Eider Ignacio Garca Gaspar

Temas selectos de bioingeniera I: Desarrollo de frmacos

Gerardo Blancas Flores

Electroforesis bidimensional

 Objetivo.
La electroforesis bidimensional se basa en separar las protenas en una mezcla segn
sus dos propiedades moleculares, una en cada dimensin. El procedimiento ms usado
se basa en la separacin en una primera dimensin mediante isoelectroenfoque y la
segunda dimensin segn peso molecular mediante electroforesis en poliacrilamida.

Metodologa a seguir.

Preparacin de la muestra: Es el paso ms crtico y clave en el xito del experimento.

En l se emplean agentes caotrpicos, surfactantes y agentes reductores. Los agentes
caotrpicos como la urea y tiourea, provocan la desnaturalizacin de las protenas por
ruptura de puentes de hidrgeno, dejando expuestos los residuos hidrofbicos que son
solubilizados por los agentes surfactantes. Los agentes reductores como el DTT
completan la desnaturalizacin proteica por ruptura de puentes disulfuro.
Separacin en la 1 Dimensin (Isoelectroenfoque): primer lugar las protenas se
separan en base a su punto isoelctrico en gradientes de pH inmovilizados (IPGs).
Separacin en la 2 Dimensin (SDS-PAGE): Una vez que las protenas han sido
separadas en funcin de sus propiedades elctricas, pasamos a separarlas en funcin de
su tamao o peso molecular mediante la electroforesis en geles de acrilamida en
presencia de dodecil-sulfato sdico (SDS). Estas dos separaciones sucesivas permiten
aislar prcticamente todas las protenas de un proteoma en una matriz bidimensional
Tincin: Para visualizar las protenas en el gel, stas deben ser teidas de alguna
manera. La eleccin del mtodo de tincin viene determinado por diferentes factores,
como la sensibilidad deseada, rango lineal, facilidad de uso, precio y tipo de equipo de
adquisicin de imagen disponible. Los mtodos ms usados son la tincin con Coomassie
Blue, la tincin fluorescente con Sypro Ruby y la tincin con Plata.
Adquisicin y Anlisis de Imagen: La habilidad para adquirir datos en formato digital
es uno de los principales factores que hace a los geles bidimensionales ser un prctico
medio para recoger informacin sobre un proteoma. Antes de que los geles donde
hemos separado las protenas puedan ser analizados con un sistema de evaluacin de
imgenes, stos deben ser digitalizados. Los instrumentos de adquisicin de imgenes
ms comnmente usados son los densitmetros (GS800) y los escneres de
fluorescencia (FX ProPlus). Todos ellos funcionan con softwares de anlisis diseados
para detectar y cuantificar spots en las imgenes digitales as como para comparar y
analizar estadsticamente los geles de inters.
Desventajas.

Afecta la estructura de la protena y por lo tanto afecta la funcin de la misma.

Ventajas
Separacin de protenas en una solucin
Visualizacin y cuantificacin del numero de protenas en una solucin
Un anfolito siempre se detiene en la zona en la que el pH coincide con su punto
isoelctrico. Gran
repetitividad: los resultados no estn sujetos a variaciones debidas a las condiciones
experimentales, tales como la diferencia de potencial elctrico aplicada.
Gran poder de resolucin.
La muestra se puede colocar en cualquier zona del medio de soporte, en la zona cercana
al ctodo, al nodo o en el centro del mismo.

Espectrometra de masas

Objetivo

La espectrometra de masas (EM) es una tcnica de anlisis basada sobre la separacin de

acuerdo a sus razones masa/carga de las especies cargadas formadas a partir de la ionizacin de
una muestra. Se trata de una tcnica extremadamente sensible, de gran versatilidad, suministra
informacin muy valiosa sobre los compuestos qumicos: la masa molecular, la frmula global y,
a partir del patrn de fragmentaciones, la estructura molecular. as como la composicin
isotpica en sustancias naturales o marcadas.

Mtodo a seguir.

El proceso de anlisis por espectrometra de masas es sumamente complejo, se explica

solamente de forma muy resumida un fundamento del mismo. La espectrometra de masas est
basada en el diferente comportamiento que presentan los iones que se forman por las diferentes
tcnicas de ionizacin, al atravesar campos elctricos y magnticos. As dichos iones son
separados en funcin de su relacin masa/carga(m/z) y detectados posteriormente. Un
espectrmetro de masas consta de varios componentes bsicos:

Dispositivo de introduccin de la muestra

Cmara de ionizacin o fuente, donde se generan los iones a partir de las sustancias
qumicas a analizar

Analizador, que diferencia los iones generados en funcin de su relacin m/z

Detector que produce una seal elctrica amplificada para cada uno de los iones
generados

As, una vez separadas las sustancias en el cromatgrafo, es necesario ionizar las molculas y
obtener iones en fase gaseosa. Este proceso tiene lugar en la fuente de ionizacin y actualmente
existen diferentes tcnicas que permiten llevar a cabo dicha ionizacin. Entre las ms
importantes destacan la ionizacin electrnica, que se basa en el bombardeo de electrones o la
ionizacin qumica, donde la ionizacin se realiza a travs de choques con molculas
previamente ionizadas como metanol. Para el acoplamiento con los cromatgrafos de lquidos, la
ionizacin a presin atmosfrica (API) ha tenido un gran xito ya sea mediante la modalidad de
electrospray o la denominada ionizacin qumica a presin atmosfrica, siendo la ms empleada
en la mayora de los equipos.
Una vez generados los iones son introducidos en el analizador, existiendo distintas modalidades,
siendo el ms usado el denominado cuadrupolo debido a su gran robustez para anlisis de rutina
y su relativo bajo costo comparado con otros como la trampa de iones o los analizadores de
tiempo de vuelo. Este analizador se compone de 4 barras alargadas conectadas elctricamente
entre s en pares opuestos a los que se le aplica un voltaje variable y, para un voltaje dado, slo
los iones con una m/z determinada presentarn una trayectoria estable y podrn ser detectados
(iones resonantes) mientras que el resto son expulsados del cuadrupolo y no llegan al detector
(iones no resonantes).
Ventajas

Identificacin inequvoca de de casi cualquier tipo de de substancia, desde tomos hasta

molculas complejas de peso molecular elevado
Anlisis cuantitativo y cualitativo
Identificacin de una substancia en presencia de otras similares
Alta sensibilidad
Tcnica universal y especifica
Informacin isotpica
Informacin estructural, energas de enlace, cintica, fisicoqumica, etc.
Tcnica rpida (anlisis en lnea en tiempos reales, control de procesos enzimticos,
metablicos, etc.)

Desventajas

Tcnica destructiva, la muestra no se puede recuperar al haber sufrido la fragmentacin

Necesidad de un diseo experimental adecuado.

ADN recombinante
Objetivo

El ADN recombinante es resultado del uso de diversas tcnicas que los bilogos moleculares
utilizan para manipular las molculas de ADN. El proceso consiste en tomar una molcula de
ADN de un organismo, sea virus, planta o una bacteria y en el laboratorio manipularla y ponerla
de nuevo dentro de otro organismo. Esto se puede hacer para estudiar la expresin de un gen,
para producir protenas en el tratamiento de una enfermedad gentica, vacunas o con fines
econmicos y cientficos
Metodologa a seguir.
El proceso de produccin de un ADN recombinante comienza con la identificacin desde un
organismo de una secuencia de ADN de inters con el fin de propagarlo en otro organismo que
carece de la secuencia y, por ende, del producto protico de esa secuencia de ADN. As se
pueden producir cantidades ilimitadas de la protena codificada por el susodicho gen. En
trminos simples, el procedimiento consiste en:

Localizacin de genes y sus funciones.

Clonacin del ADN, y su posterior almacenamiento en genes.

Reaccin en cadena de la polimerasa (PCR)

Utilizacin de vectores de expresin

Ventajas

Mucho ms rpido y preciso.

Se transmiten slo los genes deseados.
Obtencin de productos en mucha mayor cantidad.
Permite la obtencin de fragmentos de ADN de tal tamao que pueden ser estudiados y
manipulados. Para ello se utilizan enzimas de restriccin y retrotranscriptasas.
Permite la clonacin gnica para la obtencin de gran cantidad de fragmentos de ADN, lo
cual puede conseguirse a travs de la clonacin molecular y mediante la tcnica PCR.
Permite la identificacin de segmentos de ADN que puedan tener inters cientfico o
industrial (farmacutico, por ejemplo).
Permite la determinacin de la secuencia de nucletidos de fragmentos de ADN.
En el campo mdico: produccin de sustancias con efectos teraputicos, diagnstico de
enfermedades hereditarias, identificacin de genes humanos especficos y terapia gnica
(reemplazo de genes defectuosos por normales).
En el campo agrcola: mejora de plantas cultivables, resistencia a herbicidas, plagas y
enfermedades microbianas, incremento del rendimiento fotosinttico, mejora de calidad
en productos agrcolas, ...
En el campo ganadero: mejora en la productividad, resistencia a enfermedades,
produccin de protenas de valor farmacolgico

Desventajas

Como sucede siempre, provienen o pueden proceder del mal uso de las tcnicas
mencionadas, lo cual es motivo de preocupacin por los riesgos e implicaciones que
pueden derivarse
Evitar aspectos del progreso que atenten contra la dignidad humana, y que las
posibilidades cientficas no generen peligrosidad por falta de definiciones ticas.
Establecen una serie de limitaciones por motivos ecolgicos, sanitarios, morales, sociales,
polticos,... En concreto y en resumen, se trata, sobre todo, de:
La salvaguarda de la dignidad y los derechos humanos (tema fundamental).
la evitacin de desastres ecolgicos.
el impedir el desarrollo o aparicin de enfermedades (que pudieran ser incontrolables).