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CUIB

FACULTAD DE MEDICINA

ESTUDIO DE CANALES PERMEABLES A CALCIO


DE MEMBRANAS INTRACELULARES
DE CLULAS VEGETALES
Tesis para obtener el grado de

Doctor en Ciencias Fisiolgicas

Presenta:

M.C. Vadim Prez Koldenkova

Asesor:

Dr. Igor Pottosin

Colima, Col. Junio de 2007

ndice

ndice ............................................................................................................................................... i
Abreviaturas ................................................................................................................................. iii
1. Introduccin ............................................................................................................................... 1
1.1 Generalidades ......................................................................................................................... 1
1.1.1 Concentraciones y transporte de Ca2+ en las plantas....................................................... 2
1.1.2 Depsitos intracelulares de Ca2+ en plantas.La vacuola ltica y el retculo
endoplsmico................................................................................................................... 3
1.1.3 Transporte de Ca2+ en las vacuolas y el retculo endoplsmico....................................... 5
1.1.4 Transduccin de seales por calcio en clulas vegetales................................................. 8
1.2 Antecedentes ........................................................................................................................ 13
1.2.1 Canales vacuolares, permeables a Ca2+. ........................................................................ 13
1.2.2 SVel nico canal vacuolar permeable a Ca2+ establecido firmemente. ..................... 15
1.2.3 Canales permeables a Ca2+ del retculo endoplsmico .................................................. 28
2. Objetivos del proyecto............................................................................................................. 32
2.1 Hiptesis............................................................................................................................... 32
2.2 Objetivos .............................................................................................................................. 32
3. Metodologa.............................................................................................................................. 34
3.1 Preparaciones ....................................................................................................................... 34
3.1.1 Objeto de estudio. .......................................................................................................... 34
3.1.2 Obtencin de vacuolas. Soluciones de trabajo............................................................... 34
3.1.3 Obtencin de fraccin microsomal enriquecida de RE ................................................. 36
3.1.4 Obtencin de liposomas gigantes. Tcnica de deshidratacin-rehidratacin. ............... 36
3.2 Registros electrofisiolgicos ................................................................................................ 37
Patch Clamp............................................................................................................................ 37
3.2.1 Generalidades................................................................................................................. 37
3.2.2 Fabricacin de micropipetas .......................................................................................... 38
3.2.3 Registros de actividad de canales en las configuraciones attached, vacuola-completa,
parche aislado. .............................................................................................................. 38
3.2.4 Medicin del potencial a travs de la membrana vacuolar............................................ 38
3.2.5 Protocolos de voltaje para el estudio del canal vacuolar SV. Obtencin de relacin
corriente-voltaje del canal unitario................................................................................ 40
i

3.2.6 Determinacin de la probabilidad de apertura............................................................... 40


3.2.7 Calibracin del efecto de Ca2+ vacuolar sobre el canal SV. .......................................... 41
3.2.8 Estimacin del nivel de calcio vacuolar libre, utilizando la curva de calibracin......... 41
3.2.9 Protocolos de voltaje para el estudio de canales permeables a Ca2+ del retculo
endoplsmico................................................................................................................. 43
Microelectrodos ionoselectivos .............................................................................................. 43
3.2.10 Mediciones de la actividad de cationes vacuolares con la tcnica tradicional de
electrodos ionoselectivos............................................................................................... 43
3.2.11 Tcnica MIFE (Microelectrode Ion Flux Estimation)................................................. 44
4. Concentraciones libres de los principales cationes fisiolgicos vacuolares y sus efectos
sobre el canal SV. .................................................................................................................... 47
4.1 Introduccin. ........................................................................................................................ 47
4.2 Resultados. ........................................................................................................................... 47
4.2.1 Osmolaridad y valor del pH del jugo vacuolar. ............................................................. 47
4.2.2 Registros en configuracin attached. ............................................................................. 49
4.2.3 Concentraciones vacuolares fisiolgicas de K+, Na+, Ca2+ y Mg2+. .............................. 51
4.2.4 Efecto del pH vacuolar sobre el umbral de activacin del canal SV. ............................ 53
4.2.5 Efecto del Na+ vacuolar sobre la curva de activacin del canal SV en condiciones de pH
fisiolgico...................................................................................................................... 56
4.2.6 Efecto conjunto de los cationes fisiolgicos ms importantes H+, Na+, Mg2+, Ca2+
que modulan la cintica de activacin del canal SV. .................................................... 60
4.2.7 Evaluacin de la actividad del canal SV en condiciones inicas fisiolgicas. .............. 62
4.3 Discusin.............................................................................................................................. 69
5. Estudios de canales permeables a Ca2+ del RE. .................................................................... 75
5.1 Introduccin. ........................................................................................................................ 75
5.2 Resultados. ........................................................................................................................... 75
5.2.1 Selectividad.................................................................................................................... 77
5.2.2 Modulacin por voltaje.................................................................................................. 77
5.3 Discusin.............................................................................................................................. 77
6. Conclusiones............................................................................................................................. 82
Agradecimientos .......................................................................................................................... 84
Bibliografa................................................................................................................................... 85
Appndice ................................................................................................................................... 102

ii

Abreviaturas

ABA cido abscsico (fitohormona),


cADPR adenosin-fosfato-ribosa cclico,
CAX (cation exchangers), en este trabajo intercambiadores Ca2+/H+,
IP3 inositol-3,4,5-trisfosfato,
LCIC liberacin de calcio inducida por calcio,
MIFE (microelectrode ion flux estimation) tcnica de estimacin de flujo inico con
microelectrodos,
RE retculo endoplsmico,
SV (slow vacuolar channel) canal vacuolar lento,
TPC (two pore channel) canal de doble poro,
V1% potencial de apertura de 1% del total de canales abiertos registrados.

iii

1. Introduccin

1.1 Generalidades
A diferencia de otros seres vivos, las plantas no tienen la capacidad de escoger el entorno
en el que ocurre su crecimiento y desarrollo. Por esta razn, los organismos vegetales requieren
de mecanismos especficos, destinados a asegurar el funcionamiento normal de sus clulas en el
rango de condiciones que se puedan presentar en su medio ambiente. Entre los factores con
mayor variabilidad para las plantas se encuentra el suministro mineral procedente del suelo. En
base a las concentraciones de nutrientes disponibles en el suelo y las necesidades de las plantas,
stos pueden encontrarse en deficiencia o en exceso, obligando a las plantas a poner en
funcionamiento los mecanismos correspondientes para el mantenimiento de la homeostasis inica
celular. El mecanismo que tiene la mayor distribucin en el reino vegetal es el almacenamiento o
acumulacin, utilizado por las plantas tanto para la prevencin de deficiencias, como para la
eliminacin de excesos de nutrientes en el citoplasma y el aislamiento de metabolitos y
substancias txicas.
El calcio es uno de los elementos esenciales para la vida, que, sin embargo, se encuentra en su
mayor parte almacenado en organelas especiales o en el exterior de la clula el apoplasto, y se
encuentra en mnimas y rigurosamente mantenidas concentraciones (alrededor de 100-200 nM en
condiciones de reposo) en el citoplasma. Su alto grado de compartimentacin es una necesidad
para evitar su precipitacin en el citoplasma con el fosfato inorgnico (Sanders y col., 1999), y la
competencia por los sitios de unin con el Mg2+ citoslico (Marschner, 1995). La gran diferencia
de concentraciones entre el citoplasma, por una parte, y el apoplasto y los compartimentos
intracelulares, por la otra, probablemente son la razn del uso de las seales de Ca2+ como
vnculo entre los estmulos extracelulares y las respuestas intracelulares1. Actualmente, esta ruta
de sealizacin se encuentra en tal grado de desarrollo que permite con tan solo un evento la
elevacin del calcio citoplsmico generar respuestas opuestas, como, por ejemplo, el cierre o
1

Maathuis F. Ligand-gated ion channels. En: Blatt M.R. (Ed.) Membrane transport in plants. Blackwell Publishing,
CRC Press, 2004, p. 199.
1

la apertura de las clulas de guarda en respuesta a la aplicacin de las hormonas reguladoras


ABA (cido abscsico) o IAA (cido indolilactico).
En las plantas la elevacin del Ca2+ citoslico en numerosos casos es el resultado del influjo a
travs de la membrana plasmtica. Sin embargo, muchos procesos fisiolgicos requieren la
participacin de depsitos intracelulares de calcio. Su presencia permite localizar la seal de Ca2+
y su tiempo de vida (patrn espacio-tiempo), y, por otra parte, amplificar y prolongar la seal
inicial de calcio, as como disear su forma (patrn amplitud-frecuencia) de manera especfica
para cada estmulo (Allen y col., 2001). Por esto, el estudio de los canales inicos permeables a
calcio los componentes primarios que permiten la entrada y la elevacin del nivel de Ca2+ en
el citoplasma es una de las principales tareas para el entendimiento del funcionamiento de la
maquinaria llamada sealizacin por calcio.

1.1.1 Concentraciones y transporte de Ca2+ en las plantas.


En las plantas que crecen en condiciones adecuadas de calcio en su medio habitual, el
contenido promedio de calcio en los tallos es de 0.1-5% de su masa seca (Marschner, 1995) o, en
trminos de concentraciones 0.3-16.5 mM (White y col., 1992; de Silva y col., 1998). Estos
valores reflejan tanto la disponibilidad del calcio en el suelo, como las diferentes necesidades de
las plantas en este mineral. La deficiencia por calcio raramente se presenta en la naturaleza pero
ocurre con ms frecuencia en la horticultura y se debe principalmente a la indisponibilidad
momentnea del mineral para los tejidos en desarrollo, causada por la imposibilidad de su
redistribucin de los tejidos ms maduros va la floema (White y Broadley, 2003). Por su relacin
al calcio, las plantas son agrupadas en calcfugas (calcifuges, de suelos cidos pobres en calcio) y
calccolas (calcicoles, habitantes de suelos calcreos). Aunque es la tolerancia a Al, Mn y Fe lo
que principalmente determina la flora de los suelos cidos, y la insensibilidad a la deficiencia de
P y Fe lo que determina la flora en suelos calcreos (Lee, 1999), las calcfugas generalmente
crecen bien en bajas concentraciones de calcio en la rizsfera y no presentan amplia respuesta al
incremento de calcio. Al contraste, se considera que los mecanismos que le permiten a las
calccolas mantener en su hbitat natural un bajo nivel de Ca2+ en el citoplasma, no les permiten
crecer en condiciones de bajo suplemento de ste, induciendo deficiencia por calcio (Lee, 1999).
Probablemente, calcio, al igual que otros iones, penetra por las puntas de las races, de donde
se mueve por el apoplasto hacia los vasos de la xilema (Ferguson y Clarkson, 1976; Clarkson,

1993; White, 2001), en los cuales principalmente ocurre su movimiento, siguiendo el flujo de
agua causado por la transpiracin (Epstein y Bloom, 2005). Por otra parte, en las races de cebolla
(Allium cepa) existen evidencias de que el transporte de calcio a la xilema puede ocurrir a travs
del simplasto (Cholewa y Peterson, 2004). Se considera que en esta ruta los iones de calcio entran
al simplasto a travs de canales permeables a calcio de la membrana plasmtica, siendo
bombeados despus a los tejidos de conduccin por las Ca2+-ATPasas y los intercambiadores
H+/Ca2+ (White y Broadley, 2003) los transportadores de Ca2+ ms importantes de las clulas
vegetales.

1.1.2 Depsitos intracelulares de Ca2+ en plantas.


La vacuola ltica y el retculo endoplsmico.
La capacidad de secuestrar el calcio citoplsmico en las clulas vegetales ha sido probada
para la vacuola, el retculo endoplsmico, las mitocondrias y los cloroplastos (Bush, 1995). No
obstante, son escazos los estudios sobre las concentraciones de calcio libre presentes en estos
compartimentos, y generalizados sus resultados, a pesar de que las mediciones de calcio total
demuestran claramente una distribucin no uniforme de ste a nivel de rganos, tejidos e incluso
a nivel celular, en dependencia de la disponibilidad de Ca2+ en el suelo y las caractersticas
funcionales de los tejidos (Dietz y col., 1992; Fricke y col., 1995; Karley y col., 2000).

En las clulas vegetales la vacuola central o ltica es el mayor depsito (ms del 80% del
volumen de la clula) de calcio intracelular. A pesar de esto, existe solo un reporte ampliamente
conocido de la actividad del Ca2+ en vacuolas de las plantas superiores Riccia fluitans (en
rizoides) y Zea mays (en races) 2.3 y 1.5 mM, respectivamente (Felle, 1988).
Sorprendentemente, estos datos insuficientes han sido puestos en base de la opinin de un alto
nivel de calcio libre, existente en las vacuolas, y son utilizados en modelos de transporte a travs
de la membrana vacuolar, aunque estudios de tan solo calcio total demuestran una localizacin
asimtrica de este catin en las hojas con patrones distintos para diferentes tejidos (Fricke y col.,
1995; aparte Karley y col., 2000). Incluso as, ha sido mostrado que la concentracin de calcio
en los tejidos se encuentra en funcin del calcio presente en el suelo (Dietz y col., 1992) y
depende de la estacin del ao, sufriendo cambios en vacuolas de tejidos dedicadas al
almacenamiento en poca de invierno (Stelzer y col., 1990, 1993) y manipulndose de diferentes
3

formas en hojas deciduas e invernales (en Larix decidua es acumulado en vacuolas del
endodermo y desechado durante el deshoje; en la planta de hojas perenes Picea abies el Ca2+ es
almacenado hasta la primavera en las vacuolas y en el apoplasto del mesfilo; Gierth y col.,
1998; Stelzer y col., 1990).
Se considera, que la mayor parte del Ca2+ vacuolar se encuentra ligado por aniones orgnicos
(oxalato, citrato, isocitrato, malato) formando, en muchos casos, complejos de baja solubilidad
precipitados en forma de cristales (principalmente de oxalato de calcio). Las funciones
primarias de estos complejos son la regulacin de alta capacidad del calcio vacuolar (tanto
almacenamiento de Ca2+, como la precipitacin de sus excedentes en una forma osmtica- y
fisiolgicamente inerte), la defensa contra herbvoros, as como la detoxificacin de Al3+ y
metales pesados (ver Franceschi y Nakata, 2005 para una revisin reciente). En las plantas
conocidas como precipitadoras de oxalato (a las que pertenece el betabel (White y Broadley,
2003) el objeto de estudio del presente trabajo) en los tejidos en crecimiento se encuentran
clulas especializadas idioblastos que precipitan en sus vacuolas en forma de oxalato el
calcio del apoplasto impidiendo as que ste interfiera con el crecimiento de las clulas
inmaduras, que, debido a su pobre vacuolacin, tienen una capacidad reducida para secuestrar el
calcio (Franceschi y Nakata, 2005). Es interesante, que los idioblastos poseen una densa red de
retculo endoplsmico, cuya principal tarea, por lo visto, es el rpido secuestro del calcio entrante
al citoplasma y su transportacin a la vacuola central para su precipitacin (Kostman y col., 2003;
Franceschi y Nakata, 2005). Estos datos pueden revelar las funciones de los dos mayores
depsitos de calcio celulares: el retculo endoplsmico (como secuestrador de Ca2+) y la vacuola
central (como su almacn), en el mantenimiento de la homeostasis de calcio en la clula vegetal,
discutidos ms adelante (ver. p.1.1.3)

El retculo endoplsmico (RE) es el segundo depsito intracelular de calcio ms importante en


las clulas vegetales, despus de la vacuola. La concentracin libre de calcio en el RE fue
igualmente determinada en un solo trabajo y estimada en alrededor de 3 M (en clulas
aleurnicas de cebada; Bush y col., 1989). Por otra parte, la similitud de las funciones del RE en
las clulas eucariotas permite considerar como cercana la actividad de Ca2+ en el RE de las
clulas vegetales a la observada en clulas animales y cuyos valores varan entre 0.1-2 M
(Kendall y col., 1994, 1996) y 100-400 M (Solovyeva y Verkhratsky, 2003). El RE de las
plantas pudiera presentar similar variacin en el nivel de Ca2+ libre lumenal en dependencia de la
4

presencia de calreticulina protena de gran capacidad para secuestrar el calcio con baja
afinidad, la funcin de la cual es mantener un alto nivel de Ca2+ en el lumen del RE (Persson y
col., 2001; Wyatt y col., 2002).

En otros organelos la concentracin libre de calcio en reposo determinada es menor que la


estimada para la vacuola, aunque presenta elevaciones en respuesta a diversos estmulos. La
concentracin de Ca2+ libre en mitocondrias, determinada con la tcnica camalen, en
condiciones de reposo se encuentra alrededor de 200 nM y puede aumentar hasta 800 nM durante
diferentes estreses (Logan y Knight, 2003). En cloroplastos el nivel de Ca2+ en reposo tambin es
relativamente bajo (menos de 150 nM), pero el cambio de exposicin luz-oscuridad genera una
elevacin transitoria del nivel de calcio hasta 5-10 M (Johnson y col., 1995). Igualmente, en el
ncleo la concentracin libre de calcio es menor de 100 nM, pero presenta una breve elevacin
hasta cerca de 500 nM en condiciones de estrs (van der Luit y col., 1999).

1.1.3 Transporte de Ca2+ en las vacuolas y el retculo endoplsmico.


En general, los sistemas intracelulares de aislamiento de Ca2+ realizan cuatro importantes
tareas, necesarias para el funcionamiento normal de las clulas vivas (Sanders y col., 2002):
1. Mantienen el calcio citoplsmico al nivel de reposo y ayudan de esta forma a la extincin
de seales de calcio.
2. Acumulan el Ca2+ en compartimentos tales como el RE y la vacuola para liberarlo de forma
regulada durante el proceso de sealizacin.
3. Suplementan Ca2+ a organelos especficos que requieren un alto nivel de calcio para el
curso normal de sus reacciones bioqumicas. Por ejemplo, estas condiciones son necesarias
para el procesamiento adecuado de las protenas que van a ser secretadas desde el RE
(Rudolph y col., 1989; Gill y col., 1996).
4. Aislando el Ca2+, evitan su precipitacin con el fosfato inorgnico (Pi) en complejos de
baja solubilidad (Sanders y col., 1999).
Las protenas que ejercen el transporte de calcio en las clulas vegetales son los H+/Ca2+intercambiadores (del tipo CAX, por las siglas en ingls CAtion eXchangers) y las bombas de
calcio o Ca2+-ATPasas. Para el transporte de Ca2+ en direccin opuesta a su gradiente, los CAX
utilizan el gradiente de pH a travs de la membrana, generado y mantenido por la actividad de la

pirofosfatasa (PPiasa) y las bombas de protones (H+-ATPasas), mientras que las Ca2+-ATPasas
para este fin utilizan la energa del ATP.
La actividad de los intercambiadores H+/Ca2+ ha sido demostrada en vesculas de tonoplasto
de diferentes especies, por lo que se estima su amplia distribucin en el reino vegetal (Schumaker
y Sze, 1985; Blumwald y Pool, 1986; Blackford y col., 1990; Chanson, 1991; Hirschi y col.,
1996; Ueoka-Nakanishi y col., 1999). La primer isoforma definida de estos transportadores fue la
CAX1, localizada en vacuolas de Arabidopsis thaliana (Hirschi y col., 1996). El CAX1
intercambia H+ vacuolar por Ca2+ citoslico en razn de 3 por 1 y, en comparacin con las Ca2+ATPasas, con poca afinidad al calcio Km 10-13 M caracterstica general de los
intercambiadores Ca2+/H+ (Schumaker y Sze, 1985; Blumwald y Pool, 1986; Hirschi y col., 1996;
Hirschi, 2001); no obstante, en comparacin con las Ca2+-ATPasas, la capacidad de transporte de
estas enzimas es ms alta (Hirschi, 2001) Vmax = 25 nMmin1mg1protena (Ueoka-Nakanishi
y col., 1999). De los miembros de la familia CAX investigados (que incluye 12 isoformas en el
genoma de Arabidopsis (Sanders y col., 2002) de las cuales han sido caracterizadas cuatro), solo
el CAX1 y el CAX2 (con menor afinidad) poseen la capacidad confirmada de transportar Ca2+
(Hirschi y col., 1996). Los otros miembros de esta familia (incluyendo el CAX2), al parecer,
confieren a las plantas tolerancia a otros metales potencialmente txicos (Mn2+, Cd2+, Zn2+)
mediante su aislamiento del citoplasma, y sus capacidades de transporte de Ca2+ se desconocen
(Sanders y col., 2002). Aparte de la vacuola, existen evidencias de la presencia de los CAX en la
membrana citoplasmtica (Kasai y col., 1990).
Al igual que los CAX, las Ca2+-ATPasas aslan el Ca2+ del citoplasma, transportndolo adentro
de organelos-depsitos de Ca2+ o hacia el apoplasto, pero con una mayor afinidad Km 1-10 M
(Evans y Williams, 1998) y menor capacidad de transporte (White y Broadley, 2003) Vmax = 6
nMmin1mg1protena (Ueoka-Nakanishi y col., 1999).
Las Ca2+-ATPasas de las clulas vegetales pertenecen a la superfamilia de las P-ATPasas y
estn representadas por dos familias (Geisler y col., 2000a; Axelsen y Palmgrem, 2001): IIA (4
miembros identificados en el genoma de A. thaliana; nombrados, respectivamente, ECA1-4) y
IIB (reguladas por calmodulina o protein-kinasas dependientes de Ca2+ (CDPKs), 10 miembros
identificados en A. thaliana AtACA1, 2, 4 y 7-13, respectivamente). La localizacin interna de
las Ca2+-ATPasas tipo IIA incluyen el RE y el aparato Golgi (AtECA1, en A. thaliana; Liang y
6

col., 1997), y la membrana plasmtica y el tonoplasto (LeLCA1, en tomate Lycopersicon


esculentum; Ferrol y Bennet, 1996; Navarro-Avino y col., 1999), aunque en Arabidposis no
existen reportes de la presencia de Ca2+-ATPasas de ninguna de las dos familias en la membrana
vacuolar (Maeshima, 2001). Las Ca2+-ATPasas del tipo IIB residen en la membrana plasmtica
(AtACA8; Bonza y col., 2000), en el RE (AtACA2; Liang y col., 1997; Hong y col., 1999) y en
la membrana interna de los plstidos (AtACA1; Huang y col., 1993). Una alta actividad de Ca2+ATPasas en membranas vacuolares fue inicialmente reportada en clulas de raz de maz (Zea
mays; Gavin y col., 1993; Pfeiffer y Hager, 1993; estos dos estudios en el mismo objeto se
distinguen drsticamente en los niveles reportados de actividad de Ca2+-ATPasas asociada con el
RE). La presencia de una bomba de Ca2+ del tipo IIB fue demostrada en vesculas de tonoplasto
de Brassica (Askerlund, 1996; sta fue denominada ms tarde BCA1 por Malstrm y col., 1997).
Aparte, una gran actividad de Ca2+-ATPasas ha sido reportada en vesculas de la misma fraccin
de membranas de diferentes especies de plantas (Sze y col., 2000), aunque el contenido de
protena fue insuficiente para su deteccin como banda en gel de SDS-poliacrilamida. Estudios
ms detallados en Arabidopsis mostraron la presencia de Ca2+-ATPasas (isoforma AtACA4) en
vacuolas pequeas, pero no en la membrana de la vacuola ltica (Geisler y col., 2000b). Por lo
tanto, queda abierta la cuestin estn las Ca2+-ATPasas asociadas con el tonoplasto o con
membranas de la misma fraccin, pero pertenecientes a organelas particulares.
En base a las propiedades de transporte de Ca2+ la capacidad de transporte y la afinidad al
Ca2+ de los CAX y las Ca2+-ATPasas, a estas protenas les fueron asignados diferentes papeles
en el mantenimiento de la homeostasis de Ca2+ en el citoplasma. En condiciones fisiolgicas, la
concentracin de Ca2+ libre en el citosol es de alrededor de 0.1 M, aumentando sta a centenas
de nanomoles e incluso micromoles durante la aplicacin de diversos estmulos (McAinsh y
Hetherington, 1998) y pudiendo, probablemente, alcanzar el valor 10 M en regiones anexas a la
vacuola durante el inicio de la sealizacin (Ueoka-Nakanishi y col., 1999). La gran capacidad de
transporte de Ca2+ de los CAX permite rpidamente disminuir este incremento, sin afectar, por su
baja afinidad al Ca2+ (Km 10-15 M), las enzimas Ca2+-dependientes y Ca2+-activadas del citosol,
el Km de las cuales al Ca2+ se encuentra en el rango micromolar (Ueoka-Nakanishi y col., 1999).
Por otra parte, la poca afinidad al Ca2+ no permite a los CAX lograr un nivel de Ca2+ citoslico
menor de 1 M (Ueoka-Nakanishi y col., 1999). Es estimado que el nivel de Ca2+ citoslico es
regresado a sus valores de reposo (alrededor de 0.1 M) por las Ca2+-ATPasas que poseen una
7

mayor afinidad (Km 1-10 M) al Ca2+ (Ueoka-Nakanishi y col., 1999). En otras palabras
despus de la elevacin del Ca2+ citoslico, los CAX cumplen la funcin de la rpida
disminucin de ste a niveles en los cuales el Ca2+ es menos txico y las Ca2+-ATPasas se
encargan de la subsecuente disminucin de la concentracin de Ca2+ citoslico y de su
manutencin en un rango estrecho en condiciones de reposo.
Esta hiptesis es sostenida por las observaciones hechas en Saccharomyces cerevisiae
utilizadas como modelo de procesos de transporte en plantas, en las cuales los intercambiadores
H+/Ca2+, pero no las Ca2+-ATPasas, participan en la eliminacin de las seales de calcio despus
de la aplicacin de un choque hipertnico (Denis y Cyert, 2002). No, obstante, el mutante de
Arabidopsis det3 que posee una baja actividad de H+-ATPasa vacuolar y, probablemente, de
intercambio H+/Ca2+, presenta una relativamente alta concentracin de Ca2+ citoplsmico (Allen y
col., 2000) y las plantas tratadas con bafilomicina inhibidor de H+-ATPasas tipo V
presentan una mayor elevacin de Ca2+ citoslico en respuesta a choques hiperosmticos
(Takahashi y col., 1997).

1.1.4 Transduccin de seales por calcio en clulas vegetales


Los efectos de calcio pueden ser agrupados en 3 tipos, que describen su papel fisiolgico en
las clulas vegetales (Plieth, 2005): 1) Ca2+ como protector (un gran nmero de evidencias
demuestra una disminucin del efecto de estreses inico o toxicidad mineral en presencia de una
alta concentracin de Ca2+ en el apoplasma; ver Plieth, 2005 para ms detalles y referencias); 2)
Ca2+ como switch (interruptor) qumico (activador de canales y protenas dependientes y/o
reguladas por calcio); 3) Ca2+ como acarreador de la informacin codificada sobre los estmulos
que causan su liberacin.
La elevacin de la concentracin de calcio libre citoslico [Ca2+]cit es causada por numerosos
factores fisiolgicos y externos (Tabla 1), y es considerada un elemento clave para la generacin
de la respuesta fisiolgica adecuada (White y Broadley, 2003). Sanders y col. (1999) propusieron
su aparicin en el proceso evolutivo en base de la necesidad del mantenimiento de un nivel muy
bajo de [Ca2+]cit, en el fondo del cual las seales de calcio podran conferir sensibilidad y
velocidad a las respuestas originadas por estmulos de diferente naturaleza. Actualmente se
considera, que, para evocar la respuesta adecuada, la alteracin del [Ca2+]cit (Ca2+-signature
firma de Ca2+) generada por cada estmulo es nica. sta exclusividad se manifiesta en su
8

TABLA 1. Ejemplo de procesos de desarrollo y respuestas a estmulos biticos y abiticos,


iniciados por la perturbacin en [Ca2+]cit (White y Broadley, 2003).
Evento de desarrollo o
respuesta a estmulo externo
Elongacin de tubos
polinarios

Perturbacin de [Ca2+]cit
Oscilaciones de alta [Ca2+]cit
apical

Onda de [Ca2+]cit en el tallo


Respuesta de
autoincompatibilidad del
tubo polinario

Liberador de Ca2+
al citosol

Referencias selectas

Apoplasto e
interno

Malh y Trewavas, 1996; Holdaway-Clarke y


col, 1997; Malh y col., 1998, 2000; Messerli
y col., 2000; Rudd y Franklin-Tong, 2001

Apoplasto e
interno (IP3
dependiente)

Rudd y Franklin-Tong., 2001; Straatman y


col., 2001; Franklin-Tong y col., 2002

Polarizacin celular
despus de fertilizacin

Onda de [Ca2+]cit desde el sitio de Apoplasto


penetracin del espermo, causa la
elevacin de [Ca2+]cit sostenida

Antoine y col., 2001

Divisin celular

Elevacin de [Ca2+]cit

Bush, 1995
2+

Bush, 1995; Anil y Sankara Rao, 2001

Germinacin de semillas Elevacin lenta de [Ca ]cit


(giberelinas)

Levine y col., 1996

Apoptosis

Elevacin lenta y sostenida de


[Ca2+]cit

Luz roja

Elevacin de [Ca2+]cit

Apoplasto

Shacklock y col., 1992; Malh y col., 1998

Luz azul

Picos cortos de elevacin de


[Ca2+]cit (segundos)

Apoplasto

Malh y col., 1998; Baum y col., 1999

Ritmos circadianos

Oscilaciones circadianas de
[Ca2+]cit

Cierre de clulas de
guarda (ABA,
esfingosina-1-fosfato)

1. Elevacin de [Ca2+]cit en la
periferia celular
2. Elevacin de [Ca2+]cit alrededor
de la vacuola
3. Oscilaciones de [Ca2+]cit

1. Apoplasto
2.Vacuola
3. Apoplasto e
interno

McAinsh y col., 1992; Allen y col.,


1999,2000; Blatt, 2000a,b; White, 2000; Anil
y Sankara Rao, 2001; Evans y col., 2001; Ng y
col., 2001a,b; Schroeder y col., 2001; Klsener
y col., 2002

CO2

Elevacin de [Ca2+]cit en clulas


de guarda

Apoplasto

Webb y col., 1996

Apoplasto

McAinsh y col., 1995; Allen y col., 1999,


2000

2+
Incremento de Ca2+ en el Oscilaciones de [Ca ]cit en
clulas de guarda
apoplasto

Johnson y col., 1995; Wood y col., 2001

Respuestas a auxinas

1. Elevacin lenta y prolongada


de [Ca2+]cit
2. Oscilaciones de [Ca2+]cit

Felle, 1988; Malh y col., 1998; Ng y col.,


2001b; Plieth, 2001; Plieth y Trewavas, 2002

Elevacin de K+ en el
xilema

Elevacin de [Ca2+]cit

De Boer, 1999

Exocitosis

Elevacin de [Ca2+]cit

Battey y col., 1999; Camacho y Malh, 2003


2+

Elongacin de clulas de Elevacin sostenida de [Ca ]cit


raz

Apoplasto

Cramer y Jones, 1996; Demidchik y col., 2002

Elongacin de pelos
radiculares

Elevacin sostenida de [Ca2+]cit


en el pex

Apoplasto

Wymer y col., 1997; White, 1998; Bibikova y


col., 1999

Inhibicin de la ciclsis
citoplsmica

Elevacin de [Ca2+]cit

Ayling y Clarkson, 1996

Nodulacin

Elevacin inicial de [Ca2+]cit, con Apoplasto


subsecuentes oscilaciones

Crdenas y col., 2000; Wais y col., 2000;


Walker y col., 2000; Lhuissier y col., 2001;
Shaw y Long, 2003

Senescencia

Elevacin sostenida de [Ca2+]cit

Huang y col., 1997

Radiacin UV

Elevacin lenta de [Ca2+]cit,


elevacin de [Ca2+]cit sostenida
por minutos

Apoplasto

Frohnmeyer y col., 1999

Estrs trmico

Elevacin de [Ca2+]cit sostenida


por 15-30 minutos

Apoplasto e
interno (IP3-

Gong y col., 1998; Malh y col., 1998

dependiente)

Estrs de fro

1. Picos unitarios de [Ca2+]cit


2. Oscilaciones de [Ca2+]cit

1. Apoplasto

Knight y col., 1991; Malh y col., 1998;


White, 1998; Plieth y col., 1999; van der Luit,
1999; Allen y col., 2000; Kiegle y col., 2000;
Knight, 2000; Cessna y Low, 2001; Plieth,
2001

Enfriamiento gradual

Bifsica
1. Picos cortos de elevacin de
[Ca2+]cit (segundos)
2. Elevacin lenta de [Ca2+]cit

1. Apoplasto
2. Apoplasto e
interno (IP3-

Knight y col., 1996; Plieth y col., 1999;


Knight, 2000; Knight y Knight, 2000; Moore y
col., 2002

dependiente)

Estrs oxidativo
(paraquat, superxidos,
H2O2, ozono)

1. Picos cortos de elevacin de


[Ca2+]cit
2. Elevacin sostenidade [Ca2+]cit
3. Oscilaciones de [Ca2+]cit

1. Apoplasto
2.Apoplasto e
interno (IP3dependiente)

Price y col., 1994; Levine y col., 1996;


McAinsh y col., 1996; Knight y col., 1998;
Malh y col., 1998; Clayton y col., 1999;
Allen y col, 2000; Kawano y Muto, 2000;
Knight, 2000; Klsener y col., 2002;
Lecourieux y col., 2002

Anoxia

Bifsica
1. Picos cortos (duracin
minutos)
2. Elevacin sostenida de [Ca2+]cit
(horas)

1. Apoplasto
2. Interno,
incluyendo
mitocondrias

Subbaiah y col., 1994, 1998; Sedbrook y col.,


1996; Malh y col., 1998; Plieth, 2001

Sequa / Estrs
hiperosmtico
(mannitol)

Bifsica
Apoplasto y
1. Picos cortos (duracin de
vacuola
minutos)
2+
2. Elevacin sostenida de [Ca ]cit
(horas)

Knight y col., 1997; Malh y col., 1998;


Kiegle y col., 2000, Cessna y col., 2001; Pauly
y col., 2001; Plieth, 2001

Estrs salino (NaCl)

Bifsica
Apoplasto y
Ondas de elevacin de [Ca2+]cit en vacuola (IP3tejidos
dependiente)
1. Picos cortos (de minutos de
duracin)
2. Elevacin sostenida de [Ca2+]cit
(horas)
3. Disminucin de [Ca2+]cit (das)

Knight y col., 1997; Kiegle y col., 2000;


Knight, 2000; DeWald y col., 2001; Pauly y
col., 2001; Moore y col., 2002; Halperine y
col., 2003

Estrs hipoosmtico

Bifsica
1. Pequea elevacin de [Ca2+]cit
2. Gran elevacin de [Ca2+]cit

1. Apoplasto
2. Apoplasto e
interno

Takahashi y col., 1997; Malh y col., 1998;


Knight y col., 2000; Cessna y Low, 2001;
Cessna y col., 2001; Pauly y col., 2001; Plieth,
2001

Estimulacin mecnica
(movimiento, roce,
viento)

Picos unitarios de [Ca2+]cit


(segundos)
Onda de elevacin de [Ca2+]cit en
tejidos

Interno

Knight y col., 1991, 1992; Haley y col., 1995;


Legu y col., 1997; Malh y col., 1998; van
der Luit, 1999; Plieth, 2001
Fasano y col., 2002

Estrs de Al

elevacin de [Ca2+]cit

Zhang y Rengel, 1999

Patgenos (elicitors)

Bifsica
1. Picos lentos de elevacin de
[Ca2+]cit (duracin de minutos)
2. Elevacin sostenida de

Knight y col., 1991; Malh y col., 1998;


Mithfer y col., 1999; Blume y col., 2000;
Fellbrich y col., 2000; Grant y col., 2000;
Cessna y Low, 2001; Cessna y col., 2001;
Rudd y Franklin-Tong, 2001; Klsener y col.,
2002; Lecourieux y col., 2002

[Ca2+]cit (horas)
3. Oscilaciones de [Ca2+]cit (la
magnitud relativa de las
diferentes fases dependen del
patgeno)

1. Apoplasto
2. Apoplasto e
interno (IP3dependiente)

10

localizacin subcelular y/o en su cintica o magnitud de la alteracin de [Ca2+]cit (Mcainsh y


Hetherington, 1998; Trewavas, 1999; Rudd y Franklin-Tong, 2001). Para la coordinacin de la
respuesta celular, son producidas ondas de [Ca2+]cit que involucran sucesivamente canales
dependientes de Ca2+. Varios mecanismos han sido propuestos para la generacin de estas ondas
(ver White y Broadley, 2003 para ms detalles y referencias): la generacin por la elevacin de
[Ca2+]cit de segundos mensajeros (IP3, cADPR) que a su vez activan canales de Ca2+ distantes; la
activacin de canales de Ca2+ mecanosensibles (por la penetracin del espermo durante la
fecundacin); influjo repetitivo a travs de la membrana plasmtica (en la respuesta de
autoincopatibilidad durante el crecimiento del tubo polinario); la activacin sucesiva de canales
de la membrana plasmtica activados por hiperpolarizacin y canales activados por ligandos en el
tonoplasto (en clulas de guarda tratadas con ABA).
Sin embargo, la elevacin de [Ca2+]cit no puede ser prolongada, ya que de otra forma causara
la muerte de la clula (la elevacin sostenida del Ca2+ citoslico se encuentra implicada en la
apoptosis, tanto durante el desarrollo normal, como en respuestas de hipersensibilidad; White y
Broadley, 2003) y, por lo tanto, debe ser transitoria o de pequea amplitud. Entre los patrones
que caracterizan la distribucin temporal de la alteracin de [Ca2+]cit se destacan los siguientes
(ver Tabla 1.): 1. evento transitorio elevacin de [Ca2+]cit inmediata y transitoria, con la
restauracin del nivel de Ca2+ de reposo en minutos (causada por estmulos mecnicos no dainos
y choque de fro cold shock); 2. respuesta bifsica elevacin inmediata y transitoria de
[Ca2+]cit seguida por una elevacin de [Ca2+]cit ms prolongada (minutos-horas; inducida por
choque trmico, estrs salino agudo, estrs hiperosmtico, anoxia, estrs oxidativo; aplicacin
prolongada de temperaturas menores a las umbrales; patgenos y elicitors); 3. oscilaciones
con variaciones en su duracin, periodicidad y amplitud, as como en su forma, en dependencia
de la intensidad y la combinacin de estmulos especficos; los modelos propuestos para su
generacin incluyen (i) el vaciado y rellenado sucesivo de depsitos de Ca2+ agotables, (ii) la
activacin / desactivacin sucesiva de canales de Ca2+ mediante cascadas de sealizacin
concurrentes, (iii) la distensin y relajacin de la membrana (White y Broadley, 2003). En cuanto
al origen espacial del Ca2+ este puede provenir tanto del exterior de la clula el apoplasto,
como de depsitos internos. En la Fig. 1 se representan el origen y la localizacin de seales de
calcio en respuesta a algunos estmulos especficos.

11

ABA,
Seales polarizantes endgenas,
Choque osmtico,
Fro,
Sequa

Polarizacin,
Choque hipoosmtico

RE

Vacuola

0.1-200 mM Ca

Fro,
Sequa

1-3 mM Ca2+

2+

o
Cloroplast a

2+

2+

las
C
Citop

0.1-10 mM C

m
0.1-10

Luz / Oscuridad

Fig.1 Representacin esquemtica de las seales conocidas que inician la liberacin


de calcio en la clula vegetaln (fuente: Sanders y col., 2002, modificado).
Las flechas sealan a los compartimirnetos celulares, donde es notada la liberacin de Ca2+, originada
por los estreses mencionados.

1.2 Antecedentes

1.2.1 Canales vacuolares, permeables a Ca2+.


Actualmente existe un gran nmero de reportes de canales vacuolares permeables a Ca2+,
tanto dependientes de voltaje, como activados por ligandos. A continuacin son mencionados
algunos de ellos y sus caractersticas.
SV (Slow Vacuolar channels; Hedrich y col., 1986) es el canal permeable a calcio ms comn
de la membrana vacuolar, y, probablemente, como es discutido ms adelante es el nico canal
permeable a Ca2+ firmemente establecido en el tonoplasto. Este canal posee una severa
rectificacin saliente y modulacin por Ca2+ por ambos lados de la membrana vacuolar, y es
regulado por numerosos factores. Una descripcin ms detallada del canal SV es realizada en el
p.1.2.2.1.
VVCa (Vacuolar Voltage-gated Ca2+ channels; Johannes y col., 1992; Allen y Sanders, 1994b,
Johannes y Sanders, 1995) fueron reportados en vacuolas de la raz napiforme de Beta y en
clulas de guarda de Vicia faba y caracterizados como rectificadores-entrantes activos a
potenciales fisiolgicos y activados por Ca2+ vacuolar. La ausencia de corrientes generadas por
este canal en parches en la configuracin vacuola-completa (anlogo de whole-cell) y la
comparacin cuantitativa de la conductancia, selectividad y de los valores absolutos de la
modulacin por calcio y por voltaje, les permiti a Pottosin y Schnknecht (2007) concluir que
en los experimentos reportados se trataba del canal SV, registrado en parches invertidos (con una
orientacin opuesta a la asumida por los investigadores). Aparte, otra corriente de Ca2+ de
rectificadores-entrantes distinta a la del VVCa fue reportada en vacuolas de betabel (Gelli y
Blumwald, 1993), aunque, segn Pottosin y Muiz (2002), la existencia de canales permeables a
Ca2+, permanentemente abiertos a potenciales fisiolgicos es poco probable, ya que mediaran
una rpida liberacin de Ca2+ al citoplasma, que causara la muerte de la clula.
Canales permeables a Ca2+, activados por ligandos (IP3, cADPR) pudieran encontrarse en la
membrana vacuolar. Varios estudios sostienen esta suposicin:
13

Estudios en clulas completas: (i) tanto IP3, como cADPR causan el cierre de la estoma en las
clulas de guarda (Blatt y col., 1990; Leckie y col., 1998); (ii) el tratamiento con ABA induce,
por una parte el aumento del nivel de cADPR (Wu y col., 1998), por otra una onda de
Ca2+ en el citosol, que inicia la liberacin de calcio de depsitos intracelulares, inhibida por
rianodina (Grabov y Blatt, 1999); (iii) el bloqueo de la fosfolipasa C (PLC, enzima-productora
de IP3) elimina los efectos de ABA oscilaciones de [Ca2+]cit y el cierre de las clulas de
guarda (Staxen y col., 1999); (iv) choques hiperosmticos (NaCl, en raz de Arabidopsis)
producen IP3 y la simultnea movilizacin del Ca2+ intracelular (DeWald y col., 2001).
Estudios en preparaciones de membranas: (i) IP3 causa la liberacin de Ca2+ en vesculas de
membrana vacuolar (de avena Avena Shumaker y col., 1987; y Beta Allen y col., 1995).
Un estudio ms detallado (Muir y Sanders, 1997) en coliflor (Brassica) mostr la asociacin
de este efecto del IP3 principalmente con la fraccin de membrana plasmtica, y en menor
grado con la fraccin enriquecida de RE y la de membranas vacuolares; (ii) cADPR induce
la liberacin de Ca2+ en vesculas de RE (pero no en membranas plasmticas) de Brassica
(Navazio y col., 2001); (iii) al igual que IP3, cADPR induce la liberacin de Ca2+ en vesculas
de membrana vacuolar de Beta (Allen y col., 1995).
Aparte, se ha reportado la participacin de ligandos en la mediacin de respuestas a diversos
estmulos: IP3 media la respuesta a los estreses salino e hiperosmtico (Drobak y Watkins, 2000;
DeWald y col., 2001) y gravitropismo (Perera y col., 1999) y cADPR participa en la activacin
de genes de defensa (Durner y col., 1998) y en la transduccin de la seal generada por ABA
(Wu y col., 1997; McAinsh y Htherington, 1998). No obstante, a pesar de estos encuentros, los
canales-responsables de la liberacin de Ca2+ todava no han sido caracterizados.
Alexandre y col. (1990) reportaron la existencia de canales activados especficamente por IP3
en vacuolas de raz de betabel. Este fue el nico trabajo en clulas vegetales, en el que fueron
registrados canales unitarios activados por ligandos, no obstante, estos registros no pudieron ser
reproducidos posteriormente en varios trabajos (Chasan y Schroeder, 1992; Gelli y Blumwald,
1993). Allen y Sanders (1994a, 1995) mostraron la generacin de corrientes a travs de la
membrana vacuolar de Beta con la aplicacin de IP3 y cADPR. No obstante, en ambos casos la
corriente registrada constituy una pequea fraccin sobre la corriente de fuga no especfica y
probablemente es un artefacto causado por el intercambio de solucin. Adems, a diferencia de
los canales activados por ligandos de clulas animales, las corrientes generadas por IP3 y cADPR
14

en estos trabajos fueron independientes del nivel de Ca2+ citoslico hasta concentraciones
milimolares, en contraste con el reporte de Leckie y col (1998) de un Km de ~100 nM para la
inhibicin por Ca2+ citoslico de corrientes vacuolares originadas por cADPR en clulas de
guarda. No obstante, este valor de Km para calcio coincide con el Km de inhibicin del canal
vacuolar rpido (Fast Vacuolar channel FV), las corrientes del cual no fueron eliminadas en
este estudio. Otra de las evidencias en contra de los estudios realizados para la determinacin de
canales activados por ligandos en clulas vegetales es la alta concentracin de rojo de rutenio
100 M con la que fue inhibida la corriente inducida por cADPR (la concentracin utilizada
es 100 veces mayor a la empleada para el bloqueo del receptor de ryanodina en las clulas
animales).
De esta manera, de todos los canales permeables a Ca2+ reportados, la existencia y la
permeabilidad a Ca2+ hasta el momento solamente han sido establecidas para el canal SV uno
de los objetos de estudio del presente trabajo.

1.2.2 SVel nico canal vacuolar permeable a Ca2+ establecido firmemente.


Los primeros estudios de los mecanismos de transporte a travs de la membrana vacuolar
fueron realizados utilizando como objetos experimentales hojas enteras de plantas y grandes
cantidades de vacuolas por lo que estos experimentos no permitan distinguir la aportacin de
transportadores individuales como canales inicos o bombas (Hedrich y col. 1986). Con el fin de
detallar estos mecanismos, en 1986 Hedrich y col. aplicaron la tcnica de patch-clamp a vacuolas
individuales aisladas del mesfilo de cebada en una configuracin analga a la whole-cell
conocida como whole-vacuole. Entre otros resultados, este trabajo revel la presencia en el
tonoplasto de un canal rectificador entrante ( del lado vacuolar) no selectivo que
posteriormente (Hedrich y Neher, 1987), debido a su lenta cintica de activacin, recibi el
nombre de canal vacuolar lento (SV del ingls slow vacuolar) y fue el primer canal de la
membrana vacuolar caracterizado.
La relativamente alta expresin del canal SV en la membrana vacuolar, as como la
modulacin de su actividad tanto por el calcio citoslico como vacuolar, hizo de este canal un
blanco muy atractivo para numerosos estudios de selectividad, permeabilidad, bloqueo-activacin
y, recientemente de participacin en la sealizacin por Ca2+; todos stos realizados en objetos

15

y condiciones inicas muy diferentes que dificultan enormemente el anlisis comparativo de los
datos obtenidos.
La adopcin de la convencin sobre mediciones electrofisiolgicas en endomembranas (Bertl
y col, 1992) sirvi como primer paso para la estandarizacin de la tcnica de obtencin de
registros, particularmente, de las corrientes vacuolares. Por esta convencin, el potencial Vm a
travs de las endomembranas es registrado respecto al potencial del citoplasma y calculado para
la vacuola como Vm = Vcytosol Vvacuola. En este caso, las corrientes positivas o salientes
representan el flujo de cationes fuera del citosol (entrantes a la vacuola). Siguiendo esta
convencin, el canal SV actualmente es caracterizado como canal-rectificador saliente.

1.2.2.1 Localizacin y Estructura del Canal SV


Localizacin
Originalmente, la presencia del canal SV fue reportada en vacuolas de raz de betabel (Beta
vulgaris; Coyaud y col., 1987; Hedrich y Neher, 1987). En estudios posteriores fue demostrado
que el canal SV est ampliamente distribuido en reino vegetal y se encuentra presente en
diferentes tejidos de las plantas (Tabla.2). Canales de la misma familia, aparte, se encuentran
presentes en animales (Ishibashi y col., 2000 ver Peiter y col., 2005).
TABLA 2. Especies de plantas en las que ha sido mostrada la presencia del canal SV (fuente:
elaboracin propia).
Especie
Musgos y heptica
Posidonia oceanica
Allium cepa
Eichhornia crassipes
Triticum aestivum
Hordeum sp.
Oriza sativa
Chenopodium rubrum
Plantago sp.
Vicia faba
Beta vulgaris
Daucus carota
Lycopersicon sp.
Raphanus sativus
Arabidopsis thaliana

Referencia
Trebacz y Schnknecht., 2000
Carpaneto y col., 1997
Amodeo y col., 1994
Paganetto y col., 2001
Wherret y col., 2005
Bethke y Jones, 1994; Pottosin y col., 1997
Furuichi y col., 2001; Hashimoto y col., 2004; Kurusu
y col., 2004
Reifarth y col., 1994
Maathuis y Prins, 1990
Schulz-Lessdorf y Hedrich, 1995
Hedrich y Neher, 1987; Pottosin y col., 2004; 2005
Scholz-Starke y col., 2004
Pantoja y col., 1989
Gambale y col., 1993; Carpaneto, 2003
Colombo y col., 1994; Peiter y col., 2005

16

En las plantas antofitas, el canal SV ha sido registrado ordinariamente en la membrana vacuolar


de distintos tejidos (Tabla 3.). No obstante, en trabajos recientes en arroz (Oriza sativa) se ha
apuntado que el TPC1 (TPC two-pore channel, que, segn Peiter y cols (2005) corresponde al
TABLA 3. Localizacin del canal SV en tejidos de plantas superiores (fuente: elaboracin propia).
Tejido o tipo de clula
Hojas
Raz
Mesfilo
Clulas de guarda
Clulas aleurnicas
Clulas cultivadas

Referencia
Hedrich y col., 1986
Gambale y col., 1993; Pottosin y Schnknecht, 2007
Pottosin y col., 1997
Ward y Schroeder, 1994; Schulz-Lessdorf y Hedrich,
1995
Bethke y Jones., 1994
Colombo y col., 1988; Weiser y col., 1990

canal SV de la membrana vacuolar, se localiza en la membrana plasmtica celular (Furuichi y


col., 2001; Hashimoto y col., 2004; Kurusu y col., 2004) aunque no se presentan claras
evidencias de ello y, probablemente, esta conclusin es errnea.
En las vacuolas la expresin del canal SV es relativamente alta, alcanzando valores de varios
miles de copias por vacuola (Schulz-Lessdorf y Hedrich, 1995; Pottosin y col., 1997) que pueden
mediar una corriente de 100-1000 pApF-1.
Estructura
La estructura del canal SV fue revelada recientemente por Peiter y col. (2005) en
experimentos con plantas modificadas de Arabidopsis thaliana. Segn este trabajo, el canal SV
pertenece a la familia de canales de doble poro TPC ampliamente presentada en mono-,
dicotiledneas, gimnospermas, musgos, as como en animales (ver. Peiter y col., 2005). La
estructura del canal SV (TPC1, producto de la expresin del gen tpc1) comprende dos unidades
similares al canal Shaker, con 6 dominios transmembranales cada una y un sitio de unin en el
lado citoslico con dos motivos EF-hand (Fig.2) y varios sitios de fosforilacin. Interesante, que
la estructura presentada potencialmente explica la sensibilidad del canal SV al Ca2+ citoslico
(por la presencia de los motivos EF-hand) pero no incluye motivo conocido que explicara la
afinidad del SV al Ca2+ vacuolar.
Dobrovinskaya y colaboradores (1999b) en un estudio con bloqueadores permeables del canal
SV determinaron algunas de las caractersticas fsicas del poro del canal SV. ste, en su parte
ms angosta, tiene un dimetro mayor al del catin cuaternario permeable tetrametilamonio
(TMA+) de aproximadamente 5.5 , pero es menor que el catin impermeable tetraetilamonio
(TEA+) de aprox. 8 (Fig. 2). Adems, utilizando las propiedades estructurales de poliaminas
17

Vacuola
+

1 2 34 5
+

6
EF

7 8 9 10 11

12

EF

Citosol

vacuola

20

citosol

Fig.2 Estructura del canal TPC1, correspondiente al SV, y representacin esquemtica


(fuente: A. Peiter y col., 2005; B. elaboracin propia).
A. Es considerado que el canal TPC1, la estructura del cual fue revelada recientemente, corresponde al canal
SV. El gen TPC1 codifica una protena que presenta una estructura similar a dos unidades de Shaker
fusionadas, con dos estructuras EF-hand en el lado citoslico, residuos bsicos en el cuarto dominio de
cada unidad (+) que, probablemente, constituyen el sensor de voltaje, y dominios formadores de poro entre
los quintos y sextos dominios transmembranales. B. Representacin esquemtica de la estructura del canal
SV, mostrando caractersticas fsicas del poro del canal, obtenidas en experiementos con bloqueadores
permeables (Dobrovinskaya y cols., 1999b).

(bloqueadores permeables del canal SV; especficamente espermina (Spm4+), espermidina


(Spd3+) y putrescina (Put2+) y apoyndose en los registros con TMA+ y Tris+, en este estudio fue
determinada la asimetra de la localizacin de la mayor barrera elctrica (probablemente el
filtro de selectividad) dentro del tonoplasto a una distancia de 30% de el lado vacuolar (en
trminos de distancia elctrica). Utilizando la espermidina y putrescina (por su rigidez y cargas
uniformemente distribuidas a lo largo de las molculas que las permitieron utilizar como reglas)
fue calculado el largo fsico del poro del canal que constituye alrededor de 20 (Fig. 2). La
aproximacin del poro a un cilindro de 8 de dimetro y 20 de largo resulta (en condiciones
de 0.1 M K+ simtrico) en una conductancia mxima calculada de 206 pS, que concuerda bien
con el valor experimental de 208 8 pS registrado (Dobrovinskaya y col., 1999).

1.2.2.2 Caractersticas del canal SV


Selectividad y Permeabilidad
Originalmente, el canal SV fue caracterizado como canal selectivo para cationes
monovalentes permeable al K+ y al Na+ (Coyaud y col., 1987; Colombo y col., 1988; Pantoja y
col., 1989; Maathuis y Prins, 1990; 1991), que, adems, pudiera presentar una notable
permeabilidad a aniones (Hedrich y col., 1986; Coyaud y col., 1987; Hedrich y Kurkdjian, 1988).
Sin embargo, sta ltima propuesta, deducida del anlisis de los potenciales de inversin en
gradientes de KCl, no fue sostenida por experimentos con sustitucin de Cl por aniones
impermeables (Colombo y col., 1988; Lado y col., 1989; Amodeo y col., 1994; Allen y col.,
1996) y experimentos donde se estableca un potencial de inversin para Cl diferente del
potencial de inversin para los otros iones (Ward y col., 1995). Finalmente, Pottosin y col. (2001)
mostraron que la permeabilidad a Cl del canal SV no sobrepasa el 1% de su permeabilidad al K+.
En trabajos posteriores fue mostrada la permeabilidad del SV para Ca2+, Ba2+ (Pantoja y col.,
1992; Ward y Schroeder, 1994; Schulz-Lessdorf y Hedrich, 1995) y Mg2+ (Pottosin et al., 2001).
Los diferentes valores de la permeabilidad relativa PCa : PK, obtenidos en estos trabajos, le
permitieron a Allen y col. (1996) sugerir que el canal SV posee un poro multiinico, para el cual
es caracterstico la dependencia anmala de fracciones molares (anomalous mole-fraction
dependence) el valor de la permeabilidad relativa disminuye con el aumento de la relacin de
concentraciones [K+] / [Ca2+]. La permeabilidad absoluta para los cationes divalentes es en un
orden de magnitud menor a la misma para los cationes monovalentes (Ward y Schroeder, 1994) y

19

los cationes divalentes en su moviemiento a travs del poro se comportan como bloqueadores
permeables (Pottosin y col., 2004).
Las filas de selectividad determinadas para los canales SV de diferentes especies de plantas,
son mostradas en la Tabla 4.
TABLA 4. Selectividad y permeabilidad del canal SV (fuente: elaboracin propia).
Especie
Allium cepa
Beta vulgaris, Vicia faba

Fila
+

Referencias
+

Selectividad: Na > K > Rb > Cs


2+

2+

Selectividad: Ba > Ca > Mg

2+

Amodeo y col., 1994


Pottosin y col., 2001; 2000

Dauca carota

Permeabilidad relativa :
K+ NH +4 > Rb+ > Cs+ >> TMA+ TEA+
Conductancia :
K+ > Rb+ > Cs+ > NH +4 >> TMA+ TEA+

Scholz-Starke y col., 2004

a. Determinado por los potenciales de inversin.

Conductancia
En diferentes objetos la conductancia del canal SV vara entre 26 y 280 pS en condiciones
de 100 mM KCl simtrico y potenciales entre 20 y 80 mV, con actividad media del canal
(Schulz-Lessdorf y Hedrich, 1995). La mayor conductancia en estas condiciones la presentan los
canales SV de las clulas de guarda 280 pS (Vicia faba, Schulz-Lessdorf y Hedrich, 1995) y
210 pS (Allium cepa, Amodeo y col., 1994). La conductancia mas baja corresponde al canal SV
de vacuolas de reserva de aleurona 26 pS (Bethke y Jones, 1994). La conductancia del canal
unitario SV depende principalmente de la concentracin de K+, con los parmetros de Km ~ 100
mM y Gmax ~ 280 pS determinados para vacuolas de betabel (Gambale y col., 1996; Pottosin et
al., 2001).
El incremento de la concentracin libre de cationes divalentes en el lado vacuolar afecta la
conductancia del canal SV. En presencia de 100 mM KCl y pH 7.5 simtricos y 2 mM Ca2+ del
lado citoplsmico, el aumento de calcio o magnesio vacuolar libre de nanomoles a 10 mM causa
la reduccin dependiente de voltaje de la corriente del canal unitario, siendo esta reduccin
mayor a potenciales ms negativos (Pottosin y col., 2004): a 200 mV la corriente relativa del
canal unitario para condiciones de 10 mM de Ca2+ o Mg2+ vacuolar, respectivamente, constituye
solamente el 21 y 28% de la corriente en control, mientras que a potenciales positivos (+200 mV)
no hay diferencia en las corrientes del control y con la aplicacin vacuolar de uno de los cationes
divalentes; a 0 mV (potenciales fisiolgicos) la corriente relativa representa el 35 o 50% (Ca2+,
Mg2+, respectivamente) de la corriente en el control. Los potenciales negativos (citoslicos)

20

favorecen la aproximacin de Ca2+ y Mg2+ al sitio de unin dentro del poro. A la vez, estos
ltimos impiden el flujo libre de cationes monovalentes.
Bloqueadores
En la Tabla 5. se muestran algunos de los bloqueadores del canal SV, con las respectivas
caractersticas del bloqueo. Interesantemente, el canal SV es bloqueado por concentraciones
submicromolares de rojo de rutenio agente qumico empleado como bloqueador del receptor
de ryanodina (RR) e inhibidor de la liberacin de calcio inducida por calcio en clulas animales,
lo que pudiera sugerir cierta similitud de los papeles que juegan el RR y el SV en los respectivos
organismos.
TABLA 5. Bloqueadores y caractersticas del bloqueo del canal SV (fuente: elaboracin
propia).
Bloqueadores
Caractersticas del bloqueo
Referencias
Fisiolgicos
Ca , Mg2+ vacuolar y
citoslico
2+

Poliaminas citoslicas
Zn2+
No fisiolgicos
DIDS, SITS
A-9-C
Charibdotoxina
Tubocurarina
Quinacrina

Rojo de rutenio
TEA+
Tris+
Neomicina

Dependiente de voltaje, Kd ~ 1-3 mM (Beta)


Pottosin y col., 2000
Ca2+ citoslico causa la rectificacin saliente de la corriente
Dependiente de voltaje, Spm4+ > Spd3+ > Put2+ Kd: 30; 400;
Dobrovinskaya y col., 1999a, b
2,500 M (Beta)
Kd = 5 M

Hedrich y Kurkdjian, 1988

Kd = 1 M

Hedrich y Kurkdjian, 1988

Kd = 25 M
Kd = 20 nM
Kd = 60 M

Weiser y col., 1990, 1991a, 1993

Kd = 15 M
<0.1 M causa: 1) cierre prolongado del canal (independiente
de voltaje, irreversible), 2) bloqueo vibratorio flickering
Pottosin y col., 1999
en el estado abierto del canal (dependiente de voltaje e
irreversible). 3-5 M suprimen casi completamente la
actividad del canal SV
Kd = 1.2 mM (0 mV)
Kd = 60 mM (0 mV)

Dobrovinskaya y col., 1999b

citosol: voltaje- y concentracin-dependiente Kh0 = 78 M;


Scholz-Starke y col., 2006
lumen: efecto ms modesto

Moduladores
Hasta hoy en da no se conocen exactamente todos los reguladores de la actividad del canal
SV, as como los sitios de unin a travs de los cuales es realizada esta regulacin del canal.
Varios estudios han mostrado un repertorio muy amplio de agentes-moduladores del canal SV
(Tabla 6.), aunque en todos los casos no es posible asegurar si los efectos notados sobre la
21

TABLA 6. Factores moduladores de la actividad del canal SV (fuente: elaboracin propia).


Factor

Voltaje

Modulacin

Referencias

Pottosin y col., 2004


El SV es activado por voltaje positivo. Los potenciales de punto medio Carpaneto y col, 1997
se encuentran en funcin del Ca2+ y Mg2+ citoslicos y del Ca2+ vacuolar. (determinacin de dependencia
de voltaje en ausencia de cationes
El SV es modulado por el potencial de superficie. El apantallamiento
divalentes)

inespecfico del potencial de superficie por el cambio de 10 a 100 mM


K+ reduce por 81 mV el desplazamiento total del umbral tcnico V1%,
causado por el cambio de 0 a 0.5 mM Ca2+vac.

Pottosin y col., 2005


2+

El alto Ca citoslico es necesario para la activacin del canal (Kd ~100


M a +100mV; Beta, Hordeum, Vicia). El aumento de la concentracin
Cationes divalentes de Ca2+ vacuolar disminuye la probabilidad de apertura del canal.
Aplicado en el lado citoslico, el Mg2+ refuerza el efecto del Ca2+
Ca2+, Mg2+
citoslico (sensibilizacin del SV al Ca2+). En presencia en el lado
vacuolar, el Mg2+ tiene un efecto ms modesto.

Pottosin y col., 2000; Pottosin y


col., 1997; Pei y col., 1999.

Pottosin y col., 2000; Pottosin y


col., 1997; Pei y col., 2001

Calmodulina

No tiene efecto sobre la corriente del canal unitario, pero aumenta la


probabilidad de apertura del canal SV. Inhibidores de calmodulina (W-7, Schulz-Lessdorf y Hedrich, 1995;
Allen y Sanders., 1995; Bethke y
TFP, R 24571) disminuyen la probabilidad de apertura del canal. Este
Jones, 1994; Weiser y col., 1991b
efecto es reversible con la agregacin de calmodulina de plantas

pH

Regulacin negativa por protones en los lados citoslico y vacuolar,


Schulz-Lessdorf y Hedrich, 1995
pK=6.9 y 5.0 (Beta).
2+
Regulacin insignificante por pH vacuolar en presencia de Ca vacuolar
> 50 M (Hordeum)
Pottosin y col., 1997
En Dauca carota, el canal SV presenta la mayor conductancia en
condiciones de pH citoslico neutro (pH 7.0), disminuyendo con la
acidificacin o alcalinizacin del medio. El pH ptimo se encuentra en
dependencia de la presencia de agentes oxidantes-reductores (es
recorrido a valores ms bsicos con el aumento de la concentracin de
Scholz-Starke y col., 2004
agentes reductores)
Los agentes reductores DTT, GSH (1 mM; pH neutro), cido ascrbico

Agentes oxidantesincrementan la probabilidad de apertura del canal SV.


reductores
Cloramina-T (agente oxidante) causa la inhibicin irreversible del canal.

Scholz-Starke y col., 2004; 2005;


Carpaneto y col., 1999
Allen y Sanders, 1995

Fosforilacin

Activacin por la fosfatasa calcineurina (0.4 unidades/ml). El aumento


de la concentracin de calcineurina causa la disminucin de las
corrientes registradas.
Se proponen dos sitios de fosforilacin del canal SV, con distintos
efectos: +, sensible al cido okadaico inhibidor de fosfatasas, y , Bethke y Jones, 1997
sensible a H-7 inhibidor de kinasas

Protenas 14-3-3

La 14-3-3B (100 nM) reduce la corriente acarreada por el SV en un 80%


Van den Wijngaard y col., 2001
(1/2 = 5s). La dependencia de voltaje no es afectada.

Metales pesados

Ni2+ citoslico (Km = 99 M, Eichornia crassipes; Km = 25 M, Beta


Paganetto y col., 2001;
vulgaris) disminuye la corriente del canal SV y afecta moderadamente la Carpaneto, 2003;
2+
corriente del canal unitario, unindose a un sitio diferente al del Ca .

Al3+

1.4 M Al3+ vacuolar causa la reduccin en un orden de magnitud la


probabilidad de apertura por desplazamiento de la dependencia de
voltaje.

Wherret y col., 2005

Neomicina

neomicina en el citosol causa los siguientes efectos: a) (10-200 M)


aumenta el tiempo de activacin (modestamente) y desactivacin (>100
Scholz-Starke y col., 2006
veces) del canal, b) >10 M causa el desplazamiento de la dependencia
de voltaje a potenciales ms negativos, sin afectar la carga de compuerta.

Na+
(especficamente)

Aumento de Na+ vacuolar causa el desplazamiento de la dependencia de


Ivashikina y Hedrich., 2005
voltaje a potenciales ms positivos (en el cambio de 150 mM K+ a 150
mM Na+, 0 Ca2+, el desplazamiento total es por ~80 mV).

22

actividad del canal son el resultado de la accin directa sobre l, o sobre protenas-reguladoras
adicionales, cooexpresadas junto con en el canal SV en la membrana vacuolar.
La regulacin del canal SV es efectuada por los lados tanto vacuolar como citoslico y puede
consistir igualmente en la disminucin de la probabilidad de apertura del canal, como en su
aumento (Tabla 6.). Entre todos los agentes que regulan la actividad del canal SV, los cationes
monovalentes (K+, Na+) y los divalentes (especialmente Ca2+, Mg2+), son, probablemente, los
factores conocidos ms importantes que modulan la actividad del canal SV en condiciones
fisiolgicas.
K+ y Na+, a pesar de ser cationes monovalentes, regulan al canal SV de maneras diferentes. La
modulacin causada por K+ (Tabla 6.) es de carcter inespecfico y es efectuada a travs del
cambio del potencial de superficie del tonoplasto, que se encuentra en funcin de la fuerza inica
del contenido vacuolar. La sustitucin de K+ en este caso por una concentracin equivalente de
otros cationes orgnicos impermeables devuelve el mismo resultado la disminucin de la
sensibilidad al voltaje aplicado con el aumento de la fuerza inica de la solucin vacuolar
(Pottosin y col., 2005). El efecto de Na+ vacuolar, en contraste, al parecer es de carcter
especfico, ya que no es reproducido por el reemplazamiento de un concentracin equivalente de
K+ (Tabla 6., Ivashikina y Hedrich., 2005), y puede, segn los autores, jugar un papel importante
en el mantenimiento de la homeostasis inica durante el estrs salino.
Los efectos de Ca2+ y Mg2+ en ambos lados del tonoplasto sobre la actividad del canal SV son
similares (Tabla 6.), aunque el SV presenta una afinidad superior al Ca2+ que al Mg2+: para
evocar los efectos del primero es necesario aplicar una concentracin mucho mayor (en rdenes
de magnitud) de Mg2+. El aumento de la concentracin libre de Ca2+ o Mg2+ en el lado citoslico
causa el desplazamiento de la curva de activacin del canal SV a potenciales ms negativos. El
canal SV es activado ya por concentraciones micromolares de Ca2+ citoslico (Bethke y Jones,
1994; Reifarth y col., 1994; Schulz-Lessdorf y Hedrich., 1995; Allen y col., 1996), aunque los
valores del desplazamiento de la dependencia de voltaje difieren en los trabajos mencionados,
principalmente por la presencia de Mg2+ en las soluciones de trabajo. Para originar una activacin
similar a la causada por micromoles de Ca2+, son necesarias concentraciones milimolares de Mg2+
(Pei y col., 1999; Carpaneto y col., 2001), aunque en Hordeum el canal SV no era activado ni en
la aplicacin de 50 mM Mg2+ citoslico + EGTA agente quelante de Ca2+ (Pottosin y col.,
1997). No obstante, el Mg2+ citoslico fue propuesto como sensibilizador del canal SV al Ca2+
que pudiera jugar cierto papel en la regulacin del canal SV durante la elevacin fisiolgica del
23

Ca2+ citoplsmico (Pei y col., 1999; Carpaneto y col., 2001) mediante la sensibilizacin del canal
SV a las bajas concentraciones de Ca2+ presentes en el citoplasma.
A diferencia de sus efectos en el lado citoslico, el aumento de la concentraciones de
Ca2+/Mg2+ en el lado vacuolar disminuye la probabilidad de apertura del canal SV mediante el
desplazamiento de la dependencia de voltaje a potenciales ms positivos (Pottosin y col., 1997;
Ward y Schroeder, 1994; Pei y col., 1999; Pottosin y col., 2004). En un estudio detallado de la
modulacin del SV por cationes divalentes, Pottosin y col. (2004) determinaron que la
dependencia de voltaje de la probabilidad de apertura del canal en funcin del Ca2+ vacuolar
aplicado es bifsica y no se describe con la simple ecuacin de Boltzmann. A potenciales ms
negativos la dependencia de voltaje es muy abrupta, pero esta funcin disminuye drsticamente
su pendiente a potenciales ms positivos. Por esta razn, segn los autores, el esquema cintico
mnimo que describe la transicin del canal SV entre los estados cerrado y abierto debe contener
3 estados:
C2 C1 O.
Cada uno de los procesos de transicin C2C1 y C1O es descrito por la ecuacin de
Boltzmann y es caracterizado por sus potenciales de punto medio (midpoint potentials, V2 y V1),
en los cuales la ocupacin de los respectivos estados se encuentra en equilibrio, y por sus cargas
de compuerta (gating charges; z2 y z1), que definen la pendiente de la transicin dependiente de
voltaje entre los respectivos estados. La probabilidad de apertura del canal, de esta forma, es
determinada con la ecuacin

Po =

1
F
F
1 + exp(- z1 (V - V1 )
) (1 + exp(- z2 (V - V2 )
))
RT
RT

parte del modelo matemtico, elaborado por Pottosin y col. (2004) que describe las transiciones
del canal y permite describir de una manera muy exacta la dependencia de voltaje de la
probabilidad de apertura del canal en presencia de diferentes niveles de calcio vacuolar. En
concordancia con el modelo, la transicin al estado abierto del canal (C1O) es la menos
dependiente de voltaje (z1 = 0.7), mientras que la precedente (C2C1) es caracterizada por una
mayor dependencia de voltaje (z2 = 2.9). Aparte, fue determinado, que ambos equilibrios V1
(C1O) y V2 (C2C1) son afectados por el incremento de la concentracin de calcio vacuolar,
aunque de distinta manera: en condiciones de bajo calcio vacuolar V2 es menor que V1 y
24

predomina la transicin C1O. El aumento del calcio vacuolar causa el desplazamiento del
equilibrio hacia el estado C1 y el umbral de activacin del canal se recorre a potenciales ms
positivos. Un aumento mayor de la concentracin del calcio vacuolar trae como consecuencia el
desplazamiento del equilibrio hacia el estado C2 de la transicin C2C1. En otras palabras, el
incremento del calcio vacuolar suprime efectivamente la actividad del canal: un aumento del
calcio vacuolar de 0 a 10 mM causa el desplazamiento de la probabilidad de apertura del canal a
potenciales ms positivos (a nivel 1% de canales abiertos desde 80 a +70 mV). A potenciales
fisiolgicos (alrededor de 0 mV) en presencia de 2 mM de Ca2+ simtricos la probabilidad de
apertura del canal SV es menos de 0.01% o menos de un canal por vacuola, incluso en
condiciones que favorecen la activacin del canal (2 mM Ca2+ citoplsmico) (Pottosin y col.,
2004). La modulacin causada por Mg2+ vacuolar es similar a la originada por Ca2+, aunque su
efecto es ms modesto: un incremento del Mg2+ vacuolar de 0 a 10 mM causa el desplazamiento
de la dependencia de voltaje de solo unos 70 mV (desde 80 hasta 10 mV) a 1% de canales
abiertos.
El modelo propuesto por Pottosin y col. (2004) indica la existencia de una unin cooperativa
de varios cationes divalentes para la regulacin de la apertura del canal SV, especifica la etapa
limitante (C1O) de la activacin del canal y predice correctamente la dependencia de los
tiempos medios de activacin y desactivacin del canal en funcin de la concentracin vacuolar
de los cationes divalentes. No obstante, este modelo describe la regulacin de la compuerta
(gating) del canal SV en condiciones lejanas de las fisiolgicas pH vacuolar neutro
(probablemente, presentado solo en vacuolas aleurnicas de almacenamiento, pero no en
vacuolas lticas, utilizadas en los experimentos de ese trabajo) y alto Ca2+ citoslico (2 mM),
empleado para activar las corrientes del canal SV. Por lo tanto, no es posible estimar la
probabilidad de apertura del canal en condiciones fisiolgicas y determinar si la elevacin del
calcio citoslico es suficiente para la activacin del canal SV.

Posibilidad de la participacin del canal SV en la Liberacin de Calcio Inducida por Calcio,


LCIC (Calcium-Induced Calcium Release, CICR).
La permeabilidad del canal SV al calcio, as como su activacin por el incremento del calcio
citoslico, permiti a Ward y Schroeder (1994) proponer la participacin del canal en la
liberacin de calcio inducida por calcio (LCIC; de calcium-induced calcium release) en la
regulacin del cierre de las clulas de guarda y en las clulas vegetales en general. Esta propuesta
25

rpidamente recibi amplia aceptacin sin revisin previa (Allen y col., 1996; Barkla y Pantoja,
1996; Ward y col., 1995). Segn Ward y Schroeder (1994) la liberacin de calcio, mediada por el
canal SV, requiere un incremento inicial del calcio citoslico, inducido por un estmulo (por
ejemplo, por la fitohormona ABA). La subsecuente activacin de canales de potasio dependientes
de Ca2+ (VK) pudiera causar un desplazamiento del potencial a travs de la membrana vacuolar a
valores ms positivos. Finalmente, el aumento del calcio citoslico y el potencial positivo de la
membrana puede causar la apertura de los canales SV, permeables a calcio, dando paso, de esta
forma, a la liberacin de calcio de la vacuola (Ward y col., 1995; 1994).
Pottosin y col. (1997) argumentaron que en condiciones fisiolgicas, caracterizadas por un
nivel bajo de calcio citoslico y alto dentro de la vacuola, as como por potenciales negativos
a travs de la membrana vacuolar, la probabilidad de apertura del canal SV es muy baja. Para
aumentar la probabilidad de la apertura del SV en presencia del alto calcio vacuolar, como fue
mencionado ms arriba, se requiere Ca2+ citoslico en el rango de micromoles, as como
potenciales positivos de varias decenas de milivoltios. Sin embargo, estas condiciones reducen la
fuerza motriz de la liberacin del calcio de las vacuolas de mesfilo de cebada (Pottosin y col.,
1997). Aplicando concentraciones de calcio en el rango 13-2000 M en el lado citoplsmico en
presencia de 50 M o 2 mM en el lado vacuolar, este grupo de colaboradores determin que la
probabilidad de la apertura del canal depende en un mayor grado del gradiente de calcio aplicado
a travs de la membrana vacuolar, que de la concentracin del calcio citoslico sola. En
condiciones de nula fuerza motiva neta para calcio (Ca = V ECa = 0), la probabilidad de
apertura del canal SV es de 0.35% o, aproximadamente, 10 canales abiertos por una vacuola
tpica de 20 m de dimetro. Para las condiciones que favorecen la liberacin de calcio de la
vacuola (Ca < 0) esta probabilidad es menor todava asumiendo una actividad de calcio
vacuolar 1000 veces mayor que en el citoplasma (ECa = +87 mV) y un pequeo potencial de
membrana, estos autores calcularon una actividad promedia mucho menor de 1 canal abierto por
vacuola (Po = 0.0025%), y solo en condiciones que favorecen la acumulacin de calcio dentro de
la vacuola esta probabilidad de apertura aumentaba considerablemente (Pottosin y col., 1997).
Esta observacin les permiti a los autores sealar la dificultad de la participacin del canal SV
en la liberacin de calcio inducida por calcio.
Este resultado, a su vez, fue criticado por Bewell y col. (1999), argumentando que en
presencia de milimoles de Mg2+ citoslico, como sensibilizador, el umbral de activacin del
canal SV puede recorrerse a potenciales ms negativos obtenindose as las condiciones para la
26

liberacin de calcio a potenciales fisiolgicos. Este mecanismo fue respaldado por Carpaneto y
col. (2001). En condiciones de 10 mM de Mg2+y nanomoles de Ca2+ en el citoplasma, y 2 mM y 1
mM, respectivamente, de Mg2+ y Ca2+ vacuolar condiciones que favorecen la salida de calcio
de las vacuolas, fue obtenida la actividad del canal SV, aunque solamente a partir de +100
mV. El aumento del calcio citoslico recorre el umbral de activacin del canal y el potencial de
reversin de calcio ECa a potenciales ms negativos. Pero a 100 M de calcio citoslico el
potencial de reversin ECa es ms negativo que el potencial del umbral de activacin del canal SV
y en estas condiciones el calcio a travs de los canales SV puede fluir solamente desde el citosol
adentro de la vacuola. Adicionalmente, estos autores remarcan que la concentracin citoplsmica
utilizada (10 mM), puede corresponder solamente al Mg total en las clulas vegetales y es lejana
de la concentracin libre de magnesio citoslico, aunque ya su cambio en el rango fisiolgico
(0.1-1 mM; Bruggemann y col., 1999) puede causar el desplazamiento del potencial de
membrana unos 20 mV hacia potenciales ms negativos. No obstante, el umbral de activacin del
canal SV sigue situado considerablemente lejos del potencial vacuolar en condiciones
fisiolgicas. Por esta razn, la presencia de activadores adicionales es requerida para la liberacin
de calcio (Carpaneto y col., 2001).
Trabajos ms recientes se han centrado en la bsqueda de agentes que pudieran actuar como
activadores adicionales del canal SV y que le permitieran participar en la liberacin de Ca2+
inducida por Ca2+. Como tales posibles factores fueron determinados los agentes reductores
particularmente DTT, la forma reducida de glutationa (GSH) y el cido ascrbico (Tabla 6.;
Carpaneto y col., 1999; Scholz-Starke y col., 2004; 2005) y recientemente el antibitico
neomicina. Este ltimo agente mostr la mayor potencia de modulacin positiva del canal SV,
desplazando el umbral de activacin a potenciales negativos (Scholz-Starke y col., 2006). No
obstante, probablemente estos resultados muestran ms que nada la posibilidad de una activacin
adicional del canal SV en condiciones fisiolgicas por algn agente, no precisamente neomicina,
que pueda determinar la especificad de la liberacin de Ca2+ desde la vacuola como respuesta a
diferentes estmulos (ver. Tabla. 1).

1.2.2.3 Funcin del Canal SV


Actualmente, la funcin del canal SV en las clulas vegetales no est determinada. Por una
parte, su amplia distribucin en el reino vegetal y el alto nmero de canales expresados en una
vacuola llevan a considerar como muy importante el papel que puede jugar este canal. Por otra
27

parte,

lneas de Arabidopsis con knock-out por el gen tpc (tpc1-2 SALK_125658, tpc1-1

SALK_145413) no presentan genotipos letales e incluso, aparentemente, las plantas modificadas


llegan a reproducirse (Peiter y col., 2005). Sin embargo, es necesario sealar que las condiciones
experimentales, utilizadas en este trabajo (agua desionizada, 10 mM MES-KOH, pH 6.0 como
substrato), son lejanas de las que se presentan en cualquier suelo; adems, de el artculo no se
entiende si las semillas transgnicas examinadas fueron obtenidas de plantas cultivadas en ese
medio o con suministro de una composicin inica mas compleja. Por esto, existe la posibilidad
que no se hayan cumplido las condiciones necesarias para revelar la funcin del canal SV a travs
de disfunciones a nivel de organismo.
Ward y Schroeder (1994) propusieron la participacin del canal SV en procesos vinculados
con la liberacin de calcio inducida por calcio (ver p.1.2.2.2), basndose principalmente en la
permeabilidad del SV al Ca2+, as como por su activacin por el Ca2+ citoplsmico, mostrada ya
en 1987 en el trabajo de Hedrich y Neher. Esta propuesta fue argumentada por el encuentro que
en clulas de guarda la actividad del canal SV aumenta con la alcalinizacin del medio de
cualquier lado de la membrana vacuolar (Shulz-Lessdorf y col., 1995) efecto inducido en
condiciones fisiolgicas en el lado citoslico por la fitohormona ABA durante el cierre de las
clulas de guarda (Irving y col., 1992; Blatt y Armstrong, 1993). De este modo, la actividad del
canal SV refleja la direccin de los cambios de Ca2+ y pH citoslicos que acompaan el cierre de
las clulas de guarda 2 . No obstante, en experimentos con vacuolas de mesfilo de cebada
(Hordeum) y en base del estudio de Shulz-Lessdorf y Hedrich (1995) en clulas de guarda de
Vicia faba, Pottosin y col. (1997) descartaron la posibilidad de la participacin del canal SV en la
sealizacin de calcio mediante la liberacin de calcio inducida por calcio.

1.2.3 Canales permeables a Ca2+ del retculo endoplsmico


Actualmente existen reportes de solamente dos canales permeables a calcio en el retculo
endoplsmico de las clulas vegetales: el primero fue descubierto en los rganos
mecanoreceptivos de Bryonia dioica (BCC1, de Bryonia Calcium Channel; Klsener y col.,
1995; 1997) y el segundo fue reportado en el retculo endoplsmico del pex de raz de lechuga

Allen G.J., Sanders D. Vacuolar Ion Channels in Higher Plants. En: Roger A. Leigh, Dale Sanders (Eds.) The Plant
Vacuole. Advances in Botanical Research incorporating Advances in Plant Pathology. V. 25. Acdemic Press, 1997,
p. 227.
28

Lepidium sativum (LCC1, de Lepidium Calcium Channel; Klsener y col., 1999), estudiados
ambos con la tcnica de bicapas lipdicas.
El canal BCC1 presenta actividad en rfagas y posee al menos dos estados abiertos (Klsener
y col., 1995; 1997), mientras que el LCC1 tiene solamente un estado abierto, caracterizado por su
tiempo medio de 2.8 ms (Klsener y col., 1999). En la Tabla.7 se hace una comparacin de estos
dos canales reportados.
Aunque los estudios presentes fueron realizados en bicapas lipdicas y la orientacin absoluta
de los canales no se puede determinar, las caractersticas registradas permiten solo una
orientacin compatible con las condiciones fisiolgicas, esta es permitiendo la salida de Ca2+
del RE al citoplasma (Klsener y col., 1995, 1997, 1999). El canal BCC1 fue propuesto para la
participacin en la transduccin de las seales en los rganos mecanoreceptivos de Bryonia,
TABLA 7. Caracterstica de los canales catinicos del RE reportados en plantas superiores
Parmetro

Conductancia

BCC1 (Klsener y col., 1995; 1997)


Es funcin del gradiente de Ca2+ aplicado
(Km = 8.8 mM):
50/50 mM Ca2+ 29 pS
50/5.0 mM Ca2+ 23.6 pS
50/0.5 mM Ca2+ 14.4 pS

LCC1 (Klsener y col., 1999)


Ca2+ Gmax(100 mM) = 27.9 pS (Km
= 7.3 mM)

Selectividad

Ba2+ Ca2+ > Sr2+ > Mg2+ > X+


PCa:PK = 6.6

Ca2+ > Ba2+ > Sr2+


PCa:PK = 9.4

Bloqueadores

Gd3+ EC50 1.1 M


Cu2+ EC50 1.2 M
Zn2+ EC50 3.4 M
La3+ EC50 9.0 M
Cd2+ EC50 100 M
(obstruyen la entrada del poro del canal)

Cu2+ EC50 5 M
La3+ EC50 5 M
Gd3+ EC50 10 M

Eritrosina-B EC50 1 M

Eritrosina-B EC50 1.8 M

Verapamila (10-30 M) causa 2 efectos: i)


reduce tiempo de apertura dentro de rafagas
de actividad
ii) aumento de intervalos entre paquetes

NO tiene efecto:Verapamila (10-100


M)

NO causan efecto: Ryanodina (70 M),


thapsigargina (inhibidor de Ca-ATPasas, 20
M), trifluoperazina (antagonista de CM, 40
M)

29

Regulacin

Voltaje

Activacin por potenciales positivos. Los


potenciales de punto medio son funcin del
gradiente de Ca2+ aplicado:
V1/2 50/50 mM Ca2+ +46.2 mV
V1/2 50/5.0 mM Ca2+ +15.7 mV
V1/2 50/0.5 mM Ca2+ 16.6 mV

pH

La elevacin citoplsmica del pH disminuye


la conductancia del canal (de 29 a 16 pS en el
rango pH 7.0 - 7.75)

Otros

NO tienen efecto: IP3 (10 M), ADP o ATP


(2 mM)

Activacin por potenciales positivos.


Con el aumento del potencial
disminuye el tiempo medio del
estado cerrado. El tiempo medio del
estado abierto no es afectado.

H2O2 citoslico (0.1-1 mM) inhibe la


actividad del canal (a 1 mM
completamente)

formando junto con la Ca2+-ATPasa del RE un oscilador de Ca2+ que permite la identificacin
espacio-temporal del estmulo (Klsener y col., 1995).
Por otra parte, la inhibicin del canal LCC1 (as como el BCC1) por el inhibidor de Ca2+ATPasa eritrosina-B en bajas concentraciones pudiera ser indicacin de que estos canales pueden
aparecer como resultado del desacoplamiento de la Ca2+-ATPasa, cuyos dominios
transmembranales, como se ha mostrado en el caso de protenas de retculo sarcoplsmico,
pueden actuar como canales permeables a Ca2+ (de Meis y col., 1996). Este desacople, segn
Klsener y col. (1999), puede fcilmente ocurrir durante el procedimiento de extraccin de la
membrana, por lo que estudios ms minuciosos son requeridos.
Aparte, en varios estudios fue reportada la liberacin de Ca2+ de vesculas de RE, causada por
ligandos cADPR, NAADP (Navazio y col., 2000; 2001). Martinec y col (2000) reportaron en
este compartimiento la presencia de sitios de unin a IP3. Sin embargo, en ninguno de estos
trabajos fueron determinados o caracterizados los canales sensibles a ligandos responsables de la
liberacin de calcio.
En la Fig.3 son resumidos los mecanismos de transporte y liberacin de Ca2+ conocidos hasta
hoy en las membranas intracelulares, especficamente del tonoplasto y el retculo
endoplsmico, de las clulas vegetales.

30

ADP+Pi

H+-ATPasa

ATP
PPi

RE

2+

1-3 mM

2+

CAX

0.1-200 mM Ca2+
ACA
ECA
BCC1
LCC1

Vacuola

Ca

ADP+Pi

Ca

pH 4..6.5

H+-PPasa

ACA

ATP

SV

ATP

ADP+Pi

ADP+Pi

Ca
Citoplasma

2+

0.1-20 mM Ca

2+

2+

2+

Fig.3 Rutas conocidas de transporte de Ca en los mayores depsitos de Ca


en las clulas vegetales (fuente: elaboracin propia)

ATPasas: ACA - ATPasas con mecanismo de autoihibicin y regulacin por calmodulina, ECA - ATPasas
tipo RE; H+-ATPasa, H+-PPasa - respectivamente, bomba de protones y pirofosfatasa vacuolares que
generan el gradiente de H+, necesario para el funcionamiento de los CAX.
Transportadores: CAX - intercambiadores H+/Ca2+.
Canales: SV - canal vacuolar lento, el nico establecido firmemente hasta el momento en la membrana
vacuolar con permeabilidad al Ca2+; BCC1, LCC1 - canales determinados en vesculas del retculo
endoplsmico.

2. Objetivos del proyecto

2.1 Hiptesis
La actividad del Ca2+ en vacuolas vegetales vara. En el rango micromoles-1 mM es posible
realizar el monitoreo de la actividad de Ca2+ en la vacuola, utilizando como reportero intrnseco
el canal SV el canal vacuolar con mayor distribucin y con sensibilidad al Ca2+ vacuolar en el
rango sealado.
El canal SV es el nico canal con permeabilidad a Ca2+ establecida, presente en el mayor
depsito intracelular de Ca2+ la vacuola central. Por lo tanto, el canal SV pudiera participar en
la sealizacin por Ca2+, particularmente en la liberacin de calcio inducida por calcio (LCIC).
En la membrana del segundo mayor depsito intracelular de Ca2+ el retculo
endoplsmico, se encuentran canales permeables a Ca2+. Es probable, que algunos de estos
canales sean activados por ligandos (IP3) y participen en la liberacin de calcio desde este
compartimiento.

2.2 Objetivos
Generales:
Determinar la concentracin de Ca2+ vacuolar libre en vacuolas de clulas vegetales y las
rutas de movilizacin de Ca2+ intracelular desde los principales depsitos internos de Ca2+ la
vacuola y el retculo endoplsmico.
Especficos:
1. Elaborar una tcnica no invasora de la medicin del calcio vacuolar libre, basada en el efecto
modulador del Ca2+ sobre el canal SV. Utilizando sta, determinar el nivel de calcio vacuolar
libre en vacuolas de betabel. Comparar los datos obtenidos con datos de tcnicas alternativas
de medicin de Ca2+.
32

2. Determinar la actividad del canal SV en condiciones inicas fisiolgicas y estimar la


posibilidad de la participacin de este canal en la sealizacin por Ca2+.
3. Elaborar una tcnica que permita la bsqueda y caracterizacin de canales inicos en
membranas nativas de retculo endoplsmico. Por medio de dicha tcnica, realizar la bsqueda
de canales permeables a calcio en membranas de retculo endoplsmico. Caracterizar los
canales hallados en el RE y determinar su sensibilidad a ligandos.

33

3. Metodologa
3.1 Preparaciones
3.1.1 Objeto de estudio.
En el presente trabajo fueron estudiados canales permeables a Ca2+ de membranas
intracelulares de la raz napiforme de betabel (Beta vulgaris L.; Chenopodiacea), especficamente
de la vacuola y el retculo endoplsmico.

3.1.2 Obtencin de vacuolas. Soluciones de trabajo.


Para el trabajo utilizamos races frescas de betabel compradas en un supermercado. Las
vacuolas fueron obtenidas de manera mecnica destrozando un pequeo corte de raz de
betabel en la solucin isoosmtica de bao (modificacin de la tcnica de Trebacz y
Schnknecht, 2000) y despus de esto trasladadas a la cmara de trabajo.
Las soluciones de trabajo son descritas ms abajo (Tablas 8-12). Las soluciones con baja
concentracin de Ca2+ fueron preparadas con bferes para calcio, calculando las cantidades de
reagentes necesarias con el programa Winmaxc32 v2.50 (Patton y col, 2004). El ajuste de la
osmolaridad de las soluciones fue realizado con sorbitol, agregado en la cantidad definida por
mediciones de osmolaridad En los experimentos de calibracin (Tablas 8-11) la solucin
citoslica empleada contena 2 mM Ca2+ para mayor activacin del canal SV.

Soluciones para registros en configuracin attached


TABLA 8. Soluciones para registros en configuracin attached

Solucin de bao

Solucin de pipeta

KCl 100 mM
KCl 100 Mm
2+
Ca 0, 0.05, 0.1, 0.2, 0.5, 1.0, 2.0, 10.0 mM*
Ca2+ 2 mM
MES 10 mM
HEPES 10 mM
Sorbitol
Sorbitol
pH 6.4
pH 7.5
2+
* las soluciones con 0 y 0.05 mM de Ca fueron preparadas utilizando bferes para calcio (Tabla I en el
Apndice).

34

Soluciones para registros en parches aislados


TABLA 9. Soluciones para determinar el efecto de pH sobre la actividad del canal SV

Vacuola

Citosol

KCl 100 mM
KCl 100 mM
Ca2+ 0, 0.01, 0.05, 0.1, 0.2, 0.5, 1.0, 2.0, 10.0
Ca2+ 2 mM
mM*
MES 10 mM
HEPES 10 mM
sorbitol
sorbitol
pH 5.5 / 6.4
pH 7.5
2+
* - las soluciones con 0, 0,01 y 0,05 mM de Ca fueron preparadas utilizando bferes para calcio, como es mostrado
en la Tabla II del Apndice.
TABLA 10. Soluciones para determinar el efecto de Na+ vacuolar sobre la actividad del canal SV.

Vacuola

Citosol

KCl 187 mM
KCl 125 mM
KCl 125 mM
KCl 100 mM
NaCl 62 mM
Ca2+ 2 mM
2+
2+
2+
Ca 0, 0.5 mM*
HEPES 10 mM
Ca 0, 0.5 mM*
Ca 0, 0.5 mM*
MES 10 mM
MES 10 mM
MES 10 mM
Sorbitol
Sorbitol
sorbitol
sorbitol
pH 7.5
pH 5.5
pH 5.5
pH 5.5
* - las soluciones con 0 mM de Ca2+ fueron preparadas utilizando los valores de la Tabla II del Apndice.
TABLA 11. Soluciones para determinar el efecto conjunto de H+, Na+, Ca2+, Mg2+ sobre la actividad del SV.

Vacuola

Citosol

KCl 125 mM
KCl 100 mM
NaCl 62 mM
Ca2+ 2 mM
2+
HEPES 10 mM
Ca 0, 0.01, 0.05, 0.1, 0.2, 0.5, 1.0, 2.0 mM *
2+
sorbitol
Mg 8 mM
MES 10 mM
pH 7.5
sorbitol
pH 5.5
* - las soluciones con bajo Ca2+ fueron preparadas utilizando bferes para calcio, como es mostrado en la Tabla III
del Apndice.
TABLA 12. Soluciones de modelacin del entorno inico fisiolgico del canal SV (0.5-1.5 mM Mg2+ citoslico).

Vacuola
KCl 125 mM
NaCl 62 mM
Ca2+ 0,25 mM
Mg2+ 8 mM
MES 10 mM
sorbitol
pH 5.5

Citosol
100 nM Ca2+
KCl 100 mM
Mg2+ 0.5, 1.5 mM
Ca2+ 100 nM
HEPES 10 mM
Sorbitol
pH 7.5

20 M Ca2+
KCl 100 mM
Mg2+ 0.5, 1.5 mM
Ca2+ 20 M
HEPES 10 mM
sorbitol
pH 7.5

35

Las osmolaridad de las soluciones de trabajo fue ajustada con sorbitol a la osmolaridad del
jugo celular, determinada con un osmmetro crioscpico Osmomat 030 (Gonotec).

3.1.3 Obtencin de fraccin microsomal enriquecida de RE


1. 250 gramos de betabel fueron homogenizados a 4C en un bfer de la siguiente
composicin (en mM): 50 Tris-HCl, 1 EDTA, 1 dithiothreitol (DTT;
antioxidante), 250 sacarosa y 5 g/ml leupeptina (inhibidor de proteasas). El volumen
de la solucin necesario fue determinado calculando 2 ml por gramo de betabel utilizada.
2. El homogenato fue filtrado a travs de una gasa.
3. Centrifugacin del filtrado a 4C por 10 minutos y 10,000 g para aislar paredes celulares
y otros residuos slidos.
4. Centrifugacin en alcuotas de 40 ml por una 1 hora a 4C y 100,000 g (modificado
50,000 g por 1,5 horas debido a la ausencia de equipo requerido).
5. Obtencin del pellet (pastilla) de membrana total.
6. Resuspensin del pellet en 0.5 ml de bfer de resuspensin que contiene (en mM): 5
KH2PO4, 4 KCl, 250 sacarosa, 1 DTT y 5 g/ml de leupeptina.
7. Separacin de fracciones de membranas (alcuotas de 1 ml) en gradiente de sacarosa (10%
- 60%, volumen 40 ml) con 1 mM EDTA-KOH (pH 7.5) agregado. Temperatura
4C. Tiempo de rotacin 1 hora a 30,000 g.
Las fracciones fueron identificadas por los siguientes marcadores enzimticos ATPasa
mitocondrial, vacuolar y plasmtica; NADPH : citocromo C (P-450)-reductasa y citocromo Coxidasa. La fraccin correspondiente al RE (marcador especfico NADPH : citocromo Creductasa) fue extrada, aliquotada y conservada a 20 C.

3.1.4 Obtencin de liposomas gigantes. Tcnica de deshidratacinrehidratacin.


1. 200 ml de suspensin de membrana de RE en sacarosa fueron diluidos en 2 ml de bfer de
lavado del siguiente contenido (en mM): 50 Tris-HCl, 1 EDTA (pH 7.8), 1 DTT
y 5 g/ml leupeptina (para extraccin de la sacarosa que dificulta la formacin de
liposomas).

36

2. Centrifugacin a 100,000 g por 1 hora (igualmente modificado a 50,000 g por 1.5 horas) a
4C. Obtencin del pellet (pastilla) de membrana de retculo endoplsmico.
3. Resuspensin en 5 l de MOPS (10 mM, pH 7.4), 10 l de etilenglycol (5%).
4. los 15 l resultantes fueron colocados en la cmara experimental para la deshidratacin
(4-6 horas a 4C con o sin silicagel).
5. Hidratacin de la preparacin mediante la agregacin de 20 l KCl (100 mM) durante la
noche a 4C o exponiendo la preparacin 2-3 horas a temperatura ambiente.
6. Una vez observadas la liposomas, fue cuidadosamente aadida la solucin de bao
(inicialmente KCl (100 mM), sorbitol; reemplazada despus por soluciones de otra
composicin, segn el experimento).

3.2 Registros electrofisiolgicos


Patch Clamp
3.2.1 Generalidades
Los registros electrofisiolgicos fueron realizados a temperatura ambiente con la tcnica de
fijacin de voltaje (patch-clamp) descrita por Hamill y colaboradores (1981).
Todas las manipulaciones eran seguidas bajo un microscopio Nikon-Diaphot TMC invertido.
El electrodo de medicin fue ubicado con respecto a la vacuola con la ayuda de
micromanipuladores Burleigh XYZ con soporte de Newton (XYZ manual y Z piezoelctrico).
Como electrodo referente fue utilizado un puente de agar (2%, solucin acutica) con 100 mM de
KCl. Los voltajes de mantenimiento y de comando fueron ajustados desde un amplificador
Axopatch 200A (Axon Instruments, USA) y una computadora 486DX con el software pClamp
v.6 instalado. Aparte, en la computadora fueron diseados los protocolos de voltaje.
Las corrientes registradas fueron seguidas en el osciloscopio Tektronix 511A y grabadas en la
computadora 486DX por un convertidor anlogo-digital DigiData1200. El anlisis inicial de los
datos digitalizados fue realizado con el software de la serie pClamp v.6.
Siguiendo la propuesta realizada en el trabajo de Bertl y colaboradores (1992), el signo del
potencial se toma respecto al citosol y las corrientes positivas (salientes) representan la entrada de
cationes a la vacuola.

37

3.2.2 Fabricacin de micropipetas


Las micropipetas fueron fabricadas de capilarios de vidrio marca KIMAX (Kimble
Products, USA) o Kwik Fill (World Precision Instruments Inc, USA) en un estirador horizontal
P-97 (Sutter Instruments) y pulidas en una microforja L/M-CPZ 101 bajo un microscopio
invertido Zeiss. Las micropipetas, hechas de vidrio KIMAX, adems de esto, fueron cubiertas
con resina sinttica Sylgard (List Biomedical) para disminuir la capacitancia, causada por el
estrecho grosor de sus paredes. La resistencia de las pipetas utilizadas en los experimentos era de
10-20 MOhm para las configuraciones attached y parche aislado (inside-out, outside-out) y de 24 MOhm para la configuracin vacuola entera.

3.2.3 Registros de actividad de canales en las configuraciones attached,


vacuola-completa, parche aislado.
Las configuracin attached fue obtenida mediante una gentil succin de la membrana
vacuolar adentro de la micropipeta hasta la formacin de un sello de alta resistencia, y era la
configuracin bsica para la obtencin sucesiva de otros dos tipos de configuraciones vacuola
completa (mediante una succin fuerte para romper la membrana del sello, pero sin perder el
contacto de alta resistencia) y parche aislado en la configuracin outside-out (obtenido mediante
un movimiento rpido del micromanipulador que causa la ruptura del contacto entre la vacuola y
la micropipeta, dejando en esta ltima un pequeo fragmento de membrana con la orientacin
similar a la de la configuracin vacuola completa). Otra de las configuraciones de parche aislado,
inside-out (que se obtiene de manera similar al outside-out, pero desde la configuracin attached),
fue utilizada en algunas ocasiones, aunque su obtencin presentaba cierta dificultad y en esta
configuracin el nmero de canales en el parche fue menor, en comparacin con el outside-out.
Un esquema de la obtencin de las diferentes configuraciones es mostrado en la Fig.4. Para los
experimentos fueron utilizados muestras, donde la resistencia del sello fue mayor de 1GOhm.

3.2.4 Medicin del potencial a travs de la membrana vacuolar.


El potencial a travs del tonoplasto fue determinado en condiciones de 100 mM KCl
simtrico en la configuracin vacuola entera y fijacin de corriente (I=0). Debido a la presencia
de aniones orgnicos dentro de la vacuola, los datos fueron corregidos por el factor del potencial
de unin lquida cerca de 8 mV (electrodo positivo), determinado en mediciones con
microelectrodos con una solucin de KCl de 3M.
38

Attached

Inside-out
Whole-vacuole

Outside-out
Fig.4 Esquema de la obtencin de las diferentes configuraciones, utilizadas en la
tcnica de patch-clamp (fuente: elaboracin propia).
La obtencin de cualquier configuracin empieza por la obtencin de un sello de alta resistencia
(>1GOm) en la configuracin attached. Con base en esta se pueden obtener dos configuraciones:
mediante la ruptura de la unin entre la micropipeta y la membrana se obtiene la configuracin
inside-out, la ruptura de la membrana directamente debajo de la pipeta origina la configuracin
vacuola entera - anlogo de whole-cell. A su vez, la ruptura de la unin de la micropipeta a la
vacuola causa el aislamiento de un fragmento de membrana en la configuracin outside-out.

3.2.5 Protocolos de voltaje para el estudio del canal vacuolar SV. Obtencin
de relacin corriente-voltaje del canal unitario.
Las corrientes de los canales SV eran evocadas por pulsos rectangulares. Para los registros
en configuracin outside (vacuolar)-out, el potencial de mantenimiento fue establecido en +60
mV. El protocolo de voltaje era iniciado por un prepulso de +100 mV para la desactivacin de los
posibles canales abiertos. Los pulsos de voltaje fueron aplicados desde 100 mV con un paso de
20 mV hasta llegar a 160 180 mV. El protocolo lo finalizaba otro pulso a +100 mV para
poder observar las colas de desactivacin de los canales. La duracin del pulso era escogido de
tal manera, que las corrientes activadas alcanzaran un nivel estacionario, esto generalmente
ocurra entre 3-5 segundos, en dependencia del calcio vacuolar aplicado.
Los registros en las configuraciones inside-out y attached fueron realizados con el mismo
protocolo, excepto que todos los signos de voltajes cambiaban al opuesto.
La obtencin de curvas I-V de los canales unitarios fue realizada con la tcnica descrita por
Dobrovinskaya y col. (1999). Para obtener la relacin corriente-voltaje de un canal unitario,
manualmente se escoga un voltaje de mantenimiento en el cual se encontraba abierto no ms de
un canal SV al mismo tiempo. Sobre este potencial de mantenimiento fueron aplicados pulsos de
voltaje en forma de rampa muy rpida (con duracin de 15 ms) que recorra durante este corto
tiempo el voltaje de 200 mV hasta +200 mV. En ausencia de canales abiertos, este pulso nos da
la corriente de fuga, mientras que la aplicacin de la rampa durante el estado abierto del canal nos
regresa la suma de la corriente-fuga y la corriente del canal unitario abierto. Restando de esta
ltima la corriente-fuga obtuvimos la corriente que pasa por un canal unitario en dependencia del
voltaje aplicado, es decir, la relacin corriente-voltaje.

3.2.6 Determinacin de la probabilidad de apertura.


La corriente macroscpica I generada por la populacin de canales en un parche es
determinada como
I = i N P,
dnde i corriente del canal unitario, N nmero de canales, P probabilidad de apertura del
canal unitario.
Para comparar muestras con un diferente nmero de canales presentes primero fue evaluado el
nmero promedio de los canales abiertos (NP) en cada pulso de voltaje en el estado estacionario
de la corriente de activacin. Para eso, la corriente total de un parche (aislado o no) fue dividida
40

por el valor de la corriente del canal unitario (obtenida con la tcnica de rampas) en el valor de
voltaje correspondiente. Los datos normalizados (Fig. 5A) (NP/NPmax, donde NPmax es el mayor
nmero promedio de canales abiertos obtenido) de diferentes parches, de esta manera, pudieron
ser comparados y representan la probabilidad de apertura Po/Pomax del canal SV a cierto potencial.

3.2.7 Calibracin del efecto de Ca2+ vacuolar sobre el canal SV.


En nuestro caso, la curva de calibracin representa una relacin del voltaje en el cual la
probabilidad de apertura de canales SV es 1% en dependencia de la concentracin de Ca2+
vacuolar aplicada (Fig. 5B). Las razones por las cuales fue escogido el valor de 1% de canales
abiertos son las siguientes: 1) cerca del umbral de activacin por voltaje son ms estables los
estados cerrados del canal, los cuales definen su sensibilidad al Ca2+ vacuolar. Es decir, en
condiciones de 1% de canales abiertos nuestro electrodo es mas sensible al nivel de Ca2+, que en
condiciones cuando todos los canales estn abiertos, 2) en este por ciento de canales abiertos el
desplazamiento de la dependencia del voltaje con el cambio del nivel de Ca2+ vacuolar es casi
paralelo, 3) este por ciento de canales abiertos normalmente es detectable.
La curva de calibracin para el canal SV fue hecha a partir de los datos obtenidos en parches
aislados, para poder controlar la actividad de Ca2+ a ambos lados de la membrana.

3.2.8 Estimacin del nivel de calcio vacuolar libre, utilizando la curva de


calibracin.
Los datos utilizados para estimar el nivel de calcio vacuolar fueron los obtenidos en registros en
configuracin attached. Haciendo el mismo procedimiento descrito en los p.3.2.6-7 obtenemos la
relacin del voltaje de 1% de canales abiertos en dependencia de la actividad nativa del calcio
vacuolar (a estimar). Superponiendo estos datos sobre la curva de calibracin obtuvimos el valor
del nivel de calcio vacuolar buscado.
No obstante, por manipulaciones con el nivel de Ca2+ en el bao tenemos que suponer que
el nivel de calcio vacuolar puede sufrir cambios disminuir o aumentar, segn sea la direccin
del potencial electroqumico para Ca2+. Por eso, para averiguar la actividad autntica del calcio
vacuolar los resultados obtenidos son comparados con valores-lmites de la actividad de calcio,
calculadas por la ecuacin de Nernst: en ausencia de ATP u otra fuente de energa, se supone que
dominan los procesos pasivos de transporte, por lo que la concentracin del Ca2+ vacuolar tiende
a su valor de equilibrio. Para obtener la concentracin de equilibrio necesitamos el valor del

41

1
NP / NPmax

0.01

V / mV
V1

V1% / mV

V2

V3

Potenciales de 1%
de canales abiertos

V1%
en registros attached

V3

Curva de calibracin
obtenida en parches aislados

B
V2
V1
2+

lg [Ca ]vac / mM
[Ca2+]vac en dependencia
2+
de [Ca ]bao
2+

lg [Ca ]vac / mM
Equilibrio de [Ca2+]vac, determinado
por la ecuacin de Nernsto

[Ca2+]vac vera

2+

lg [Ca ]bao / mM
Fig.5 Pasos ejecutados para la comparacin de registros en diferentes parches, la
2+
calibracin del efecto de Ca sobre el canal SV y para la estimacin de la
actividad del calcio vacuolar (fuente: elaboracin propia).

A. Determinacin del voltaje de 1% de canales abiertos, a partir de datos obtenidos y los fit, realizados
con el modelo matemtico (Pottosin et al., 2004); B. Obtencin del nivel de Ca2+ vacuolar con la
influencia del nivel de Ca2+ aplicado en el bao; C. Obtencin de la verdadera actividad de Ca2+,
comparando los datos obtenidos en B, con la actividad-lmite para calcio, obtenida con la ecuacin de
Nernst y el potencial a travs de la membrana. Detalles - en el texto.

potencial a travs de la membrana que es registrado al fin del experimento con el parche attached
va ruptura de la membrana y medicin en condiciones de fijacin de corriente (I=0).
Colocando en una dependencia nivel Ca2+ vacuolar del nivel de Ca2+ en el bao los datos del
Ca2+ vacuolar obtenidos y los datos de la actividad-lmite calculados podemos compararlos.
Suponemos, que el nivel de Ca2+ vacuolar vero es aquel que se encuentre en el cruce de las
curvas, de lmite y obtenida de la curva de calibracin (Fig. 5C), ya que este cruce representa la
condicin de equilibrio de flujos de Ca2+ entre la vacuola y el bao, cuando la diferencia en el
potencial electroqumico para Ca2+ es nulo.

3.2.9 Protocolos de voltaje para el estudio de canales permeables a Ca2+ del


retculo endoplsmico.
Los estudios de la activacin de los canales del RE fueron realizados a un potencial de
mantenimiento de 60 mV con pulsos rectangulares de voltaje desde 140 y hasta +140 mV
(paso de 40 mV) y un postpulso a 100 mV para observar la desactivacin de los canales. En otra
modificacin del protocolo, el signo tanto del potencial de mantenimiento como del postpulso
eran cambiados al opuesto y consituan, respectivamente, +60 y +100 mV. Estos protocolos de
750 ms de duracin fueron aplicados tanto en configuracin inside-out, como outside-out, ya que,
al parecer, los canales no presentaban una orientacin determinada.
Al igual que los canales vacuolares, a los canales del RE fueron fueron aplicadas las rampas
de voltaje para determinar la relacin I-V del canal unitario, pero en el rango desde +150 hasta
150 mV para evitar la perforacin de la membrana. En algunos casos la polaridad de la rampa fue
invertida. La duracin de la rampa, aplicada a los canales del RE fue similar a la aplicada al canal
SV 15 ms.

Microelectrodos ionoselectivos
3.2.10 Mediciones de la actividad de cationes vacuolares con la tcnica
tradicional de electrodos ionoselectivos.
La tcnica estndar de microelectrodos ionoselectivos incluye el uso de microelectrodos de
doble barril: uno para la determinacin del potencial a travs de la membrana, y un segundo
para la medicin del potencial del electrodo con la resina ionoselectiva. La substraccin del
potencial consecuentemente permite calcular la actividad corregida del ion registrado.
Desafortunadamente, esta tcnica no se encontraba disponible, por lo que fue necesario el uso de
43

slo el microelectrodo ionoselectivo, haciendo las respectivas correcciones para el potencial de


unin lquida y el potencial a travs de la membrana vacuolar.
Para realizar la correcin originada por la presencia del potencial a travs del tonoplasto, fue
utilizado un segundo microelectrodo con 1M KCl que permita registrar simultneamente el
potencial de la membrana. El potencial de unin lquida fue determinado para el electrodo
ionoselectivo determinando el cambio de potencial causada por la sustitucin de la solucin de
bao de 50 mM KCl (pH5.5) por 50 mM de cido mlico (pH 5.5, KOH).
Ya que la selectividad de las resinas es afectada por la fuerza inica de las soluciones, primero
eran determinadas las concentraciones de los mayores osmticos (K+, Na+) y despus era
incluidas en la solucin de calibracin de los otros electrodos ionoselectivos (para Ca2+ en
nuestro caso). Lamentablemente, la selectividad de la resina selectiva para Na+ es afectada
drsticamente por la presencia de K+, por lo que para determinar la concentracin de Na+ fue
empleado el mtodo de fotometra.
Las resinas ionoselectivas empleadas fueron las siguientes: para K+ ionoforo de potasio,
cocktail I (Fluka 60031), para Na+ ionoforo de sodio, cocktail A (Fluka 24902), para Ca2+
ionoforo de calcio, cocktail A (Sigma I-1772).

3.2.11 Tcnica MIFE (Microelectrode Ion Flux Estimation).


El flujo neto causado por la difusin de un ion a travs de una membrana puede ser
determinado sabiendo el potencial electroqumico de ese ion, su movilidad y su concentracin en
la solucin (ver teora en Newman, 2001). El sistema MIFE permite realizar mediciones del
gradiente del potencial electroqumico cerca del objeto de estudio, para despus calcular el flujo
neto del ion a travs de la membrana, teniendo en cuenta la geometra del objeto de estudio, la
movilidad del ion y las caractersticas del electrodo de medicin (para ms detalles ver Shabala y
col., 1997 o Newman, 2001). El proceso de adquisicin de los registros consiste en el
movimiento controlado de un electrodo ionoselectivo entre dos posiciones cercana y ms
alejada en respecto al objeto de estudio (x y x + dx, respectivamente). El cambio del voltaje
dV en el electrodo (causado por la diferencia en las concentraciones a diferente distancia del
objeto) es registrado y convertido en el flujo neto J de un ion especfico (ver Fig.6):

dV
J = cuzFg
dx

44

donde, J flujo neto del ion, c concentracin del ion, u movilidad del ion, F constante
de Faraday, y asumimendo que el potencial electroqumico d, es regitrado por el electrodo como

d = zFgdV , donde g el factor de subestimacin del valor d por la caracterstica interna del
electrodo dV. El factor dx depende de la geometra de la superficie del objeto y para el caso de un
objeto esfrico (la vacuola) de radio r, se define como
1
1

dx = r 2
.

r + x r + x + dx
(Newman, 2001).
Los electrodos para la tcnica fueron elaborados en varios pasos que constituyeron su
estiracin, secado, el recubrimiento con silicona, el rellenado con la solucin apropiada y el
rellenado de la punta del electrodo con el intercambiador ionico lquido (liquid ion exchanger
LIX; cocktail 21048, Fluka, para Ca2+). Despus de esto, los electrodos fueron calibrados
utilizand soluciones-estndares con concentraciones de Ca2+ en el rango 0.05-1 mM. El objeto de
estudio lo constituyeron vacuolas de betabel, aisladas como fue mencionado anteriormente.

45

m
Citosol
Vacuola

dx
x

Fig.6 Tcnica MIFE de medicin de flujos (fuente: elaboracin propia).


La tcnica se basa en la medicin con electrodos ionoselectivos de la concentracin del ion estudiado
a diferentes distancias del objeto de estudio (x y x+dx). En estas posiciones son registrados los potenciales
V y V+dV, que son la caracterstica del potencial electroqumico m y m+dm para el ion estudiado y
permite, sabiendo la composicin de las soluciones y la geometra del objeto de estudio, obtener el flujo
del ion (ver detalles en el texto).

4. Concentraciones libres de los principales cationes


fisiolgicos vacuolares y sus efectos sobre el canal SV.

4.1 Introduccin.
La aplicacin de una fila de concentraciones de Ca2+ para el estudio de la calibracin del
canal SV revel algunos datos similares a los presentados en varios trabajos anteriores. No
obstante, a diferencia de estos ltimos, el estudio del efecto de las altas y bajas concentraciones
de iones individuales tanto en el lado vacuolar, como en lado citoslico, mostr algunas
diferencias que impidieron el cumplimiento de unos de los objetivos del presente proyecto la
estimacin del calcio vacuolar libre, utilizando el canal SV de vacuolas de raz de betabel como
reportero interno de la actividad de Ca2+. Sin embargo, el mismo principio pudo ser exitosamente
aplicado con la tcnica MIFE de medicin de flujos y originalmente no diseada para la medicin
de concentraciones inicas intramembranales.

4.2 Resultados.
4.2.1 Osmolaridad y valor del pH del jugo vacuolar.
El valor de la osmolaridad del jugo celular fue medido durante los meses de las cuatro
estaciones del ao y se encontraba entre 212 y 680 mOs, con un valor promedio de 498 96 mOs
(n=59) (Fig. 7). De todas las races, para el trabajo fueron escogidas las que presentaban una
mayor osmolaridad del jugo celular, ya que se asuma que stas tenan un mayor potencial
metablico para la expresin de protenas y, particularmente del canal vacuolar lento SV. Esta
asuncin coincide con cierta correlacin notada entre la amplitud de las corrientes macroscpicas
del canal SV en los parches y la osmolaridad determinada del contenido vacuolar, disminuyendo
ambos al iniciar la poca de lluvia. El pH del jugo celular tambin present variaciones entre 6.4
0.2 en abril 2004 (n = 9, entre 6.16 y 6.73) y 6.0 0.3 en febrero 2005 (n = 4, con valores entre
5.85 y 6.31). Estos valores fueron utilizados a continuacin para la preparacin de las soluciones
vacuolares.

47

Presin osmtica / mOs

750

500

250

10

12

mes

Fig.7 Evolucin anual de la presin osmtica del jugo celular de betabel.


Para el betabel de origen local, los valores de la mayor osmolaridad coinciden con los meses de febreromarzo (promedio por arriba de 550 mOs), mientras que los valores de menor osmolaridad fueron
registrados en los meses de junio y julio (valores promedio opr abajo de 450 mOs). Diferentes
smbolos corresponden a diferentes aos, en los que fueron realizadas las mediciones. Los smbolos
corresponden a un promedio de ms de 3 races examinadas por mes, aunque en algunos casos valores
individuales son presentados.

4.2.2 Registros en configuracin attached.


Segn estudios anteriores, es considerado que el papel principal en la regulacin de la
actividad del canal SV por el lado vacuolar pertenece al Ca2+ libre (ver Pottosin y col., 2004 para
una revisin reciente). El aislamiento de la vacuola y su exposicin a soluciones con diferentes
concentraciones de Ca2+ pudieran influir en el nivel de Ca2+ vacuolar original (Fig.5C en
Metodologa), lo que causara un cambio en la probabilidad de apertura del canal SV y, por lo
tanto del valor reportado de calcio vacuolar libre. Para determinar la magnitud de sta
influencia, los registros en la configuracin attached fueron realizados aplicando diferentes
concentraciones de Ca2+ en el bao. Las corrientes de activacin del canal SV, evocadas en estas
condiciones, son mostradas en la Fig.8A.
La activacin del canal ocurra, tpicamente, en la aplicacin de un potencial de comando Ev
de 20 mV, sin embargo, en presencia de 1 mM Ca2+ en el bao, el umbral de activacin del
canal SV fue desplazado unos 20 mV a potenciales ms positivos, probablemente, debido a la
penetracin del Ca2+ externo a la vacuola y la consecuente disminucin de la probabilidad de
apertura del canal.
El estudio de la variacin de la concentracin de Ca2+ externo sobre la corriente del canal
unitario (Fig.8B,C) no revel tampoco tendencias muy notables en presencia de tanto bajas,
como altas concentraciones de Ca2+ en el bao, las relaciones I-V del canal de vacuola en vacuola
mostraron una gran diversidad, muy probablemente provocada por la presencia en las vacuolas de
otros componentes con la capacidad de bloquear el poro del canal (p.e., poliaminas, ver
p.1.2.2.3).

4.2.2.1 Potencial a travs de la membrana vacuolar.


El potencial E establecido con la tcnica patch clamp a travs de una membrana es igual a
la suma del potencial de comando aplicado Ev y el potencial propio de esta membrana Em:
E = Ev + Em.
Por lo tanto, la probabilidad de apertura determinada en los registros realizados en la
configuracin attached, fue corregida por el factor del potencial a travs de la membrana
vacuolar. ste fue determinado en la configuracin vacuola entera en condiciones de KCl 100
mM simtrico y en dependencia de las mismas concentraciones de Ca2+ en el bao, que las

49

0Ca

0.05Ca

250 pA
0.5 s

0.5 s

0.1Ca

0.2Ca

0.5 s

1s

0.5Ca

1.0Ca

1s

B
-200

1s

10

I / pA

-200

-100

100

10

I / pA

-100
100

200

V / mV

V / mV
-10

-10

-20

-20

1Ca
0Ca

200

-30

Fig. 8 Registros de las corrientes del canal SV en configuracin attached en presencia de


2+
diferentes niveles de Ca en el bao.
Los registros de la actividad del canal SV fueron obtenidos, aplicando en la pipeta 100 mM K+ y 2 mM de
Ca2+ para su mayor activacin. A. Registros originales. Desde el potencial de mantenimiento de -100 mV
fueron aplicados pulsos de voltaje hasta +160 con un paso de 20 mV. La concentracin de Ca2+ aplicada en
2+
el bao es mostrada en cada caso. B, C. I/V relaciones de canales SV unitarios en presencia de 0 mM Ca
2+
(B) y 1 mM Ca (C). Cada curva representa el promedio de 4-18 curvas corriente-voltaje, registradas en 3
2+
vacuolas a cada concentracin de Ca .

aplicadas en los experimentos en configuracin attached. A su vez, este potencial fue corregido
por el valor del potencial de unin lquida, originado por la presencia dentro de la vacuola de
grandes aniones orgnicos, y que constituy cerca de +8 mV. La dependencia del potencial a
travs de la membrana vacuolar es mostrada en la (Fig.9). Finalmente, fueron determinados los
potenciales de 1% de canales activos (V1%), resumidos en la Tabla 13.
TABLA 13. Potencial de 1% de canales SV abiertos en parches en configuracin attached en
dependencia de la concentracin de Ca2+ aplicada en el bao.
Concentracin de Ca2+ en el bao, mM

V1%, mV

14.4

0.05

2.1

0.1

11.3

0.2

3.9

0.5

14.9

1.0

+5.3
2+

El potencial V1% fue determinado en el rango 0-1.0 mM de Ca en el bao. La realizacin de registros en la


configuracin attached en presencia de mayores concentraciones de Ca2+ (2-10 mM) no fue posible por el aumento
de la rigidez de la membrana vacuolar en estas concentraciones. El valor de V1% fue determinado utilizando los fits
de los datos de la dependencia de voltaje de la probabilidad de apertura, obtenidos para el promedio de por lo menos
3 mediciones en diferentes vacuolas.

4.2.3 Concentraciones vacuolares fisiolgicas de K+, Na+, Ca2+ y Mg2+.


Una de las principales dificultades para la interpretacin de los registros electrofisiolgicos
del canal SV, obtenidos en trabajos anteriores, es la ausencia de datos sobre el entorno inico
presente en condiciones fisiolgicas. En este trabajo fueron determinadas las concentraciones de
los cationes fisiolgicos ms relevantes para la actividad del canal SV, resumidas en la Tabla 14.
Es necesario aclarar que los valores presentados corresponden a una serie de mediciones
realizadas en un lapso de tiempo pequeo (menos de 1 mes) en muestras de un solo origen, por lo
que no podemos presumir que estos valores sean fijos y similares a los presentes en muestras de
otro origen u obtenidas en otras estaciones del ao. No obstante, las concentraciones obtenidas
nos sirvieron de referencia para los fines de nuestro trabajo. A la vez fue aprovechada la
posibilidad de realizar la medicin de la concentracin vacuolar de Ca2+ libre, inicialmente
con fines de realizar una comparacin entre estos datos y los reportados por la actividad del
canal SV. Lamentablemente, como es mostrado en el p.4.2.7, la actividad del canal no pudo ser

51

10

V / mV

-5

-10
0.0001

0.01

lg[Ca2+]bao / mM

Fig.9 Dependencia del potencial a travs de la membrana vacuolar de la concentracin


de Ca2+, aplicada en el bao.
+

El potencial de la vacuola fue determinado en condiciones de 100 mM de K en la pipeta y en el bao en


la configuracin vacuola-entera (n>10 para cada concentracin) y calculando el potencial como Vvacuola
- Vcitosol. Debido a la presencia de aniones orgnicos, el potencial fue corregido por el valor del potencial
de unin lquida - alrededor de +8 mV (electrodo ms positivo), utilizando registros con solucin de 3M
KCl en la pipeta. Es notable el aumento del declive de la curva a concentraciones mayores a 1 mM de
Ca2+ en el bao. Esto sugiere una pronunciada activacin del canal SV, producida por el Ca2+ citoplsmico,
con la subsecuente entrada del Ca2+ a la vacuola.

utilizada para la medicin del Ca2+ vacuolar. No obstante, el mismo principio3 pudo ser aplicado
con la tcnica MIFE (Fig.10A), donde, sin embargo, no eran las corrientes del canal SV el evento
monitoreado, sino el flujo de Ca2+ a travs de la membrana vacuolar, posiblemente causado por la
actividad del canal SV. Como es mostrado en la Fig. 10B, el flujo registrado fue sensible al Zn2+
(100 M) bloqueador inespecfico del canal SV (Hedrich y Kurkdjian, 1988). El flujo
remanente registrado en la aplicacin de Zn2+ pudiera corresponder a otros canales permeables
para Ca2+, hasta ahora desconocidos. Adicionalmente, esta modificacin de la tcnica MIFE
(originalmente diseada para la medicin de flujos), aplicada en condiciones de ~5 M Ca2+
citoplsmico (por la contaminacin), permiti estimar la corriente del canal SV, acarreada por
Ca2+ (alrededor de 1 pA para una vacuola tpica de 50 m de dimetro), asumiendo que este
ltimo cruza el tonoplasto solamente a travs del canal SV (Fig.10A).
TABLA 14. Concentraciones de los cationes fisiolgicos ms relevantes en vacuolas de betabel
(Beta vulgaris L.).
Ion

Concentracin o actividad determinada

Tcnica de medicin

125.4 3.7 mM

Microelectrodos K+-selectivos

Na+

62 mM

Fotometra de flama

Mg2+

8.3 0.7 mM

Electrodos Mg2+ selectivos

Ca2+

0.196 0.179 mM
0.21 mM

Electrodos Ca2+ selectivos


Modificacin de la tcnica MIFE

El efecto del cambio de las concentraciones inicas vacuolares fue estudiado por separado y
en conjunto, para determinar sus efectos sobre la actividad final del canal SV.

4.2.4 Efecto del pH vacuolar sobre el umbral de activacin del canal SV.
El efecto del pH sobre la dependencia de voltaje de la probabilidad de apertura del canal
SV fue determinado en condiciones de 100 mM KCl simtrico, 2 mM Ca2+ y pH 7.5 en el lado
citoplsmico y aplicando en el lado vacuolar una serie de concentraciones de Ca2+ (0-10 mM) en
un fondo de pH 6.4 y pH 5.5. Las corrientes generadas en estas condiciones se muestran en la
Fig. 11. La dependencia de voltaje de la probabilidad de apertura obtenida fue satisfactoriamente
descrita por el modelo propuesto por Pottosin y col. (2004; Fig.13A) con valores de cargas de
3

Aplicacin de una fila de concentraciones de Ca2+ en el bao y determinacin, mediante interpolacin, del punto de
equlibrio, donde el flujo neto de Ca2+ a travs del tonoplasto debe ser nulo. Despus, utilizando la ecuacin de Nernst
determinacin del calcio vacuolar libre, teniendo en cuenta el potencial a travs del tonoplasto. Ver p.3.2.9 de
Metodologa, para ms detalles.
53

Flujo de Ca2+ / nmol m-2 s-1

2
2+

Reversin de flujo de Ca
a travs de la membrana vacuolar

0
2+

Flujo de Ca , correspondiente
2+
a condiciones de 5 mM Ca citoslico

-2

-4
100

Flujo de Ca / nmol m s

-2

-0.5

2+

[Ca2+] / mM

-1

10

-1.0

-1.5

testigo

+1.5 mM Mg

2+

+0.1 mM Zn

2+

Fig.10 Utilizacin de la modificacin de la tcnica MIFE para la estimacin de la


2+
concentracin del Ca vacuolar.

A. Aplicando en el bao soluciones con diferentes valores de [Ca ], fue obtenida la inversin del flujo de
Ca2+ a travs de la membrana vacuolar en la concentracin alrededor de 0.2mM, estimada como cercana
a la concentracin de Ca2+ dentro de la vacuola debido al pequeo potencial a travs del tonoplasto. Es
notable la activacin consecutiva del flujo de Ca2+ con el aumento de la concentracin de [Ca2+]cit hasta
0.05mM que, probablemente, representa la activacin del canal SV. En este caso, el valor del flujo a travs
del tonoplasto en condiciones de 0 Ca2+ en el bao, representa el flujo neto de Ca2+ a travs del canal SV
en condiciones de 5 mM de Ca2+, por la contaminacin del agua de las soluciones y la imposibilidad de
utilizar agente quelantes. B. Evidencias de que el flujo registrado es originado por el canal SV. La
2+
2+
aplicacin de 1.5 mM Mg en el citosol aumenta el flujo de Ca registrado en comparacin con el testigo
(probablemente, mediante la coactivacin del canal; ver texto). Al mismo tiempo, la aplicacin de 0.1 mM
2+
de Zn (bloqueador inespecfico del SV) causa la inhibicin del flujo por ms del 50%. El flujo restante
probablemente pertenece a los canales SV no bloqueados y/u otros canales, permeables a Ca2+, no
identificados hasta ahora.
Los valores del flujo son el promedio de 6-8 mediciones en vacuolas individuales.
2+

1s

pH 6.4

250pA

pH 5.5
500 pA

0Ca

0.01Ca

500 pA

0.1Ca

1.0Ca

10.0Ca

Fig.11 Registros de corrientes del canal SV en condiciones de pH vacuolar cido.


+

La actividad del canal SV fue registrada en parches aislados en condiciones de 100 mM de K


simtrico, 2 mM Ca2+ y pH 7.5 en el lado citoplsmico y diferentes concentraciones de Ca2+ en el
lado vacuolar en un fondo de pH 6.4 7.5. Los registros fueron realizados desde el potencial de
mantenimiento de -100 mV con un paso hasta +160 mV (para ms claridad aqu son mostrados con
un paso de 40 mV). Al igual que en condiciones de pH vacuolar neutro (pH 7.5), el canal SV
present sensibilidad al Ca2+ vacuolar - en condiciones ya de 0.05 mM de ste, son abolidas las
corrientes entrantes. Para ms claridad, los registros se muestran reflejados verticalmente, pero
representan las corrientes salientes del citoplasma, como establece la convencin de Bertl y
cols., (1992).

compuertas (z1=0.6 y z2=2.9), similares a las reportadas en ese trabajo (z1=0.7 y z2=2.9; Pottosin
y col., 2004), por lo tanto, el esquema general de las transiciones del canal del estado cerrado al
estado abierto no es afectado por la disminucin del pH vacuolar. La acidificacin del lado
vacuolar a pH 6.4 y 5.5 no tuvo efecto sobre la amplitud de las corrientes de los canales unitarios
(Fig.12). En contraste, la dependencia de voltaje de la probabilidad de apertura del canal mostr
un comportamiento particular con la disminucin del pH vacuolar (Fig.13A,B) en comparacin
con datos reportados anteriormente para un rango similar de Ca2+ vacuolar, pero en condiciones
de pH 7.5 (Pottosin y col., 2004). En presencia de bajas (0 mM) concentraciones de Ca2+, la
disminucin del pH desde 7.5 (referencia) hasta 5.5, no tuvo efecto notable sobre el potencial del
umbral de activacin del canal y sobre la dependencia de voltaje de su probabilidad de apertura
(Fig.13). Sin embargo, en el rango de concentraciones de 0.05-1.0 mM de Ca2+ stos mostraron
una consecutiva desensibilizacin al nivel de Ca2+ con la disminucin del pH, revelndose a pH
5.5 como una meseta en la dependencia del potencial V1% en funcin del Ca2+ aplicado en el lado
vacuolar (Fig.13B), con un potencial V1% promedio de 14.7 4.4 mV (valores entre 19.5 y
13.5 mV para un cambio de concentracin de Ca2+ en el rango 0.05-1 mM; comparar con el
desplazamiento del potencial V1% desde 63.2 hasta 21.0 en el cambio de concentracin de Ca2+
vacuolar de 0.01 a 0.05 mM.).

4.2.5 Efecto del Na+ vacuolar sobre la curva de activacin del canal SV en
condiciones de pH fisiolgico.
En nuestro trabajo, las vacuolas de betabel presentaron una concentracin de Na+
aproximadamente igual a la mitad de sta para K+ (ver Tabla 14, p.4.2.3). La regulacin del canal
SV por este ltimo cation, reportada previamente en el trabajo de Ivashikina y Hedrich (2005; ver
tambin p.1.2.2.5), y del Ca2+ vacuolar fue investigada en detalles en nuestro estudio. En
presencia de 0 Ca2+ vacuolar y en el fondo fisiolgico de K+ (125 mM), la aplicacin de Na+ en
concentraciones cercanas a las fisiolgicas (62 mM), caus un desplazamiento del potencial V1%
desde 61 mV hasta 48 mV (Fig.14A). Este efecto de disminucin de la probabilidad de
apertura del canal SV es evocado por Na+ de manera especfica, ya que la sustitucin de Na+ por
una concentracin equivalente de K+ no result en un desplazamiento del umbral de igual
magnitud (Fig.14A). A diferencia de esto, la probabilidad de apertura del canal en presencia en el
lado vacuolar de 62 mM Na+ y 0.5 mM Ca2+ en el fondo de 125 mM K+, es mayor, en
comparacin con la aplicacin de la misma concentracin de calcio pero en el fondo de una
56

pH 6.4
-200

10

I / pA

-100

100
10Ca

200

-10

-20
2.0Ca
1.0Ca

-30

0.5Ca
0.2Ca
0.01Ca
0.05Ca
0Ca

-40

pH 5.5
-200

10

I / pA

-100
100

10Ca

200

-10

-20
2.0Ca
1.0Ca
0.5Ca
0.2Ca
0.05Ca
0Ca
0.01Ca

-30

-40

Fig.12 Efecto del pH vacuolar sobre la relacin corriente-voltaje del canal SV unitario.
Las curvas corriente-voltaje fueron obtenidas con la aplicacin de rampas de voltaje de +200 a -200 mV
de 15 ms de duracin, en condiciones iguales a las de la Fig.10.
Aparentemente, el pH vacuolar aplicado no tuvo efecto sobre las corrientes del canal unitario, por lo que
los efectos del pH se deben al cambio en la probabilidad de apertura del canal y no involucran el bloqueo
de ste. Cada curva representa el promedio de n>20 registros.

A
NPo / NPomax

0 Ca
0.01 Ca
0.05 Ca
0.5 Ca
2 Ca
10 Ca

0.01

0.0001
-50

50

100

150

V / mV

B
60

pH 7.5

V1% / mV

pH 6.4

30

pH 5.5

0
-30
-60
-7

10 10

-5

0.01

0.1

Ca

2+

10

/ mM

Fig.13 Efecto del pH vacuolar sobre la dependencia de voltaje de la probabilidad de


apertura del canal SV.
Utilizando los registros de la Fig.11 fueron determinados los potenciales de 1% de canales abiertos
en presencia de diferentes concentraciones de Ca2+ en el lado vacuolar. A. Dependencia de voltaje
de las corrientes del canal SV en parches aislados con 0-10 mM de Ca2+ y pH 5.5 en el lado vacuolar,
ajustados con la ecuacin de Boltzman doble. El potencial de 1% de canales abiertos fue determinado y
utilizado para la construccin de la curva de calibracin (B). Las curvas para 0.1 y 0.2 mM Ca2+ estn
situadas entre las curvas para 0.05 y 0.5 mM de Ca2+ y fueron omitidas para ms claridad. Los puntos
son el promedio de 4-8 parches individuales y son presentados con la desviacin estndar.
B. Curvas de calibracin del potencial V1% en funcin del Ca2+ vacuolar y diferentes pH
vacuolares. La curva para pH 7.5 fue elaborada a partir de los datos de Pottosin y col., 2004 y es
presentada sin SD. Es notable la aparicin de un plato a pH 6.4 en el rango de 0.2-0.5 mM de Ca2+, que
se extiende al rango de 0.05-0.5 mM de Ca2+ a pH 5.5, sugeriendo una pequea especificad del canal SV
al Ca2+ dentro de estos rangos a pH vacuolar bajo.

A
NPo / NPomax

0 Ca
0.01

125 K
187 K
125 K + 62 Na

0.0001
-100

-50

50

100

150

V / mV

B
NPo / NPomax

0.5 Ca
0.01

125 K
187 K
125 K + 62 Na

0.0001
-100

-50

50

100

150

V / mV

Fig.14 Efecto del Na vacuolar sobre la dependencia de voltaje de la probabilidad


de apertura del canal SV.
El efecto del Na+ vacuolar fue estudiado en parches aislados en presencia de 100 mM K+ simtrico,
2 mM Ca2+ y pH 7.5 en el lado citoslico y las concentraciones sealadas de K+ y Na+ y pH 5.5
en el lado vacuolar. Los smbolos corresponden al promedio de por lo menos 3 parches individuales.
A. Efecto del Na+ vacuolar sobre la probabilidad de apertura del canal SV en ausencia de Ca2+
vacuolar. El recorrimiento del potencial del umbral de activacin del canal en presencia de 62 mM
de Na+ vacuolar es un efecto especfico, ya que no es evocado por una sustitucin equivalente de
Na+ por K+. B. Efecto del Na+ vacuolar sobre la probabilidad de apertura del canal SV en presencia
de 0.5 mM de Ca2+. A diferencia de los resultados en A, el Na+ vacuolar aumenta la probabilidad
de apertura del canal SV en presencia de Ca2+. Sin embargo, la comparacin de los efectos de Na+,
revela ms bien una dessensibilizacin del canal SV al Ca2+ vacuolar. En ambos experimentos los
datos fueron ajustados, utilizando el modelo matemtico, propuesto por Pottosin y cols., (2004).

concentracin equivalente de K+ (Fig.14B). Esta diferencia equivale a un desplazamiento del


umbral de activacin del canal SV por alrededor de 20 mV a potenciales ms negativos en
presencia de Na+ (Fig.14B). Esta aparente ambigedad del efecto de Na+ desaparece, si
comparamos las curvas de probabilidad de apertura con diferentes niveles de Ca2+: la
dependencia de voltaje de la probabilidad de apertura del canal en ambos casos es igual (V1% =
46 mV y 43 mV, respectivamente en condiciones de 0 y 0.5 mM Ca2+), y no presenta
sensibilidad al nivel de Ca2+ vacuolar aplicado (Fig.14).

4.2.6 Efecto conjunto de los cationes fisiolgicos ms importantes H+,


Na+, Mg2+, Ca2+ que modulan la cintica de activacin del canal SV.
El efecto conjunto del pH, Na+, Ca2+ y Mg2+ vacuolar, fue investigado en presencia de
concentraciones fisiolgicas de estos cationes (Na+ 62 mM, Mg2+ 8 mM y pH 5.5) en el
lado vacuolar y en un fondo de 100 mM de K+ y 2 mM de Ca2+ citoslico para una mayor
activacin de las corrientes generadas por el canal SV. En ausencia virtual de Ca2+ (Ca2+ libre
60 nM), la presencia de otros iones recorra el potencial V1% desde 76/78 mV
(respectivamente, a pH 5.5 y 7.5 y en ausencia de Na+, Ca2+ y Mg2+) hasta 40 mV (Fig.15). Al
igual que en los experimentos para mostrar el efecto del pH, la funcin de V1%([Ca2+]vac) present
una meseta en el rango de 0.05-0.5 mM de Ca2+ vacuolar (V1% = 18.7 3.8; valores de V1%
entre

22 y 13.5 mV). Sumados, estos dos factores ocasionaron un desplazamiento de la

dependencia de voltaje por tan slo 20 mV a potenciales ms positivos en un cambio de


concentracin de Ca2+ desde 0 hasta 0.5 mM de Ca2+ vacuolar. Para comparar, un mismo
cambio de concentracin de Ca2+ en condiciones de pH 7.5, 100 mM K+ y en ausencia de otros
cationes, causa el desplazamiento de la probabilidad de apertura por un valor casi 5 veces mayor
alrededor de 95 mV (Pottosin y col., 2004).
Este comportamiento de la curva de calibracin V1%([Ca2+]vac) se distingue drsticamente de lo
esperado en base a la curva de calibracin obtenida en experimentos con pH vacuolar 7.5 y en
ausencia de cationes excepto Ca2+ (Fig.13B; Pottosin y col., 2004), lo que hace ineficiente su
utilizacin para determinar el nivel de Ca2+ vacuolar libre: en experimentos en configuracin
attached, la determinacin del potencial V1% no permite resolver de una manera precisa la
concentracin de Ca2+ vacuolar en el rango bajo nanomolar-submilimolar.

60

A
NPo / NPomax

0 Ca
0.01 Ca
0.05 Ca
0.1 Ca
0.2 Ca
0.5 Ca
1 Ca
2 Ca

0.01

0.0001
-100

-50

50

100

150

V / mV

V1% / mV

60
30

pH 5.5
pH 5.5 +125 K
+62 Na +8 Mg
attacheds

0
-30
-60

0.01

0.1

10

Ca2+ / mM

2+

Fig.15 Efecto conjunto de los cationes fisiolgicos ms relevantes (H , Na , Ca ,


Mg2+) para la regulacin de la actividad del canal SV desde el lado vacuolar.
+

2+

Los registros, obtenidos en condiciones de (en mM): 125 K , 62 Na , 8 Mg , pH 5.5 y diferentes


concentraciones de Ca2+ en el lado vacuolar y 2 mM de Ca2+, pH 7.5 en el lado citoslico, fueron
utilizados para la determinacin de la probabilidad de apertura del canal SV en condiciones de
composicin vacuolar cercana a la fisiolgica. Registros ajustados con la ecuacin Boltzmann doble,
segun Pottosin y cols., 2004 (A). B. Curva de calibracin del canal SV en un entorno inico vacuolar
cercano al fisiolgico. Se nota el pequeo desplazamiento del potencial V1% en el rango de
concentraciones de Ca2+, cercano al que tiene lugar en las vacuolas intactas, lo que impide el uso del
canal SV como reportero intrnseco de la actividad de Ca2+ en la vacuola (en gris se muestran los
potenciales V1% de los registros en configuracin attached). Para comparar se muestras la curva de
calibracin del canal SV a pH 5.5 y en ausencia de otros cationes excepto Ca2+ (ver Fig.13). Los
registros son el promedio de 3-5 mediciones en parches aislados individuales.

4.2.7 Evaluacin de la actividad del canal SV en condiciones inicas


fisiolgicas.
La evaluacin de la probabilidad de apertura del canal a potenciales fisiolgicos en el
experimento anterior nos devuelve la actividad del canal SV en condiciones inicas fisiolgicas
en la vacuola. Sin embargo, este resultado es obtenido en condiciones de un alto Ca2+ en el lado
citoslico, utilizado en estos experimentos para evocar una mayor actividad del canal. Para
obtener una idea de la actividad bsica del canal en su entorno inico natural, en el lado
citoslico fueron aplicadas concentraciones cercanas a las que tienen lugar en las clulas vivas:
Ca2+ 0.1 20 M (respectivamente, para modelar condiciones de reposo o elevacin de calcio
citoslico), K+ 100 mM, pH 7.5. En estas condiciones en el citoplasma, adems, se encuentra
presente cierta cantidad de Mg2+ otro de los cationes que regulan la actividad del canal SV
(ver p.1.2.2.4), aunque no existen mediciones precisas de su actividad. El nivel de Mg2+ en el
citosol es estimado entre 0.3-1.0 mM en base de mediciones realizadas en el citoplasma de
clulas animales y escasas mediciones en plantas4 (Yazaki y col., 1988; Romani y Scarpa, 2000).
En nuestros experimentos fueron utilizadas soluciones citoslicas con 0.5 y 1.5 mM de Mg2+,
consideradas como abarcantes del rango que se puede presentar en las clulas vivas. Los registros
fueron realizados en parches aislados aplicando en el lado vacuolar la solucin empleada para
modelar el contenido vacuolar (ver p.4.2.6) y despus comparados con registros en configuracin
attached, obtenidos en la aplicacin de las soluciones citoplsmicas tanto en el bao, como en la
micropipeta.
Las corrientes del canal SV evocadas en condiciones de distintas concentraciones de Ca2+ y
Mg2+ citoslico en parches aislados y en configuracin attached, son mostradas en las Figs.16-19.
Es notable, que en presencia de tanto 0.5 como 1.5 mM de Mg2+, las corrientes originadas por 0.1
M de Ca2+ (condiciones de reposo) representan solamente alrededor del 10% de la corriente
originada en la aplicacin de 20 M de Ca2+ (condiciones de elevacin de Ca2+ cit, Fig.1619B), sin afectar drsticamente el potencial del umbral de activacin (alrededor de 60 mV en
parches aislados). En el caso de los registros en configuracin attached, la activacin del SV fue
registrada a los 40 mV en presencia de Ca2+ 20 M citoslico, y a 60 mV para condiciones de
reposo (0.1 M Ca2+) (Figs. 18,19). Esta diferencia en los valores del potencial del umbral de
4

Ver tambin Hawkesford M.J., Miller A.J. Ion-coupled transport of inorganic solutes. En: Blatt M.R. (Ed.)
Membrane transport in plants. Blackwell Publishing, CRC Press, 2004, p. 106.
62

1s
250pA

A
160
140

Ca 0.1 mM,
Mg2+ 0,5 mM
2+

120
100
80
60

O/Out
B
160

140

Ca 20 mM,
Mg2+ 0,5 mM
2+

120

100
80
60

Fig.16 Registros de corrientes del canal SV en parches aislados en condiciones


que modelan su entorno fisiolgico vacuolar y citoplsmico. I.
Los registros fueron obtenidos en un parche aislado en condiciones que modelan las fisiolgicas:
la solucin vacuolar contena (en mM): 125 K+, 62 Na+, 8 Mg2+, 0.25 Ca2+ y pH 5.5, determinadas
+
2+
como se menciona en el p.4.2.3; la solucin citoplsmica contena 100 mM K y 0.1 20 mM Ca
2+
en el fondo de 0.5 1.5 mM Mg y pH 7.5. Los registros fueron obtenidos desde un potencial de
mantenimiento de -100 mV aplicando pulsos de voltaje hasta +160 con un paso de 20 mV.
A,B - Registros en presencia de 0.5 mM Mg2+ citoslico y 0.1 mM (A) 20 mM (B) de Ca2+. Se
nota claramente que en presencia de 0.1 mM de Ca2+, se activa slo una pequea fraccin del total
de los canales SV presentes en el parche. Para ms claridad, los registros se muestran reflejados
verticalmente, pero representan las corrientes salientes del citoplasma, como establece la
convencin de Bertl y cols., (1992).

1s
250pA

160

140
120

Ca 0.1 mM,
Mg2+ 1,5 mM
2+

100
80
60

O/Out

B
160

Ca 20 mM,
Mg2+ 1,5 mM
2+

140

120

100
80
60

Fig.17 Registros de corrientes del canal SV en parches aislados en condiciones que modelan
su entorno fisiolgico vacuolar y citoplsmico. II.
Los registros fueron obtenidos en un parche aislado en condiciones que modelan las fisiolgicas: la solucin
vacuolar contena (en mM): 125 K+, 62 Na+, 8 Mg2+, 0.25 Ca2+ y pH 5.5, determinadas como se menciona en el
+
2+
2+
p.4.2.3; la solucin citoplsmica contena 100 mM K y 0.1 20 mM Ca en el fondo de 0.5 1.5 mM Mg y
pH 7.5. Los registros fueron obtenidos desde un potencial de mantenimiento de -100 mV aplicando pulsos de
2+
voltaje hasta +160 con un paso de 20 mV. A,B - Registros en presencia de 1.5 mM Mg citoslico y 0.1 mM (A)
2+
20 mM (B) de Ca . Al igual que en la Fig.16A, la corriente del canal SV en presencia de 0.1 mM de Ca2+
citoslico es una fraccin de la corriente total, evocada por la presencia de 20 mM de Ca2+. No obstante, en
comparacin con la Fig.16A,B se nota una mayor amplitud de las corientes originadas, probablemente, por el
efecto activador del Mg2+ citoslico. Para ms claridad, los registros se muestran reflejados verticalmente, pero
representan las corrientes salientes del citoplasma, como establece la convencin de Bertl y cols., (1992).

1s
250pA

A
160
140
120

Ca 0.1 mM,
Mg2+ 0,5 mM
2+

100
80
60

Attached
B

160
140

Ca 20 mM,
2+
Mg 0.5 mM
2+

120
100
80
60
40

Fig.18 Registros de corrientes del canal SV en parches attached en condiciones


que modelan su entorno fisiolgico citoplsmico. I.
Los registros presentados fueron obtenidos en parches attached en condiciones citoplsmicas, que
+
2+
2+
modelan las fisiolgicas (en mM): 100 mM K y 0.1 20 mM Ca en el fondo de 0.5 1.5 mM Mg y
pH 7.5. Los registros fueron obtenidos desde un potencial de mantenimiento de +100 mV
aplicando pulsos de voltaje hasta -160 con un paso de 20 mV.
A,B - Registros en presencia de 0.5 mM Mg2+ citoslico y 0.1 mM (A) 20 mM (B) de Ca2+.
Los registros fueron obtenidos de la misma vacuola.
El potencial sealado al lado de cada registro representa el potencial de comando aplicado y no est
corregido por el valor del potencial a travs del tonoplasto y por el potencial de unin lquida.

1s
250pA

A
160
140
120

Ca 0.1 mM,
Mg2+ 1,5 mM
2+

100
80
60

Attached
B
160

Ca 20 mM,
2+
Mg 1,5 mM
2+

140
120
100
80
60
40

Fig.19 Registros de corrientes del canal SV en parches attached en condiciones


que modelan su entorno fisiolgico citoplsmico. II.
Los registros fueron obtenidos en parches attached en condiciones citoplsmicas que modelan
+
2+
2+
las fisiolgicas (en mM): 100 mM K y 0.1 20 mM Ca en el fondo de 0.5 1.5 mM Mg y
pH 7.5. Los registros fueron obtenidos desde un potencial de mantenimiento de +100 mV
aplicando pulsos de voltaje hasta -160 con un paso de 20 mV.
2+
2+
A,B - Registros en presencia de 1.5 mM Mg citoslico y 0.1 mM (A) 20 mM (B) de Ca . Al
2+
igual que en la Fig.18, la corriente del canal SV en presencia de 0.1 mM de Ca citoslico es una
fraccin de la corriente total, evocada por la presencia de 20 mM de Ca2+.
El potencial sealado al lado de cada registro representa el potencial de comando aplicado y no est
corregido por el valor del potencial a travs del tonoplasto y por el potencial de unin lquida.

activacin entre los registros en configuracin attached y outside-out probablemente se debe a la


existencia del potencial a travs del tonoplasto, cuyo valor es cercano a los 20 mV de diferencia
entre los registros (+15-+17, en dependencia de la concentracin de Mg2+ aplicada).
Adicionalmente, en presencia de 0.1 M Ca2+, probablemente por la baja densidad de canales
abiertos en los parches, el umbral de activacin fue registrado a potenciales an ms positivos (a
+80, tomando en cuenta el potencial a travs del tonoplasto; Figs. 18-19A).
La normalizacin y descripcin de los datos obtenidos en parches aislados con el modelo
matemtico, propuesto por Pottosin y cols. (2004), nos devuelve la probabilidad de apertura del
canal a potenciales fisiolgicos (+15-+17 mV; Fig. 20) alrededor de 0.02% y cerca de
0.0004%, respectivamente en condiciones de mxima elevacin de Ca2+ cit (20 M Ca2+ y 1.5
mM Mg2+) y condiciones de reposo (0.1 M Ca2+ y 0.5 mM Mg2+). El anlisis de los datos
obtenidos en parches attached mostr que en stos la dependencia de voltaje de la probabilidad de
apertura del canal SV es muy similar a la obtenida en parches aislados; los valores de la
probabilidad de apertura a potenciales fisiolgicos para las diferentes concentraciones de Ca2+ y
Mg2+ en ambos casos son prcticamente iguales (Fig. 20).
Al igual que en trabajos anteriores (Pei y col., 1999; Carpaneto y col., 2001), tanto en parches
aislados, como en parches attached fue obtenido el efecto activador del Mg2+ citoslico, que se
revel en los experimentos con 1.5 mM Mg2+ como un aumento del nmero de canales abiertos
en comparacin con los registrados en presencia de 0.5 mM Mg2+ (Figs. 16-20). No obstante, este
incremento no fue producido por el desplazamiento del umbral de activacin, que se mantuvo
intacto (alrededor de los 60 mV) en experimentos en las ambas configuraciones empleadas. El
efecto descrito pudiera ser explicado, si asumir que en el tonoplasto existe un pool de canales SV
inactivos, activados por la presencia de Ca2+ (en bajas concentraciones) y/o Mg2+ en el citosol. En
otras palabras, Ca2+ y Mg2+ aumentan el nmero de canales que pueden ser activados por voltaje
y regulan el equilibrio de los estados activo-inactivo, en los que puede encontrarse el canal.

67

A
NPo / NPomax

1
0.01

Parches aislados

0.0001

0.1mM Ca , 1.5 Mg
2+

2+

20mM Ca , 1.5 Mg
2+

1e-006

2+

0.1mM Ca2+, 0.5 Mg2+


20mM Ca , 0.5 Mg
2+

1e-008

50

100

V / mV

2+

150

200

NPo / NPomax

1
0.01

Parches attached
0.0001

0.1mM Ca2+, 1.5 Mg2+


20mM Ca2+, 1.5 Mg2+

1e-006

0.1mM Ca2+, 0.5 Mg2+


20mM Ca2+, 0.5 Mg2+

1e-008

50

100

150

200

V / mV

Fig.20 Comparacin de la modulacin de la probabilidad de apertura del canal SV por


cationes fisiolgicos ms relevantes en parches aislados y en configuracin attached.
En base de la amplitud de las corrientes macroscpicas del canal SV y de la corriente del canal unitario,
determinada en la Fig.16, fue determinada la probabilidad de apertura del canal SV en condiciones cercanas
a las fisiolgicas. A. Probabilidad de apertura del canal en parches aislados. Los puntos son el promedio de
2+
por lo menos 3 registros en parches individuales. Ya que en condiciones de 0.1mM Ca citoslico las
corrientes evocadas constituan una fraccin del total de canales, presentes en los parches, la normalizacin
fue realizada respecto a la corriente en condiciones de la mxima activacin obtenida (20 mM Ca2+, 1.5 mM
Mg2+). B. Probabilidad de apertura del canal en parches en configuracin attached. Los puntos son el promedio
de 6-11 parches obtenidos en 2-3 vacuolas diferentes. El potencial a travs de la membrana vacuolar fue corregido
por el valor del potencial del tonoplasto: +15 mV en 0.5 mM Mg2+ y +17 mV en 1.5 mM Mg2+. Las corrientes
fueron normalizadas a la corriente mxima. Como referencia se emplearon las fracciones de las corrientes mximas
normalizadas en condiciones de 20 mM Ca2+, 1.5 mM Mg2+ ( ) y 0.1 mM Ca2+, 0.5 mM Mg2+ ( ), obtenidas en los
parches aislados.

4.3 Discusin.
A diferencia de estudios anteriores, en los cuales el canal SV emerga como un canal
verstil que responde a la aplicacin de diferentes estmulos y reagentes, los datos de nuestro
trabajo revelan un alto nivel de control de la actividad del canal SV por su entorno inico, que se
revela en una buferizacin de la actividad del canal en rangos bastante estrechos, en los cuales
la probabilidad de apertura del SV es relativamente insensible incluso al nivel de Ca2+ vacuolar
en el rango micromolar-milimolar uno de los factores propuestos como de mayor importancia
para la determinacin de la actividad del canal (Pottosin y col., 2004).
Efectos del pH sobre la actividad del canal SV.
El efecto del pH vacuolar sobre la probabilidad de apertura del canal SV fue estudiado en dos
trabajos, en clulas de guarda de Vicia (Schulz-Lessdorf y Hedrich, 1995) y en vacuolas de
Hordeum (Pottosin y col., 1997). En el primer caso fue mostrada una disminucin de la
probabilidad de apertura del canal con la acidificacin del contenido vacuolar, aunque sta
disminucin fue obtenida en presencia de 1 mM de Ca2+ y 5 mM de Mg2+ dentro de la vacuola.
Pottosin y col. (1997, en Hordeum) sealaron que en presencia de concentraciones de Ca2+ en el
rango 0.05-2 mM de Ca2+ dentro de la vacuola, la disminucin del pH vacuolar no tiene efecto
sobre la probabilidad de apertura del canal SV (a diferencia del desplazamiento del umbral de
activacin de 20 a +40 mV en la disminucin del pH vacuolar de 7.5 a 5.5, en ausencia de Ca2+
vacuolar).
En el presente estudio es mostrado que la disminucin del pH vacuolar no tiene efecto sobre el
potencial V1% en condiciones de nulo calcio vacuolar, lo que significa que el valor de pK para los
grupos funcionales (sitios de unin con Ca2+, ver abajo) en el caso de vacuolas de raz de betabel
no vara para los estados cerrados y abierto del canal y, por lo tanto, la protonizacin no ocurre
preferentemente en ninguno de los estados. En el rango de Ca2+ vacuolar de 0.05-1.0 mM en la
dependencia de voltaje de la probabilidad de apertura del canal aparece una meseta en la curva de
calibracin del potencial V1% (Fig.13B). Este fenmeno pudiera deberse a que en condiciones de
pH vacuolar bajo disminuye la afinidad al Ca2+ de uno de los estados cerrados del canal,
probablemente por la competencia entre dos cationes H+ y Ca2+ (Schulz-Lessdorf y Hedrich,
1995; Pottosin y col., 1997). El cambio de pH de 7.5 a 5.5 en el lado vacuolar caus una

69

disminucin poco significativa de la corriente del canal unitario SV (Pottosin y col., 2004;
presente estudio, Fig.12) al igual que en el trabajo de Schulz-Lessdorf y Hedrich (1995).
Efectos del Na+ vacuolar sobre la actividad del canal SV
Recientemente, Ivashikina y Hedrich (2005) en Arabidopsis mostraron que el aumento de la
concentracin del Na+ vacuolar causa el desplazamiento del umbral de activacin del canal hacia
potenciales ms positivos, disminuyendo as la probabilidad de apertura del canal (ver p.1.2.2.2
para ms detalles), lo que podra sirvir como mecanismo para la disminucin de la liberacin
proveniente de la vacuola de excedentes txicos de Na+ al citoplasma durante el estrs salino. De
manera similar, nuestros datos sealan que, en ausencia de Ca2+ en el lado vacuolar el Na+ causa
un desplazamiento especfico de la probabilidad de apertura del canal a potenciales ms positivos
(ms significativo que el provocado por los cationes monovalentes en general, p.e. K+ [Fig.13A],
o cationes monovalentes orgnicos [Pottosin et al., 2005]). Sin embargo, el estudio de los efectos
conjuntos de Na+ vacuolar en presencia de Ca2+ vacuolar revel, ms que nada, una
desensibilizacin de la dependencia de voltaje de la probabilidad de apertura del canal SV al
nivel de Ca2+ cercano al presente en la vacuola (Fig.14B). La naturaleza de este efecto especfico
del Na+ vacuolar se desconoce, pero pudiera tratarse de una competencia entre el Na+ y el Ca2+
vacuolares por un sitio de unin al canal.
A pesar de la ambigedad de la modulacin del canal SV por Na+ vacuolar, este efecto
requiere un estudio ms detallado, ya que en condiciones fisolgicas potencialmente puede jugar
un papel importante en la resistencia de las plantas al estrs salino.
Efecto conjunto de los cationes fisiolgicos ms importantes para la regulacin de la actividad
del canal SV
La actividad del canal SV en condiciones inicas vacuolares cercanas a las fisiolgicas no ha
sido previamente estudiada. Como muestra la Fig.15, en estas condiciones la actividad del canal
SV se encuentra rigurosamente mantenida en un estrecho rango, que, en trminos de un
desplazamiento de la dependencia de voltaje del canal, representa menos de 20 mV alrededor del
rango de Ca2+ vacuolar estimado. Posiblemente, esta fuerte buferizacin de la actividad del
canal SV le permite desarrollar sus funciones en las diversas condiciones presentes en las
vacuolas de distintos tejidos de las plantas, caracterizadas, al menos, por una gran diferencia en la
concentracin total de Ca2+ presente (ver.p1.1.2).

70

Adicionalemente, para fines de nuestro estudio, este resultado signific la imposibilidad del
uso del canal SV como reportero intrnseco de la actividad del Ca2+ dentro de las vacuolas lticas
de betabel, como muestra la colocacin del potencial V1% de los registros realizados en parches
attached sobre la curva de calibracin del canal SV. No obstante, existe la posibilidad de que el
mtodo propuesto para la medicin del Ca2+ vacuolar pudiera ser aplicado a otros objetos de
estudio, por ejemplo vacuolas de clulas aleurnicas, que, a diferencia de las vacuolas lticas,
presentan un pH lumenal neutro, y en las cuales se ha reportado la presencia de canal SV (Bethke
y Jones, 1997).
Modelacin del entorno inico del canal SV y estimacin de la actividad del canal SV. La
elevacin fisiolgica del Ca2+ citoslico es suficiente para evocar la liberacin de Ca2+ inducida
por Ca2+.
La modelacin de las concentraciones de los cationes fisiolgicos ms importantes que
regulan la actividad del canal SV requiri la determinacin previa de esas concentraciones, ya
que a pesar de que son ampliamente especuladas en la bibliografa, existen contados estudios
dedicados a la determinacin de la actividad inica en compartimientos especficos. Un ejemplo
de sto es la actividad de Ca2+ dentro de la vacuola, postulada como de rango milimolar, despus
de la medicin realizada por Felle (1988) en vacuolas de dos especies de plantas. En nuestro
estudio fue determinado que, al menos en las vacuolas de las races de betabel examinadas, la
concentracin de Ca2+ libre es menor en un orden de magnitud a lo establecido en la literatura
(Tabla.15).
Adicionalmente, utilizando la tcnica de microelectrodos ionoselectivos fue determinada la
concentracin vacuolar de otro cation fisiolgico abundante y pobremente estudiado Mg2+,
que, a diferencia del Ca2+, en nuestro objeto de estudio se encuentra en niveles milimolares
(Tabla.14). Lamentablemente, la concentracin citoslica de Mg2+ tampoco ha sido objeto de
estudios detallados en clulas de plantas superiores, por lo que para la estimacin de la actividad
TABLA 15. Comparacin de la actividad de Ca2+ dentro de la vacuola, reportada en diferentes
objetos de estudio.
Valor de [Ca2+]vac / mM
2.3
1.5
0.2

Objeto de estudio
Riccia fluitans (rizoides)
Zea mays (races)
Beta vulgaris (races)

Referencia
Felle, 1988
Presente estudio

71

del canal SV en condiciones cercanas a las fisiolgicas, fueron aplicadas concentraciones


consideradas como abarcantes del rango de Mg2+ libre en el citoplasma de las clulas vegetales,
estimado en base a estudios de la actividad de Mg2+ en clulas animales (Romani y Scarpa.,
2000).
Para establecer la relevancia de los cationes ms importantes para la actividad del canal SV en
condiciones fisiolgicas, as como para determinar la actividad (el nmero de canales abiertos) en
diferentes condiciones de Ca2+ (que modelan los estados reposo y elevacin de calcio de la
clula) y Mg2+, fue realizada una comparacin de los registros en las configuraciones outside-out
(modelando el entorno citoslico y vacuolar) y attached (empleando las soluciones citoslicas
anteriores) (Fig. 20). A pesar de cierta diferencia, las curvas de probabilidad de apertura
obtenidas en ambas configuraciones resultaron ser muy similares, al igual que los valores de la
probabilidad de apertura del SV a potenciales fisiolgicos (Fig. 20). Esto indica que en las clulas
vivas la actividad de los canales SV, al menos en gran medida, es determinada por las
concentraciones de los principales cationes inorgnicos presentes (K+, H+, Na+, Ca2+ y Mg2+ en el
lado vacuolar, y Ca2+ y Mg2+ en el citosol).
Como siguiente paso, para estimar la magnitud de la corriente de Ca2+ generada en
condiciones fisiolgicas de calcio citoslico elevado (20 M Ca2+), as como para determinar si
pueden los canales SV mediar la liberacin de calcio inducida por calcio, es necesario realizar
una comparacin de los datos obtenidos con las diferentes tcnicas (patch-clamp, MIFE),
descritas en el presente trabajo. Para una vacuola tpica de 50 m de dimetro (con un rea A =
d2 = 7,850 m2) obtenemos una corriente por vacuola en condiciones de Ca2+ citoslico elevado
igual a:
I ( pA/vacuola ) = inpA = 0.1 8 0.0002 7,850 = 1.26 ,
donde i (pA/canal) corriente del canal unitario (alrededor de 100 fA; Gradmann et al., 1997;
Allen et al., 1998); n (canal/m-2) densidad de canales, alrededor de 8 canales por m2 (Igor
Pottosin, datos no publicados); p (sin unidad) probabilidad de apertura del canal a potenciales
fisiolgicos (0,0002; valor obtenido de la curva de probabilidad de apertura, Fig. 20); A
(m2/vacuola) rea de la membrana vacuolar. Este valor corresponde, aproximadamente, a
unos 13 canales SV abiertos en condiciones de Ca2+ citoslico elevado, a potenciales fisiolgicos
(Fig. 21). Es interesante notar, que este nmero de canales abiertos se presenta en un total de

72

Total de canales
por vacuola

NPo / NPomax
1

10,000
0.01
100
0.0001
1
1e-006
0.01
1e-008

50

150

100

200

V / mV
20mM Ca2+, 1.5 Mg2+
0.1mM Ca , 0.5 Mg
2+

2+

Fig.21 Estimacin de la actividad del canal SV en condiciones fisiolgicas.


El nmero aproximado de canales fue estimado en base a la densidad de 8 canales / mm (Igor Pottosin, datos
no publicados) para una vacuola tpica de 50 mm de dimetro. En condiciones de elevacin de Ca2+ citoslico
el nmero estimado de canales activos por vacuola es aproximadamente 13 (corresponde a la fraccin de 0,0002
canales activos por vacuola en estas condiciones, ver Fig. 20), mientras que en condiciones de reposo en estado
abierto se encuentran menos de un canal por vacuola.
El nmero de copias del SV calculado sobrepasa los 10,000 (~62,000) por vacuola.
Para ms claridad, son mostrados nicamante los registros obtenidos en las concentraciones abarcantes de Ca2+
y Mg2+.
2

canales SV calculado de ms de 60,000 por vacuola, lo que constituye un valor mayor al nmero
de canales, tomado como referencia en la literatura (Pottosin y Schnknecht, 2007).

Un clculo similar para los datos, obtenidos con la tcnica MIFE, nos devuelve:
I ( pA/vacuola ) = zFJA = 2 9.65 10 4 3 109 7.85 109 = 4.55 ,
donde z (sin unidad) carga elctrica del ion analizado; +2 para Ca2+; F (Coul/mol)
constante de Faraday (carga elctrica de un mol de sustancia; 9,65104 Coul/mol); J (mol m-2 s-1)
flujo de iones; en nuestro caso flujo de Ca2+, registrado con la tcnica MIFE; A
(m2/vacuola) rea de la membrana vacuolar.
Las corrientes de Ca2+ calculadas, salientes de la vacuola, son del mismo orden de magnitud;
la diferencia entre los dos valores determinados podra ser causada por: i) la contribucin de
canales hasta ahora desconocidos con permeabilidad para Ca2+ (diferentes del SV); 2) la
sobreestimacin del flujo de Ca2+ por la tcnica MIFE; 3) posibles errores de extrapolacin al
rango de bajas probabilidades de apertura y/o 4) por la subestimacin de la fraccin de la
corriente de Ca2+ en condiciones fisiolgicas. Sin embargo, los valores estimados son del rango
de pA, y por lo tanto pueden causar una significante y rpida elevacin del Ca2+ en el citoplasma
(Pottosin y Schnknecht, 2007). En otras palabras, la elevacin del Ca2+ citoslico es suficiente
para provocar la liberacin de calcio inducida por calcio, mediada por los canales SV de la
membrana vacuolar.
Por otra parte, en condiciones fisiolgicas deben existir factores-reguladores adicionales que
controlan esta activacin, ya que como es mostrado en el p.1.1.4, Tabla 1, no todos los estreses
que causan la elevacin del Ca2+ citoslico provocan la liberacin de Ca2+ desde la vacuola. El
estudio de las condiciones en las que se origina la liberacin de Ca2+ desde la vacuola durante
esos estreses (fro, sequa) pudiera, tal vez, revelar el mecanismo regulador adicional que le
permite al SV u otro canal permeable a Ca2+, hasta ahora desconocido, participar en la liberacin
de Ca2+ inducida por Ca2+.

74

5. Estudios de canales permeables a Ca2+ del RE.

5.1 Introduccin.
En general, la tcnica de deshidratacin-rehidratacin mostr ser adecuada para la
formacin de liposomas gigantes, aunque se tuvieron ciertos problemas de carcter tcnico
respecto a la optimizacin desde la cantidad de membrana a utilizar, hasta los tiempos y las
condiciones requeridas para la obtencin de liposomas adecuadas para la realizacin de registros
con la tcnica de patch clamp. Con visualmente buenas preparaciones fue logrado obtener sellos
de alta resistencia (2-7 GOhm) con un alto rendimiento (ms del 50%). En stas pudieron ser
obtenidas las cuatro configuraciones bsicas para la realizacin de registros con la tcnica patch
clamp: attached, inside-out, un anlogo del whole-cell liposoma entera, y outside-out. Las
configuraciones attached e inside-out presentaron resultados idnticos (Fig.22), mientras que la
configuracin liposoma entera mostr en la mayora de los casos un alto nivel de fuga
inespecfica. Probablemente esto se debe a que las liposomas no representan vesculas
completamente cerradas y, por lo tanto, carecen de potencial de membrana y las concentraciones
inicas en su interior son iguales a las del bao. Entonces, las configuraciones recomendadas para
el estudio con la tcnica de patch clamp son las de parche aislado inside-out y outside-out. La
utilizacin de estas dos orientaciones inversas de la membrana podra ayudar a investigar los
efectos de moduladores desde ambos lados de la membrana del RE, as como verificar la
orientacin preferente de la membrana de los liposomas gigantes.

5.2 Resultados.
Finalmente, se pudo caracterizar un canal catinico del retculo endoplsmico no reportado
previamente. Algunas de las carctersticas de este novedoso canal son mencionadas a
continuacin.

75

Fig.22 Registros de un canal catinico del RE, previamente no reportado.


Los registros de corrientes en liposomas de membranas de retculo endoplsmico revelaron la presencia
de un canal catinico (PCl / PK < 0.03) no selectivo de una conductancia alrededor de 165 pS.
A. Registros de corrientes de canales unitarios del RE, evocadas por una rampa de voltaje de +150 a
+
-150 mV de 15 ms de duracin. El potencial de reversin para K es sealado. Las condiciones de
los experimentos son sealadas en cada caso. B. Fragmento de la relacin corriente-voltaje del canal
unitario. Se puede observar que el potencial de inversin del canal coincide con el potencial de equilibrio
+
para K , por lo que se concluye que el canal no presenta selectividad entre K+ y Na+.

5.2.1 Selectividad.
La selectividad del canal fue estudiada aplicando la tcnica de rampas para determinar el
potencial de inversin de la corriente del canal. Aplicando pulsos de 15 ms de duracin de +150 a
-150 mV fueron registradas las corrientes de canales unitarios en gradientes de 10K/100K o
10K/100Na (pipeta-bao, respectivamente). Esto permiti demostrar la selectividad para cationes
(PCl/PK < 0.03) del nuevo descubierto canal y la ausencia de selectividad especfica para K+ o Na+
(Fig.22).
Estudios preliminares de la permeabilidad a Ca2+ fueron realizados mediante la aplicacin de
un gradiente bi-inico (150Ca/100K, respectivamente para la micropipeta y el bao) y la
obtencin de la curva corriente-voltaje del canal unitario. El potencial de inversin obtenido en
estas condiciones es de cerca de 30 mV (Fig. 23) y corresponde a una permeabilidad relativa PCa /
PK 3.5. La conductancia del canal para Ca2+ y K+, determinada en estas condiciones, fue de 157
pS para ambos.

5.2.2 Modulacin por voltaje.


La modulacin del nuevo descubierto canal por voltaje fue estudiada mediante la aplicacin
de pulsos rectangulares de 140 hasta +140 con un paso de 40 mV desde un potencial de
mantenimiento de 60 mV. En estas condiciones fue determinada la activacin del canal
estudiado, aparentemente de manera transitoria (Fig.24). Interesante, que el cambio del signo
del potencial de mantenimiento a +60 mV disminua el tiempo de inactivacin del canal en
comparacin con la inactivacin presentada a 60 mV (Fig.24). Igualmente es interesante la
activacin espontnea del canal en la aplicacin de rampas de voltaje de +150 a 150. Al
contraste, el cambio del signo del potencial de mantenimiento (de 60 a +60, como en el caso
anterior) y la aplicacin de rampas de voltaje invertidas (150 / +150 mV) result en una
actividad reducida durante la rampa.

5.3 Discusin.
Como es mostrado en este trabajo, la combinacin de las tcnicas de patch-clamp y de
lipososmas gigantes permite realizar de una manera efectiva el estudio de canales inicos
localizados en la membrana del retculo endoplsmico. A continuacin son mencionados algunas
de las limitantes y ventajas del mtodo desarrollado.
77

I / pA

10

100 KCl

150 CaCl2

-10

Er = 30 mV

-20
150

-100

-50

50

100

V / mV

2+

Fig.23 Datos preliminares de permeabilidad para Ca del canal descubierto en el RE.


2+

La permeabilidad a Ca fue estudiada en condiciones bi-ionicas 150Ca2+/100K+ en protocolos de rampa


(+150 / -150 mV). En estas condiciones la corriente del canal presenta su inversin al potencial de +30
mV, correspondiente a una permeabilidad relativa PCa/PK ~3.5 y una conductancia de 157 pS igual para
Ca2+ y K+.

Fig.24 Modulacin de la actividad del canal del RE por voltaje.


Los registros fueron obtenidos en parches aislados mediante la aplicacin de pulsos de voltaje de
+140 a -140 mV, con un paso de 40 mV. Aparentemente, el canal se activa de manera transiente.
La inactivacin resulta ms prolongada a potenciales de mantenimiento de -60 mV, en comparacin
con +60 mV.

Las principales limitantes encontradas son las siguientes:


La tcnica elaborada por nosotros requiere la purificacin previa de la fraccin membranal,

correspondiente al RE. Este procedimiento pudiera traer como consecuencias: la prdida de


protenas solubles que pudieran participar en la regulacin de los canales inicos, cambios
en la estructura de los canales u otras protenas a ser estudiadas. No obstante, las mismas
limitaciones las tiene el nico mtodo empleado actualmente para el estudio de las
propiedades electrofisiolgicas de los canales del ER la tcnica de incorporacin de
protenas a bicapas lipdicas, que, sin embargo, ha permitido realizar el estudio de los
canales-receptores de IP3 del RE de clulas animales (ver, p.e., Tu y col., 2005).
La orientacin de los canales puede no coincidir con su orientacin fisiolgica, por lo que

existe cierta incertidumbre en el tipo de configuracin en la que son realizados los registros
con la tcnica de patch-clamp.
Las ventajas principales del mtodo desarrollado que permiten posicionarlo como el ms
apropiado hasta el momento para el estudio de canales inicos de las membranas del retculo
endoplsmico, son:
La rapidez relativa de la tcnica. Debido a que las protenas del retculo endoplsmico no

pasan por el proceso de purificacin, el tiempo de preparacin de la muestra se reduce


considerablemente en comparacin con el mtodo convencional.
El entorno lipdico de los canales queda intacto, lo que permite determinar las

caractersticas del canal en un entorno ms cercano al natural, sin lpidos adicionales. Esto
permite realizar los registros electrofisiolgicos en condiciones lo ms cercanas posible a
las que se dan en el retculo endoplsmico intacto.
Los registros presentados ms arriba muestran la presencia en liposomas gigantes de retculo
endoplsmico de un canal catinico que no conduce aniones (Cl) y posee una alta permeabilidad
para K+, Na+ y Ca2+, similar al canal formado por el receptor de ryanodina en el retculo
endoplsmico de clulas animales. Sin embargo hay diferencias cuantitativas entre estos dos
canales, principalmente, en valores de conductancia para K+ y la sensibilidad al Ca2+.
La dependencia de voltaje del canal estudiado en betabel (Fig.24) es diferente a la reportada
para los canales permeables a Ca2+ del retculo endoplsmico de Bryonia y Lepidium: BCC1 y
LCC1 son activados nicamente por potenciales positivos; nuestro canal no presenta este tipo
80

rectificacin (Klsener y col., 1995; 1997; 1999). Por lo tanto, se puede afirmar que fue
registrado un canal novedoso, cuyo mecanismo de funcionamiento y sensibilidad a moduladores
quedan por ser estudiados. Al igual que en los trabajos de Klsener y col. (1995) no fue detectada
ninguna actividad de canales inicos en la agregacin de IP3 (2 M). Estos resultados pudieran
sugerir que el receptor de IP3 no forma parte de la estructura del canal permeable a Ca2+, sino que
pudiera estar acoplado a ste ltimo, lavndose durante el proceso de purificacin de la fraccin
membranal del retculo endoplsmico. Otra opcin pudiera ser que los canales-receptores de IP3
no se encuentran presentes (al menos, en cantidades determinables con las tcnicas
electrofisiolgicas actuales) en los tejidos de la raz napiforme de betabel, ya que se ha
demostrado que en preparaciones vesiculares el IP3 es capaz de evocar la liberacin del Ca2+
almacenado (aunque en otra fraccin membranal y en otra especie de planta; Schumaker y Sze,
1987).

81

6. Conclusiones.

1. El nivel de Ca2+ libre en vacuolas de raz de betabel (Beta vulgaris) es de alrededor de 0.2 mM
un valor 10 veces menor, que el establecido en la literatura para las vacuolas de clulas
vegetales.
2. En condiciones que modelan el entorno inico fisiolgico vacuolar del canal SV, ste presenta
una sensibilidad disminuida a la variacion de Ca2+ vacuolar en el rango fisiolgico, por lo que
no puede ser utilizado como reportero intrnseco para la medicin de la actividad del Ca2+ en
vacuolas de raz de betabel. En estas condiciones (caracterizadas, bsicamente, por los niveles
vacuolares de cationes fisiolgicos abundantes K+, Na+, Ca2+, Mg2+ y H+), la actividad del
canal SV se encuentra mantenida (buferizada) en un rango estrecho.
3. La comparacin de los registros obtenidos (i) mediante la modelacin del entorno inico
fisiolgico vacuolar y citoplasmtico del canal SV en parches aislados, y (ii) mediante la
modelacin del entorno inico citoplasmtico del canal SV en parches attached, revela la
semejanza de la dependencia de la probabilidad de apertura del canal SV en ambos casos. La
elevacin del Ca2+ citoslico en el rango 0.1-20 M no afecta a la dependencia de voltaje del
canal; ms bien incrementa el nmero de canales activables por voltaje.
4. Datos obtenidos con las tcnicas de MIFE y patch-clamp sugieren que en condiciones de Ca2+
citoslico elevado (varios M) la actividad de los canales SV permite una liberacin de Ca2+
de alrededor de picoamperios por vacuola; esta corriente es suficiente para mantener la
liberacin de calcio inducida por calcio (LCIC).
5. El uso combinado de las tcnicas de liposomas gigantes y de patch clamp (por primera vez
en clulas vegetales) permiti registrar canales inicos en membranas del retculo
82

endoplsmico. Empleando esta combinacin, fue descubierto en membranas de retculo


endoplsmico un canal catinico permeable a Ca2+ no descrito previamente. El canal fue
caracterizado: determinada su selectividad y modulacin por voltaje, pero todava requiere
estudios adicionales.
6. Lamentablemente, en experimentos preliminares para la bsqueda de canales activados por
ligandos, al igual que en trabajos previos, no fue detectada actividad alguna evocada en la
aplicacin del ligando intracelular IP3. Sin embargo, la relativa sencillez de la tcnica de
liposomas gigantes pudiera permitir en un futuro la determinacin en membranas del RE de
canales activados por ligandos.

83

Agradecimientos

A Dios, por ayudarme a concluir esta tesis.


Se agradece a la Q.B.B Ligia Brito Argez, tcnico-acadmico del Centro de Investigacin
Cientfica de Yucatn (CICY), Mrida, por su invaluable comprensin y apoyo en la obtencin
de las membranas de RE y la obtencin de las liposomas gigantes.
Se agradece al Ph.D. Tim Wherret, de la Universidad de Tasmania, Hobart, por la
realizacin de las mediciones con microelectrodos ionoselectivos y la tcnica MIFE, y por
compartir los resultados obtenidos para los fines del presente trabajo.
La realizacin de esta tesis fue posible gracias al apoyo financiero otorgado por el Consejo
Nacional de Ciencia y Tecnologa (CONACYT) para la realizacin del proyecto 38181N a cargo
del Dr. Igor Pottosin del Centro Universitario de Investigaciones Biomdicas, Universidad de
Colima.
Personalmente, le agradezco profundamente al Dr. Igor Pottosin su dedicacin al trabajo y
su apoyo a mi establecimiento en Colima para la realizacin de esta tesis. A l, mis ms sinceras
gracias por mantener firmes mis pies en la tierra.
A todas las otras personas, que aunque no las menciono aqu merecen mis agradecimientos
de todo corazn, tan solo por existir.

84

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101

Appndice

TABLA I. Obtencin de bajos valores de calcio libre para registros en configuracin attached.

[Ca2+] deseada / M

CaCl2 / M

EGTA / mM
(Kd 3.38e-05)

HEDTA / mM
(Kd 5.53e-06)

[Ca2+] libre / M

<0.1
50

660

2
-

~0.03
50.6

TABLA II. Obtencin de bajos valores de calcio libre para la determinacin del efecto del pH sobre

la actividad del canal SV.


pH

[Ca2+] deseada / M

CaCl2 / M

EGTA / mM (Kd

HEDTA / mM (Kd
5.53e-06, pH 6.4)

(Kd 9.0 e-06, pH 5.5)

EDTA / mM

[Ca2+] libre/ M

<0.1
10
50
<0.1
10
50

2,600
4,250
0
650
660

2
1
-

5
5
5
-

~0.009
9.67
47.5
~0.03
10.2
50.6

5.5

6.4

3.38e-05, pH 6.4)

TABLA III. Obtencin de bajos valores de calcio libre para la determinacin del efecto conjunto de

los mayores cationes fisiolgicos sobre la actividad del canal SV (pH 5.5).
[Ca2+] deseada / M

CaCl2 / mM

EDTA / mM
(Kd Ca2+ 9.0e-06)

[Ca2+] libre / M

<0.1
10

2.6

5
5

~0.03
9.0

TABLA IV. Preparacin de soluciones citoplsmicas para experimentos de modelacin de

condiciones fiosolgicas.
Mg2+ /
mM
0.5

1.5

[Ca2+]
deseada /
M

MgCl2 / mM

CaCl2 / mM

(KdCa 3.4e-04,
KdMg 1.1, pH 5.5)

EGTA / mM

NTA / mM (KdCa

0.1

2.0

2.9

0.52

0.1

20

2.5

0.76

0.51

21.9

0.1

3.5

2.0

2.9

2.5

1.52

0.1

20

3.5

0.28

1.52

22.7

6,73e-03, KdMg
1.86e-01, pH 5.5)

[Mg2+] libre/ mM [Ca2+] libre/ M

102