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PRCTICA VI.

IDENTIFICACIN BIOQUMICA DE MICROORGANISMOS

Objetivos

Utilizar medios de cultivo diferenciales para identificar microorganismos


Identificar microorganismos por medio de sus propiedades bioqumicas

Introduccin
Cuando se analiza una muestra, adems de conocer el nmero de microorganismos que la
componen, tambin es importante identificarlas. Uno de las formas para identificar las
bacterias, es por medio de sus caractersticas bioqumicas, que son puestas a prueba en
medios de cultivo diferenciales, donde se evalan entre otras caractersticas: la presencia de
determinadas enzimas, capacidades fermentativas, degradacin de compuestos, etc.
Materiales
Autoclave
Incubadora
Asas microbiolgicas
Mechero de gas
Portaobjetos
Perxido de hidrogeno
Tubos con cultivos problema
Tubos con caldo triptona
Tubos con caldo MRVP

Tubos con agar citrato de


Simmons
Tubos con agar TSI
Tubos con caldo urea
Reactivo de Kovacs
Rojo de Metilo
Reactivo A y B de VogesProskauer

Procedimiento
Identificacin presuntiva por medio de cultivos diferenciales

A cada estudiante se le entregara un muestra problema con una determinada


bacteria, a la cual se le realizara las siguientes pruebas, con el fin de obtener su
identificacin:
o Pruebas IMVIC
Indol: tome dos tubos con caldo triptona, a uno de ellos
inoclelo con ayuda de un asa redonda, el segundo tubo servir
de control. Incube los tubos a 35C durante 48 horas. Luego de
este periodo, agregue 5 gotas del reactivo de Kovacs. Anote los
cambios. La aparicin de un anillo rojo-prpura es indicio de una
prueba indol positiva.
Rojo de metilo: tome dos tubos con caldo MRVP, a uno de ellos
inoclelo con ayuda de un asa redonda, el segundo tubo servir

de control. Incube los tubos a 35C durante 48 horas. Luego de


este periodo, agregue 5 gotas de rojo de metilo. No lo agite.
Anote los cambios. Un cambio a color rojo es indicio de una
prueba positiva.
Prueba de Voges Proskauer: tome dos tubos con caldo MRVP,
a uno de ellos inoclelo con ayuda de un asa redonda, el segundo
tubo servir de control. Incube los tubos a 35C durante 48 horas.
Luego de este periodo, agregue 0,6ml del Reactivo A de VogesProskauer (alfa-naftol 5% en etlico absoluto) y 0,2ml del
Reactivo B de Voges-Proskauer (KOH 40%). Agite fuertemente.
La aparicin de un color rosado-violceo es indicio de una
prueba positiva.
Prueba de citrato: tome dos tubos con agar citrato de simmons.
En uno de ellos, realice una inoculacin con una estra simple en
la superficie del medio. El segundo tubo servir de control.
Incube los tubos a 35C durante 48 horas. Un viraje de color
hacia el azul es indicio de una prueba positiva.

o Pruebas TSI (Triple Sugar Iron)


Tome 2 tubos de agar TSI. En uno de ellos haga una inoculacin
por puncin (hasta unos 3-5mm del fondo) con un asa de punta
(figura 4). Extraiga el asa y realice una estra simple en la
superficie del medio. Incube los tubos a 35C durante 48 horas.
Determine el resultado de la prueba con ayuda de la figura 1.
o Prueba de la ureasa
Tome 2 tubos de caldo urea. A uno de ellos inoclelo con ayuda
de un asa redonda, el segundo tubo servir de control. Incube los
tubos a 35C durante 48 horas. Un viraje de color a rosadoviolceo es indicio de una prueba positiva.

Figura 1. Posibles resultados obtenidos con la prueba TSI

o Prueba Catalasa
De unos de los tubos de agar solido (Citrato de Simmons o TSI)
tome una colonia o un pedazo de ella con ayuda del asa redonda
y colquela sobre un portaobjetos. Agregue sobre ella una gota
de perxido de hidrgeno (H2O2) y observe. La aparicin de
efervescencia es indicio de una prueba positiva.

ANEXO 1.

Agar Citrato de Simmons


Composicin en gramos por litro
Citrato de sodio
2.0
Cloruro de sodio
5.0
Fosfato dipotsico
1.0
Fosfato monoamnico
1.0
Sulfato de magnesio
0.2
Azul de bromotimol
0.08
Agar
15.0
pH final: 6.9 0.2

Agua Triptona
Composicin en gramos por litro
Triptona
10.0
Cloruro de sodio
5.0
pH final: 7.5 0.2

Caldo RMVP
Composicin en gramos por litro
Pluripeptona
7.0
Glucosa
5.0
Fosfato dipotsico
5.0
pH final: 6.9 0.2

Agar TSI
Composicin en gramos por litro
Extracto de carne
3.0
Pluripeptona
20.0
Cloruro de sodio
5.0
Lactosa
10.0
Sacarosa
10.0
Glucosa
1.0
Sulfato de hierro y amonio
0.2
Tiosulfato de sodio
0.2
Rojo de fenol
0.025
Agar
13.0
pH final: 7.3 0.2

Caldo Urea
Composicin en gramos por litro
Urea
20.0
Extracto de levadura
0.10
Fosfato potsico
0.09
Fosfato disdico
0.095
Rojo fenol
0.01
pH final: 6.8 0.2