindose as el gasto de
producir la enzima, haciendo econmicamente ms factible la administracin en
pacientes. Por otra parte pensamos que es de considerable importancia comercial que
exista actualmente la produccin de asparaginasa por dos microorganismos diferentes,

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permitiendo a pacientes que presenten efectos secundarios con un tratamiento, una
terapia alternativa.

Una examinacin comparativa de E. coli asparaginasa producida en USSR, Alemania y

Japn fue hecha por (Kondrat, 1984) y revel que las caractersticas clnicas de la
preparacin hecha en URSS y Alemania eran idnticos. La accin anti leucmica de la
preparacin hecha en la URSS fue superior que a la hecha en Japn. Por lo tanto Sse
recomienda el uso clnico de asparaginasa hecha en URSS y Alemania (Verma et al.,
2007)

Una forma innovadora de eliminar el cncer que causa la acrilamida de pan ha sido
desarrollada por investigadores de la empresa qumica holandesa DSM, utilizando
tecnologa de genes para degradar la asparagina, el aminocido libre precursor de la
acrilamida, antes de la coccin. Este proceso implica la clonacin de una cepa de
asparagina hidrolizada por

asparaginasa desde Aspergillus Nigerniger. La cepa

resultante de la fermentacin se purifica antes de ser aadida a la masa. Este mtodo dio
lugar a una considerable disminucin en los niveles de acrilamida (Dunn, 2004).

En la actualidad se utilizan Aspergillus Oryzae oryzae y A. Niger niger para la industria de

panificacin (Morales et al, 2008). Estas enzimas funcionan ptimamente entre 40 a 60C
y a un pH de entre 6.0 a 7.0. Dado que las temperaturas de coccin a menudo suben a
120 C, es conveniente disponer de enzimas que sean estables y activas en una amplia
gama de temperatura y pH (Sinah et al, 2013). En el ao 2013 la empresa danesa
Novozymes, lanz al mercado una Asparaginasa proveniente de una cepa modificada de
Aspergillus Oryzae oryzae capaz de funcionar a un mayor rango de temperaturas,
Acrylaway HighT (Vang et al, 2014). Podemos ver as que mejora su producto anterior
Acrylaway que ya era capaz de reducir la acrilamida entre un 50-90% (Novozymes,
2007) y gracias a esto se ampla su rango de aplicacin. Este producto ya se utiliza en
ms de 30 pases incluido Chile segn datos de la misma empresa (vase anexo 4).

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Aunque ha transcurrido poco tiempo desde que se tuvo constancia de esta va de
contaminacin por acrilamida en humanos, a travs de alimentos que ingerimos diarios, el
avance cientfico ha sido muy rpido en el desarrollo de mtodos factibles a la hora de
disminuir y eliminar cantidades de acrilamida para reducir los riesgos de salud que
pueden afectarnos.

*Faltan datos de ventas anuales (busquen en paginas de empresas o en aduana, ya que

saben que en chile tb la usan)

CAPITULO 3
CONCLUSIONES
Si bien la asparaginasa no posee una amplia variedad de aplicaciones, esto no quiere
decir que no sea importante. Respecto al uso teraputico contra la leucemia todava hay
un largo camino por recorrer. Sin embargo actualmente es una de las alternativas ms
efectivas contra la leucemia linfoblstica aguda y una estrategia altamente rentable contra
la acrilamida en alimentos, le ha dado relevancia a esta enzima que podra encontrar
nuevas aplicaciones, como ha demostrado la patente referente a su uso en la industria
petrolera.

Si otras aplicaciones, como la mencionada en pozos petrolferos, comienzan a ser

utilizadas se podra ver un aumento en la demanda de la asparaginasa. Adems
aplicacin de asparaginasa en la industria alimentaria para la eliminacin de la causa
cncer de acrilamida de los alimentos al horno ha sido uno de los descubrimientos
eminentes de la poca moderna. Por lo tanto se necesita mucho ms tiempo para
explorar acerca los posibles usos? de esta increble enzima.

12

REFERENCIAS
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17 revistas de 35 referencias 48,5% < 70%

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ANEXOS
ANEXO 1
MECANISMO DE ACCION ASPARAGINASA

Figura 1: Esquema mecanismo de reaccin asparaginasa.

Fuente: Neelam Verma, Kuldeep Kumar and Gurnoor Kaur, Sneh Anand. L-Asparaginase:
A Promising Chemotherapeutic Agent.

18

ANEXO 2
DIFERENTES FUENTES BACTERIANAS PARA ASPARAGINASA

19

Tabla 1: Diferentes Fuentes bacterianas para asparaginasa.

Fuente: R.E.Peterson and A.Ciegler. L-asparaginase Production by Various Bacteria.

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ANEXO 3
EVOLUCION TEMPORAL DE LA APARACION DE ASPARAGINASA II

Figura 2: Evolucin temporal de la aparicin de asparaginasa II en cultivos.

Fuente: Howard Cedar and James H. Schwartz. Production of L-Asparaginase II by
Escherichia Coli.

ANEXO 4

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USO INDUSTRIAL DE ACRYLAWAY EN EL MUNDO

Figura 3: Uso industrial de Novozymes Acrylaway en el mundo al ao 2013

Fuente: Novozymes 2013. <http://www.snackex.com/Workshop%20presentations/1206_16.00-16.20_Benjamin%20Thieringer%20%28Novozymes%29.pdf>