Nueva fase para d-SPE (QuEChERS) que

mejora la retirada de grasas

Angel Castro
Analytical Sales Specialist
sigma-aldrich.com

Introduccin
En estos aos el uso de QuEChERS para la limpieza de muestras se
ha aplicado con exito a otros alimentos mas alla de vegetales y frutas,
por ejemplo leche, aceite pan. Asi el rango de compuestos
analizados por esta tecnica se ha agrandado a otros tipos de
compuestos desde pesticidas a otros contaminantes (P. ej. Drogas
veterinarias). Todos estos analisis se llevan a cabo por metodos en
equipos LC-MS.
Las fases de SPE que se han usado hasta ahora como sorbentes en
el metodo QuEChERS son: amina primaria-secundaria (PSA) para la
eliminacin de cidos, pigmentos polares y azcares; Carbon grafitado
(GCB) para la eliminacin de pigmentos de color como la clorofila; y
C18 para la eliminacin de lipidos y componentes no polares.
El sorbente tipo C18 era hasta ahora el unico disponible para la
eliminacin de grasas y compuestos no polares.
En esta presentacin presentamos el uso de un nuevo sorbente para
la eliminacin de lipidos (Z-Sep)

Agenda
Que son Supel QuE Z-Sep/C18 and Z-Sep+?
Beneficios
Posicionamiento Z-Sep/C18 and Z-Sep+
Descripcin del producto
Caracteristicas clave
Como trabaja el metodo QuEChERS?
Datos y ejemplos

Que son Supel QuE Z-Sep/C18 y Z-Sep+?

Repaso del metodo:

Lo que conocemos

Supel QuE ( Dispersive SPE, dSPE, QuEChERS)

Usamos sorbentes SPE en bulk

Desarrollado para analisis de
pesticidas, en multirresiduos (100)
Diseado para eliminar
interferencias en muestras de
alimentos
Analitos quedan sin retener
Diferentes metodos dSPE:
EU Standard Method EN 15662
AOAC Method 2007.01
Metodo original(extraccin sin tampon)

Being applied to other compounds (e.g.,veterinary drugs) and samples!

Que son Supel QuE Z-Sep/C18 and Z-Sep+?

Lo que sabemos..
HybridSPE-Phospholipid
(conocido como Z-Sep)
Proprietary HybridSPE
zirconia-coated silica

El atomo de Zirconio actua como un acido

de Lewis
Los grupo fosfato en los fosfolipidos actua
como una base fuerte de Lewis y se une
fuertemente con los atomos de Zirconio.
Los analitos se eluyen libres de fosfolipidos

Phospholipids

Que son Supel QuE Z-Sep/C18 and Z-Sep+?

Que ocurre cuando?

(now known as Z-Sep)

Proprietary HybridSPE
zirconia-coated silica

Se encuentra

Phospholipids

Que son Supel QuE Z-Sep/C18 and Z-Sep+?

Que son Supel QuE Z-Sep/C18 and Z-Sep+?

Que son Supel QuE Z-Sep/C18 and Z-Sep+?

y.

Nacen Supel QuE Z-Sep/C18 and Z-Sep+

Que son Supel QuE Z-Sep/C18 and Z-Sep+?

Supel QuE Z-Sep/C18

Supel QuE Z-Sep+

50 mg de Discovery DSC-18 y 20 mg de
Z-Sep (HybridSPE , Silica recubierta de
zirconio)
Envases de 2 mL en tubos de centrifuga;
100 tubos/pack (catalog # 55284-U)

Zr

C18
Zr
Zr
Zr
Zr
Zr

Zr

Zr

C18

Zr

C18

Doble enlace C-18 y Z-Sep

Envase de 2 mL tubo de centrifuga, 500
mg;
50 tubos/pack (catalog # 55296-U)
Muestras 5 tubos/pack (catalog #
55297-U)
Bulk, 20 g (catalog # 55299-U)
C18
Zr

C18

C18

C18

Zr

C18

C18

C18
C18

Zr
C18

Beneficios

Supel QuE Z-Sep/C18 mejora la limpieza de
muestras para matrices complejas, eliminando mas
grasa y color del extracto que las fases tradicionales
de QuEChERS para metodos LC-MS.

Eliminando las interferencias causadas por la
matriz, los productos Z-Sep proporcionan unos
metodos LC-MS mas robustos.

Esta tecnologia propia puede Reemplazar las fases
C18 y PSA en los metodos actuales sin ningun
desarrollo adicional del metodo.

Posicionamiento Supel QuE Z-Sep/C18 y Z-Sep+

Supel QuE Z-Sep/C18
Util para matrices con
contenido en fosfolipidos <15%
Frutas
Vegetales
Ejemplo:
Analisis de residuos de
pesticidas

Supel QuE Z-Sep+

Util para matrices con contenido
en fosfolipidos >15%
Tejido animal
Ejemplo:
Analisis de drogas veterinarias

Posicionamiento Supel QuE Z-Sep/C18 y Z-Sep+

Z-Sep tiene un grupo
intercambiador ionico con
caracter acido
Z-Sep+ tiene ambas
funcionalides en su superficie
intercambiador ionico y
funcionalidad hidrofobica
La interacin entre la parte
hidrofobica de las grasas y el
grupo hidrofilico de estas con
las 2 funcionalidades del ZSep+ tiene un efecto de
sinergia para la retencin de
grasas
..

Z-Sep & Zirconio

O
O

Zr

O
O

Zr

O
O

Descripcin de producto
Plataforma simple y generica para la preparacin de muestra.

Diseado para la eliminacin de interferencias hidrofobicas (a nivel bruto)

de las muestras, antes del analisis por LC-MS LC-MS-MS.
El mecanismo de retencin de lipidos basado en dos interacciones
sinergicas
Entre el grupo polar de los lipidos y el grupo enlazado de intercambio
ionico
Entre las cadenas hidrofobicas de lipidos y el grupo hidrofobico
enlazado a la superficie del Z-Sep.
La limpieza tiene mas exito en un formato dispersive SPE, cuando la fase
libre se mezcla con el extracto, y el tubo es centrifugado para separar el
sorbente y el sobrenadante que luego recogemos.

Caracteristicas clave
Disminuye las interferencias grasas de la matriz
Elimina los colores, especialmente pigmentos verdes
Emplea Quick Easy Cheap Effective Rugged Safe metodologa
asociada al metodo QuEChERS.
Util para el analisis de residuos de pesticidas
Util para el analisis de residuos veterinarios en tejido animal (Z-Sep+)

Datos
Se probo la eliminacin de oleinas por diferentes sorbentes. La mezcla incluye
1mL solucion de mono-, di- y tri-oleinas en 90% acetonitrilo-10% agua y 25 mg
de sorbente. Las oleinas se mantienen en solucin al medir mediante HPLCELSD. Mas del 75% de las oleinas se retuvieron por Z-Sep/C18 mientras cerca
del 100% se retuvo con Z-Sep+, dando los mejores resultados de todos los
sorbentes analizados en el experimento. Aqui se muestra la retencin de oleinas
en diferentes sorbentes.

Como funciona el metodo QuEChERS?

Homogeneizar
Adicin de CO2
Solido (dry ice)

Como funciona el metodo QuEChERS?

Extraccin

Pesar 10 g de muestra
en un tubo de centrifuga
de 50 mL con tapa
roscada

Aadir 10 mL de
Acetonitrilo & 100 L
Internal Standard

Agitar fuertemene 1 min

Como funciona el metodo QuEChERS?

Aadir sulfato de magnesio, y tampon salino

Agitar fuertemente 1 min

Tampon tipo EN :
Trisodium citrate dihydrate; disodium
hydrogencitrate sesquihydrate, sodium chloride
Tampo tipo AOAC:
Na Acetate
Importante: Primero aadir la muestra en el
vial y despues aadir la sal para prevenir la
formacin de grumos

19

Como funciona el metodo QuEChERS?

5 min centrifugacin
Si es necesario : tomar 1 ml extracto
para pesticidas acidos

Fase Acetonitrilo (para

usar en un analisis posterior)

Precipitado
Agua de la muestra
Sales

Como funciona el metodo QuEChERS?

Transferir la fase de acetonitrilo al tubo de centrifuga con

sulfato de magnesio y el sorbente (en este caso ZSep/C18 or Z-Sep+ para muestras con alto contenido en
grasas)
Si es necesario: aadir GCB para muestras con alto
contenido en pigmentos

agitar!

Purificacin

Como funciona el metodo QuEChERS?

5 min centrifugacin

Usa el sobrenadante
incoloro para la
cromatografia
Acidificar con 5 % de
acido formico a pH 5

22

Experimental: Comparacin de C18/PSA y ZSep+ para la extraccin y recuperacin de

analitos de aguacate
Objectivo: Comparar la recuperacin de analito en acetonitrilo
con extractos de guacamole despues de la limpieza con C18/PSA
and Z-Sep+
Experimental:

Extraccin con acetonitrilo

Limpieza con una mezcla de Z-Sep+ C18/PSA
Nivel de pesticidas 100 ng/g
Usando un Agilent 7890 GC-MS LVI at 5 uL

Extraccin de aguacate usando acetonitrilo

Resultados:
Name
trifluralin
alpha-BHC
Hexachlorobenzene
dimethoate
simazine
quintozene
gama-BHC
heptachlor
malathion
metolachlor
chlorpyrifos
endosulfan
DDT
methoxychlor
coumaphos
cyfluthrin
cypermethrin
deltamethrin

% Recuperacin
Z-Sep+
C18
87%
71%
84%
91%
39%
44%
91%
84%
85%
74%
71%
62%
78%
75%
78%
58%
89%
74%
86%
74%
102%
72%
94%
68%
69%
60%
82%
42%
95%
68%
88%
0%
85%
0%
42%
0%

Queda un
poco de color

Conclusin
Las mejores recuperacions se
dan siempre con el Z-Sep+
Z-Sep+ es mas efectivo en
eliminar las interferencias
causadas por la matriz para la
lista de pesticidas
No se puede detectar por
las interferencias de
matriz

Pesticidas en manzanas y naranjas con QuEChERS

Pesticides from green apples at 50 ppb

Comparacin entre limpieza con ZSep/C18 PSA

Z-Sep/C18
150%

PSA

recovery

2 sets de compuestos

Z-Sep/C18

PSA

100%
50%
0%
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 33 11 34 12 35 13 14 15

compound number

Green
Apple

Pesticides from green apples at 10 ppb

Conclusin
La mejor eliminacin de pigmentos
se da con Z-Sep/C18 PSA
Recuperacin comparable en
muchos casos.

reco very

Z-Sep/C18
140%
120%
100%
80%
60%
40%
20%
0%

PSA

17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32
compound number

Indica mejores recuperacione con Z-Sep/C18

Problemas y preguntas frecuentes

Por que se usa acetonitrilo y formico en el metodo de
limpieza de algunas drogas veterinarias?

El Acetonitrilo es un agente precipitante de proteinas muy comun cuando se
preparan muestras biologicas para analisis por LC-MS. El precipitado de proteinas
resultante se separa facilmente por centrifugacin.

Se usa un mayor porcentage de acetonitrilo al usar Z-Sep+ para evitar la
retencin de los compuestos mas hidrofobicos, dada la presencia the grupos
hidrofobicos en la superficie.

La adicin de formico al 1-2% al extracto de acetonitrilo antes de la etapa de
limpieza, es critica por que el formico es una base de Lewis mas fuerte que
muchos grupos carboxilo (-COOH) que se encuentran en compuestos acidos
(inhibiendo la retencin del analito en la fase Z-Sep+); pero no tan fuerte como los
restos fosfatos encontrados en los fosfolipidos; y 2) el bajo pH neutraliza la
actividad del silanol residual en la superficie de la silica, eliminando la
interaccin secundaria de intercambio cationico con los compuestos basicos de
interes.

Problemas y preguntas frecuentes

Puedo incrementar la sesibilidad de mi ensayo,
incrementando la cantidad de muestra concentrando
(evaporacin y reconstitucin) el sobrenadante del Z-Sep+?
La concentratin/evaporacin del sobrenadante puede ser una buena opcin si el
procedimiento no afecta la estabilidad de los compuestos. Incrementar el tamao
de muestra es posible siempre que el extracto resultante este suficientemenete
limpio para el analisis por equipos de LC-MS.

Problemas y preguntas frecuentes

Puede la fase Z-Sep+ usarse como cartuchos de SPE 96well plates?
La fas eZ-Sep+ puede usar en cartuchos tipo SPE y 96-well plates para
compuestos no acidos y que no formen quelatos.

Problemas y preguntas frecuentes

Precaucin: Baja recuperacin por quelatos acidos y
compuestos quelato:
Algunos quelatos acidos y compuestos quelato pueden dar bajas recuperaciones
cuando se usa el metodo primario(1% de formico y Acetonitrilo).
Grupos funcionales tipo quelato que pueden dar bajar recuperacines: Betahydroxy caroboxylic acids, 1,3-Diketone type compounds, Beta-hydroxy ketones,
1,3-Diol type compounds.

Sumario
Supel QuE Z-Sep/C18 y Z-Sep+ combinan la quimica del C18 y la
silica recubierta de Zirconio para la eliminacin de interferencias
hidrofobicas en nuestras muestras.
Supel QuE Z-Sep/C18 Z-Sep+ eliminan de forma efectiva mas grasa y
color de las muestras que las tradicionales fases tipo QuEChERS
para metodos LC-MS, y pueden reemplazar a las fases C18 y PSA en
los metodos actuales sin un desarrolo de metodo adicional.
La tecnologia Z-Sep es util para el analisis de residuos de pesticidas
en alimentos y residuos de drogas veterinarias en tejido animal.
En un estudio buscando la retencin de mono-, di- y tri-oleinas,
mas del 75% de las oleinas fueron retenidas por Z-Sep/C18 mientras
que cerca del 100% fueron retenidas por Z-Sep+, dando los mejores
resultados de todos los sorbentes comparados en el experimento.
La tcnica Z-Sep emplea Quick Easy Cheap Effective Rugged Safe
metodologia asociada al QuEChERS.

Gracias por vuestra atencin