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Manual de Practicas

Aislamiento de bacterias aerobias

Prctica # 4
AISLAMIENTO DE BACTERIAS AEROBIAS
INTRODUCCION
La poblacin microbiana existente en nuestro entorno es grande y
compleja. Cientos de especies microbianas habitan normalmente en
distintas partes de nuestro cuerpo, incluidas la boca, el tracto intestinal y
la piel. Al nacer, los microbios inmediatamente empiezan a colonizar
nuestros cuerpos, as como a casi todos los objetos del mundo. Ellos
flotan alrededor hasta que entran en contacto con una superficie que
ofrezca comida y resguardo. Se encuentran ms frecuentemente en la
oscuridad, en objetos hmedos que a menudo entran en contacto con la
comida, la suciedad o la vegetacin. Las superficies del bao, los cepillos
para el cabello, los refrigeradores, los lavaplatos y las tablas de cocina
tienen a menudo muchos microbios. Las manijas y las paredes tienen
menos porque son pobres en nutrientes y secos.
Los microorganismos se cultivan en el laboratorio sobre materiales
nutritivos denominados medios. Se dispone de una gran cantidad de
medios y la clase que se debe de utilizar depende de muchos factores,
uno de los cuales es la clase de microorganismos que se va a cultivar. El
material que se inocula sobre el medio se denomina inculo mediante
alguna tcnica (siembra por estra en placa o siembra en masa en placa).
Durante la incubacin a 37:C , las clulas microbianas individuales se
reproducen tan rpidamente que en un lapso de 18 a 24 horas producen
masas visibles de clulas denominadas colonias. Una colonia es visible a
simple vista. Cada colonia diferente es presumiblemente un cultivo puro
de una sola clase de microorganismo. Si dos clulas microbianas
procedentes del inculo original quedan muy cerca una de otra sobre el
medio de Agar, la masa de clulas observables no ser un cultivo puro.
Despus de la incubacin en un medio slido, se desarrollan
colonias macroscpicas de bacterias que proceden de una sola bacteria o
de una agrupacin de bacterias, estas ltimas tambin llamadas
unidades formadoras de colonias. Cuando se tienen colonias
perfectamente separadas, cada una de stas pueden aislarse o
resembrarse para obtener un cultivo con un solo tipo de colonias que
tendr bacterias de la misma especie, al que se llama cultivo puro o
axnico. Para verificar que se trata de un cultivo puro es necesario que
en las resiembras
subsecuentes de la colonias tengan la misma
morfologa colonial y microscpica.
Existen mtodos para el aislamiento de bacterias en medios de
cultivo slidos. Un mtodo cualitativo es la tcnica de estra cruzada
(Fig. 1) y un mtodo cuantitativo es la tcnica de las diluciones (Fig. 2).

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Fig. 1.- Tcnica de estra cruzada.

VOLUMEN DE
TRANSFERENCIA

Diluyen
te
Alcu
ota

Medio de cultivo
solido

Fig.2 Tcnica de las diluciones

Fig. 3 Tcnica correcta de esterilizar el asa


Tcnica de enfriamiento de asa

Fig. 4

Las principales indicaciones para un correcto aislamiento son:


- Las asas deben esterilizarse antes de utilizarlas y enfriarse sobre el
agar o el material de vidrio (en zonas estriles) antes de tomar la
muestra de microorganismos, con objeto de no destruirlos por calor.
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- Despus de utilizarlas, las asas se vuleven a esterilizar.


- Las bocas de los tubos y matraces de vidrio se flamean ligeramente una
vez destapadas, y despus de la inoculacin.
- Durante la inoculacin, los tapones se mantienen en la mano
sujetndolos por la parte que no entra en contacto con tubos y matraces.
- Los tubos abiertos deben mantenerse en posicin inclinada para que el
riesgo de contaminacin sea mnimo.
- Las tapas de las placas Petri no deben colocarse nunca sobre la mesa
de trabajo.

OBJETIVO:
-

Aprender y practicar la tcnica de aislamiento de la estra cruzada


y el mtodo de las diluciones.
Observar la gran variedad de microorganismos presentes en el
medio ambiente, determinando las diferentes morfologas de
colonias que se obtienen.

MATERIAL:
Tubos de ensaye 16 x 150

Agua destilada estril

Pipetas de 1 y 10 ml

Cajas petri

Matraz Erlenmeyer

Etanol

Muestras de suelo

Agar cuenta estndar

Mechero de Fisher
METODO:
I.- Aislamiento de bacterias por el mtodo de diluciones.
1.- Marcar 10 tubos de 16 X 150 estriles.
2.- Adicionar 4.5 ml de agua destilada estril en condiciones de
esterilidad.
3.- Pesar 0.5 g de la muestra de suelo y adicionar al tubo 1. Homogenizar
y dejar sedimentar la muestra.
4.- Realizar una serie de diluciones decimales hasta la dilucin 10 -10 (tubo
10) usando 0.5 ml como volumen de transferencia. Lo ideal es utilizar
una pipeta estril para cada transferencia y agitar con un vortex en cada
paso. Con muestras que contienen microorganismos patgenos o
sustancias txicas nos es recomendable usar las pipetas con la boca, en
cambio debe usarse una propipeta o bulbo.
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5.- Colocar 0.1 ml de las diluciones: 10 -10, 10-9,10-8,10-7 y 10-6 en la


superficie de una placa de gelosa simple o agar cuenta estndar.
Tambin colocar 0.1 ml de las mismas diluciones en agar cuenta
estndar, extender las muestras en la superficie con una varilla de vidrio
acodada estril. La varilla se esteriliza mojndola en alcohol, escurriendo
el exceso y pasndola por la flama del mechero. Al extinguirse el fuego la
varilla estar estril.
6.- Envolver las cajas con la tapa hacia abajo, marcar el paquete e
incubar a 28C durante 24-48 hrs.
II.- Aislamiento de bacterias por la tcnica de la estra cruzada
1.- Esterilizar el asa (fig.3), y enfriar en un extremo del agar. (Fig. 4)
2.- A partir del tubo con la dilucin 10 -1, tomar una asada y sembrarla en
el medio de Cuenta estndar por estra cruzada. (Fig. 1).
3.- Marcar las cajas e incubarlas a 28C durante 48-72 hrs.
NOTA: EL REPORTE E INFORME DE ESTA PRCTICA Y LA
SIGUIENTE SE ENTREGARAN JUNTAS ! !

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