I.

INTRODUCCIN
Las tinciones en microbiologa son las primeras herramientas que se utilizan en el
laboratorio para el diagnstico de las enfermedades infecciosas. Hay una gran
variedad de tinciones, que se han ido desarrollando para la deteccin de los
diferentes agentes infecciosos en los que se incluyen bacterias, parsitos y hongos.
En esta primera clase aprenderemos y practicaremos la preparacin de una muestra
para tincin simple de bacterias, el procedimiento y posterior reconocimiento de sus
estructuras individuales y en grupo.
Se trabajaron con tres bacterias Escherichia coli, Staphylococcus sp y Bacillus sp, que
nos ayudaron a lograr la tincin simple con facilidad, este mtodo constituye una
tcnica simple y directa que a travs del uso de colorante, nos permite contrastar y
diferenciar los microorganismos de su entorno.

II.

OBJETIVOS
-

III.

Ejecutar una preparacin de muestra fija de bacterias para posterior tincin.

Observar las diferentes formas, tamaos y agrupaciones que presentan los
microorganismos aplicando un mtodo simple de tincin.

LABORATORIO
MARCO TERICO

DE

PREPARACION
DE UNA MUESTRA FIJA DE BACTERIAS PARA TINCION
MICROBIOLOGA
Los microorganismos
especialmente
las bacterias, tienen poco contraste cuando se
UNIVERSIDAD
NACIONAL
observan sin teir al microscopio, por lo que se acostumbra teirlos para aumentar el
contraste con su entorno.
AGRARIA LA MOLINA
La tincin es un mtodo para incrementar el contraste entre la clula y su entorno y por
lo tanto contribuye a mejorar la imagen observada. Las tcnicas de tincin con diversos
colorantes facilitan la observacin al aumentar notablemente el contraste. En la tincin
generalmente se utiliza un colorante en el cual sus molculas se absorben a una
superficie. El uso de colorante permite cambiar el color de las clulas de los
microorganismos y poder realizar la observacin en microscopio ptico. (Rodrguez,
2005)

COLORANTE
En esencia los colorantes son sales en las que uno de sus iones tiene color y se
denomina cromforo. El cromforo es todo grupo aislado, covalente e insaturado, que
tiene una absorcin caracterstica. Se pueden presentar en dos formas fundamentales:
en sistemas conjugados pi o complejos metlicos; la tincin se da cuando se une el
cromforo a un componente celular. Los auxcromos es otro componente del colorante,
son grupos funcionales o radicales que constituyen una molcula y poseen carga parcial
positiva; tienen la funcin de intensificar la formacin de color mediante la accin de
grupos de tomos no saturados.
Los colorantes se clasifican en bsico, cidos y neutros, segn sea la carga del grupo
cromgeno. La nigrosina y la fucsina acida son colorantes cidos; en tato el azul de
metileno, la fucsina bsica (carbolfucsina), el cristal violeta, la safranina, el verde
malaquita y el rojo neutro son colorantes bsicos; algunos colorantes son neutros, como
el Giemsa, el Wright y el Leishman. (Rodrguez, 2005)
Los colorantes tienen las siguientes funciones:
1. Permiten hacer visibles a los objetos microscpicos y transparentes.
2. Revelan su forma y tamao.

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3. Muestran la presencia de estructuras internas y externas.

4. Producen reacciones qumicas especficas.
En Microbiologa todas las tinciones se realizan a partir de suspensiones de
microorganismos extendidas en un portaobjetos, secadas y fijadas. La fijacin,
procedimiento que permite preservar estructuras celulares, se puede llevar a cabo con
diferentes tratamientos: fijacin por calor o fijacin qumica. La fijacin por calor es la
ms utilizada para la observacin de bacterias. Este procedimiento consiste en pasar el
portaobjetos, con la suspensin bacteriana extendida y seca, a travs de una llama de
un mechero. La fijacin por calor preserva la morfologa externa de los microorganismos
pero no las estructuras internas. La fijacin qumica con agentes como etanol,
formaldehido y cido actico entre otros muchos, se utiliza para preservar las
estructuras celulares. Esta tincin depender de la compasin qumica de la clula
microbiana (as como el pH del material que lo rodea) determina el colorante tomado por
la clula. (Rodrguez, 2005)

TIPOS DE TINCION:
De acuerdo a la reaccin que ocurre
- Tincin Simple:
Esta es una tincin directa que utiliza solo un colorante, el cual debe ser bsico
para que la clula bacteriana se tia. Permite demostrar la morfologa general de
una clula de manera rpida; al emplearse un nico colorante, todas las clulas se
observaran del color del colorante empleado. (Rodrguez, 2005)
La mayora de los colorantes utilizados en las tinciones positivas son colorantes
derivados de las anilinas, sales orgnicas intensamente pigmentadas que
proceden del alquitrn. Se denominan colorantes bsicos si el cromforo (porcin
coloreada) de la molcula est cargada positivamente, por ejemplo, cristal violeta
y azul de metileno son colorantes bsicos. Otros colorantes de esta categora
utilizados con frecuencia en bacteriologa son safranina, fuchina bsica y verde
malaquita. Colorantes cidos con rojo Congo, rosa de bengala, eosina y fuchina
cida tiene un cromforo cargado negativamente y son utilizados para teir
positivamente ciertos componentes como las protenas.
-

Tincin Diferencial:
El colorante utilizado pone de manifiesto diferencias entre clulas bacterianas o
entre partes de una misma clula. Estas tcnicas utilizan ms de un colorante o
bien ciertos reactivos complementarios para la tincin. Ejemplos: Tincin de Gram,
Tincin de Ziehl-Neelsen, etc.

BACTERIAS QUE OBSERVAMOS EN LABORATORIO

Bacillus sp
Los microorganismos del genero Bacillus son bacilos de gran tamao (4-10
m), Gram positivos, aerobios estrictos o anaerobios facultativos
encapsulados. Una caracterstica importante es que forman esporas
extraordinariamente resistentes a condiciones desfavorables.
Son mviles por la presencia de flagelos laterales, son catalasa positiva,
presentando hemolisis variables y un crecimiento activo en un rango de pH
5.5 8.5. (Corrales, 2011)
Staphylococcus sp

La ciencia es el alma de la prosperidad de las naciones y la fuente de vida de todo progreso

Louis Pasteur

Observacin de bacterias

UNALM

Los miembros del genero Staphylococcus son catalasa positivos, son Gram
positivos.
- Escherichia coli
Es una bacteria que integra parte de la flora intestinal del hombre y de los
dems animales. Las Escherichia coli son inofensivas, sim embargo algunas
pueden producir enfermedades.
IV.
PARTE EXPERIMENTAL

Ejercicio N1: Preparacin de una muestra fija de bacterias para tincin

Materiales

Asa de kolle

Lmina porta objeto

Mechero de alcohol

Muestra conteniendo bacterias

Piseta con agua

Mtodos
1. Coloque una gota de agua sobre una lmina porta objeto completamente limpia. Con
ayuda del asa de kolle coloque sobre la gota una pequea porcin de la muestra a fijar.
SI la muestra que contiene al microorganismo es lquida, puede aplicarse directamente
sin la gota de agua.
2. Distribuya la gota cargada con la muestra en la lmina hasta formar una pelcula
delgada.
3. Seque la lmina al aire o a una razonable distancia sobre la llama del mechero.

Ejercicios N2: Tincin simple con colorantes bsicos

Materiales

Aceite de inmersin

Colorantes bsicos: azul de metileno, carbolfucsina, cristal violeta

Lminas fijadas de microorganismos

Papel secante

Piseta con agua

Soporte para tincin

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Mtodos
1. Coloque las lminas fijadas de microorganismas sobre el soporte para tincin.
2. Agregue 5 o 6 gotas de cada colorante dejando que acten por un tiempo de: 30
segundos para el azul de metileno; 10 segundos para el cristal violeta y 5 segundos para
la carbolfucsina.
3. Una vez cumplido el tiempo para los colorantes, lave cada lmina con la piseta de agua.
4. Seque las lminas al aire o con papel secante.
5. Examine las preparaciones teidas bajo el objetivo de inmersin (100-150X) de un
microscopio compuesto.
6. Elabore esquemas de sus observaciones destacando las diferencias en tamao, forma y
agrupaciones que se presenten.

V.

RESULTADOS

Antes del desarrollo de las tcnicas de tincin el material debe ser fijado, esto es lo que
hicimos en el ejercicio N1, los resultados fueron los siguientes:

La muestra del microrganismo ha

sido fijada en el portaobjetos.
Resultados de las muestras fijadas con colorantes bsicos para el
ejercicio N2:

Muestra

Colorante
usado

Tiempo de
Reaccin

Observacione
s

Staphylococcus
Cristal violeta
10 segundos
Tincin
sp
apropiada
La Bacillus
ciencia essp
el alma de
la prosperidad
de las naciones
la fuente de vida
de todo progreso
Azul
de metileno
20 y30
Tincin
Louis
Pasteur
segundos
apropiada coli usando el colorante
Muestra
fijada de Escherichia
Escherichia coli
Carbolfucsina
5 segundos
Tincin
carbolfucsina.
apropiada

Observacin de bacterias

1 Muestra vista en

UNALM

microscopio

Gnero: Staphylococcus sp
Colorante: Cristal violeta
Forma: Cocos
Agrupacin: Racimo
Grado de aumento: 1000x

Muestra vista en microscopio

Gnero: Bacillus sp
Colorante: Azul de metileno
Forma: Bacilos (alargado)
Agrupacin: Estreptobacilos
(En cadena)
Grado de aumento: 1000x

3 Muestra vista en

Especie: Escherichia coli

Colorante: Carbolfucsina
Forma: Cocobacilo
Agrupacin: No tiene
Grado de aumento: 1000x

VI.

microscopio

DISCUSIONES

Observacin de Escherichia coli

Se observ que presentan forma de coco bacilo y que carece de agrupacin. Brock (2004),
seala que entre las bacterias entricas se encuentran especies patgenas para el hombre,
animales y plantas. Son bacilos rectos gram negativos; mviles por flagelos peritricos o
inmviles; no esporulados; anaerobios facultativos, producen glucosa, catalasa positivo,
pertenecen a la gamma Proteobacteria. Siendo una de ellas la Escherichia coli.
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Observacin de bacterias

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Brock (2004) afirma que los miembros del gnero Escherichia son habitantes universales de
todos los animales de sangre caliente, incluido el hombre. Escherichia tienen una funcin
nutricional en el intestino sintetizando vitaminas y en especial vitamina K. Como anaerobio
facultativo que es, probablemente tambin contribuye a la anaerobiosis del ambiente del
intestino grueso. Algunas cepas son patgenas y han sido implicadas en el desarrollo de
cuadros diarreicos en nios. En personas de edad avanzada, es relativamente frecuente que
ciertas estirpes de Escherichia causen infecciones de las vas urinarias o en aquellos pacientes
que han sido tratados con radiaciones ionizantes. Estas cepas forman antgeno K, que permite
la colonizacin del intestino delgado y produccin de una enterotoxina que es la responsable
de los cuadros diarreicos.

Observacin de Staphylococcus sp

Segn Brock (2004), bacteria gram positiva no esporulada con un bajo contenido de GC
(guanina y citosina). Anaerobios facultativos y producen cido de la glucosa tanto en
aerobiosis como anaerobiosis. Son catalasa positivo, lo que permite diferenciarlos de las
especies del gnero Streptococcus y otros gneros de cocos Gram positivos, que son
relativamente tolerantes de medios con baja actividad de agua, resistiendo bastante bien
hbitats secos y salinos. A menudo son pigmentados, lo que da una herramienta adicional
para su identificacin. Los estafilococos son parsitos comunes de los humanos y animales y
ocasionalmente causan infecciones serias: se reconocen dos especies importantes en relacin
con los humanos, Staphylococcus epidermis, no patgeno y apigmentado que normalmente se
encuentran en la piel y las mucosas y Staphylococcus aureus, de color amarillo y normalmente
asociado con patologas como fornculos, neumona, osteomilitis, meningitis y artritis. Poseen
tendencia a agruparse en racimos, tienen una forma esfrica y un dimetro alrededor de 1 u.
Se observ en la prctica que presentan forma de cocos (redondos) y se agrupan en racimos,
tal como se seala.

Observacin de Bacillus sp

Segn Zamudio (1998), el gnero Bacillus

consta de bacilos grandes grampositivos,
esporgenos con endospora generalmente central de forma cilndrica o helicoidal; son
aerobios estrictos o facultativos, catalasa positiva. Estn ampliamente distribuidos en la
naturaleza: suelos, vegetacin, agua y aire. nicamente nueve especies se han relacionado a
procesos infecciosos en el humano.
Brock (2004) seala que las especies del gnero Bacillus presentan un bajo contenido de GC
(guanina y citosina), crecen bien en medios definidos utilizando una plyade de fuentes de
carbono.
Muchos producen enzimas extracelulares, como hidrolasas, que rompen
polisacridos complejos, cidos nucleicos o cidos grasos hasta unidades asimilables por las
clulas; estos productos sirven como fuentes de carbono y donadores de electrones. Muchos
producen antibiticos como son la bacitracina, poliximina, tirocidina, gramicidina y circulina.
Las especies del gnero Bacillus son bastones con extremidades rectas o redondeadas de
tamaos variables (0.5 * 1.2 um hasta 2.5*10 um), generalmente mviles gracias a sus cilios
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peritricos, lo cual se comprueba al observarse en la prctica que su forma era alargada y la

agrupacin en la que se distribuan era en forma de cadena.

VII.

CONCLUSIONES
-

A travs del microscopio se pudo observar con ayuda del colorante las diversas
agrupaciones: E. coli (no definida), estreptobacilos (lineal) y estafilococo (en
racimos), adems se puede observar los diversos tamaos de las bacterias.
Para lograr una tincin exitosa para bacterias pequeas, es importante la
velocidad de reaccin del colorante en trminos de investigacin.
La tincin simple que se realiz ayudo a incrementar el contraste, debido a que
las bacterias absorbieron el colorante y quedarn teidas del mismo color.

VIII. CUESTIONARIO
1. Cules son las asociaciones ms frecuentes en bacterias?
Al observarse al microscopio, las bacterias de una especie dada pueden encontrarse
como clulas separadas (individuales) o formando agrupamientos caractersticos.
Segn las especies, las clulas pueden estar en parejas, en grupos irregulares, en
cadenas o filamentos, en paquetes regulares de cuatro, ocho o ms clulas o en
forma de empalizada, un cierto nmero de clulas alargadas dispuestas
adyacentemente en hilera lateral. Estas diferentes disposiciones de las clulas no
resultan de la agregacin de clulas previamente individuales; se forman debido a
que las clulas de las diferentes especies se dividen (reproducen) de modos
diferentes, y a que dos o ms clulas pueden permanecer unidas tras el proceso de
divisin celular. (Paul Singleton ,1999)
Las clulas de muchos procariotas se mantienen juntas despus de la divisin celular
formando grupos, y estas asociaciones frecuentes son caractersticas de diferentes
organismos. Los cocos que despus de la divisin permanecen unidos en pares se
denominan diplococos y los que permanecen unidos en forma de cadena se
denominan estreptococos. Los cocos que se dividen en dos planos y permanecen
unidos en grupos de cuatro se conocen con el nombre de ttradas, los que se
dividen en tres planos y permanecen unidos en grupos de configuracin cbica se
llaman sarcinas y los que se dividen en planos mltiples y forman grupos similares a
racimos de uva o lminas amplias se denominan estafilococos.
Los bacilos se dividen exclusivamente a travs de sus ejes menores, de manera que
la cantidad de grupos de bacilos es menor que la de cocos. La mayora de bacilos se
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observan como bastones aislados. Los diplobacilos permanecen unidos en pares

despus de la divisin, mientras que los estreptobacilos forman cadenas. Otros
bacilos son ovalados y se parecen mucho a los cocos, por lo que recibieron el nombre
de cocobacilos.

2. En qu rango de tamaos se definen las bacterias?

Las clulas bacterianas se miden habitualmente en micrmetros, m (antes llamados
micras, ); 1 m = 0,001 mm. Las bacterias ms pequeas miden en torno a 0,2 m
(por ej., las clulas de Chlamydia); en el otro extremo de la escala, algunas clulas de
Spirochaeta son de unos 250 m de longitud, pero la mayor bacteria (600 m) es
Epulopiscium fishelsoni, que habita en el intestino de pez cirujano (Acanthurus
nigrofuscus) [Angert, Claments y Pace (1993) Nature 362 239 - 241].
Sin embargo, estos son casos extremos; en la mayora de las especies las mximas
dimensiones de una clula se encuentran en el rango de 1 a 10 m. Ntese que las
bacterias ms pequeas estn en el mismo orden de tamao que el lmite de resolucin
de un buen microscopio ptico, en torno a 0,2 m. (Paul Singleton ,1999)

3. Cules son las formas bacterianas ms frecuentes?

Las clulas bacterianas varan ampliamente en forma, de acuerdo con las especies. Las
clulas redondas o <esfricas>, de cualquier especie son llamadas cocos. Las clulas
alargadas de cualquier especie se denominan bacilos. Los cocos no necesariamente
tienen una forma esfrica perfecta, y no todos los bacilos tienen exactamente la misma
forma. Por ejemplo, algunos cocos tienen una forma ms o menos arrionada y algunos
bacilos son afilados por los extremos (bacilos fusiformes) o son curvados (vibrios). Las
clulas ovoides de forma intermedia entre cocos y bacilos, se llaman cocobacilos. Hay
tambin dos tipos de clulas espirales unas que son ms o menos rgidas (espirilos), y
otros que son ms flexibles (espiroquetas).
Existen las llamadas bacterias
cuadradas(bacterias cuadradas y planas) y bacterias tipo caja (bacterias angulares
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de formas variadas). Finalmente estn los actinomicetos la mayora de cuyas especies

crecen como filamentos finos parecidos a hongos llamados hifas; un agrupamiento o
masa de hifas se denominan micelio. (Paul Singleton, 1999)
4. Qu diferencia a una tincin directa de una tincin negativa?
En la tincin directa el microorganismo o tejido se tie por inmersin en el colorante
mientras que en una tincin negativa el microorganismo permanece sin teir y destaca
de una coloracin de fondo. Para ello se utilizan los colorantes cidos como la negrosina.
(Baker ,1970)
La tincin directa simple permite observar la forma, el tamao y los agrupamientos de
las bacterias usando un nico colorante (normalmente bsico), pues estos
microorganismos absorben el colorante. Mientras que en la tincin negativa, uso de
colorantes neutros o cidos, la clula bacteriana no absorbe el colorante quedando
incolora y transparente, slo se tie el fondo. Y debido a que no necesitan del calor, las
morfologas de las clulas no son alteradas. (Covadonga ,2010)

5. Qu importancia le atribuyen a las diferencias en reactividad de los

colorantes empleados?
A parte de diferenciar y hacer visibles los constituyentes de una clula, la tincin ayuda
a identificar los microorganismos y a situarlos en su propio grupo particular, en virtud de
su comportamiento frente a determinados colorantes.
El motivo en virtud del cual tienen lugar las reacciones de tincin no est actualmente
esclarecido, pero parece que se trata de una combinacin de reacciones fsicas y
qumicas.
Recurdese la electrolisis en que al electrodo cargados positivamente o nodo atrae a
los aniones cargados negativamente y el electrodo cargado negativamente o ctodo
atrae a los cationes cargados positivamente. Como las clulas bacterianas son ricas en
cidos nucledos que poseen carga negativa, es natural que los colorantes bsicos
depositen su material colorante en el catin positivo, de esa suerte el organismo que lo
atrae se colorear. Los colorantes cidos, sin embargo en los cuales la materia colorante
est en el anin con carga negativa no tien las bacterias y se usan principalmente para
la tincin de fondo o para coloracin de contraste. (Baker ,1970)
6. Cul es la funcin del aceite de inmersin?
La funcin del aceite de inmersin es restringir el movimiento de la muestra, adems de
evitar el rozamiento entre el cubre objetos y el objetivo, generalmente se lo utiliza
cuando vamos a observar con el objetivo 100x. Otra funcin del aceite de inmersin es
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evitar que la luz se desve; al contrario lo que se pretende es que la luz llegue
concentrada hacia la muestra.
Cuando se utilizan objetivos de aceite de inmersin, una gota de aceite como ocurre a
menudo, entre la lente y el frotis. (Paul Singleton ,1999)
7. Cul es la funcin del lente objetivo de inmersin?
En bacteriologa frecuentemente existe la necesidad de utilizar un elevado nmero de
aumentos (por ej., 1000 X), para lo cual el microscopio debe poseer un objetivo de
aceite de inmersin (aumento alrededor de 100 X) y un ocular apropiado (alrededor de
10 X).
El mximo aumento til que se puede conseguir con un objetivo determinado es 1000
veces su apertura numrica (NA).(Paul Singleton ,1999)
El objetivo es la lente de mayor importancia de un microscopio, pues de sus propiedades
depende que se consiga o se frustre la imagen final. Las principales funciones del lente
objetivo son: (Salle, 1957)
a) Reunir los rayos luminosos de cualquier punto del objeto.
b) Concentrar la luz en un punto de la imagen.
c) Ampliar la imagen.

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