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FACULTAD DE MEDICINA HUMANA

LABORATORIO DE BIOLOGA
CURSO: BIOLOGA MOLECULAR Y CELULAR
PROFESOR: MANUEL ALVIS DAVILA

INFORME DE PRCTICA
PRCTICA N: 10
TTULO: FUNDAMENTOS DE ELECTROFORESIS
INTEGRANTES:
- MENDOZA TELLO, ARIADNA
- PASACHE RISCO, ANGELA
- RAFAEL BADILLO, ASTRID
HORARIO de PRCTICAS:
DIA: MARTES
HORA: 10am - 12pm
FECHA de REALIZACIN de la PRCTICA: 17 de junio del 2014
FECHA de ENTREGA del INFORME: 24 de junio del 2014

LIMA PER

I INTRODUCCIN
La electroforesis es una tcnica que se utiliza con frecuencia para fraccionar
protenas, as como para detectar el producto de una PCR. Depende de
la capacidad de molculas cargadas para migrar cuando se colocan en
un campo elctrico.
La separacin electrofortica de protenas casi siempre se realiza por
electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE), en la que las protenas
son impulsadas por una corriente que se aplica a travs de una matriz
gelatinosa. La matriz se compone de una pequea molcula orgnica
(acrilamida) que establece enlaces cruzados para formar un tamiz
molecular, una especie de filtro.
El movimiento relativo de las protenas por un gel de poliacrilamida depende
de la densidad de carga (carga por unidad de masa) de las molculas.
Mientras mayor sea la densidad de carga, la protena se impulsa con ms
fuerza por el gel y, por tanto, la migracin es ms rpida. Sin embargo, la
densidad de carga es solo un factor importante en el fraccionamiento por
PAGE: el tamao y la forma tambin influyen. La poliacrilamida forma un
tamiz molecular con enlaces cruzados que enreda las protenas que pasan
por el gel. Entre mayor sea la protena, ms se enreda y migra con ms
lentitud. La forma tambin es un factor importante, ya que las protenas
globulares compactas se mueven ms rpido que las protenas fibrosas
alargadas de masa molecular similar. La concentracin de acrilamida (y el
agente de los enlaces cruzados) que se emplea para hacer el gel es otro
factor importante. A menor concentracin de acrilamida, menos enlaces
cruzados se forman en el gel y la migracin de una molcula protenica
determinada puede ser ms rpida.
El progreso de la electroforesis se sigue al observar la migracin de un tinte
rastreador cargado que se mueve justo por delante de las protenas ms
rpidas. Despus que el tinte rastreador se movi a la localizacin deseada,
la corriente se corta y el gel se retira de su recipiente. Por lo general, el gel
se tie con azul Coomassie o tincin de plata para revelar la localizacin de
las protenas.

Objetivos
1. Familiarizarse con la tcnica de electroforesis en gel
2. Comprender los conceptos que estn involucrados en la separacin
de cidos nucleicos en una corrida electrofortica
3. Visualizar la muestra de ADN aislada de la prctica anterior
II RESULTADOS
El siguiente cuadro indica la muestra en cada carril, su volumen y el grupo
del cual se tom la muestra:
CARRIL
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11

MUESTRA
ADN Ladder
ADN total
PCR amplificado
PCR amplificado
PCR amplificado
PCR amplificado
ADN Ladder
ADN total +
ECORI
ADN total +
ECORI
ADN total
ADN Ladder

VOLUMEN
1 L
1 L
1 L
1 L
1 L
1 L
1 L
1 L

GRUPO

1 L

Al azar

1 L
1 L

Al azar

Al azar
I
II
III
IV
Al azar

Resultados de la electroforesis con gel de


poliacrilamida

Carril 1:
Se encuentra el ADN ladder o ADN marcador como una escalera que
indica el intervalo de tamao de los fragmentos de ADN en pares de bases
(pb)
Carril 2:
Se visualiza una banda oscura y gruesa de ADN en la parte superior

Carril 3:
No se ve banda de ADN alguna
Carril 4:
No se ve banda de ADN alguna
Carril 5:
Se visualiza una banda de color grisceo, gruesa de ADN en la parte central
Carril 6:
Se visualiza una banda de color plomo, gruesa (un poco ms gruesa que la
del carril 5) de ADN en la parte central
Carril 7:
Se encuentra el ADN ladder o ADN marcador
Carril 8:
Se visualizan fragmentos de ADN en bandas intercaladas desde la parte
superior hasta antes de la parte central
Carril 9:
Se visualizan fragmentos de ADN en bandas intercaladas desde la parte
superior hasta antes de la parte central. A diferencia del carril 8, estas
bandas son un poco ms gruesas
Carril 10:
Al igual que en el carril 2, se ve una banda oscura y gruesa de ADN en la
parte superior
Carril 11:
Se encuentra el ADN ladder o ADN marcador

III ANLISIS Y DISCUSIN DE RESULTADOS


Consideramos necesario hacer el siguiente background antes de iniciar la
discusin:
Sabemos que las molculas de ADN tienen carga negativa debido a su
grupo fosfato. En la corrida electrofortica que se realiz, se aplic un
voltaje a distintas muestras de ADN. La carga negativa del ADN hace que

esta se desplace hacia el polo positivo (nodo) que se situaba en la parte


inferior de la cmara de electroforesis. La velocidad de migracin de estas
molculas en la electroforesis depende de 1) su carga neta
2) su tamao o peso
molecular
3) su estructura
tridimensional (ADN circular o lineal)
4) la
concentracin del gel de poliacrilamida
5) el voltaje aplicado.
Como ya mencionamos, el nodo se encontraba en la parte inferior, es por
ello que describimos el desplazamiento de las diferentes muestran de ADN
en los distintos carriles como uno de tipo de arriba hacia abajo. Adems,
el voltaje aplicado ha sido constante, por lo que no podremos atribuir
diferencias en la velocidad de migracin a este factor. Asimismo, la
concentracin del gel de poliacrilamida ha generado un poco de igual
tamao para todos los carriles, as que tampoco influye en la velocidad de
migracin.
Carriles 1, 7 y 11:
En los carriles 1, 7 y 11 hay 1 L de DNA ladder (tambin llamados ADN
marcadores). El DNA ladder usualmente contiene un grupo conocido de
fragmentos de ADN con diferentes tamaos en pares de bases (pb) o kilo de
bases (kb). Estos fragmentos de ADN son separados y visualizados como
bandas de ADN en un gel. Estas bandas separadas de ADN cuando se juntan
tienen el aspecto de una escalera en el gel, por lo que son llamadas DNA
ladder (ladder significa escalera). Los marcadores de ADN son usados en
electroforesis para determinar el tamao y la cantidad de los fragmentos de
ADN de la muestra o de la ampliacin de ADN que se obtuvo por PCR. El
nmero que va junto al DNA ladder indica el intervalo de tamao de los
fragmentos de ADN.
Carril 2 y 10:
En cada uno de los carriles 2 y 10 tenemos 1 L de ADN total, el que no ha
pasado por el proceso de PCR. Las muestras se escogieron al azar y ambos
resultados son sumamente similares, por lo que la siguiente discusin valdr
para ambas muestras:
Debido a que es una molcula grande (lo sabemos al medirla con el ADN
marcador), su velocidad de migracin a travs del gel de poliacrilamida
durante la corrida electrofortica fue lenta. Es as que la migracin fue
mnima: se qued en la parte superior.
Carriles 3, 4, 5 y 6:
Los carriles 3, 4, 5 y 6, en teora, deberan mostrar resultados
idnticos, ya que todos estos presentan 1 L de ADN con 150 pb
debido a la amplificacin por PCR. Empero, esto no sucede as. Los
carriles 3 y 4 fueron extrados del grupo 1 y 2, respectivamente. En

estos carriles no se obtuvo ningn resultado. En contraste,


carriles 5 y 6 obtuvieron resultados similares. La diferencia
estos 2 ltimos carriles radic en la nitidez y el grosor de
bandas de ADN. Las muestras de los carriles 5 y 6 se obtuvieron
grupo 3 y 4, respectivamente.

los
en
las
del

Carril 3 y 4:
La deteccin del producto de una PCR se realiza normalmente mediante una
corrida electrofortica. Es as que, despus de la extraccin de ADN
mediante el Kit de Extraccin Pureling-genomic (Invitrogen) y su respectiva
cuantificacin, se realiz PCR para amplificar en forma exponencial un
fragmento de ese ADN.
Para la ejecucin de cada procedimiento se sigue un protocolo. Los pasos a
seguir en el protocolo son sumamente especficos, por lo que un error en el
cumplimiento de estos lleva a errores relevantes en los resultados. En este
experimento, en la segunda etapa de la PCR, la etapa de hibridacin, donde
los cebadores (tambin llamados primers) especficos para protenas globina, hibridan las secuencias complementarias del ADN molde, la
temperatura debe ser de 55 C. Si es que hay una alteracin de la
temperatura durante este proceso, el cebador no podr actuar de manera
ptima cumpliendo su funcin de marcar el sitio donde luego actuar la ADN
Polimerasa.
Es as que el sitio de anclaje no se marca adecuadamente y al final se
adicionan secuencias de nucletidos en distintos sitios o en ninguno, lo
que, ltima instancia, lleva a que no se vea ADN como banda en el gel de
poliacrilamida: este es el caso de este par de carriles (3 y 4).
Tambin ha podido surgir una alteracin al momento del incremento de la
temperatura a 72C, temperatura ptima para la realizacin de la tercera
etapa de la PCR: la etapa de elongacin. Los cebadores pudieron haber
actuado eficazmente su funcin; sin embargo, la ADN polimerasa, por
cambios en la temperatura, no pudo adicionar los nucletidos. Es as que no
ha habido producto de PCR, por lo que no se ha mostrado ADN en la
electroforesis.
Carril 5 y 6:
Los resultados de los carriles 5 y 6 muestran que el protocolo se sigui con
mayor cuidado que en los carriles 3 y 4. La banda de ambos carriles se
ubic en el centro. Debido a que es una molcula relativamente pequea
(posee 150 pb, lo cual es confirmado por su medicin con el ADN marcador),
su velocidad de migracin a travs del gel de poliacrilamida durante la
corrida electrofortica fue rpida. Es as que el ADN se situ en la parte
inferior.

La diferencia de ambos resultados, radica en la nitidez y grosor de la banda


del carril 6. Tales caractersticas se pueden atribuir a una mayor extraccin
de ADN por parte del grupo 4 con el Kit de Extraccin Pureling-genomic
(Invitrogen). Extraccin que super los 0.5 ng/mL de ADN extrado por los
otros grupos. Al haber ms ADN, se generaron ms copias de la secuencia
de ADN blanco en PCR, por lo que hay una banda ms gruesa en el carril 6
que en el 5, lo que nos indica mayor ADN.
Cabe sealar que la escasa obtencin de ADN (menor a 0.5 ng/mL) de los
grupos 1, 2 y 3 se pudo dar debido a la mayor concentracin de eritrocitos
en la sangre que se extrajo. Los eritrocitos son pura membrana por as
decirlo, no contienen ncleo ni mitocondrias. Por lo que el ADN extrado de
la sangre se tiene que basar en las plaquetas y linfocitos, los que s poseen
ncleo, por ende, tambin ADN.
Carril 8 y 9:
Los carriles 8 y 9, en teora, deberan mostrar resultados idnticos, ya que
ambos presentan 1 L de ADN total junto con la enzima de restriccin
EcoR1. Las muestras se escogieron al azar de los 4 grupos. La enzima de
restriccin EcoR1 proviene de Escherichia coli y su funcin es reconocer y
escindir el ADN entre guanina (G) y adenina (A) en la secuencia de bases
5GAATTC3. Las bandas de ADN en estos carriles muestran aspecto
similar. Ambas estn en la parte superior difuminndose hasta el centro en
bandas discontinuas. El ADN fue digerido por la EcoR1, lo que gener estos
fragmentos durante la electroforesis en gel de poliacrilamida. Los
fragmentos se deben al corte por la enzima de restriccin en la secuencia
ya sealada.
La leve diferencia en el aspecto de los carriles se puede atribuir tanto a la
eficiencia del procedimiento experimental como a la concentracin de ADN.
Es as que podemos sealar que hubo mayor concentracin de ADN en la
muestra usada para el carril 9 debido a las bandas ms gruesas, tal vez
un poco ms de 0.5 ng/mL.
IV CONCLUSIONES
1. Nos familiarizamos con la tcnica de la electroforesis en gel al ver las
secuencias del proceso experimental: el armado del equipo de
electroforesis, la preparacin del gel de poliacrilamida, la tincin del
gel despus de la corrida electrofortica y los resultados finales
2. Comprendimos los conceptos que estn involucrados en la separacin
de cido nucleicos en una corrida electrofortica como la carga neta
de la molcula, el voltaje aplicado, la estructura tridimensional, entre
otros.
3. Visualizamos la muestra de ADN aislada de la prctica de PCR al usar
la electroforesis en gel de poliacrilamida para constatar el producto
de la PCR
V BIBLIOGRAFA

Expression Technologies Inc. [en lnea] (2003) DNA ladders/DNA markers for
gel electrophoresis. [fecha de acceso 23 de junio del 2014]. Recuperado de:
http://www.exptec.com/DNA%20ladders%20and%20DNA%20markers.htm
Garca H. Electroforesis en geles de poliacrilamida: fundamentos, actualidad
e importancia. Univ DIAG 2001; 1 (2): 31 - 41
Karp G. En: Mc Graw Hill Interamericana. Tcnicas en Biologa Celular y
Molecular. 6ta edicin. Mxico D.F.: Biologa Celular y Molecular: Conceptos y
experimentos; 2011. p. 737 - 753.