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II.

Manual de Prcticas del Laboratorio de Bioqumica

4. Enzimas
Las
enzimas
son
protenas
especializadas de actividad cataltica.
Algunas de ellas estn formadas
nicamente de aminocidos mientras que
otras presentan algn otro componente de
naturaleza no aminocida. La parte
proteica
se
denomina
apoenzima,
mientras que la parte no proteica se
denomina coenzima; cuando
se
encuentran aisladas, ambas son no
funcionales, pero juntas forman una
protena
funcional
denominada
haloenzima.
Las coenzimas funcionan a menudo
en la transferencia de electrones o de
grupos funcionales. Generalmente son
derivados de vitaminas, las cuales no
pueden ser sintetizadas en las clulas de
los organismos superiores, por lo que
deben ser adquiridas en la dieta.
Las enzimas presentan algunas
caractersticas que las diferencian de los
catalizadores qumicos, como:
1.- Mayor velocidad de reaccin.
2.- Condiciones de reaccin ms suaves.
3.- Mayor especificidad de reaccin.
4.- Capacidad de regulacin.
Las
enzimas
aceleran
las
reacciones biolgicas al disminuir la
energa de activacin de una reaccin
dada sin alterar su equilibrio. Su
mecanismo de accin consiste en la
formacin de un complejo entre la enzima
y el sustrato (ES), el cual realiza la
reaccin qumica adecuada y permite la
recuperacin de la enzima original en el
momento en que el complejo enzimaproducto se rompen para liberar al
producto.
El sustrato se une a la enzima en el
sitio activo, el cual consiste en un arreglo
espacial de algunos aminocidos de la
protena
donde
se
encuentran
generalmente el grupo prosttico o la
coenzima y que tienen la capacidad de

interactuar con el sustrato. Hay algunas


enzimas que sintetizan directamente en
su forma activa, otras se sintetizan en
forma de proenzimas inactivas o
zimgenos y deben ser activadas por
procesos especiales para llegar a ser
funcionales. Algunas otras enzimas
presentan sitios diferentes del sitio activo
donde se asocian molculas que modulan
su actividad. Estas enzimas se conocen
como enzimas alostricas y el sitio donde
interactan con el modulador se llama sitio
alostrico.
La velocidad de las reacciones
enzimticas dependen de:
a) La cantidad o la actividad de la enzima.
b) La concentracin del sustrato.
c) El pH y la composicin de la solucin en
que se lleve a acabo la reaccin.
d) La temperatura.
e) La
presencia
de
activadores
e
inhibidores.
Los inhibidores enzimticos pueden
ser de varios tipos; los ms importantes
son los competitivos y los no competitivos.
Los inhibidores competitivos interactan
con el sitio activo de la enzima y se
parecen al sustrato en su estructura, o lo
que compiten con el para unirse al sitio
activo. En general se remueven con un
exceso de sustrato. Los inhibidores no
competitivos
reaccionan
con
otra
estructura importante de la molcula
enzimtica. La inhibicin puede ser
reversible o irreversible en el caso de que
el inhibidor realice un cambio permanente
de un grupo funcional de la enzima.
El efecto de un inhibidor no competitivo
no puede revertirse por un exceso de
sustrato. El comportamiento cintico de las
enzimas, as como el efecto de los
diferentes tipos de molculas sobre la
actividad enzimtica, puede ser estudiado
mediante diversas tcnicas cinticas y
10,25
grficas.

UNIVERSIDAD VERACRUZANA
LABORATORIO DE BIOQUMICA
PRCTICA No. 5
OBTENCIN DE CATALASA Y AMILASA
NOMBRE:

GRUPO:

TIEMPO DE PRCTICA: 2 Horas.


OBJETIVO:

Obtener un extracto enzimtico


crudo de catalasa y amilasa salival
a partir de una serie de sustratos
animales y vegetales.

PREGUNTAS PRELABORATORIO
1.-Qu funcin tienen las enzimas en los
procesos metablicos?
2.-Qu es un cofactor o coenzima?

FUNDAMENTO
La catalasa, como otras enzimas,
es alterable por la presencia de
activadores o de inhibidores y por todos
los factores que afectan la estructura y
conformacin
proteica,
como
son
principalmente el pH y la temperatura.
Las
amilasas
son
enzimas
hidrolticas que degradan el almidn para
producir glucosa, maltosa o pequeos
oligosacridos llamados dextrina limite. La
amilasa pancretica o amilopsina, cataliza
especficamente la hidrlisis de enlaces
glucosdicos 1,4 al igual que la amilasa
salival. Los enlaces 1,6 no son
hidrolizados por estas enzimas y por ello
se forman las dextrinas limite. Tampoco
los enlaces "" pueden ser hidrolizados
por este tipo de amilasas.

FECHA:

MATERIAL Y PROCEDIMIENTO
EXPERIMENTAL
MATERIAL DE LABORATORIO:
- Mortero con pistilo
- Gasa
- Bao mara
- 3 Pipetas graduadas de 10 ml
- 3 Pipetas graduadas de 5 ml
- 6 Tubos de ensaye
- 1 Tubo de ensaye de boca ancha
- Frasco de vidrio grande
- Termmetro
- 1 Embudo de filtracin
- Agitador mecnico
- 2 Vasos de precipitados de 250 ml
- Gradilla
- Parrilla
- Navaja o exacto
- Arena lavada y seca
- Placa de toque
MATERIAL BIOLGICO:
- Hgado de pollo o de res, gusanos,
triturados,
papa,
manzana,
frjol
macerados en seco, 2 a 5 g de cada
uno.
- Saliva (amilasa salival) recolectar unos
2.5 ml de saliva, filtrada a travs de gasa
evitando que tenga espuma.
REACTIVOS:
(Para su preparacin vase la preparacin
de soluciones).
- Agua oxigenada al 3%
- NaCN y Pb(NO3)2 al 5%

- Solucin de almidn al 2%
- Solucin indicadora de lugol
- Reactivo de Benedict

aceite). Separe una ventana en el material


aislante, que permita observar el interior
del tubo sin sacarlo; para ello puede usar 2
placas de vidrio, madera o nieve seca, del
tamao adecuado (ver figura 4.1).
Introduzca un termmetro a travs del
tapn monohoradado, de manera que el
bulbo quede sumergido al poner 10 ml de
solucin. Ponga 10 ml de H2O2 al 3%, tape
y anote la temperatura inicial. Introduzca
dos trozos pequeos de hgado o 10 gotas
de sangre, en el tubo, tapndolo de nuevo
rpidamente pero sin ajustar demasiado el
tapn. Anote la temperatura cada 30 seg.,
durante 5 min.

a) Determinacin de la Catalasa:
MTODO:
1. Corte en trozos delgados cada uno de
los tejidos disponibles y pngalos sobre
papel
absorbente,
rotulando
cuidadosamente su nombre. No deben
tocarse los tejidos con los dedos, sino
manipularlos con pinzas.
2. De cada tipo de tejido separe una
porcin, pngala en un tubo cubrindola
con agua destilada e introdzcalo en un
bao de agua hirviente durante 5 minutos,
para que hierva el contenido del tubo.
Coloque estas porciones hervidas sobre
papel absorbente, anotando el nombre y la
indicacin de que se ha hervido.
3. Prepare una serie de tubos, 4 por cada
tejido, marcados segn una clave que
permita distinguirlos. Agregue lo que se
indica en el cuadro. Mezcle bien y
pngalos a incubar en un bao a 37C.
Observe y anote lo que sucede en cada
tubo. Cuando haya terminado con un tipo
de tejido, lave bien los 4 tubos con agua
destilada y empiece con otra serie. Marque
con 1 a 5 cruces, segn aprecie en cada
caso la intensidad del burbujeo en cada
tubo de cada serie.
CONTENIDO
H2O2 al 3%
NaCN al 5%
Pb(NO3)2
al 5%
Tejido

1
2 ml

Porcin
sin
hervir

2
2 ml

Porcin
hervida

3
2 ml
5 gotas
Porcin
sin
hervir

Figura 4.1 Calormetro

4
2 ml

1.

5 gotas

2.

Porcin
sin
hervir

3.

Resultado
(1 A 5+)

4. Prepare un calormetro sencillo en la


siguiente forma: Introduzca 1 tubo de
ensaye de boca ancha, con tapn
monohoradado, de corcho (u oasis), en un
frasco de vidrio suficientemente grande
para contenerlo rodeado de material
aislante trmico (lana de vidrio, arena o

4.
5.

b) Obtencin de la Amilasa Salival:


MTODO:
En un tubo de ensaye ponga 1.5 ml de
saliva y 1.5 ml de agua destilada.
Introduzca el tubo en un bao de agua
manteniendo a 40 C.
Agregue rpidamente 2 ml de disolucin
de almidn al 2%. A los 0, 10, 20, 30 y 35
minutos ponga una gota de la mezcla en
una placa de toque y agregue 1 gota de
lugol, anote los cambios de color.
Mantngala en el bao durante media
hora, agitando cada 5 minutos.
Al mismo tiempo a los 0, 15 y 30 minutos,
verifique en porciones de 0.5 ml la
16
reaccin de Benedict.

HOJA DE RESULTADOS
NOMBRE:

GRUPO:

1.- Realice una tabla donde indique la


intensidad del burbujeo que apreci en
cada tubo de cada serie.
2.- Anote la temperatura observada en el
calormetro para cada 30 segundos.

FECHA:

3.- Describa los cambios de color para


cada tiempo en la obtencin de la amilasa
salival.

DISCUSIN DE RESULTADOS

CONCLUSIONES

CUESTIONARIO
1.- Qu son las peroxisomas y que
importancia tienen dichos organismos
celulares?
2.- La catalasa rompe el perxido de
7
hidrgeno cerca de 10 veces ms rpido
que la reaccin no catalizada. Si la ltima
requiere un ao, cunto tiempo se
necesitara para la reaccin catalasacatalizador?

3.-Describe otros dos mtodos empleados


para determinar la actividad de amilasa.
4.-Cules son los dos tipos de amilasa
que se conocen?
5.-Menciona los productos de la accin de
la -amilasa cuando se hidroliza un enlace
glicosdico.

REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS

UNIVERSIDAD VERACRUZANA
LABORATORIO DE BIOQUMICA
PRCTICA No. 6
EFECTO DEL pH Y LA TEMPERATURA SOBRE LA VELOCIDAD DE
REACCIN DE LA UREASA
NOMBRE:

GRUPO:

TIEMPO DE PRCTICA: 2 Horas.


OBJETIVO:

Determinar, en forma prctica, la


manera en que el pH y la
temperatura afectan la actividad
enzimtica.

PREGUNTAS PRELABORATORIO
1.- Qu es la ureasa?
2.- En donde se encuentra la ureasa?

FUNDAMENTO
Uno de los factores que ms
pueden influir sobre la velocidad de las
reacciones enzimticas, en condiciones
biolgicas, es el pH. Cada enzima tiene un
pH ptimo de accin, que no siempre es
cercano a la neutralidad, aunque este es el
caso ms frecuente. El efecto del pH sobre
la velocidad de reaccin depende o puede
explicarse por:
a) Una alteracin de la carga elctrica
neta de la protena, repercutiendo
esto en su solubilidad.
b) Una alteracin de la estructura terciaria
o cuaternaria que determina el cambio
a una conformacin ms activa o
inactiva.
c) Un efecto del cambio del pH sobre el
sustrato.
d) Los efectos anteriores combinados.

FECHA:

En
procesos
microbiolgicos
industriales, es importante determinar los
efectos del pH sobre la velocidad de
reaccin, a fin de encontrar el pH ptimo
para el rendimiento deseado. En estudios
tericos sobre mecanismos de accin,
determinacin del sitio activo de una
enzima y similares, tambin es muy til
establecer la curva de pH contra la
actividad enzimtica.
En la prctica se empleara HgCl2,
como envenenador de la enzima a fin de
detener su actividad en el momento exacto
que se desee y en el blanco, para eliminar
toda traza de actividad atribuible a la
enzima. Esta enzima cataliza la siguiente
reaccin:
O
II
2
H2N-C-NH + 3 H2O ------------------> CO2 + 2 NH4OH
Urea
Agua
Bixido
Hidrxido
de Carbono de
Amonio

MATERIAL Y PROCEDIMIENTO
EXPERIMENTAL
MATERIAL DE LABORATORIO:
- Gradilla
- Bao maria
- Parrilla
- 8 Tubos de ensayo
- 8 Matraces Erlenmeyer de 125 ml
- Bureta
- Termmetro

MATERIAL BIOLGICO:
- Harina de haba o de soya 100 g.
REACTIVOS:
(Para su preparacin vase la preparacin
de soluciones).
- Disolucin de urea 0.25 M, 500 ml
- Disolucin de rojo de metilo al 0.04%, 50
ml
- Disolucin de ureasa 50 ml
- Soluciones buffer de los siguientes pHs:
5,6,6.3,7.2 y 8.5.
- HCl 0.1 N, 1 litro.
- HgCl2 al 1%, 50 ml
- Etanol
- Acetona
- Indicador de Shiro-Tashiro

1.

2.

3.
4.

5.

6.

a) Extraccin de Ureasa
MTODO:
Para obtener harina de haba o de soya
triture perfectamente en un mortero las
semillas desengrasadas, deje secar
perfectamente en un horno a 60 C
durante la noche y pulverice ms el polvo
seco.
Agite la harina en un matraz con una
mezcla de acetona-agua (3:1), en cantidad
suficiente para cubrir perfectamente el
polvo.
Filtre la mezcla, lavando con pequeas
porciones de acetona.
El filtrado se deja en el refrigerador hasta
que cristalice. Los cristales se pueden
volver a cristalizar disolvindolos en
agua caliente y adicionando gota a gota
acetona fra hasta conseguir un ligero
enturbimiento.
El extracto se debe conservar a pH 6.3,
adicionndole la cantidad adecuada de
buffer de fosfatos para lograr este pH .
Puede emplearse alcohol en lugar de
acetona, en especial si la harina es de
soya.
En caso de emplear un ureasa comercial
prepara la disolucin para la prueba en
buffer de fosfatos a pH 6.3 a una
concentracin de 0.1%.

b) Determinacin de la Actividad a
Diferentes pHs y Temperatura
MTODO:
1. Prepara dos series de tubos, 5 que sirvan
como blanco y 5 que contendrn el
problema, rotulando claramente, agregue
lo que indica los cuadros e incubndolos
como se indica,
2. Terminando
el proceso de incubacin,
titule el contenido de cada tubo, en un
matraz diferente, agregando 4 gotas del
indicador Shiro-Tashiro o de rojo de metilo
16
y para titular utilice HCl 0.1N.
I. Efecto pH:
1ra Serie

Tubos Blanco
2
3
4

1
5
Urea 0.25 M
5
5
5
5
5
(ml)
Buffer (ml)
4.5
4.5
4.5
4.5
4.5
De pHs
5
6
7.2
8
10
HgCl2 al 1%
0.05 0.05 0.05 0.05 0.05
(ml)
Incubar a 50 C durante 5 minutos, agitando
Extracto de
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
ureasa (ml)
Incubar a 50 C durante 25 minutos, titular con HCl
0.1N
Resultados (ml
de HCl 0.1N)
2da Serie
1

Tubos Problema
2
3
4

Urea 0.25 M
5
5
5
5
(ml)
Buffer (ml)
4.5
4.5
4.5
4.5
De pHs
5
6
7.2
8
Extracto de
0.5
0.5
0.5
0.5
ureasa (ml)
Incubar a 50 C durante 30 minutos
HgCl2 al 1%
0.05 0.05 0.05 0.05
(ml)
Titular con HCl 0.1N
Resultados (ml
de HCl 0.1N)

Diferencia entre titulaciones X


micromoles de urea hidrolizados.

5
5
4.5
10
0.5
0.05

50

II. Manual de Prcticas del Laboratorio de Bioqumica I

II.Efecto Temperatura:
1ra Serie
1

Tubos Blanco
2
3
4

Tubos Problema
2
3
4

5
Urea 0.25 M
5
5
5
5
5
(ml)
Buffer(ml) pH
4.5
4.5
4.5
4.5
4.5
6.0
HgCl2 al 1%
0.05 0.05 0.05 0.05 0.05
(ml)
Temperatura
20
30
40
50
60
de incubacin
( C)
Tiempo de incubacin 5 minutos.
Extracto de
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
ureasa (ml)
Incubar 25 minutos ms y titular con HCl 0.1N
Resultados (ml
de HCl 0.1N)

2da Serie

Urea 0.25 M
5
5
(ml)
Buffer (ml)
4.5
4.5
pH 6.0
Extracto de
0.5
0.5
ureasa (ml)
Temperatura
20
30
de incubacin
( C)
Tiempo de incubacin
HgCl2 al 1%
0.05 0.05
(ml)
Titular con HCl
Resultados (ml
de HCl 0.1N)

4.5

4.5

4.5

0.5

0.5

0.5

40

50

60

30 minutos
0.05

0.05

0.05

0.1N

HOJA DE RESULTADOS
NOMBRE:
1.- Grafique en papel milimtrico los
micromoles
de
urea
hidrolizados
(ordenadas) contra el pH o temperatura
segn sea el caso (abscisas) y una los
puntos en lnea recta.
- Clculos:
El nmero de micromoles de urea
hidrolizados en cada tubo es igual a los ml
de HCl 0.1 N multiplicados por 50, que se
deduce de la siguiente forma: se necesitan
dos moles de HCl por cada mol de urea
hidrolizada. As, la solucin de HCl 0.1 N

GRUPO:

FECHA:

contiene 100 micromoles/ml, por lo que a


cada ml le corresponden 50 micromoles de
urea hidrolizados.
2.- Escriba la reaccin balanceada y con
frmulas desarrolladas, de la hidrlisis de
la urea.
3.- Escriba la reaccin que ocurre entre el
carbonato de amonio y el HCl durante la
titulacin.
4.- De acuerdo con los resultados de tu
grafica cul es el pH ptimo y la
temperatura ptima para la ureasa?

II. Manual de Prcticas del Laboratorio de Bioqumica I

DISCUSIN DE RESULTADOS

CONCLUSIONES

CUESTIONARIO
1.- Una enzima la cual tiene su actividad
mxima en pH 5 exhibe una gran
reduccin de su actividad en pH 7 Explica
brevemente por qu?
2.-Qu
parmetros
fundamentales
influyen en la constante de velocidad de
una
reaccin
enzimtica.?
Qu
parmetros influyen en la velocidad de una
reaccin enzimtica?
3.-En las reacciones qumicas orgnicas e
inorgnicas
la
temperatura
es
incrementada ms rpidamente. Esta
misma direccin es observada cuando una
reaccin de la enzima catalizada es
llevada a cabo a 15, 25 y 40 C. Sin
embargo a 45 y 50 C la velocidad de

reaccin disminuye fuertemente. Explica


Por qu sucede esto?
4.-Indica si los siguientes enunciados son
Falsos o Verdaderos, si el enunciado es
falso, corrgelo.
a) El valor de la Vmx es una
caracterstica fundamental para
cada enzima.
b) Enzimas las cuales se ajustan a la
cintica de Michaelis-Menten no
estn directamente involucradas en
cualquier
regulacin
de
realimentacin.
c) El HCl puede actuar como un cido
general de la catlisis.

REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS