T Completo

UNIVERSIDAD NACIONAL MAYOR DE SAN MARCOS
Fundada en 1551
FACULTAD DE FARMACIA Y BIOQUMICA

ESCUELA DE POST- GRADO
PRODUCCIN DE ENZIMAS PECTINASAS POR ACTINOMYCETOS EN

CULTIVO SUMERGIDO UTILIZANDO PECTINA Y CSCARA DE NARANJA
TESIS
Para optar el Grado acadmico de:
MAGSTER EN BIOTECNOLOGA
AUTOR
Alexis Germn Arroyo Orbegoso
LIMA PER
2002
DEDICATORIA
A mis padres: Alipio y Anselma,
por su apoyo y comprensin en
los momentos ms difciles
AGRADECIMIENTOS
Mg. Mirtha Roque Alcarraz y Mg. Juan Carlos Woolcott Hurtado, por la
asesora y orientacin impartida durante el desarrollo de la presente tesis.
Dr. Gerardo Gamarra Ballena, por su enseanza y colaboracin prestada.
Blgo. Luis Vargas Apaza, por su constante aliento, orientacin y

colaboracin.
Dr. Gerardo Gamarra Ballena, Dra. Amparo Zavaleta Pesantes, Mg. Angel
Narvez Villavicencio, Mg. Mirtha Roque Alcarraz y Mg. Juan Carlos
Woolcott Hurtado, por las sugerencias y correcciones finales realizadas para
el logro de la presente tesis.
NDICE
RESUMEN
SUMMARY
I.
INTRODUCCIN
II.
MARCO TERICO
III.
MATERIALES Y MTODOS
IV.
RESULTADOS
V.
DISCUSIN
VI.
CONCLUSIONES
VII.
BIBLIOGRAFA
ANEXOS
Produccin de enzimas pectinasas por actinomycetos en cultivo

sumergido utilizando pectina y cscara de naranja. Arroyo
Orbegoso, Alexs Germn
RESUMEN
El objetivo de esta investigacin fue seleccionar las condiciones que

permitan la produccin de enzimas pectinasas, a partir de cscaras de naranja,
empleando Actinomyces naeslundii. En la primera fase, se determinaron las
condiciones de pH , temperatura, agitacin y aireacin, para un buen
crecimiento del microorganismo. En la
segunda, se emple el diseo
experimental Plackett-Burman, mediante la evaluacin de ocho nutrientes, con

dos niveles de variacin. Los nutrientes fueron: cscara de naranja, sulfato de
amonio, rea, sulfato ferroso, cloruro de calcio, cloruro de sodio, sulfato de
magnesio y carbonato de sodio, utilizndose matraces Erlenmeyer con 150 mL
de medio experimental pH 7.00 a 37 C y 300 rpm por 5 das. En la tercera
fase, fue realizada la optimizacin del medio de cultivo experimental, siguiendo
el diseo de Box-Benhken, en el que hubo evaluacin de las concentraciones
de cscara de naranja, sulfato de amonio y sulfato ferroso en tres niveles. Con
los resultados obtenidos, se realiz el anlisis de regresin mltiple. Los
clculos y grficos estadsticos fueron ejecutados con el software Statistical
2.1. obtenindose la mxima produccin de enzimas, con las siguientes
concentraciones: cscara de naranja 16.7 g / L, sulfato de amonio 5 g /L y
sulfato ferroso 0.013 g / L, obtenindose 0.65 U.I. / mL de actividad enzimtica,
en tres das de biotransformacin.
Palabra clave: biotecnologa, enzimas, pectinasas, pectina.
Elaboracin y diseo en formato PDF, por la Oficina General del Sistema de Bibliotecas y
Biblioteca Central UNMSM

SUMMARY
The objective of this research was to choice the conditions that they
permit to optimize the pectinasas enzymes production using orange skins and
Actinomyces naeslundii; on first phase was used qualitative techniques for to
determinate the conditions of pH, cultivation temperature, agitation and aeration
for a good growth microorganism. On the second phase was used the PlackettBurman design through the investigation of eight nutrients with two variation
levels; The eight nutrients was: oranges skin, ammonium sulfate, urea, ferrous
sulfate, calcium chloride, sodium chloride, magnesium sulfate y sodium
carbonate. It was used Erlenmeyer flask with 150 mL of experimental medium
pH 7, to 37 C, agitation to 300 rpm for 5 days. Third phase of optimization was
developed through Box- Benhken design, oranges skin, ammonium sulfate and
ferrous sulfate concentration were evaluated on three level. It was realized a
multiple regression analyses with the three variables
found previously .
calculus and graphics were developed with Statistical 2.1 software. Optimum
Parameters
were: oranges skin 16.7 g / L, ammonium sulfate 5 g / L and
ferrous sulfate 0.013 g / L. it was obtained 0.65 UI / mL of enzymatic activity in

three days of biotransformation.
Key word: biotechnology, enzymes, pectinases, pectin.
Produccin de enzimas pectinasas por actinomycetos en

sumergido
utilizando
pectina
y
cscara
de
naranja.
I.
cultivo
Arroyo
INTRODUCCIN
Las enzimas pectinasas son un conjunto de enzimas que hidrolizan la

pectina. stas presentan una extensa aplicacin en la industria alimentaria,
principalmente en la obtencin y clarificacin de jugos, vinos y cervezas
(Fogarty y Ward, 1974; Neubeck, 1975)
Las enzimas pectinasas extracelulares que hidrolizan la pectina
pueden
ser producidas por diferentes microorganismos como hongos y bacterias; en

esta investigacin
trabajamos con una bacteria que en pruebas preliminares
produjo enzimas pectinolticas.

Siendo el Per un pas rico en productos agrcolas conviene desarrollar
un bioproceso orientado al aprovechamiento integral de recursos provenientes
de la produccin agrcola y agroindustrial, adems de evitar la contaminacin
ambiental, por los residuos provenientes de estas actividades. Uno de estos
residuos por aprovechar es la cscara de naranja que, por su volumen, resulta
atractivo para la produccin industrial de enzimas pectinasas, por lo que, en el
presente trabajo de investigacin, se desarrollo un bioproceso a nivel de
laboratorio, para la produccin de pectinasas por
Actinomyces naeslundii
plantendonos los siguientes objetivos:
- Evaluar los parmetros
pH, temperatura, concentracin de nutrientes,
aireacin y agitacin para la produccin de enzimas pectinasas en un medio

sinttico de laboratorio.
- Evaluar los niveles de produccin de pectinasas con los parmetros

establecidos, utilizando un medio natural a base de cscara de naranja.
Produccin de enzimas pectinasas

sumergido
utilizando
pectina
y
II.
por actinomycetos en
cscara
de
naranja.
cultivo
Arroyo
MARCO TERICO.
2.1. LOS ACTINOMYCETOS:

Los actinomycetos han despertado un gran inters para biotecnlogos,
genetistas
ecologistas,
por
su
habilidad
para
producir
metabolitos
secundarios.
Muchos actinomycetos pueden crecer en los medios comunes usados
en los laboratorios tales como agar nutricio, agar tripticasa soya, agar sangre y
tambin en agar infusin cerebro corazn.
Los actinomycetos crecern en caldos, pero necesitan ser cultivadas
bajo condiciones especiales. El crecimiento en un tubo con caldo sin
movimiento se da en la superficie, dejando el resto del caldo intacto. Los
cultivos lquidos requieren considerable agitacin y aireacin. La agitacin
puede estar entre 200 250 rpm. para dar la adecuada aireacin y
homogenizacin del medio. De necesitar mayor mezclado, se puede colocar
baffles en la parte interior del recipiente. Conforme avanza el tiempo de cultivo,
el microorganismo crecer en forma de pellet (Cross, 1980).
Los actinomycetos son un grupo de bacterias filamentosas , GRAM (+) ,
las
clulas que se van a formar son denominadas conidias, adems las
encontramos participando en la degradacin de desechos orgnicos en los

suelos como el compostaje.
Vistos al microscopio tiene la forma de un hongo pequeo de tamao
bacteriano; la pared celular est constituida por una serie de cidos murmicos
y diaminopimricos, careciendo de pectidoglucanos, caracterstica que ayuda a
reconocer a las bacterias. La composicin de la membrana ayud a excluir a
los actinomycetos de la denominacin hongo, por encontrar esteroles en la
membrana. En cuanto al citoplasma, se ha clasificado como microorganismo
procariote debido a que no posee un ncleo y que su cromatina se encuentra
libre en el citoplasma. Su informacin gentica posee una inestabilidad muy

sumergido
utilizando
pectina
y
cscara
de
naranja.
cultivo
Arroyo
alta. Los actinomycetos generan metabolitos secundarios al final de la fase

logartmica. En la naturaleza son los mayores productores de antibiticos,
seguidos por los hongos. Tienen la capacidad de degradar pesticidas y
derivados de petrleo. Se han
encontrado actinomycetos termfilos que
interviene en el proceso de compostaje, produciendo una serie de enzimas

como las celulasas y amilasas. Los actinomycetos son considerados como los
mdicos del suelo.
En los actinomycetos podemos ver actualmente el gran potencial que
tienen en el campo agrcola, biomdico, en la salud y en la biorremediacin
(Franco, 2001).
2.2. PECTINAS
Las pectinas o sustancias pcticas son polisacridos que se componen
principalmente de cidos poligalacturnicos coloides (poliurnidos derivados
del cido galacturnico CHO(CHOH) 4COOH. Se hallan en los tejidos de las
plantas. Las pectinas son tiles por su capacidad para formar geles o jaleas
con
compuestos
polihidroxilados,
como
los
azcares
con
cantidades
diminutas de iones polivalentes. En el presente estudio. El vocablo jalea se

usar para designar al muy conocido producto semislido formado por pectina,
azcar y cido en condiciones determinadas.
La sustancia que se haba supuesto era la causa de que los jugos de
fruta se convirtieran en jalea, fue aislada por Braconnot en 1824, quien la
denomin pectina. Las extensas investigaciones realizadas en los cien aos
siguientes esclarecieron las propiedades de las sustancias pcticas, pero poco
hicieron para aclarar su naturaleza qumica. Entre 1920 y 1940 qued
establecida la produccin de pectinas en escala comercial en cierto nmero de
naciones y aqullas llegaron a formar parte importante en el comercio
internacional (Kirk, 1961).
Produccin de enzimas pectinasas por actinomycetos en cultivo sumergido utilizando pectina y cscara de naranja
Elaboracin y diseo en formato PDF, por la Oficina General del Sistema de Bibliotecas y Biblioteca Central UNMSM

sumergido
utilizando
pectina
y
2.3.
ANLISIS
FSICO-QUMICO
DEL
cscara
de
naranja.
SUSTRAT O
(CSCARA
cultivo
Arroyo
DE
NARANJA).
CUADRO 1.
COMPOSICIN FSICO -QUMICA DE LA CSCARADE NARANJA
(Demain A. Y Solomon N., 1986).
Componentes
principales
(%)
Minerales
(%)
Vitaminas
(mg/Kg)
Aminocidos
(%)
materia seca
protena
carbohidratos
Grasas
fibra
cenizas
calcio
magnesio
Fsforo
Potasio
Azufre
colina
Niacina
ac. Pantotnico
riboflavina
arginina
Cistina
lisina
metionina
triptofano
90.00
6.00
62.70
3.40
13.00
6.90
2.00
0.16
0.10
0.62
0.06
770.00
22.00
14.96
22.20
0.28
0.11
0.20
0.11
0.06

sumergido
utilizando
pectina
y
2.4.
INVESTIGACIONES
REFERENTES
cscara
de
naranja.
LA
cultivo
Arroyo
PRODUCCIN
DE
PECTINASAS.
En la Fermentacin en Sustrato Slido (FSS), la concentracin del
sustrato es mayor que en la Fermentacin en Cultivo Sumergido (FCS), debido
a que contiene entre 1 a 10% de agua.(Laukevics, 1988).
En otra investigacin, (Sols-Pereira & col., 1996), demostraron que en
una concentracin de 5 g/L de glucosa en una FCS
pectinasas por Aspergillus niger
la produccin de
fue reprimida, igualmente como la produccin
de otras enzimas hidrolticas, tales como poligalacturonasas, pectinesterasas y

celulasas; pero en una FSS con concentracin de glucosa de 5 g/L la sntesis
de pectinasas no es afectada.
En la FCS el medio es completamente simple, consistiendo en un
producto de la agricultura no refinado, el cual contiene todos los nutrientes
necesarios para el crecimiento microbiano. Los sustratos ms empleados en
FSS son productos agrcolas (soya, arroz, trigo, maz, etc), o subproductos
agro industriales (salvado de trigo, bagazo de caa, residuos de remolacha,
bagazo de ctricos, bagazo de manzana, cscaras de diversos vegetales, etc.).
stos, generalmente, empleados en combinacin y/o, complementados con
fuentes
de
carbono
energa
fcilmente
metabolizables
(almidn,
maltodextrinas, melazas, etc.) y otros nutrientes (rea, calcio, fosfatos, etc)

(Agosin, 1995).
Estos sustratos son colocados en agua, aunque pueden requerir de
algn
pretratamiento.
El
pretratamiento
de
estos
sustratos
trmico
principalmente) tiene un doble propsito; esterilizacin del sustrato y cambios

en las propiedades fisicoqumicas del sustrato (gelatinizacin del almidn,
aumento de la porosidad, etc.), que influye favorablemente en la degradabilidad
y accesibilidad de los componentes polimricos (polisacridos y protenas) y
estructurales del sustrato (Milstein y Flowers, 1986).

sumergido
utilizando
pectina
y
cscara
de
naranja.
cultivo
Arroyo
Una produccin de pectinasa usando cscara de limn con diferentes

pretratamientos,
fue
realizada
determinndose
pectin
esterasa
poligalacturonasa. Los resultados menos favorables fueron obtenidos usando

cscara de limn seca;
usando cscara de limn lavada y no lavada los
resultados fueron similares
para la poligalacturonasa, en tanto que el nivel de
pectin esterasa fue particularmente alto con cscara de limn no lavada. Los
bajos niveles de actividad fueron obtenidos cuando las cscaras se secaron a
una temperatura final de 120 C, lo cual indica claramente la importancia de
este tratamiento con las cscaras, cuando es usado para la produccin de
pectinasas (Maldonado, 1986).
Por otro lado, se ha probado sulfato de amonio para suplir la fuente de
nitrgeno, debido al menor costo que el fosfato de amonio. El ensayo dio lugar
a una reduccin del 20% de actividad pectinasa (Saval y Huitron, 1983).
El pH
ptimo de la enzima poligalacturonasa fue probada usando buffer
acetato para pH 2.5 - 4.5 obtenindose una actividad pectinoltica mxima a un

pH de 3.5 (El Sayed, 1994).
Las bacterias anaerbicas productoras de pectinasas presentan un buen
crecimiento a pH 7.0 y una temperatura de 45 C. La mxima actividad
poligalacturonasa
fue de 4.7 U.I./mL hallada en un caldo de fermentacin
(Shivakuman, 1995).
En otra investigacin (Abdel - Fattah y Ismail, 1996) trabajaron sobre el
efecto de las reacciones al variar
valores de pH y Temperatura de las
preparaciones
valores
enzimticas,
hallando
ptimos
de
4.5
50
C,
respectivamente.
La produccin de pectinasa extracelular es inducida por sustancias

pcticas o por desechos agroindustriales tales como pulpa de limn o naranja,
los cuales tienen apreciables cantidades de pectina ,(Aguilar y Huitron, 1986).

sumergido
utilizando
pectina
y
cscara
de
naranja.
cultivo
Arroyo
Pectina y glucosa fueron usadas como comparacin de fuente de

carbono, los resultados obtenidos con glucosa fueron pobres, considerando la
naturaleza inducible de las enzimas pectinolticas (Kilara, 1982).
(Sincere, 1989), seleccionaron tres cepas productoras de enzimas
pcticas (Talaromyces flavus, Penicillium charlessi
Tubercularia vulgaris),
utilizando pellets de pulpa de ctricos se obtuvieron actividades pectinolticas

ms altas que las producidas por Aspergillus nger.
En otro estudio de produccin de pectinasas bacterianas, utilizando pulpa de
caf como sustrato, se encontr 0.76 U (unidades de actividad enzimtica) para
pulpa de caf hmedo (Cabello y col.,1982).
La presencia de pectina en la composicin del medio de cultivo es un
factor importante, ya que influye sobre la diversidad y cantidad de enzimas
pcticas, sabiendo adems que la produccin de enzimas pectinasas es
inducible y no constitutivo (Trejo y col., 1991).
Moreno y col.,(1995) reportan un estudio de produccin de pectinasa a
partir de fermentacin en sustrato slido utilizando cscara de yuca y limn con
Aspergillus niger ATCC 10864 obtenindose una productividad volumtrica de
434.4 U.I./(L*h), mayor que otros autores, 39 U.I./(L*h) ( Abdel-Fattah y col.,
1977)
Con respecto a las desventajas que pueden haber en una FSS tenemos
que es un proceso ms lento que una FCS, debido a la gruesa barrera de
slido; tambin presenta problemas de disipacin de calor limitado por la
transferencia de masa intrapartcula (Trejo y col.,1991).
2.5. BIORREACTORES.
El cultivo de bacterias, levaduras y hongos en un cultivo sumergido es
una prctica universal en la industria de fermentaciones, desde la dcada de
los 40s. La aplicacin de energa a los sistemas de fermentacin hace que los

sumergido
utilizando
pectina
y
cscara
de
naranja.
cultivo
Arroyo
procesos de transporte convectivos sean rdenes de magnitud ms rpidos

que los procesos difusionales que controlan el transporte en el cultivo slido.
Esto ha permitido el desarrollo de procesos de alta productividad que han
hecho del cultivo sumergido la tcnica de ms uso en la industria de las
fermentaciones. Aunque la agitacin mecnica sigue siendo la forma ms
usada de aplicar energa.
Independientemente del tipo de cultivo, existen tres consideraciones,
adems de la homogenizacin y la transferencia de oxgeno, que son de
importancia en el diseo de biorreactores: La primera tiene que ver con la
esterilidad. Llevar a cabo un proceso en ausencia de contaminacin es un
requisito fundamental. El diseo de tomas de muestras y sellos mecnicos, el
acabado de la superficie del tanque, as como de la conexin de vlvulas y
aditamentos, juega un rol importante en un diseo exitoso. Un segundo aspecto
de importancia es la remocin de calor. En vista de que las temperaturas de
fermentacin son moderadas (25 a 40 C) y que el cultivo de clulas es un
proceso exotrmico, el control de la temperatura en un biorreactor requiere de
la
remocin
fundamental
de
cantidades
importancia
son
importantes
los
de calor. Un tercer punto de
aspectos
mecnicos,
la
seleccin
de
reductores de velocidad y el diseo de la flecha de agitacin (Miranda y col.,

1996).
2.6. ENZIMAS PECTINASAS COMERCIALES.
La moderna tecnologa de los zumos de frutas exige una degradacin
rpida e intensa de la pectina, con el fin de que el prensado, la clarificacin y la
filtracin puedan realizarse de una manera segura y econmica.
PECTINEX es una preparacin
purificada, producida por una cepa de
Aspergillus nger. El producto contiene principalmente pectin-transeliminasa,

poligalacturonasa, pectinesterasa y hemicelulasas, siendo capaz de romper
sustancias pcticas vegetales.

sumergido
utilizando
pectina
y
cscara
de
naranja.
cultivo
Arroyo
PECTINEX y ULTRAZYM son productos que han sido obtenidos como

resultado de una investigacin y un desarrollo de varios aos. Por su amplio
espectro de accin, satisfacen de manera ideal las diversas exigencias que se
imponen a su sistema ptimo de enzima en cada una de las etapas individuales
de produccin. Por lo tanto, PECTINEX y ULTRAZYM
permiten
asegurar
buenos resultados en todo el mundo, bajo las ms diversas condiciones

tecnolgicas.
VENTAJAS:
La utilizacin de PECTINEX y de ULTRAZYM garantizan:
-Durante la accin de la enzima sobre la pulpa:
La mejora en la extraccin
del zumo, aumentando con ello el rendimiento
global del zumo.

La reduccin de los tiempos de prensado, con incremento subsiguiente de la
produccin.
La liberacin de componentes fundamentales como color, aroma, etc., por
descomposicin especfica de la pulpa.
- Durante el tratamiento enzimtico de los zumos:
El desdoblamiento rpido y completo de la pectina.
La
floculacin
rpida
la
sedimentacin
compacta
de
las
sustancias
enturbiadoras, con un mnimo de clarificantes.

La filtracin ptima, con menor gasto de material filtrante.
La
estabilidad
segura
de
los
zumos
completamente
claros,
de
sus
concentrados y de sus diluidos. (Andersen, 1991).

2.7. SITUACIN DEL MERCADO INTERNACIONAL DE LAS ENZIMAS.
En el cuadro 2, se muestra la situacin del mercado internacional, de
acuerdo con los datos publicados por (Eveleigh y col.,1990). Es impactante, por
un lado, el hecho de que
ms de 2000 enzimas registradas slo 60 sean

sumergido
utilizando
pectina
y
cscara
de
naranja.
cultivo
Arroyo
producidas comercialmente y de stas slo cinco cubran ms del 80% del

mercado (Garca y col., 1993).
Es innegable que la expansin del mercado de enzimas observado en
los ltimos aos en los pases de latinoamericana, es un aliciente para la
creacin de nuevas empresas nacionales o mixtas que produzcan enzimas a
nivel nacional o subregional (Illanes, 1994).
Cuadro 2.
PRODUCCIN MUNDIAL DE ENZIMAS (Garca y col.,1993)
Enzima
Ton / ao % del total
Proteasa fungal
13
0.95
Pectinasa
Amilasa fungal
25
25
1.83
1.83
25
75
325
350
525
1363
1.83
5.50
23.85
25.70
38.51
100.00
Cuajo microbiano
Glucosa isomerasa
Amilasa bacteriana
Amiloglucosidasa
Proteasa bacteriana
TOTAL

III. MATERIALES Y MTODOS

3.1 MATERIALES.
3.1.1 MATERIAL BIOLGICO:

En el presente trabajo, se utiliz
el microorganismo Actinomyces
naeslundii, el cual fue aislado en el Instituto de Microbiologa y Biotecnologa

"Simn Prez Alva" de la UNMSM, a partir de una muestra de suelos
naranjales de la localidad de Huaral, distrito de Huando, del departamento de
Lima, e identificado en el Instituto Nacional de Salud (INS)(ANEXO A).
3.1.2 MEDIOS DE CULTIVO:
a).Medios de cultivo complejos:
- Cultivo en slido: Constituido por Agar Trypticasa Soya y Agar Trypticasa

Soya, suplementado con 1% de pectina ctrica.
- Cultivo en lquido: Constituido por Caldo Trypticasa Soya y Caldo Trypticasa
Soya suplementado con 1% de pectina ctrica.
b).Medio de cultivo experimental:
Constituido por sales minerales y cscara de naranja como nica fuente de

carbono, variando sus concentraciones de acuerdo al siguiente cuadro:

COMPOSICIN DEL MEDIO DE CULTIVO EXPERIMENTAL

NUTRIENTES
X1
X2
X3
X4
X5
X6
X7
X8
CONCENTRACIN CONCENTRACIN
MNIMA (g/L)
MXIMA (g/L)
Cscara. de naranja
(NH4 )2 SO4
REA
FeSO4 .7H2 O
CaCl2
NaCl
MgSO4 .7H2 O
Na2 CO3
2.000
1.000
0.700
0.013
0.020
1.000
0.200
0.800
16.700
5.000
5.000
0.080
0.083
5.000
1.000
4.000
3.1.3. MATERIALES:
Mechero
Asa de Kolle
Termmetro
Cronmetro
Erlenmeyers de 250 mL
Beakers de 150, 250, 500, 1000 mL
Pipetas de 1, 2, 5, 10, 25 mL
Probetas de 100, 250, 500, 1000 mL
Baguetas
Tubos de ensayo de 15 * 150 mm.
Placas petri
Embudos de vidrio
Kitasato
Tips de 50, 1000, 5000 L.
Parafilm
Algodn

Pinzas
Gradillas
Filtro gelman 0.2 M
Bomba de aire de 500 mL / min (URANUS)
3.1.4. REACTIVOS:
Medio Agar Trypticasa Soya (TSA)

Medio Caldo Trypticasa Soya (TSB)
rea
Sulfato de magnesio
Cloruro de calcio
Solucin amortiguadora (buffer) de fosfato 0.05 M, pH 7
cido sulfrico q.p.
Hidrxido de sodio
Alcohol etlico de 96
Agar-agar
Solucin amortiguadora (buffer) de acetato 0.05 M, pH 4.8
Solucin de pectina al 1%
Reactivo de cido 3,5- dinitrosalicilico (DNS) (Miller, 1959)
Estndar de cido D-galacturnico para anlisis (SIGMA)1 mg /mL
Sulfato de amonio
Tartrato de sodio y potasio
Estndar de Albmina srica de bovino 10 mg / mL
Pectina (sigma)
Pectina ctrica de grado alimentario
Cscaras de naranja
Sulfato ferroso
Cloruro de sodio
Rojo de rutenio

3.1.5. EQUIPOS
Autoclave
Biorreactor de 1 litro
Espectrofotmetro de rango visible SPECTRONIC 20
Estufa con temperatura controlada a 37 C MEMMERT S 30
Bao mara con temperatura controlada a 37 C INSTRUMENTAL.
Horno a 180 C
Centrfuga
Agitador a 200 r.p.m.
Cocinilla
Refrigeradora
Balanza analtica
Balanza de platillos
Bomba de vaco
Vortex
Equipo de destilacin
Micro pipetas de 50, 1000, 5000 L
3.2. MTODOS
3.2.1.
ACONDICIONAMIENTO
DEL
MICROORGANISMO
(Cabello
col.,1982).
El microorganismo que utilizamos en esta investigacin fue sembrado
peridicamente, tanto en un medio slido como en el lquido, de la siguiente
manera:
- Se sembr una colonia de Actinomyces naeslundii en un tubo con Caldo
Trypticasa Soya,
suplementado con 1% pectina ctrica, y luego se incub
durante 5 das a 37 C.

- A continuacin, se realiz una siembra del medio lquido en Agar Trypticasa

Soya, suplementado con 1% pectina ctrica, y se realiz la incubacin durante 3
das a 37 C.
- Posteriormente, se repitieron los pasos anteriores por 60 das.
3.2.2.
EVALUACIN
TEMPERATURA Y
PRELIMINAR
DE
LOS
PARMETROS
pH,
AIREACIN-AGITACIN EN UN MEDIO SINTTICO,
PARA LA PRODUCCIN DE PECTINASAS.
a) DETERMINACIN DEL pH PTIMO ( Becker y col.,1999).

En primer lugar, el microorganismo fue Inoculado en caldos de TSB,
amortiguados a tres pH (5, 7 y 8.5); a continuacin, se incub en estufa a 37
C por 72 horas; y, finalmente, se midi la masa celular por espectrofotometra
a 600 nm.
b) DETERMINACIN DE LA TEMPERATURA PTIMA (Becker y col.,1999).
En el presente caso, se sigui el siguiente procedimiento:
- Inoculacin del microorganismo en caldos de TSB
-Incubacin de los tubos los tubos a temperaturas de 28C, 37C y 45 C
durante 72 horas
-Medicin de la masa celular, por espectrofotometra a 600 nm.
c) DETERMINACIN DE LA AIREACIN-AGITACIN (Becker y col.,1999).

La aireacin-agitacin se evalu a las 72 horas de incubacin, a 37 C,
comparando el aumento de la masa microbiana por espectrofotometra, a 600
nm de los
tubos con caldo control de TSB, en dos condiciones
experimentales:
-Tubos con sello de parafina estril y sin agitacin (SIN aireacin-agitacin)
-Tubos sin sello de parafina estril y con agitacin (CON aireacin-agitacin)

3.2.3. CONDICIONES DEL PROCESO DE BIOTRANSFORMACIN:
a) ACONDICIONAMIENTO DEL SUSTRATO

Se utiliz cscara de naranja como sustrato para la biotransformacin, la cual
tuvo el siguiente tratamiento:
La cscara de naranja fue recolectada de comerciantes de jugo de naranja
cercanos a la UNMSM. Enseguida, se extrajo el aceite de la cscara de naranja
utilizando un equipo de arrastre al vapor; a continuacin, la cscara fue secada
a 80 C por 24 horas en estufa. Posteriormente, la cscara de naranja fue
triturada en un molino manual de tornillo sin fin y tamizada a un tamao de
partcula menor a 0.5 mm de dimetro
b)
MANTENIMIENTO
DEL
MICROORGANISMO:
El
microorganismo
Actinomyces naeslundii se mantuvo por resiembras peridicas en el medio

Agar Trypticasa Soya (TSA), suplementado con 1 % de pectina ctrica. Las
condiciones de crecimiento del microorganismo fueron de 37 C durante 24
horas.
c) PREPARACIN DEL INCULO: El inculo se prepar a partir de un cultivo
de 24 horas, haciendo diluciones de ste en solucin fisiolgica estril, hasta
obtener una suspensin de clulas de 3 x 10
u.f.c./mL. De aqu, se tomaron
alcuotas de 45 mL, que se transfirieron a matraces erlenmeyer cuyos

contenidos fueron de 150 mL.
d) DISEO DEL MEDIO DE CULTIVO EXPERIMENTAL : El medio de cultivo
estuvo
representado por nutrientes ubicados dentro de un rango mnimo-
mximo:

CUADRO 3.
COMPOSICIN DEL MEDIO DE CULTIVO EXPERIMENTAL
NUTRIENTES
X1
X2
X3
X4
X5
X6
X7
X8
CONCENTRACIN CONCENTRACIN
MNIMA (g/L)
MXIMA (g/L)
Cscara de naranja
(NH4 )2 SO4
REA
FeSO4 .7H2 O
CaCl2
NaCl
MgSO4 .7H2 O
Na2 CO3
2.000
1.000
0.700
0.013
0.020
1.000
0.200
0.800
16.700
5.000
5.000
0.080
0.083
5.000
1.000
4.000
Estos componentes fueron evaluados en una plantilla estadstica de PlacKettBurman, de donde se obtuvo los nutrientes ms significativos para la
produccin de enzimas pectinasas.
e). OBTENCIN DE PECTINASAS: La obtencin del extracto enzimtico crudo
fue realizada por centrifugacin, a 5000 rpm por 20 minutos de las muestras
constituidas por 5mL de cultivo, tomadas cada 8 horas, durante 7 das.
3.2.4. MTODOS DE ANLISIS:
a) DETERMINACIN CUANTITATIVA DE LA ACTIVIDAD PECTINOLTICA:

La Actividad enzimtica del extracto obtenido luego de la biotransformacin, fue
evaluada por la liberacin de azcares reductores de la pectina (1% p/v pectina
sigma); la cual fue medida colorimtricamente, con el
reactivo cido 3,5 -
dinitrosaliclico (DNS). Se realiz una curva estndar de cido D-galacturnico

al 1% preparado en solucin amortiguadora de acetato 0.1M y pH 4.8 (Miller y
col., 1959) teniendo en cuenta que una unidad enzimtica se defini como la

cantidad de enzima que liber 1M de cido D-galacturnico por minuto a 50

C (ANEXO M ).
b) DETERMINACIN DE LA CONCENTRACIN DE BIOMASA: Fue utilizada
la tcnica de recuento en placa de clulas viables, para lo cual se tomaron
alcuotas del cultivo cada 8 horas (1 mL);luego, se realiz diluciones seriadas,
para colocar 0.1 mL de clulas diluidas en la superficie de una placa TSA,
extendindose stas, con una asa de Drigalski, e incubadas, finalmente, a 37
C (ANEXO C).
3.2.5. ANLISIS ESTADSTICO:
a) ANLISIS Y SELECCIN DE NUTRIENTES MS INFLUYENTES EN LA

PRODUCCIN DE PECTINASAS.
En una primera etapa de anlisis se utiliz el diseo experimental de

Plackett-Burman para identificar los nutrientes de mayor influencia en la
produccin de
pectinasas, esto permiti evaluar 8 variables en 12
experimentos con 2 rplicas, teniendo en cuenta una concentracin alta (+1) y

una baja (-1) de cada uno de los nutrientes. La evaluacin de los mismos, se
realiz en frascos erlenmeyers de 250 mL de capacidad, que contenan 150
mL de medio experimental.

CUADRO 4.
PLANTILLA DE PLACKETT BURMAN ( Ayala y Pardo,1995 )
VARIABLES
N
X1
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
X2
1
1
-1
1
1
1
-1
-1
-1
1
-1
-1
X3
1
-1
1
1
1
-1
-1
-1
1
-1
1
-1
X4
-1
1
1
1
-1
-1
-1
1
-1
1
1
-1
X5
1
1
-1
-1
-1
1
-1
1
1
-1
1
-1
X6
1
-1
-1
-1
1
-1
1
1
-1
1
1
-1
X7
-1
-1
-1
1
-1
1
1
-1
1
1
1
-1
X8
-1
1
-1
1
1
-1
1
1
1
-1
-1
-1
-1
1
1
-1
1
1
1
-1
-1
-1
1
-1
Donde:
X1= Cscara de naranja.
X5= CaCl2
X2= (NH4)2SO4
X6= NaCl
X3= (NH2)2CO
X7= MgSO4
X4= FeSO4*7H2O
X8= Na2CO3
b) OPTIMIZACIN DE LA CONCENTRACIN DE NUTRIENTES PARA LA

MXIMA PRODUCCIN DE PECTINASAS.
Se utiliz el Diseo de Box Benhken, el cual sirvi para determinar las
concentraciones ptimas de cada variable independiente (X 1= Cscara de
naranja; X2= (NH4)2 SO4 y X4= FeSO4. 7H2O ), para la mxima produccin de
pectinasas, diseo que fue complementado con la
tcnica de anlisis de
respuesta superficial a las variables independientes anteriores, para luego

ajustarlas al modelo polinomial cuadrtico siguiente:

Z=b0+b1*X1+b2*X2+b3*X4+b4*X1*X2+b5*X1*X4+b6*X2*X4+b7*X12+b8*X22+b9*X42
Donde:
Z = Variable dependiente (Produccin de enzima)
X1= Cscara de naranja.
X2= (NH4)2SO4.
X4= FeSO4*7H2O.
b0 = Constante por determinar

b1, b2, b3 = Coeficientes lineales por determinar
b4, b5, b6, b7, b8, b9 = Coeficientes cuadrticos por determinar
CUADRO 5.
PLANTILLA DE BOX BENHKEN (Robles y Col. 1995)
VARIABLES
N
X1
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
X2
1
1
1
1
1
1
-1
-1
-1
-1
-1
-1
0
-1
0
0
X4
1
-1
1
0
0
-1
1
1
0
0
0
1
1
-1
0
0
1
-1
0
-1
-1
0
1
-1
0
-1
1
0
-1
-1
0
0
Para la identificacin de un valor ptimo, fue necesario estimar la

curvatura de las variables ensayadas, determinndose los coeficientes del
modelo polinomial, usando la tcnica de regresin mltiple, cuyos valores
fueron asignados a las ecuaciones XY polinomiales, para generar respuestas
predictivas (representadas en los grficos de respuesta en superficie y de
lneas de contorno).

c) BIOTRANSFORMACIN FINAL EN BIORREACTOR.

Con las concentraciones ptimas obtenidas del experimento anterior, se
realiz un ltimo experimento, en el cual fueron evaluados el crecimiento
microbiano y la actividad enzimtica, utilizando para ello un inculo en fase
logartmica con la finalidad de aprovechar la fuente de carbono en el
mantenimiento del microorganismo.

Orbegoso, Alexis Germn
IV. RESULTADOS
4.1. EVALUACIN PRELIMINAR DE LOS PARMETROS CINTICOS pH,
TEMPERATURA Y AIREACIN-AGITACIN EN UN MEDIO SINTTICO,
PARA LA PRODUCCIN DE PECTINASAS.
4.1.1. DETERMINACIN DEL pH PTIMO
FIGURA 1. EFECTO DEL pH SOBRE EL CRECIMIENTO DEL

MICROORGANISMO
Densidad ptica a 600 nm
0.8
0.7
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0
5.0
7.0
8.5
pH

FIGURA 2. CRECIMIENTO DEL MICROORGANISMO A DIFERENTES pH
Tubo # (1
3 )
(4
pH = 7.0
6)
(7
pH = 8.5
10)
pH = 5.0
4.1.2. DETERMINACIN DE LA TEMPERATURA PTIMA
La evaluacin del crecimiento del microorganismo vs. temperatura en

caldo TSB , determin que la temperatura ptima fue de 37 C, luego de 72
horas de incubacin (Figura 3).

FIGURA 3. EFECTO DE LA TEMPERATURA SOBRE EL CRECIMIENTO
Densidad ptica a 600

nm
DEL MICROORGANISMO
0.7
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0
28
37
45
Temperatura ( C )
4.1.3. DETERMINACIN DE LA AIREACIN-AGITACIN
En experimentos previos se determin que la mayor concentracin de

biomasa ( D.O. 0.65) se obtuvo en un medio control con aireacin-agitacin a
300 rpm. Estos resultados, presentaron la necesidad de fijar valores de
agitacin 300 rpm y aireacin 0.5 vvm, para el proceso de biotransformacin
sobre medio natural. (Figura 4).

FIGURA 4. EFECTO DE LA AIREACIN-AGITACIN EN EL CRECIMIENTO
Densidad ptica a 600

nm
DEL MICROORGANISMO
0.7
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0
SIN
CON
AIREACION-AGITACION
4.2.
CRECIMIENTO DEL
MICROORGANISMO
Y PRODUCCIN
DE
PECTINASAS.
En la Figura 5, se observa que la mxima produccin de pectinasas es

alcanzada en la etapa estacionaria del crecimiento microbiano, es decir, a las
64 horas.

FIGURA 5. CURVA DE CRECIMIENTO DEL MICROORGANISMO Y
10.00
0.90
9.50
0.80
9.00
0.70
Log (ufc/mL)
8.50
0.60
8.00
0.50
7.50
0.40
7.00
0.30
6.50
96
10
4
11
2
12
0
80
88
0.00
64
72
5.00
48
56
0.10
32
40
5.50
8
16
24
0.20
6.00
ACT. PECTINASA UI/mL
PRODUCCIN DE PECTINASAS EN MEDIO TS- PECTINA 1%
Tiempo (horas)
Log N DE (ufc/ml).
ACTIVIDAD PECTINASA ( U.I/ml )
4.3. PROCESO DE BIOTRANSFORMACIN
4.3.1. ANLISIS Y SELECCIN DE NUTRIENTES MS INFLUYENTES EN

LA PRODUCCIN DE ENZIMAS PECTINASAS.
El anlisis del diseo de Plackett Burman demostr que los nutrientes

que ms influyeron sobre la produccin de
pectinasas fueron: Cscara de
naranja , (NH4)2SO4 y FeSO4*7H2O, seleccionndose stos, para un anlisis

posterior de optimizacin ( ANEXO K ).

4.3.2.OPTIMIZACIN DE LOS 3 NUTRIENTES SELECCIONADOS EN LA

ETAPA ANTERIOR.
Mediante la optimizacin de los 3 nutrientes ms influyentes, utilizando

el diseo de Box Benhken, obtuvimos los siguientes resultados:
Cscara de naranja ( 16.7 g/ L ), (NH4)2SO4 (5 g/ L ), FeSO4*7H2O (0.013 g/ L )
y una produccin mxima predictiva de pectinasas de 0.71 U.I./mL (ANEXOS
L, L.1 y L.2).
4.3.3. BIOTRANSFORMACIN FINAL EN BIORREACTOR
La cintica microbiana, llevada a cabo con los resultados obtenidos del

diseo de Box Benhken, maximiz la respuesta entre las 60 y 80 horas, tiempo
en el que se logr una produccin de 0.65 U.I./mL de la enzima.
CUADRO 6.
CONCENTRACIONES PTIMAS A TRABAJAR EN BIORREACTOR
VARIABLES
VALORES
X1 = Cscara de naranja
PTIMOS
x2
X4
X3
X5
X6
X7
X8
VALORES
MEDIOS
= (NH4)2 SO4
= FeSO4.7H2O
= (NH2)2CO
= CaCl2
= NaCl
= MgSO4
= Na2CO3
CONCENTRACIN (g / L)
16.700
5.000
0.013
2.850
0.051
3.000
0.600
2.400

Volumen del medio experimental
: 1000 mL
Concentracin celular del inculo
: 3 x 10 u.f.c / mL
Tiempo de biotransformacin
: 120 horas
Volumen de inculo
: 100 mL
Temperatura
: 37 C
Aireacin
: 0.5 vvm.
Agitacin
: 300 rpm.
pH
: 7.0
En el resultado del crecimiento de la poblacin microbiana que se

muestra en la Figura 6, podemos notar que ste obtuvo un mximo valor entre
las 60 y 80 horas de transcurrido el proceso de biotransformacin.
En la misma figura, se muestra la produccin de pectinasas, durante el

proceso de biotransformacin,
registrndose una alta
produccin de 0.65
U.I./mL a las 72 horas, valor muy cercano a lo pronosticado en las Curvas de

Superficie Respuesta 0.71 U.I./mL (ANEXO L.2).

FIGURA 6. CINTICA DE CRECIMIENTO Y PRODUCCIN DE

PECTINASAS POR Actinomyces naeslundii EN UN BIORREACTOR DE 1
0.70
0.60
0.50
0.40
0.30
0.20
0.10
Act. pectinasa (UI/mL)
10.00
9.50
9.00
8.50
8.00
7.50
7.00
6.50
6.00
5.50
5.00
11
2
96
80
64
48
32
0.00
16
Log (ufc/mL)
LITRO
Tiempo (horas)
Log N DE ufc/mL.
ACTIVIDAD PECTINASA ( U.I/mL )

V. DISCUSIN
El crecimiento de Actinomyces naeslundii en caldo TSB suplementado
con 1% de pectina evidenci a las 48 horas un mayor desarrollo a pH 7.0 y
temperatura de 37C (Figuras 1,2,3) que a los
temperaturas de 28 y 45 C. Los valores de
pH
5.0 y 8.5 y a las
pH y temperatura ptimos
obtenidos, concuerdan con lo reportado por Bergey(1974), donde menciona un

pH 7.0 y una temperatura de 37 C, para un buen crecimiento de Actinomyces
naeslundii, por lo que en adelante se trabaj con una solucin amortiguadora
de fosfato a pH 7.0.
En el experimento se determin que el microorganismo necesit

aireacin y agitacin, para un mayor crecimiento, concordando con lo expuesto
por Cross (1980). Los valores de 0.5 vvm para la aireacin y de 300 rpm para
la agitacin fueron fijados en el presente trabajo (Figura 4). No se reportan
resultados comparativos en la literatura citada ya que, dichos trabajos se
realizaron mayormente a nivel de erlenmeyers, procedimientos que dificultan la
evaluacin de las variables antes mencionadas.
La produccin de pectinasas por Actinomyces naeslundii ,en medio

lquido (Figura 5), evidenci que la enzima alcanza su mayor rendimiento al
final de la etapa logartmica del crecimiento microbiano, lo cual ratifica lo
expuesto por Franco (2001) y tambin concuerda con lo obtenido por Aguilar y
Huitron, (1986) en el sentido de que las pectinasas son enzimas inducidas por
la presencia de sustancias pcticas
El anlisis estadstico, mediante el diseo experimental de Plackett

Burman, permiti seleccionar los nutrientes ms influyentes en el proceso de
biotransformacin, los cuales fueron posteriormente ajustados con el diseo de

Box Benhken, obteniendo finalmente valores ptimos para cscara de naranja,

16.7 g/ L; (NH4)2SO4 ,5 g/ L; FeSO4*7H2O, 0.013 g/ L. La utilizacin de estos
diseos estadsticos han sido desarrollados tambin por otros autores como:
Robles H.,(1995); Miranda y col.,(1996);Trujillo y col.,(2001); y Vasquez y
col.,(2001).
En el trabajo de investigacin se obtuvo una correlacin estadstica de

0.84, lo cual significa que la ecuacin de coeficientes se acerca al evento
experimental, para la produccin de pectinasas. Las Figuras L.1.4, L.1.5, L.1.6,
y L.1.8 muestran un equilibrio inestable que perjudica el anlisis de
ptimizacin y nos aleja de la solucin. Mientras que las Figuras L.1.1, L.1.2,
L.1.3, L.1.7 y L.1.9 muestran tendencias hacia la maximizacin de la
produccin de enzimas, siendo la ms representativa la Figura L.1.7, donde se
puede apreciar que la elevacin de
la concentracin de X1 (cscara de
naranja) y la disminucin de X4 (FeSO4*7H2O), estimulara la produccin de

pectinasas, adems de una mejor correlacin.
Al comparar las actividades enzimticas mximas producidas en el

medio TSB, suplementado con 1% de pectina y el medio experimental
desarrollado, cuyos valores fueron 0.80 U.I./mL y 0.65U.I./mL respectivamente,
se encontr que en el primer medio hay mayor actividad enzimtica, debido a la
mejor disponibilidad de Actinomyces naeslundii , para utilizar la pectina en
estado libre que, atrapada en partculas de cscaras de naranja. Asimismo, el
valor de 0.65 U.I./mL de actividad enzimtica es menor que lo reportado por
otros investigadores como Cabello y col. (1982), quienes obtuvieron 3.77
U.I./mL de actividad producidas por un Bacillus. Spp. en un medio sumergido,
constituido por pulpa de caf, sales minerales y agua.

VI. CONCLUSIONES
1. Se obtuvo una actividad enzimtica de 0.65 U.I./mL en cultivo sumergido en
medio ptimizado, compuesto por cscara de naranja 16.5 g/L, (NH4) 2SO4 5
g/L y FeSO4*7H2O 0.013 g/L.
2. Las condiciones de crecimiento y produccin de pectinasas por Actinomyces
naeslundii son: pH 7.0, 37 C, 300 rpm y 0.5 vvm de aireacin.

VII. BIBLIOGRAFA
1
ABDEL-FATTAH, A.,
MABROUK, S.,
&
ISMAIL, A.,
(1977).
Production of polygalacturonase and pectin methyl esterase by Fungi.

Chem. Microbiol. Technol.,6,38-41.
2
ABDEL-FATTAH, A., & ISMAIL, A.,
(1996). Utilization of orange peels
for the production of multienzyme complexes by some fungal strains.

Process. Biochem. 35;7 645-650
3
AGOSIN, E., MAUREIRA, M., BIFFANI, V. & PEREZ, F. (1996). In

"Recent advances in solid state cultivation", Kluwer Editions, Dordrecht,
Alemania.
AGUILAR, G. & HUITRON, C. (1986). Application of fed-batch cultures

in the production of extra cellular pectinase by Aspergillus sp. Enzyme
and Microbial Technology. 9, 541-545.
ANDERSEN, P., (1991) Enzimas para la produccin de zumos de fruta,

Informacin tcnica de Novo Nordisk Ferment Ltd., SUIZA.
A.O.A.C., (1970) Official Methods of Analysis of Association of Official

Analitical Chemists, Washington D.C., USA.
AYALA
J.
&
PARDO,
R.
(1995).
Optimizacin
por
diseos
experimentales, A & B S.A.,115 - 134.

8
BECKER, J., CALDWELL. G. & ZACHGO. E., (1999). Biotecnologa

curso prctico de laboratorio, Acribia, S.A., ESPAA, 201-204.
BERGEY, (1974) Manual of Systematic Bacteriology, I .663 665.
10
CABELLO-VELAZCO, A., RUIZ, J. & ORIHUELA, M. (1982). Produccin

de pectinasas bacterianas utilizando pulpa de caf como substrato. Rev.
Latamer. Microbiol. 24, 173-179.
11
CAMPOS, D., (2001).
Curso Aplicaciones de la biotecnologa
enzimtica en procesos agroindustriales, Universidad Nacional Agraria la

Molina, PER.

12
CARRIZALES, V., RODRIGUEZ, H., &
SARDINA, I.,
(1981).
Determination of the specific growth rate of molds on semi- solid

cultures. Biotechnol. Bioeng. 23, 321-333.
13
CROSS, T., (1980).
Growth and examination of Actinomycetes- some
guidelines, American Society for Microbiology, USA, 605-609

14
DE LA CRUZ, T. & MIRANDA, H. (2001). Optimizacin de la produccin

de metilgalato de Caesalpinea spinosa por fermentacin en estado
slido
con
Aspergillus
nger
MIT-HI,
II
Congreso
Peruano
de
Biotecnologa y Bioingeniera, PER.

15
DEMAIN, A. & SOLOMON, N., (1986).
Manual
of Industrial
Microbiology and Biotechnology, American Society for Microbiology,

USA,130- 131
16
DONAGHY, J. & MC KAY, A., (1994). Pectin extraction from citrus peel
by polygalacturonase
produced on whey. Bioresource Technology. 47,
25-28.
17
EL-SAYED, S., MOHARIB, S. & JWANNY, E. (1994). Isolation and

characterization
of
polygalacturonase
and
invertase
from
yeast
Endomycopsis fibuligera 3812. Bioconversion of date waste. Internat. J.

Sci. Technol. 29, 255-262.
18
FOGARTY, W.M. & WARD, O.P. (1974). Pectinases and pectin

polysaccharides. Progress in Industrial Microbiol. 13:59-119.
19
FRANCO,
M.
(2001).
Actinomycetos
morfologa,
potencial
biotecnolgico y agroindustrial. II Congreso Peruano de Biotecnologa y

Bioingeniera, PER.
20
GAINVORS,
A.
&
FREZIER.
H.,
(1994).
Detection
of
Polygalacturonase, Pectin-lyase and Pectin-esterase Activities in a

Saccharomyces cerevisiae Strain. UR-FS-LMG. FRANCIA.
21
GARCIA,
M.,
QUINTERO,
R.
&
LOPEZ-MURGUIA,
A.,
(1993).
Biotecnologa alimentaria, Limusa Noriega editores, MXICO,110-112.


22
HART, H., PARISH, M., BURNS, J. & WICKER, L. (1991). Orange

finisher pulp as substrate for polygalacturonase production by Rhizopus
oryzae. J.Food Sci. 56. 2, 481-483.
23
IGLESIAS, H., & CHIRIFE, J.(1982). Handbook of food isotherms: water

sorption parameters for food and food components. Academic. Press,
New York, USA.
24
ILLANES, A.,(1994). Biotecnologa de las enzimas, Editorial Universitaria

de Valparaso, CHILE, 200-201.
25
KILARA, A., (1982). Enzymes and their uses in processed apple

industry. A. Review. Process. Biochem. 17, 4 35-41.
26
KIRK, E., (1961). Enciclopedia de Tecnologa Qumica.T.II.Ed. HispanoAmericana; Primera edicin; MXICO.
27
KUNDU, A., GHOSH, B. & GHOSH, S. (1983). Role of water in the

hydrolysis of cellulose in a solid state. J.Fermen.Technol. 61, 185-188.
28
LAUKEVICS, J., APSITE, A. & VIESTUR, T. (1984). Solid substrate

fermentation of what straw to fungal protein. Biotechnol. Bioeng 26,
1465-1474.
29
MALDONADO, M.,NAVARRO, A., & DANLEY, A.,(1986). Production of

pectinases by Aspergillus sp. using differently pretreated lemon peel as
the carbon source. Biotechnol. 8, 501-504.
30
C KAY, A., (1988). A plate assay method for the detection of fungal
polygalacturonasa secretion, FEMS Letters 56, 353-358.
31
ILLER, G. L., (1959). Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination

of reducing sugar. Analytical Chemistry 31, 426428.
32
MILSTEIN, O.,VERED, Y.,SHARMA & FLOWERS, H. (1986). Heat and

microbial treatments for nutritional upgrading of wheat straw. Biotechnol.
Bioeng. 28, 381-386.

33
MIRANDA, H., ROBLES, H. & HORNA, E., (1996). Diseo de

biorreactores, Curso Terico-Prctico, Universidad Peruana Cayetano
Herdia, PER.
34
MONTGOMERY, D., (1992). Diseo y Anlisis de Experimentos, Grupo

Editorial Iberoamericana, MXICO, 467- 509.
35
MORENO, P., WOOLCOTT, D. & MARCEL, G., (1995). Produccin de

pectinasa a partir de fermentacin en sustrato slido utilizando cscara
de yuca y limn con Aspergillus nger ATCC 10864. Tesis. Universidad
Nacional Agraria la Molina. PER.
36
NEUBECK,C.E.( 1975). Fruits, fruits products and wines. In: Reed, 6.

(Ed.) Enzymes in Food Processing. Academic Press, New York.
37
QUISPE, J.(1994). Manual de Laboratorio de Qumica Orgnica II.

Universidad Nacional de Ingeniera. PER.
38
RAIMBAULT, M., & ALAZARD, D., (1980). Culture method to study

fungal growth in solid fermentation. Eur. J. Appl. Microbiol. Biotechnol. 9,
199-209.
39
ROBLES, H., (1995). Optimizacin de la produccin de bioinsecticida por

Bacillus Thuringiensis ,Tesis, Universidad Nacional de Trujillo, PER.
40
SAVAL, S., & HUITRON, C., (1983). Microbiol pectinases from henequen
pulp. Dev. Ind. Microb. 24, 547-551.
41
SANJAY, J., DURAND, H., & TIRABY, G. (1990). Production
of extra
cellular pectinase enzymes by a mutant of Penicillium occitanis. Appl.

Microbiol. Biotechnol. 34, 308-311.
42
SEELEY, H. & VAN DEMARK, P., (1973). Manual de Laboratorio para

Microbiologa, Editorial Blume, ESPAA, 59-63.
43
SHIVAKUMAN, P., & NAND, K., (1995). Anaerobic degradation of pectin

by mixed consortia and optimization of fermentation parameters for
higher pectinase activity. Lett. Appl. Microbiol. 20, 117-119.

44
SIESSERE, V. & SAID, S. (1994). Pectin enzymes production in solidstate fermentation using citrus pulp pellets by Talaromyces flavus,
Tubercularia and Penicillium charlessi. Biotechnol. 11, 343-344.
45
SOLIS, S.,FAVELA, E. & GUTIRREZ, M. (1996). Production of

pectinases by Aspergillus Nger in solid-state fermentation at high initial
glucose
concentrations.
World
Journal
of
Microbiology
and
Biotechnology 12, 257-260.

46
TREJO,M., ORIOL, E., LOPEZ, A., ROUSSOS, S., CHARLESSI, P.,

VINIEGRA, G. & RAIBANT, M.
(1991). Produccin de pectinasas de
Aspergillus nger por fermentacin slida sobre soporte . Micol. Neotrop.

Apli. 4, 49 - 62.
47
TRUJILLO, R., MENDOZA, R. & HORNA, E. (2001). Optimizacin en la

produccin de ensilado de residuos de sardina (sardinops sagax sagax)
utilizando cepas de levaduras, II Congreso Peruano de Biotecnologa y
Bioingeniera, PER.
48
VASQUEZ, C.& ROBLES, H.(2001). Influencia de las concentraciones

del almidn de papa, MgSO4, CaCO3 & KH2PO4 en medio fermentativo a
base de sanguaza sobre la produccin de bioinsecticida por Bacillus
thuringiensis, II Congreso Peruano de Biotecnologa y Bioingeniera,
PER.

ANEXOS
A.
IDENTIFICACIN FENOTPICA DE Actinomyces naeslundii
Morfologa de la colonia: circular, entera, convexa y de color blanco

Estudio microscpico: La observacin microscpica se realiz a un cultivo
joven de 24 horas, resultando una coloracin GRAM POSITIVO
CUADRO 7.
PRUEBAS BIOQUMICAS
CARACTERSTICAS
RESULTADOS
Formacin de cidos
Arabinosa
Fructosa
Negativo
Positivo
Galactosa
Positivo
Glucosa
Manitol
Ribosa
Xilosa
Almidn soluble
Positivo
Negativo
Negativo
Negativo
Positivo
Catalasa
Motilidad
Indol
NO3 - NO2
Voges- Proskaeur
Ureasa
Hidrlisis de gelatina
Hidrlisis de Pectina
Negativo
Positiva
Negativo
Positivo
Negativo
Negativo
Negativo
Positivo
Bergeys Manual of Systematic Bacteriology, I pp .663 665.

Con las pruebas anteriores y otras adicionales, se identific que nuestro
microorganismo fue Actinomyces naeslundii

B EVALUACIN CUALITATIVA DE LA ACTIVIDAD PECTINASA DE

Actynomices naeslundii.( Mc Kay., 1988)
- Se sembr por puntura en una placa petri con agar control TSA suplementado
con 1% de pectina ctrica, incubndose, enseguida, a 37 C por 5 das. Luego,
la placa fue colocada a 50 C por 48 horas. A continuacin, se retir la colonia
crecida por lavados sucesivos con agua destilada estril. Finalmente, se
adicion el reactivo rojo de rutenio al 1 % sobre el rea donde estuvo la
colonia, tornndose sta de un color prpura, lo cual evidenci la degradacin
de la pectina.
ACTIVIDAD HIDROLTICA DEL MICROORGANISMO SOBRE LA PECTINA

C.
RECUENTO DE CLULAS VIABLES (Becker y col.,1999)
- Tomar una muestra de cultivo, y hacer diluciones 10X (Cada dilucin 10X se
prepara aadiendo 1 mL de clulas a 9 mL de diluyente estril).
- Colocar 0.1 mL de clulas diluidas sobre la superficie de una placa de agar
TSA.
- Despus de colocar la alcuota de 0.1 mL de clulas diluidas sobre la placa de
agar TSA, la gota se extiende sobre la superficie con un asa de Drigalski (a
modo de palo de hockey).
- Una vez que la superficie de la placa est seca, se coloca sta en la estufa de
incubacin a 37 C
D. SOLUCIN AMORTIGUADORA DE ACETATO DE SODIO pH 5, 0.015M:
CH3COOH
0.3264 g/L
CH3COONa
0.7839 g/L
Agua destilada
1000 mL
E. SOLUCIN AMORTIGUADORA DE FOSFATO DE SODIO pH 7, 0.015M:
NaH2PO4
0.497 g/L
Na2HPO4
1.618 g/L
Agua destilada
1000 mL
F.
SOLUCIN AMORTIGUADORA DE FOSFATO DE SODIO pH 8.5,
0.015M:
NaH2PO4
0.04 g/L
Na2HPO4
2.087 g/L
Agua destilada
1000 mL

G.1. EVALUACIN DE LA TEMPERATURA

N
28 C
1
2
3
4
5
37 C
0.18
0.22
0.28
0.30
0.38
0.27
PROMEDIO
45 C
0.62
0.75
0.60
0.78
0.55
0.66
0.38
0.41
0.34
0.30
0.25
0.34
G.2. EVALUACIN DEL pH

N
5
1
2
3
PROMEDIO
7
0.15
0.19
0.23
0.19
8.5
0.71
0.60
0.73
0.68
0.13
0.20
0.15
0.16
G.3. EVALUACIN DE LA AIREACIN-AGITACIN

N
Densidad ptica a 600 nm.
sin aireacin-agitacin con aireacin-agitacin

1
0.38
0.64
2
0.31
0.58
3
0.44
0.72
PROMEDIO
0.38
0.65

H. ANLISIS FSICO-QUMICO DE LA CSCARA DE NARANJA
ANLISIS FSICO-QUMICO
materia seca (AOAC, 1961)
Protena (AOAC, 1961)
Pectina (Kirk, 1961)
Aceites y grasas (UNI,1994)
Cenizas (AOAC, 1961)
I.
%
92.00
4.00
4.00
2.50
5.00
CURVA DE CRECIMIENTO DEL MICROORGANISMO Y

ACTIVIDAD ENZIMTICA EN UN MEDIO TSB SUPLEMENTADO
CON 1% PECTINA
II.
TIEMPO Log N DE ACTIVIDAD
(Horas)
ufc / mL
PECTINASA
( U.I/mL )
0
8
16
24
32
40
48
56
64
72
80
88
96
104
112
120
6.48
6.49
6.45
6.81
6.48
6.49
9.45
9.48
9.43
9.48
9.46
9.00
8.93
7.15
6.08
5.60
0.00
0.00
0.05
0.10
0.12
0.21
0.22
0.61
0.80
0.77
0.74
0.72
0.68
0.59
0.50
0.40

J.
CRECIMIENTO DEL MICROORGANISMO EN UN MEDIO CSCARA

DE NARANJA
TIEMPO
NMERO
DE
(Horas) CLULAS
( u.f.c / mL )
8
0
8
16
24
32
40
48
56
64
72
80
88
96
104
112
3.0*10
8
3.2*10
8
3.1*10
8
6.9*10
8
8.0*10
5.8*10
8
10.3*10
8
5.1*10
8
22.0*10
9
3.5*10
9
3.0*10
8
12.3*10
7
96.0*10
6
16.1*10
5
14.2*10
120
3.5*10
ACTIVIDAD
Log N DE ENZIMTICA PROTENA
CEL/mL
PECTINASA
( U.I/mL )
TOTAL
(mg/Ml)
8.48
8.51
8.49
8.84
8.90
8.76
9.01
8.71
9.34
9.54
9.48
9.09
8.98
7.21
6.15
0.00
0.00
0.11
0.26
0.26
0.27
0.40
0.58
0.64
0.00
0.00
0.00
0.07
5.54
0.62
0.52
0.49
0.46
0.40
0.11
0.11
0.16
0.23
0.24
0.25
0.26
0.19
0.15
0.12
0.09
0.38
0.09
0.65
Produccin de enzimas pectinasas por actinomycetos en cultivo sumergido utilizando pectina y cscara de
naranja. Arroyo Orbegoso, Alexs Germn

L.1. FIGURAS REFERENTES A LAS ECUACIONES XY POLINOMIALES PARA

EL CLCULO DE LAS RESPUESTAS EN SUPERFICIE Y LNEAS DE
CONTORNO DE LA PRODUCCIN DE PECTINASAS
FIGURA L.1.1
RESPUESTA EN SUPERFICIE DE LA PRODUCCIN DE ENZIMAS CUANDO
X4 = FeSO4 * 7H2 O = 0.08 g / L
Function Plot (NEW.STA 10v*10c)
Z=0.7199-0.01064*x-0.1432*y-0.0005*x^2+0.0179*y^2+0.00221*x*y
0.345
0.366
0.387
0.408
0.430
0.451
0.472
0.493
0.514
0.535
above
LNEAS DE CONTORNO DE LA PRODUCCIN DE ENZIMAS CUANDO

X4 = FeSO4 * 7H2 O = 0.08 g / L
3D Contour Plot (NEW.STA 10v*10c)
Z=0.7199-0.01064*x-0.1432*y-0.0005*x^2+0.0179*y^2+0.00221*x*y
5.0
4.5
X2 = ( NH4 ) 2SO4 g / Lt
4.0
3.5
3.0
2.5
2.0
1.5
1.0
2
10
11
12
13
14
15
16
0.345
0.366
0.387
0.408
0.429
0.451
0.472
0.493
0.514
0.535
X1 = CASC. NARANJA g / Lt

FIGURA L.1.2

X4 = FeSO4 * 7H2 O = 0.0465 g / L
Z=0.4929+0.0008*x-0.08854*y-0.0005*x^2+0.0179*y^2+0.00221*x*y
0.269
0.302
0.334
0.367
0.399
0.431
0.464
0.496
0.529
0.561
above

X4 = FeSO4 * 7H2 O = 0.0465 g / L
Z=0.4929+0.0008*x-0.0885*y-0.0005*x^2+0.0179*y^2+0.002210*x*y
5.0
4.5
( NH4 )2 SO4 g / Lt
4.0
3.5
3.0
2.5
2.0
1.5
1.0
2
10
11
12
13
14
15
16
0.269
0.302
0.334
0.367
0.399
0.431
0.464
0.496
0.529
0.561
CASC. NARANJA g / Lt

FIGURA L.1.3

X4 = FeSO4 * 7H2 O = 0.013 g / L

Z=0.7199-0.0106*x-0.1432*y-0.0005*x^2+0.0179*y^2+0.00221*x*y
0.274
0.321
0.369
0.417
0.465
0.513
0.561
0.608
0.656
0.704
above

X4 = FeSO4 * 7H2 O = 0.013 g / L
Z=0.7199-0.01064*x-0.1432*y-0.0005*x^2+0.0179*y^2+0.00221*x*y
5.0
4.5
( NH4 )2 SO4 g / Lt
4.0
3.5
3.0
2.5
2.0
1.5
1.0
2
10
11
12
13
14
15
16
0.274
0.321
0.369
0.417
0.465
0.513
0.561
0.608
0.656
0.704

FIGURA L.1.4

X1 = CASC. NARANJA = 16.7 g / L
Z=0.2184+0.0242*x+4.1914*y+0.0179*x^2-24.895*y^2-1.6309*x*y
0.153
0.195
0.237
0.278
0.320
0.362
0.404
0.446
0.488
0.530
above

X1 = CASC. NARANJA = 16.7 g / L.
Z=0.2184+0.0242*x+4.1914*y+0.0179*x^2-24.895*y^2-1.6309*x*y
0.078
0.073
0.068
Fe SO4 * 7 H2O g / Lt
0.063
0.058
0.053
0.048
0.043
0.038
0.033
0.028
0.023
0.018
0.013
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
3.5
4.0
4.5
5.0
0.153
0.195
0.237
0.278
0.320
0.362
0.404
0.446
0.488
0.530
( NH4 )2 SO4 g / Lt

FIGURA L.1.5
Z=0.1979+0.01797*x+6.6939*y+0.0179*x^2-24.895*y^2-1.6309*x*y
0.306
0.340
0.375
0.410
0.445
0.479
0.514
0.549
0.583
0.618
above

Z=0.1979+0.01797*x+6.6939*y+0.0179*x^2-24.895*y^2-1.6309*x*y
0.078
0.073
0.068
Fe SO4 * 7 H2O g / Lt
0.063
0.058
0.053
0.048
0.043
0.038
0.033
0.028
0.023
0.018
0.013
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
3.5
4.0
4.5
5.0
0.306
0.340
0.375
0.410
0.445
0.479
0.514
0.549
0.583
0.618
( NH4 )2 SO4 g / Lt

FIGURA L.1.6
X1 = CASC. NARANJA = 2 g / L
Z=0.12008-0.00828*x+9.19944*y+0.0179*x^2-24.895*y^2-1.6309*x*y
0.259
0.293
0.326
0.360
0.393
0.426
0.460
0.493
0.527
0.560
above

X1 = CASC. NARANJA = 2 g / L
Z=0.12008-0.00828*x+9.1994*y+0.0179*x^2-24.895*y^2-1.6309*x*y
0.078
0.073
0.068
Fe SO4 * 7H2O g / Lt
0.063
0.058
0.053
0.048
0.043
0.038
0.033
0.028
0.023
0.018
0.013
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
3.5
4.0
4.5
5.0
0.259
0.293
0.326
0.360
0.393
0.426
0.460
0.493
0.527
0.560
( NH4 )2 SO4 g / Lt

FIGURA L.1.7
X2 = (NH4 )2 SO4 = 5 g / L
Z=0.473+0.02765*x+1.7229*y-0.0005*x^2-24.895*y^2-0.3405*x*y
0.354
0.394
0.434
0.473
0.513
0.553
0.593
0.633
0.673
0.712
above

X2 = (NH4 )2 SO4 = 5 g / L
Z=0.473+0.02765*x+1.7229*y-0.0005*x^2-24.895*y^2-0.3405*x*y
0.078
0.073
0.068
0.063
0.058
0.053
0.048
0.043
0.038
0.033
0.028
0.023
0.018
0.013
2
10
11
12
13
14
15
16
0.354
0.394
0.434
0.473
0.513
0.553
0.593
0.633
0.673
0.712

FIGURA L.1.8
X2 = (NH4 )2 SO4 = 3 g / L
Z=0.06701+0.02323*x+4.9847*y-0.0005*x^2-24.895*y^2-0.34048*x*y
0.256
0.275
0.294
0.313
0.332
0.351
0.370
0.388
0.407
0.426
above

X2 = (NH4 )2 SO4 = 3 g / L
Z=0.06701+0.02323*x+4.9847*y-0.0005*x^2-24.895*y^2-0.34048*x*y
0.078
0.073
0.068
0.063
0.058
0.053
0.048
0.043
0.038
0.033
0.028
0.023
0.018
0.013
2
10
11
12
13
14
15
16
0.256
0.275
0.294
0.313
0.332
0.351
0.370
0.388
0.407
0.426

FIGURA L.1.9
X2 = (NH4 )2 SO4 = 1 g / L
Z=0.0942+0.01881*x+8.2465*y-0.0005*x^2-24.895*y^2-0.34048*x*y
0.259
0.293
0.326
0.360
0.393
0.426
0.460
0.493
0.527
0.560
above

X2 = (NH4 )2 SO4 = 1 g / L
Z=0.0942+0.01881*x+8.2465*y-0.0005*x^2-24.895*y^2-0.34048*x*y
0.078
0.073
0.068
0.063
0.058
0.053
0.048
0.043
0.038
0.033
0.028
0.023
0.018
0.013
2
10
11
12
13
14
15
16
0.259
0.293
0.326
0.360
0.393
0.426
0.460
0.493
0.527
0.560


M.
DETERMINACIN COLORIMTRICA DEL CIDO D-
GALACTURNICO (MTODO DE MILLER & COL., 1959).

Procedimiento:
BLANCO
volmen de medio
0.5 mL
buffer acetato
1.0 mL
Llevar a ebullicin
10 min
preincubacin
50 C x 15 min
sustrato (pectina al 1%)
0.5 mL
Incubar
50 C x 30 min
DNS
3.0 ML
centrifugar a 4000 rpm x 10 minutos
decantar y llevar a 100 C x 5 minutos
leer la absorvancia a 540 nm
MUESTRA
0.5 mL
1.0 mL
-----50 C x 15 min
0.5 mL
50 C x 30 min
3.0 mL
Absorvancia (540 nm)
CURVA STANDARD DE ACIDO DGALACTURNICO

2
1.8
1.6
1.4
1.2
1
0.8
0.6
0.4
0.2
0
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0.9
Acido D-galacturnico (mg/mL)

Actividad Enzimtica ( UI / mL ) =
( M B ) * 103 ? moles
PM * (Tiempo de reaccin de 30 min)
Donde:
M, B = concentracin de cido D - galacturnico en mg / mL
PM = peso molecular del cido D galacturnico ( 212.2 )
N.
BIORREACTOR UTILIZADO PARA LA PRODUCCIN DE PECTINASAS

T Completo

Cargado por

Información del documento

Título original

Derechos de autor

Formatos disponibles

Compartir este documento

Compartir o incrustar documentos

Opciones para compartir

¿Le pareció útil este documento?

¿Este contenido es inapropiado?

Copyright:

Formatos disponibles

T Completo

Cargado por

Copyright:

Formatos disponibles

UNIVERSIDAD NACIONAL MAYOR DE SAN MARCOS

FACULTAD DE FARMACIA Y BIOQUMICA

PRODUCCIN DE ENZIMAS PECTINASAS POR ACTINOMYCETOS EN

Dr. Gerardo Gamarra Ballena, por su enseanza y colaboracin prestada.

Blgo. Luis Vargas Apaza, por su constante aliento, orientacin y

Produccin de enzimas pectinasas por actinomycetos en cultivo

El objetivo de esta investigacin fue seleccionar las condiciones que

segunda, se emple el diseo

experimental Plackett-Burman, mediante la evaluacin de ocho nutrientes, con

Palabra clave: biotecnologa, enzimas, pectinasas, pectina.

Produccin de enzimas pectinasas por actinomycetos en cultivo

were: oranges skin 16.7 g / L, ammonium sulfate 5 g / L and

ferrous sulfate 0.013 g / L. it was obtained 0.65 UI / mL of enzymatic activity in

Key word: biotechnology, enzymes, pectinases, pectin.

Produccin de enzimas pectinasas por actinomycetos en

Las enzimas pectinasas son un conjunto de enzimas que hidrolizan la

Las enzimas pectinasas extracelulares que hidrolizan la pectina

ser producidas por diferentes microorganismos como hongos y bacterias; en

trabajamos con una bacteria que en pruebas preliminares

produjo enzimas pectinolticas.

plantendonos los siguientes objetivos:

- Evaluar los parmetros

pH, temperatura, concentracin de nutrientes,

aireacin y agitacin para la produccin de enzimas pectinasas en un medio

- Evaluar los niveles de produccin de pectinasas con los parmetros

Produccin de enzimas pectinasas

2.1. LOS ACTINOMYCETOS:

clulas que se van a formar son denominadas conidias, adems las

encontramos participando en la degradacin de desechos orgnicos en los

Produccin de enzimas pectinasas

alta. Los actinomycetos generan metabolitos secundarios al final de la fase

encontrado actinomycetos termfilos que

interviene en el proceso de compostaje, produciendo una serie de enzimas

diminutas de iones polivalentes. En el presente estudio. El vocablo jalea se

Produccin de enzimas pectinasas

Produccin de enzimas pectinasas

fue reprimida, igualmente como la produccin

de otras enzimas hidrolticas, tales como poligalacturonasas, pectinesterasas y

maltodextrinas, melazas, etc.) y otros nutrientes (rea, calcio, fosfatos, etc)

principalmente) tiene un doble propsito; esterilizacin del sustrato y cambios

Produccin de enzimas pectinasas

Una produccin de pectinasa usando cscara de limn con diferentes

poligalacturonasa. Los resultados menos favorables fueron obtenidos usando

usando cscara de limn lavada y no lavada los

resultados fueron similares

para la poligalacturonasa, en tanto que el nivel de

ptimo de la enzima poligalacturonasa fue probada usando buffer

acetato para pH 2.5 - 4.5 obtenindose una actividad pectinoltica mxima a un

fue de 4.7 U.I./mL hallada en un caldo de fermentacin

valores de pH y Temperatura de las

La produccin de pectinasa extracelular es inducida por sustancias

Produccin de enzimas pectinasas

Pectina y glucosa fueron usadas como comparacin de fuente de

utilizando pellets de pulpa de ctricos se obtuvieron actividades pectinolticas

Produccin de enzimas pectinasas

procesos de transporte convectivos sean rdenes de magnitud ms rpidos

de calor. Un tercer punto de

reductores de velocidad y el diseo de la flecha de agitacin (Miranda y col.,

purificada, producida por una cepa de

Aspergillus nger. El producto contiene principalmente pectin-transeliminasa,

Produccin de enzimas pectinasas

PECTINEX y ULTRAZYM son productos que han sido obtenidos como

buenos resultados en todo el mundo, bajo las ms diversas condiciones