INTRODUCCIN.

El fraccionamiento celular es usado para investigar la bioqumica y fisiologa de organelos fuera

del ambiente complejo de la clula intacta. El objetivo principal de este experimento es aislar
los cloroplastos, ncleo y mitocondria del tejido de plantas por el mtodo de fraccionamiento
celular. Los otros objetivos son examinar esas fracciones microscpicamente y estimar el
coeficiente de sedimentacin de los cloroplastos.
HOMOGENIZACIN
Para preparar los tejidos para el fraccionamiento celular, primero se debe suspender en un
medio apropiado(una solucin amortiguadora, salina azcar isotnica). Para mantener la
integridad de los organelos y enzimas durante el procedimiento de la fraccionacin , todas las
soluciones y cristalera debe mantenerse fras. Despus de rebanar las hojas, el tejido est
preparado para la homogenizacin, procedimiento que rompe los enlaces celulares y libera el
contenido celular, sin daar el medio en suspensin. La suspensin de clulas constituyentes
se llama homogenado. Para los tejidos de plantas, la homogenizacin se debe realizar con un
mortero, al cual se le aade arena como abrasivo.
CENTRIFUGACION
Debido a las diferencias en tamao y densidad, cada componente celular est sujeto a una
fuerza centrfuga. La fuerza generada por la centrfuga se expresa como fuerza
centrfugarelativa(RCF)en unidades de g. La RCF es una funcin de velocidad de
centrifugacin en revoluciones por minutos (rpm) y la distancia de partculas desde el eje de
rotacin. Conociendo esta distancia (x) y el (rpm), se puede determinar el RCF de la ecuacin :
RCF = 1.19 x 10-5 (rpm)2x, donde x se toma como la distancia (en cm) desde el eje de rotacin
hasta el margen de afuera del tubo de centrfuga.
CENTRIFUGACION DIFERENCIAL
En la centrifugacin diferencial, el homogenado es centrifugado repetidas veces a altas
velocidades ,sedimentndolo progresivamente en pequeas partculas. La primera
centrifugacin es a 600g por 10 minutos, el cual sedimenta la fraccin nuclear. Este pellet
contiene el ncleo, clulas intactas y tejido.. L prxima separacin es elsobrenadante
postnuclear partculas suspendidas en lquido sobre el pellet nuclear, el cual es tranferido a
otro tubo de centrfuga y se centrfuga a 10,000 g por 30 minutos en una centrfuga refrigerada.
El material sedimentado se conoce como fraccin mitocondrial ; ste contiene mitocondria y
micro cuerpos.
Los cloroplastos de las clulas de espinaca se aislarn utilizando el mtodo modificado de
F.R Whatley y D.I.Arnon (1962). La espinaca se homogeniza en un amortiguador de sal.
Despus que el tejido de la planta se macera en un mortero, el homogenado se filtra a travs
de una gaza para remover los pedazos grandes de tejidos. El filtrado es centrifugado a 200 g
por 1 minuto. El sobrenadante se centrfuga a 1300 g por 5 minutos, sedimentando los
clorosplastos.
La fraccin nuclear y mitocondrial de las clulas de las clulas de la coliflor se obtendrn
utilizando una centrifugacin diferencial escrita por W.D. Bonner (1967). El tejido se
homogeniza en una solucin amortiguadora de mannitol. Despus se la filtracin a travs de
una gaza, el homogenado es centrifugado.
ANALISIS

FALTA AGREGAR LAS PREGUNTAS DE EL PREVIO

Porque debe mantenerse toda la metodologa en temperaturas bajas? Porque se

aade PBS?
Los organelos y la enzimas de la celula se deben suspender en un medio apropiado para asi
mantener su integridad
La solucin se homogeneiza en una solucin isotnica para detener el dao osmtico, con una solucin
tampn para regular el pH, y a una temperatura muy baja para evitar daos enzimticos. Los orgnulos
se mantienen en fro, en un medio isotnico y tamponado.
El resultado ahora es una pasta fina de lquido, el homogenato de clulas, que consta de clulas intactas
y componentes celulares. Con un cuidadoso trabajo se mantienen intactos los orgnulos celulares,
siendo funcionales en gran medida.

Porque se elimina la vena central de la espinaca?

Que se obtiene en la primera centrifugacin (pastilla de el tubo A)?
Qu se obtiene en la segunda centrifugacin, cuando centrifugamos el sedimento de A
(pastilla de tubo B)?
Por qu se agrega PBS otra vez, despues de obtener las pastillas de A y B?
Para que la urea a los tubos AU y BU?que hace la urea?
EXAMINACION MICROSCPICA
Todas las fracciones aisladas se examinarn microscpicamente para identificar los
organelos presentes.
Cloroplastos. Los cloroplastos son relativamente rganelos grandes, por lo tanto, se
algunos detalles internos se observan con el microscopio de luz. Luego de examinar la
morfologa normal de los cloroplastos de la espinaca, se estudiarn los efectos de dos
compuestos orgnicos. Los cloroplastos sern tratados con una solucin saturada de urea y
una solucin acuosa deTriton X-100, el cual es un detergente fuerte. Urea es conocida para
desnaturalizar protenas, alguna de las cuales salen de la membrana de los cloroplastos.
Ncleo. Para la observacin de los ncleos se debe realizar una tincin. El tinte a utilizar ser
lacto-aceto-orcein, el cual tie de rojo la cromatina. Cada nucleolo aparece como un rea
prominente, redonda y clara.
Mitocondria. Las mitocondrias son teidas con el tinte Janus green B. Despus de la
tincin, la mitocondria tie azul-verdosa, la cual es el color del tinte en su forma oxidada; en su
forma reducida, el tinte es incoloro. El Janus green se mantiene en estado oxidado por el
sistema de oxidasa citocromo de la mitocondria.
Que hace el acetocarmin en los tubos A y B?