Está en la página 1de 5

Anlisis del paper Is Saliva a Potential Biomarker of Arsenic Exposure?

A Case-Control
Study in West Bengal, India de Bhowmick et al. (2013).
Juan Fernando Daz
Biotecnologa Ambiental, Ingeniera en Biotecnologa, Escuela Politcnica del Ejrcito.
22 de mayo, 2013
RESUMEN
El documento cientfico elaborado por Bhowmick
et al. (2013) muestra los resultados obtenidos en la
investigacin para determinar si la saliva puede
servir como un biomarcador para el monitoreo de
la exposicin a Arsnico (As). Como parte de este
estudio tambin se diseo un mtodo analtico
simple y reproducible para cuantificar As.
El arsnico presente en el agua subterrnea, la cual
suele ser utilizada para ingestin en diversas
comunidades, es un problema de salud pblica ya
que la exposicin continua y a dosis altas puede
causar arsenicosis, la cual se manifiesta con
problemas de salud graves as como tambin con
cncer en rganos del cuerpo. Estudios previos
para determinacin del nivel de exposicin a As en
humanos han empleado distintos tipos de fluidos,
entre ellos la orina, y muestras de tejidos, sin
embargo existen inconvenientes de ndole variada
que ponen a consideracin la bsqueda de un
nuevo y mejor biomarcador. La saliva es un fluido
no
usado
ampliamente
en
estudios
epidemiolgicos, de los pocos estudios existentes
varios concluyen que la saliva no es un
biomarcador adecuado.
Las poblaciones de West Bengal, India usaban
anteriormente agua subterrnea con una alta
concentracin de As, aunque ahora emplean un
agua ms segura todava ciertos grupos del lugar
consumen el agua con niveles nocivos de As. En el
estudio se tom muestras de orina y de saliva de
los voluntarios seleccionados para realizar el
anlisis respectivo. Por otra parte tambin se
analiz el agua del lugar para ver la posible
correlacin de la presencia de arsnico en las
personas con los niveles actuales y anteriores
encontrados en el agua usada ya sea para riego de
cultivos o consumo personal.
La tecnologa aplicada fue bsicamente la digestin
cida de las muestras y anlisis con espectrometra
de absorcin atmica con generacin de hidruro
(HG-AAS) y un espectrmetro de masas/plasma
acoplado inductivamente (ICP-MS). La HG-AAS
tiene una sensibilidad alta ya que posee lmites de
deteccin bajos, lo que permite determinar
arsnico en muestras reales, esto es gracias al
acoplamiento de un generador de hidruros
(Morand et al., s/a). Por otra parte, el ICP-MS
combina el anlisis rpido de la tecnologa ICP con
la precisin y los lmites de deteccin bajos de un

espectrmetro de masas. Puede hacer un


multianlisis de elementos traza, incluso hasta
partes por trilln (Worley et al., s/a).
Los resultados del ensayo hallaron que existe
asociacin entre la ingesta diaria de As y su
concentracin en la saliva. De igual forma se vio
una correlacin positiva entre la concentracin del
metal en orina y saliva. La ingesta total diaria (TDI)
y las calificaciones de lesin de piel se relacionaron
al As en orina, mientras que el sexo, hbitos de
fumar, las calificaciones de lesiones y la TDI
tuvieron efecto sobre el As en saliva. Tambin los
investigadores concluyen que la saliva puede
permitir tener un panorama de lo que est
ocurriendo dentro del organismo en el proceso
metablico del As.
La conclusin ms importante es que la saliva es un
biomarcador de la exposicin de las personas al
arsnico tras la ingestin de agua potable o
alimentos regados con agua con altos niveles del
metal.
METODOLOGA
A continuacin se explicar brevemente la
metodologa empleada en la investigacin de
Bhowmick et al. (2013).
Estudio de la poblacin y recoleccin de muestras
Se colect igual nmero de muestras de orina y
saliva dentro de tres poblados del distrito de
Nadia, West Bengal, India. Los participantes
salieron de un estudio transversal o estudio de
prevalencia realizado entre el 2006 y 2007. Se
escogi personas que hayan vivido como mnimo
10 aos en el rea de estudio y tengan entre 18 y
65 aos. Se excluy a quienes tenan
enfermedades contagiosas o disfuncin renal.
Adems se obtuvo informacin de le edad, sexo,
peso y tamao corporal, ndice de masa corporal,
ocupacin aos de residencia y hbitos de bebida y
tabaquismo. Finalmente, se caracteriz a los
pacientes por sus lesiones en la piel. En botellas
tratadas previamente con cido se recolect las
muestras de orina y saliva independientemente,
tras lo cual se las almacen a -20C hasta el
anlisis.
Las muestras de agua potable se
recogieron en botellas similares en los puntos
identificados como fuentes primarias del lquido y
se les aadi HNO3.
Preparacin de la muestra y anlisis

Las muestras de orina fueron filtradas y digeridas


con HNO3 por 4 horas a 120C, posteriormente
con H2O2 se removi el exceso de orgnicos y se
continu con el calentamiento. El As en la muestra
se analiz con HG-AAS. Las muestras de agua
previamente acondicionadas con cido ntrico se
analizaron para As tambin con HG-AAS. El As en
saliva se midi con ICP-MS. Para ello las muestras
se centrifugaron, se le aadi HNO3, etanol y un
estndar interno. La reproducibilidad fue
controlada mediante la ejecucin frecuente de los
estndares de laboratorio.
Estimacin de la exposicin total a As inorgnico
Aunque el consumo de agua subterrnea es una de
las principales formas de entrada de As (III y V)
inorgnico al organismo de los humanos, el
consumo de alimentos, como el arroz en este
estudio, es otra forma de introducir As en el
sistema, por ello se estim cual era la ingesta de
agua y arroz diaria.
Anlisis de datos
La informacin obtenida se transform a logaritmo
para que pueda ser usada con propsitos
estadsticos. Adems se estableci la correlacin
entre la ingesta diaria total y el As en saliva y orina.
Por otra parte, se examin la relacin existente
entre los niveles de As en el organismo con las
variables demogrficas y otras variables
independientes como la edad de los participantes.
ESTUDIOS PREVIOS SIMILARES
Como lo mencion el estudio de Bhowmick et al.
(2013) existen pocos estudios realizados acerca de
la saliva como un biomarcador para identificar la
exposicin a arsnico. Entre ellos se tiene el
estudio de Fngstrm et al. (2008) el cual analiz la
exposicin de los infantes al As a travs de la leche
materna. A breves rasgos este estudio trataba de
determinar si la leche materna podra ser una va
de transferencia de As a los infantes o por el otro
lado, ser un medio de proteccin contra el metal.
La conclusin final fue que efectivamente la leche
de la madre constituye un medio de proteccin
para el nio, ya que a pesar de las altas dosis de
ingesta que pudieron haber tenido las madres a
travs del agua potable, la leche solo mostr bajas
concentraciones de As inorgnico (media de 1
g/kg, rango de 0.2519 g/kg). Como
consecuencia de esto los nios presentaron
concentraciones bajas de As en orina (media de 1.1
g/L; rango de 0.329 g/L). El arsnico en la leche
se correlacion con el arsnico en la sangre
materna, la orina y la saliva. La especie prevalente
de arsnico fue el arsenito [As (III)]. La tecnologa
usada en este estudio fue el ICP-MS para el anlisis
de las muestras de leche, saliva y eritrocitos,
mientras que para el anlisis de orina se utiliz la

HG-AAS. Por otro lado, se uso cromatografa


lquida de alto desempeo (HPLC) para identificar
las especies qumicas de arsnico [As (III), As (V),
MA (metil arsnico) y DMA (dimetil arsnico)] en
orina.
En otro estudio, Yuan et al. (2008) tratan sobre la
identificacin de especies arsenicales en saliva
humana. La investigacin resalta la importancia de
bio-monitorear los qumicos y sus metabolitos en
el cuerpo humano con el fin de rastrear los efectos
causados
por
estas
sustancias
y
las
transformaciones que pueden sufrir las mismas, ya
que debido a esto pueden tener un transporte
diferente en el organismo o causar distintos
problemas. El objetivo principal es establecer a la
saliva como un biomarcador de buenas
caractersticas, no invasivo, altamente sensible y
capaz de establecer correlacin entre las
concentraciones halladas y la exposicin previa al
As. En la metodologa de este artculo se emplea
cromatografa lquida (LC) combinada con ICP-MS
para separar las diferentes especies de arsnico y
establecer los niveles de los mismos. Luego para
confirmar los resultados se emple espectrometra
de masas con ionizacin por electrospray (ESI-MS)
acoplada a LC y finalmente se uso tambin
monitoreo de mltiple reaccin. En los resultados
se pudo identificar principalmente cuatro especies
de arsnico: As (III), As (V), MA (V) y DMA (V).
Adicionalmente se hall bajas concentraciones de
MA (III) y DMA (III). Las especies predominantes
fueron las inorgnicas [As (III) y As (V)] con 85% del
total de arsnico. Las concentraciones totales de
saliva oscilaron entre 0.2 a 3.3 g/L entre los
voluntarios de Edmonton Canad, mientras que las
muestras de Mongolia interior estuvieron entre 0.4
a 140 g/L. Como conclusin se plante que la
prevalencia de las lesiones de piel (un sntoma
comn de envenenamiento con arsnico)
presentes en las personas se pueden relacionar
con las concentraciones de As en su saliva
haciendo a este fluido un biomarcador ideal
incluso para determinar las cantidades de cada
especie del metal.
Chen (2013) junto a Yuan (autor del artculo
mencionado anteriormente) y otros colaboradores
analizaron tambin las diferentes especies de
arsnico presentes en la saliva de pacientes de
leucemia promieloctica aguda tratados con
trixido de arsnico, un procedimiento muy comn
en esta enfermedad. Esta investigacin se realiz
porque un monitoreo detallado del As teraputico
y sus metabolitos puede ayudar a mejorar la
eficacia del tratamiento y minimizar los efectos
colaterales inducidos por el arsnico. Las muestras
se analizaron utilizando HPLC acoplada con ICP-MS.
Tambin se efectu una HPLC acoplada a ESI-MS.
2

En los resultados se pudo establecer la presencia


de 8 especies arsenicales, algunas de ellas
inorgnicas y otras de ellas en forma de molculas
metiladas y/o tioladas. El As (III) se estableci
como la especie predominante con el 71,8% del
total de arsnico presente en saliva. Adems se
observ que conforme se aumentaba la
concentracin de arsnico en la sangre (esto
ocurra producto de las infusiones diarias que se
suministraba a cada paciente como parte del
tratamiento normal) la metilacin del arsnico
disminua, hallndose menos especies metiladas en
las muestras analizadas sugiriendo que la
saturacin de este compuesto en el organismo
puede conducir a una deficiencia de la
biometilacin. Al final, la conclusin fue que la
saliva puede ser usada como un biomarcador
clnico apropiado para el monitoreo de especies
arsenicales
en
pacientes
con
leucemia
promieloctica aguda (APL).
En un estudio realizado en el 2010 por Lew et al.,
cuyo objetivo era bio-monitorear el arsnico en
orina y saliva de nios que juegan en campos de
juego construidos a partir de madera tratada con
arseniato de cobre cromado (CCA). Esto se hizo
debido a que en estudios anteriores muestras del
lavado de manos de nios que estaban en las
zonas de juegos tenan cuatro veces ms arsnico
que las muestras de otros nios. Entonces, era
probable que estas zonas de juego elaboradas con
CCA sean una va de exposicin para los infantes.
Se analizaron muestras de orina y saliva mediante
HPLC combinada con ICP-MS. Las especies
identificadas en las muestras de ambos grupos de
nios fueron similares [As (III), As (V), MA y DMA].
La suma de las especies de arsnico en orina
dieron valores de 15 28 g/L en el grupo CCA y
12 23 g/L en el grupo no CCA. Mientras que en
saliva la suma dio como resultado 1.1 2.1 g/L en
el grupo CCA y 1.4 1.1 g/L en el grupo no CCA.
De este modo se concluy que no hay una
diferencia significativa entre ambos grupos y por
ende se puede decir que las zonas de juegos
elaboradas en CCA no son una fuente significativa
de arsnico para los nios.
DISCUSIN
A pesar de que no existen actualmente varias y
diversas investigaciones donde se utilice a la saliva
como un biomarcador confiable, con la poca
informacin que se tiene cada uno puede ir
extrayendo sus propias conclusiones respecto a la
utilidad de esta herramienta de bio-monitoreo.
Analizando los cuatro estudios citados en este
documento junto al texto base de Bhowmick et al.
(2013), se halla algunos elementos comunes. As se
tiene que todos ellos encontraron bsicamente

cuatro especies de arsnico: arsenito, arsenato,


metil arsnico o monometil arsnico y dimetil
arsnico, As (III), As (V), MA o MMA y DMA,
respectivamente.
Como se conoce, el As es un elemento txico para
el ser humano y otras formas de vida sobre el
planeta cuando estn expuestas a altas dosis y
durante periodos prolongados. En el ser humano
puede causar daos a varios rganos internos e
incluso originar la aparicin de cncer en algunos
de ellos (Khan et al., 2011). Sin embargo, existe
una gran diferencia entre lo que es As orgnico
(como en la comida del mar) e inorgnico
(proveniente de rocas y el suelo) y esto reside en
su toxicidad (Hamano-Nagaoka et al., 2007).
Dentro de las especies inorgnicas que estn
ampliamente distribuidas en los ambientes hay dos
en especial, el arsenato y arsenito. El arsenito es
mucho ms toxico, soluble y mvil que el arsenato.
Por ello, hallar concentraciones altas o incluso
bajas de esta forma del metal puede ser un
llamado de peligro para la comunidad que emplea
el agua como fuente de bebida (Khan et al., 2011;
Fngstrm et al., 2008). Se debera tener principal
control y cuidado con las formas de arsenato como

2
H2AsO4 y HAsO4 ya que ellas son predominantes
en las aguas bien oxidadas, mientras que las

formas de arsenito como H3AsO3 y H2AsO3 son


predominantes en los ambientes reducidos (Khan
et al., 2011).
Por otro lado, debido a la existencia de pocos
artculos parecidos, Bhowmick et al. (2013),
Fngstrm et al. (2008), y Chen et al. (2013) en
cada uno de sus artculos respectivos citan a Yuan
et al. (2008) con su artculo Arsenic Speciation
Analysis in Human Saliva el cual constituye la
primera investigacin realizada en este tema y la
base para el desarrollo de investigaciones futuras.
En estos tres artculos la metodologa usada es la
misma. Usan cido ntrico para la digestin de las
muestras y posteriormente perxido de hidrgeno.
El cido ntrico sirve para realizar una digestin
parcial cida de la muestra y de esa manera extraer
el arsnico inorgnico (iAs) en ella presente, ya que
hasta la fecha no se ha logrado una completa
recuperacin de este tipo de arsnico y que como
se mencion antes es la especie ms txica
(Hamano-Nagaoka et al., 2007). El perxido de
hidrgeno busca en cambio remover el exceso de
orgnicos de la muestra y evitar cualquier
problema posterior en la medicin (Bhowmick et
al., 2013).
Los
equipos
y
tecnologa
utilizada
mayoritariamente en los cinco estudios fue la
espectrometra de masas/plasma acoplada
inductivamente (ICP-MS) la cual se combinaba con
cromatografa de gases para poder separar las
3

especies de arsnico presentes. Esta combinacin


se usa adems porque con ella se logra lmites de
deteccin de hasta partes por milln, lo cual es
muy til si se piensa en hacer un bio-monitoreo
(Hata et al, 2007; Worley et al., s/a). Otra tcnica
empleada por Bhowmick et al. y Fngstrm et al.
es la de espectrometra de absorcin atmica con
generacin de hidruro (HG-AAS), donde la
produccin de hidruros ha ayudado a la absorcin
atmica a aumentar su sensibilidad, es decir
logrando medir niveles ms bajos de arsnico en
las muestras (Morand et al., s/a). Adicionalmente,
Yuan et al. (2008) y Chen et al. (2013) utilizan en
sus estudios la espectrometra de masas con
ionizacin por electrospray. Esta tcnica
bsicamente lo que consigue es romper la muestra
hasta dejar al analito libre de solvente y sea un
nico ion, para que posteriormente pase a un
espectrmetro de masas (HT-LABS). De esta forma,
ambos autores consiguieron confirmar las especies
presentes en sus muestras y que ya haban sido
identificadas por ICP-MS.
Entre las conclusiones obtenidas por varios autores
se puede extraer que no solo el agua subterrnea
es una fuente de arsnico. Una poblacin tambin
puede ingerir As a travs de sus alimentos, en
especial la comida marina y el arroz (Susheela,
1998; Nishimura, 2010). Es por ella que muchas
veces se sugiere a los participantes de un estudio o
pacientes que no ingieran alimentos ni bebidas por
lo menos treinta minutos antes de la toma de
muestra, ya que esto podra verse reflejado en los
resultados obtenidos (Bhowmick et al., 2013;
Fngstrm et al,. 2008). As mismo, cabe destacar
que respecto al arroz, este ya posee naturalmente
arsnico en su biomasa y puede ser que la
acotacin hecha por Bhowmick et al. (2013) no sea
del todo cierta al mencionar que el riego de estos
cultivos con agua subterrnea alta en As puede ser
la causante de que el arroz sea otra fuente de
exposicin al As para la poblacin. Tal vez esto sea
cierto en parte, aduciendo que el As en el agua
increment la concentracin de As en la gramnea,
sin embargo puede ser que se necesiten anlisis y
estudios ms precisos respecto a esto para llegar a
una conclusin ms fehaciente.
Como puntos finales, cabe mencionar que aunque
la orina sea usada ampliamente como un
biomarcador, en este caso de estudio puede que
no sea totalmente idneo, ya que el As es
eliminado rpidamente tras su ingesta en este
medio (Bhowmick et al., 2013). En contraste a esto
ltimo, la saliva es producida constantemente y
posee un flujo alto de sangre, y los qumicos y sus
metabolitos son distribuidos por muchos
mecanismos como difusin pasiva, transporte
activo y ultrafiltracin desde la sangre. Con esto se

ha demostrado que la concentracin de


contaminantes qumicos presentes en la saliva es
un reflejo de su concentracin en el plasma (Yuan
et al., 2008). Aunque los niveles de As hallados en
saliva en los cinco estudios mencionados son bajos,
todos ellos estn correlacionados con los niveles
hallados en otros fluidos o tejidos que pueden
poseer concentraciones mayores de arsnico.
Adems en todas las investigaciones analizadas,
excepto en la de Fngstrm et al. (2008), se
instaura que las concentraciones de arsnico en
saliva estn directamente relacionadas con las
lesiones de piel de los participantes de cada
estudio.
Por todas estas razones la saliva puede conseguir
su lugar como un biomarcador de mucha
importancia para el bio-monitoreo de la exposicin
frente a arsnico, ya que es no invasiva, puede
obtenerse en pacientes difciles como los nios,
permite un anlisis simple y presenta buena
correlacin entre las especies de As presentes y sus
concentraciones con los sntomas de las personas.
REFERENCIAS
Worley, J., Kvech, S. (s/a). ICP-MS. Disponible
en
http://www.webapps.cee.vt.edu/ewr/environ
mental/teach/smprimer/icpms/icpms.htm
Morand, E., Gimnez, M., Benitez, M., Garro, O.
(s/a). Determinacin de arsnico en agua por
espectrometra de absorcin atmica con
generacin de hidruro (HG-AAS). Disponible en
http://www.bvsde.paho.org/bvsacd/arsenico/
morand.pdf
Bhowmick, S., Halder, D., Kundu, A., Saha, D.,
Iglesias, M., Nriagu, J., Guha, D., Roman-Ross,
G., Chatterjee, D. (2013). Is Saliva a Potential
Biomarker of Arsenic Exposure? A Case-Control
Study in West Bengal, India. Environ. Sci.
Technol. DOI 10.1021/es303756s
Fngstrm, B., Moore, S., Nermell, B., Kuenstl,
L., Goessler, W., Grandr, M., Kabir, I., Palm, B.,
El Arifeen, S., Vahter, M. (2008). Breast-feeding
Protects against Arsenic Exposure in
Bangladeshi Infants. Environmental Health
Perspectives. 116 (7): 963-969.
Yuan, C., Lu, X., Oro, N., Wang, Z., Xia, Y., Wade,
T., Mumford, J., Le, C. (2008). Arsenic
Speciation Analysis in Human Saliva. Clinical
Chemistry 54 (1): 163171.
Hamano-Nagaoka, M., Hanaoka, K., Usui, M.,
Nishimura, T., Maitani, T. (2007). Nitric Acidbased Partial-digestion Method for Selective
Determination of Inorganic Arsenic in Hijiki and
Application to Soaked Hijiki. J. Food Hyg. Soc.
Jpn. 49 (2): 88-94.

Nishimura,
T.,
Hamano-Nagaoka,
M.,
Sakakibara, N., Abe, T., Maekawa, Y., Maitani,
T. (2010). Determination Method for Total
Arsenic and Partial-digestion Method with
Nitric Acid for Inorganic Arsenic Speciation in
Several Varieties of Rice. Food Hyg. Saf, Sci. 51
(4): 178-181.
Khan, M., Ho, Y. (2011). Arsenic in Drinking
Water: A Review on Toxicological Effects,
Mechanism of Accumulation and Remediation.
Asian Journal of Chemistry. 23 (5): 1889-1901.
Chen B., Cao F., Yuan C., Lu, X., Shen, S., Zhou,
J., Le, C. (2013). Arsenic speciation in saliva of
acute promyelocytic leukemia patients
undergoing arsenic trioxide treatment. Anal
Bioanal Chem. 405: 19031911. DOI
10.1007/s00216-012-6700-5

Lew, K., Acker, J., Gabos, S., Le, C. (2010).


Biomonitoring of Arsenic in Urine and Saliva of
Children Playing on Playgrounds Constructed
from Chromated Copper Arsenate-Treated
Wood. Environ. Sci. Technol. 44 (10): 3986
3991. DOI 10.1021/es100128n
Susheela, A. (1998). Arsenic in Drinking Water a
Public Health Hazard. NFI Bulletin. 19 (4); 1-5.
Hata, A., Endo, Y., Nakajima, Y., Ikebe, M.,
Ogawa, M., Fujitani, N., Endo, G. (2007). HPLCICP-MS Speciation Analysis of Arsenic in Urine
of Japanese Subjects without Occupational
Exposure. J. Occup. Health. 49: 217-223.
HT-LABS. (s/a). ESI/MS. Disponible en
http://www.htlabs.com/Analytical_Lab/esi_ms.html