Gentica Bacteriana

La gentica es el estudio de los mecanismos por los cuales los

caracteres se transmiten de un organismo a otro y como se
expresan.
El genoma bacteriano est formado por el cromosoma y los
plasmidios que pudiera haber. La mayora de las bacterias tiene
un plasmidio, pero algunas no tiene ninguno. El conjunto de
cromosoma-plasmidio forma el genoma. Cromosoma y
plasmidios se forman de DNA, en bacterias solo DNA (los
virus pueden tener RNA). Se forman de una doble hebra
antiparalela de una molcula helicoidal (DNA).
El cromosoma
bacteriano
es
siempre
uno
solo. No tienen
ningn tipo de
envoltura como
los eucariotas,
est suelto en el
citoplasma
en
una
zona
llamada nucleoide. Es siempre DNA de doble hebra y es circular (no lineal como nosotros).
Puede estar en un estado relajado o en un estado sobre-enrollado que es el estado en que
generalmente se encuentran los plasmidios.
El nucleoide es el lugar donde se encuentra el cromosoma bacteriano, y al microscopio
electrnico se observa como una regin clara dentro del citoplasma.
El cromosoma bacteriano se encuentra condensado o
empaquetado, si extiendo el DNA de una bacteria me
da como 80 veces el largo de la bacteria. Entonces
est empaquetado de una manera muy condensada, y
en esto colaboran las protenas y molculas de RNA.
Entonces el cromosoma se compone de un 60% de
DNA, pero tambin tiene 30% de RNA y un 10% de
protenas, que operan para que el empaquetamiento se
encuentre as.
Esas protenas no son histonas, son histone-like-proteins, que son parecidas a ellas. Estn
cargadas positivamente para interactuar con el DNA cargado negativamente y lo que se
forman son loops. Las protenas sirven de anclajes de esos loops, y estos loops forman un

dominio y a su vez esos loops estn sper enrollados y anclados por otras protenas, y esa
es la manera en que se encuentra el DNA dentro de la bacteria.

Esta es una bacteria de Escherichia coli, a la que le hicieron una lisis parcial, rompieron su
pared y dejaron escapar el DNA, y una lisis parcial proteica tambin para que se suelten las
protenas. Ah est el DNA extendido de la bacteria.
Las distintas especies de bacteria tienen distintos genomas, el largo del genoma puede ser
muy distinto, por ejemplo 4200 kb tiene el Bacillus, pero el Micoplasma genitalium tiene
580 kb. Y la diferencia en esto, la micoplasma es la bacteria que no tiene pared, pequea y
deficiente metabolitamente; su ahorro en tener enzimas metablicas completas se traduce
en un genoma mucho ms pequeo.
Para comparar los pares de bases respecto a los
seres humanos, 3,4x10^9 pares de bases, una
diferencia bastante grande.
Ac esta el tamao de algunos genomas solo
para comparar. Ac el de Micoplasma
genitalium con un genoma muy pequeo, igual
que Haemophilus y Helicobacter. Y las
Pseudomonas con un genoma bastante grande de
6,26 Mb, lo mismo que Streptomyeces.
La representacin de un cromosoma
bacteriano. Este es el cromosoma de
Haemophilus influenzae, la primera bacteria
que se secuenci. Tomaron esta por tener un
genoma muy chico, y as se representa la
anotacin del genoma. No solo hay que
secuenciar, sino que hay que ver a que
corresponde cada secuencia; el asignar un
nombre a cada gen se llama anotar el genoma.
Los distintos colorcitos representan genes
involucrados en distintas funciones. Los

distintos microorganismos tienen un tamao

distinto de sus genes. Por ejemplo de
Sacharomyces cervisiae que es un eucariota tienen
un tamao promedio de sus genes de 1,9 kilobases,
mientras que el Micoplasma genitalium tiene 1,2
kb y Escherichia coli 1,1 kb. El tamao promedio
de los genes es diferente.

Esto es un gen, est formado por su

regin promotora (regin -35 y -10),
luego de eso viene el inicio de la trascripcin (la posicin +1), luego la secuencia de unin
al ribosoma (secuencia de Shine-Delgarno o Ribosome Binding Side), luego el inicio y
termino de la traduccin marcados por codones especficos: el inicio con ATG que codifica
para metionina y el fin por los codones de termino donde el ribosoma al encontrarse con
ellos los suelta y se termina la trascripcin (esto es lo que se llama la regin codificante o
marco abierto de lectura, cuando ustedes ven ORF es por Open reading frame); y el
terminador, que es el terminador de la trascripcin, donde la RNA polimerasa suelta el
DNA y deja de transcribir.
As se ven los genes al bajarse de la base de datos universal de los genes. Parece chino,
pero no es chino. Baje este gen porque trabajo con l. Ac esta la secuencia de ShineDelgarno, ac el ATG que codifica para metionina, ac est la secuencia codificante que
llega hasta ac y termina con TAA. Tambin hay
otros detalles, la regin en verde es el pptido
seal que le dice al ribosoma secrtame, con esa
secuencia el pptido va dirigido al citoplasma. Y
esto naranja que est ac es una parte de anclaje al
citoplasma, que cuando se traduce queda inmerso
en la membrana, y lo que est aqu queda hacia la
superficie. Esta es la protena M de Streptococcus
pyogenes, que es una protena de membrana que
participa evitando la fagocitosis porque confunde
al sistema inmune.
Con esta tabla, que es el cdigo gentico, se lee la secuencia que les mostr. Es degenerado,
tenemos varios codones para un mismo aminocido.

Los
plsmidos
o
plasmidios. Son el otro
componente
de
los
genomas bacterianos y
se replican de manera
independiente
al
cromosoma. Es de DNA
circular de doble hebra.
Siempre
est
sper
enrollado, tiene como
varias torsiones. Tiene
un tamao variable pero
siempre
menor
al
cromosoma, y tambin
tienen un nmero de
copias
variables
dependiendo
del
plsmido
que
sea,
existen miles de plsmidos distintos. Cada plsmido tiene un nmero de copias que es una
caracterstica propia del plsmido, hay algunos que estn en una copia y otros que estn en
varias copias dentro de la bacteria, y ellos mismos regulan cuantas copias hay. Los
plasmidios se pueden transferir horizontalmente por conjugacin de una bacteria a la otra.
La gracia de los plasmidios es que tienen genes no esenciales para la vida de la bacteria,
pero que le aportan una ventaja, por ejemplo resistencia a antibiticos, capacidad de
metabolizar algunos metales pesados, rutas metablicas para poder utilizar una fuente de
carbono rara que otras bacterias no podran utilizar, toxinas para competir o factores de
virulencia.
*En la misma bacteria pueden haber muchos plasmidios, del mismo tipo y de distintos tipos,
que deben se compatibles entre si, hay un sistema de compatibilidad de plasmidios donde
algunos son compatibles entre si y otros no.
Tener un plasmidio es una carga para la bacteria, es como un parsito, hay que replicarlo,
implica consumir nucletidos en cada ciclo celular, en cada ciclo de replicacin y en cada
fisin; entonces la nica manera de conservarlo es que tenga algo bueno, si no aporta nada
la bacteria lo elimina por curacin (lo expulsa). El plasmidio casi siempre est
independiente del cromosoma, pero tambin puede integrarse a l, y cuando est integrado
se dice que est en forma integrada, y cuando est afuera se dice que est en forma
episomal. Puede integrarse y salir dependiendo de las condiciones.
Esto es el dogma central de la biologa molecular de
la transferencia de informacin gentica, que es
unidireccional y universal; es en todos los organismos
lo mismo, todos tienen replicacin, trascripcin y
traduccin. Ocurre siempre en esta secuencia, la
replicacin est a cargo de la DNA polimerasa, la
trascripcin de la RNA polimerasa y la traduccin es
la lectura de la molcula de RNA por los ribosomas y
la sntesis de la protena.

La replicacin de un cromosoma
bacteriano ocurre de una forma
muy caracterstica, donde existen
secuencias
especficas
que
participan en la replicacin. El Ori
C es el origen de la replicacin, all
comienza
a
replicarse
el
cromosoma, y lo hace de esta
manera, se van formando dos
orquillas de replicacin, entonces
la hebra se abre en el origen de
replicacin por la helicasa que la
desenrolla, all se mete la DNA
polimerasa
y
sintetiza
la
complementaria para este lado y la
complementaria del otro lado para el otro. Esto es una orquilla de replicacin y esta es la
otra, entonces esto se va separando y esta forma recuerda a la letra griega theta, por eso se
dice que el cromosoma bacteriano se replica en una estructura theta. Muchos plasmidios
tambin se dividen as.
Despus de la replicacin viene la
trascripcin. Esto es pasar la
informacin que estaba en el DNA a
un RNA para que pueda ser
traducido. Lo que tiene de particular
la trascripcin en procariotas es que
ocurre todo al mismo tiempo. Ac
tenemos el inici de la trascripcin
(el +1) que se pega a la RNA
polimerasa y va a empezar a
transcribir la molcula de RNA. Lo
que ocurre una clula procariota que
no ocurre en una eucariota es que
apenas sale la molcula de RNA mensajero viene un ribosoma y empieza a traducir. Eso no
puede ocurrir en un eucariota porque esto ocurre en el ncleo y los ribosomas estn en el
citoplasma, entonces tiene que terminarse de formar el mRNA completo, este sale del
ncleo atravesando la membrana nuclear y llegar a los ribosomas que estn en el citoplasma;
adems antes de salir tienen que sufrir todo el proceso de splicing (eliminar los intrones y
madurar el RNA), todo esto no ocurre aqu. Lo otro es que en un eucarionte 1 mRNA un
gen, en procariontes 1 mRNA varios genes; se forma una protena grande que despus se
corta; en eucariontes 1 mRNA 1 protena (monosincrnico) mientras que en procariontes un
mRNA varias protenas (polisincrnico).

El ltimo paso en el flujo

de informacin es la
traduccin, que es la
sntesis
de
protenas,
donde la informacin que
est en el mRNA se
traduce para formar una
protena, lo que ocurre de
esta manera. El mRNA va
pasando por el ribosoma y
el codon se va a acoplar
con el anticodon del tRNA
que
tiene
pegados
aminocidos que se va a
quedar en el sitio E,
despus este sale y va a
llegar el que le sigue que
se va a unir a este aminocido y as se va formando la cadena de protenas.
Esto es para ilustrar las diferencias que
existen en la transferencia de informacin en
procariotas y eucariotas. Esto pasa en
procariotas donde 1 un mRNA tiene una
regin codificante A y una regin
codificante B que se traducen y despus se
cortan, mientras que en eucariontes primero
se forma el transcrito primario, luego tiene
que sufrir un procesamiento y empalme
donde se eliminan los intrones y el RNA
maduro que recin despus de esto puede
salir al citoplasma unido a protenas, se
traduce en el citoplasma y este mRNA se traduce para una protena.
Ahora empezamos con como evolucionan
los microorganismos. Les dije que las
bacterias se dividen por fisin binaria, una
simple divisin en dos de la bacteria donde
duplica su material y se divide, y las dos
clulas resultantes son idnticas a la clula
original. Para evolucionar, ya que su
reproduccin es asexual, tienen que haber
otros medios para lograr variabilidad.
La variabilidad es importante para poder
vivir en el medio, para adaptarse a los
cambios, y la manera de adaptarse a los

cambios es generando variabilidad. Esa generacin de variabilidad es como evolucionan los

genomas bacterianos, esto lo hacen con mecanismos de variacin gentica: Mutaciones,
recombinacin y reordenamiento del cromosoma, y transferencia de material gentico.
Una mutacin es un cambio hereditario
en la secuencia de bases del genoma de
un microorganismo. Surgen de manera
espontnea, son hechos sumamente
espordicos que ocurren con muy baja
frecuencia; un error durante la
replicacin ocurre como 1:10000, estos
cambios que surgen de manera
espontnea puede ocurrir durante la
replicacin de material gentico
porque la DNA polimerasa se puede
equivocar o pueden ser inducidos por
agentes
qumicos
mutagenos
(nitrosoguanidina, bromuro de etilio), o tambin pueden ocurrir por agentes fsicos como la
luz UV o radiacin ionizante.
Para que una mutacin pueda cambiar el fenotipo de una bacteria tiene que establecerse y
debe conseguir una ventaja adaptativa. Si esa mutacin no confiere ventaja (o bien le
confiere una desventaja) se va a perder, esa bacteria no va a sobrevivir y nunca ms se
sabr de esa mutacin; pero si la mutacin es buena y le confiere ventaja adaptativa
entonces esa bacteria va a poder dividirse ms que las dems y va a poder propagarse en la
poblacin.
Hay distintos tipos de mutaciones, por ejemplo la mutacin missense donde se cambia el
codon de un aminocido por otro (aqu ocurre un cambio entre la tirosina y la asparagina).
Una mutacin nosense es cuando da un codon de trmino (como cuando da una TAA) y la
protena termina abruptamente y no es funcional. Una mutacin silenciosa es cuando no
pasa nada (por ejemplo se inserta la misma tirosina que en la protena wild type) y ocurre
cuando una mutacin ocurre en la tercera posicin del codon, como es degenerado la
tercera posicin es la ms variable y puede ocurrir que codifique para lo mismo.
Tambin estn los tipos de mutacin por
insercin o por delecin. Si ac tenemos el
wild type, si sacamos una U va a haber un
Frameshift (cambio en el marco de
lectura), se cambia todo porque ahora el
ribosoma no va a leer UUU, va a leer
UUG lo que codifica para otra cosa, y el
que le sigue tambin (todo se corre). Esta
protena tampoco va a ser funcional.
Lo mismo cuando se inserta una U. Ac
estamos hablando de mutaciones que
pudieran ser inducidas por luz UV, un
error en la DNA polimerasa que insert

una U donde no deba. Entonces cuando hay una U de ms, lo que corre el marco de
lectura y la protena tendr una secuencia totalmente distinta a la original y tambin va a ser
no funcional. Para que el cambio no sea tan drstico tiene que haber una insercin o una
delecin de un mltiplo de 3 bases, si se insertan 3 bases voy a insertar un aminocido de
ms, pero la protena ser prcticamente igual a la original (lo mismo que si saco un codn).
Otro mecanismo de variacin gentica
es la recombinacin. Es un intercambio
de material gentico entre elementos
genticos diferentes, la ms conocida
es la recombinacin homologa (como
su nombre lo dice requiere de
secuencias homologas o similares).
Como dice ah, son idnticas o casi
idnticas para que pueda ocurrir este
tipo de recombinacin. Requiere de la
participacin de la enzima Rec A. As
comienza la recombinacin, donde
primero hay un corte de simple hebra
en una de las molculas (un donador),
en ese corte luego vendr la protena SSB (Single Stranded DNA Binding Protein) que se
une a cadenas simples y la va a proteger (una cadena simple de DNA es muy susceptible a
la degradacin), y luego viene la protena Rec A que cataliza el intercambio de cadena,
pegando este fragmento de DNA simple hebra a la cadena receptora. Luego contina el
intercambio, esto se extiende y se va corriendo hasta que ocurre un apareamiento y el
resultado es que esta va a terminar apareada aqu abajo, entonces si ac haba una diferencia
de secuencia, ella ahora estar aqu. Depende de donde se corta la diferente estructura que
se forme, si se resuelve en el sitio marcado con amarillo voy a tener parches (pedazos de
intercambio), en cambio si se resuelve en los sitios marcados con azul tendr empalmes
(pedazos ms grandes donde hubo intercambio de hebras). El resultado es que ahora el
organismo va a tener una cadena de DNA que viene de otro origen que podra tener una
mutacin interesante que le confiere una ventaja adaptativa.
El tercer mecanismo de variabilidad
gentica es la transferencia de material
gentico entre bacterias, estos son:
transformacin, conjugacin, transduccin
y transposicin. El tipo de informacin que
se transfiere es resistencia a antibiticos,
metabolismo
de
metales
pesados,
capacidades catablicas de degradar
fuentes
de
carbono,
capacidades
biosintticas, factores de virulencia,
factores de adhesividad, toxinas, etc.
La transformacin es un proceso mediante
el cual una bacteria capta DNA que se encuentra libre en el medioambiente donde est. Ese

material gentico para que pueda ocurrir una transformacin efectiva tiene que
recombinarse, integrarse al cromosoma, si no se pierde en la primera divisin. Ese DNA
puede salir de una bacteria muerta que se lis y dej su DNA flotando por ah hasta que
fuese captado por otra bacteria. Tambin es un proceso poco frecuente, de 1 en no se
cuantos miles de millones, pero como las bacterias son millones siempre habr alguna que
lo capte.

Los requerimientos para que haya una trasformacin, tiene que haber un DNA
transformante y una bacteria capaz de captarlo, no cualquier bacteria puede hacerlo ya que
necesita una protena de membrana, la DNA Binding Protein, y tiene que tener unas
protenas especficas de unin a simple hebra, ya que el DNA entra como simple hebra, ya
que al entrar esta protena degrada una de las cadenas (la nucleasa del dibujo), y tiene que
haber protenas que se unan a esta cadena. Adems tiene que estar Rec A para que pueda
ocurrir recombinacin del DNA captado con el del cromosoma bacteriano (la misma Rec A
de la que hablamos).
Luego ocurre la recombinacin y el DNA qued integrado al cromosoma bacteriano.
No todas las bacterias pueden hacer esto,
las bacterias que pueden hacerlo se dicen
son competentes. Hay bacterias que son
naturalmente competentes como esos
gneros que estn ah enumerados
(Bacillus,
Streptococcus
pneunoniae,
Haemophilus influenzae, etc.), porque
tienen esas protenas de la diapo ante
anterior (la DNA Binding protein, las
protenas de la recombinacin homologa).
Ellas regulan su estado de competencia, se
dicen que son competentes y entran un
estado de competencia que depende de
protenas que liberan al medioambiente para decirse unas a otras que estn en tal estado.
Tambin existen diferencias en el DNA que pueden captar: Strepto pneumonia puede captar
cualquier DNA (es promiscuo), pero Neisseria gonorrea y Haemophilus influenzae captan
DNA con secuencias especficas.

Bacillus subtilis aceptan DNA de una

hebra. Estas bacterias producen y
excretan al medio un pptido pequeo
durante el crecimiento que cuando
alcanza ciertas concentraciones se dice
que la bacteria est competente (lista
para captar DNA). Tienen ComP, una
kinasa sensora que se encuentra en la
membrana y ComA que es una
protena reguladora de la respuesta, es
una protena que cuando la kinasa
sensora de ese pptido le pasa la seal
a ComA, este va a activar un montn
de genes que tienen que ver con la
transformacin. Si yo tengo un cultivo de Bacillus subtilis en el laboratorio, solo un 20% de
las clulas de ese cultivo son competentes (pueden captar DNA exgeno).
Haemophilus influenzae tambin es
otra bacteria que es naturalmente
competente, pero ella acepta DNA de
doble hebra, pero ella no acepta
cualquier DNA, este debe tener una
secuencia especfica de 11 pares de
bases, que es muy frecuente en el
cromosoma del mismo Haemophilus,
es decir acepta DNA de su misma
especie solamente.
En el laboratorio las bacterias se
transforman todo el rato sin pertenecer
necesariamente a esos gneros
transformables. Se puede hacer una
bacteria cualquiera se haga competente
por distintos mecanismos. Se puede
transformar casi cualquier bacteria (o
cualquier cosa). Cuando ponemos una
bacteria en contacto con DNA en
solucin, solo algunas bacterias van a
resultar transformadas, pero como se
tienen tantas bacterias en ese cultivo,
con que alguna se transforme me
conformo. Los valores normales de
eficiencia de transformacin van de 0.1
a 1% que es bastante; hay que poner una concentracin mnima de DNA de 0.00001 g/mL
o 10 ng/mL. Se hace una bacteria competente con una solucin de cloruro de calcio y fro

(hielo), o con un pulso elctrico, lo ms usado en este momento, ya que aumenta la

permeabilidad de la bacteria y esta se vuelve competente.
Esto es un electroporador y
lo que yo hago en el
laboratorio. Le doy un
pulso elctrico como de
2000 Volts, pero que dure
unos milisegundos, y en
ese tiempo se hacen poros
en la membrana por donde
se mete el DNA. As se
hace la transformacin
artificial en el laboratorio.
Lo pongo en una celda de
metal, pongo la bacteria
con el DNA, le doy el
pulso y el DNA se mete en
la
bacteria
en
los
milisegundos que duren los
2000 Volts (es regulable, eucariontes soportan un poco ms). Luego selecciono en un
medio de cultivo para ver quienes son las que incorporaron el DNA que yo quera, esto se
hace con un marcador de seleccin (que generalmente es resistencia a antibitico). Se mete
el gen deseado pegadito a un gen de resistencia a antibitico (como resistencia a
canamicina), entonces las cultivo en un medio con canamicina, y las que crecen son las
transformadas.