Minisatellite polymorphisms of the SLC6A19: Susceptibility in

hypertension

So-Young Seol a, Sang-Yeop Lee a,b, Young-Dae Kim c, Eun-Ju Do a, Jeong-Ah Kwon a,
Seung Il Kim d,
In-Sun Chu b,*, Sun-Hee Leem a,*
Department of Biological Science, Dong-A University, 840 Hadan-2-dong, Saha-gu, Busan 604-714, Republic of Korea
Medical Genomics Research Center, KRIBB, Daejeon 305-806, Republic of Korea
c Department of Internal Medicine, College of Medicine, Dong-A University, Busan 602-714, Republic of Korea
d Proteomics Team, Korea Basic Science Institute, Daejeon, 305-806, Republic of Korea
a

Polimorfismos mini satlites del SLC6A19: Susceptibilidad en la hipertensin

Resumen
El SLC6A19 es un homlogo humano de B 0 AT1 que codifica un transportador de
aminocidos neutros. Examinamos la distribucin del VNTR (nmero variable de
repeticiones en tndem; mini satlites) y se realizaron anlisis polimrfica de
SCL6A19 aislado del ADN genmico de los controles y las familias multi
generacionales. Se descubri que el SLC6A19 contena siete bloques de mini
satlites, 3 de los cuales (SLC6A19-MS1, -MS4 y -MS7) mostraron polimorfismo y
resultaron ser transmitidos a travs de la meiosis, siguiendo la herencia
mendeliana en siete familias. Estos polimorfismos mini satlite pueden ser
marcadores tiles para el mapeo de la paternidad y la huella de ADN. Adems, se
realiz un estudio de casos y controles en el que se compar el ADN genmico de
400 controles y 205 casos con hipertensin esencial (tambin llamada
hipertensin primaria, esta por definicin, no tiene una causa identificable). Una
asociacin estadsticamente significativa fue identificada entre los raros alelos
SLC6A19-MS7 y la aparicin de la hipertensin (OR, 7,87; intervalo de confianza
del 95%, 0.88-70.66; y p = 0,028). Estos hallazgos sugieren que el raro alelo
SLC6A19-MS7 puede ser un factor de riesgo para la hipertensin.
Palabras clave

La hipertensin esencial/primaria;

Transportador de neurotransmisores;

VNTR;

Polimorfismos mini satlites;

SLC6A19

El SLC6 (familia transportadora del soluto 6), familia de protenas actan como
transportadores especficos para los neurotransmisores, aminocidos, y osmolitos.
Toda la familia de protenas SLC6 se puede dividir en los siguientes cuatro
subgrupos: GABA (cido -aminobutrico), monoaminas, AA (aminocidos) y
Hurfanos. Miembros de la familia SLC6 son conocidos por jugar un papel
importante en una serie de condiciones patolgicas, y varios miembros de la
familia SLC6 son potenciales objetivos de drogas que estn siendo continuados
actualmente por la industria farmacutica [2], [5], [11] [27]. El grupo de hurfanos
de la familia SLC6 incluye SLC6A15, SLC6A16, SLC6A17, SLC6A18, SLC6A19 y
SLC6A20. El SLC6A forma un clster de filognesis con SLC6A19 y
SLC6A20 [11]. Adems, SLC6A18 estaba presente en la parte secuenciada de
una biblioteca en un proyecto de secuenciacin del ADNc a gran escala y anotado
automticamente como Xtrp2 [22]. Los patrones de expresin de SLC6A18 y
SLC6A19 se han encontrado cantidades abundantes en el cerebro anterior [11]y el
rin. Adems, se ha informado de que el gen murino XT2 , que es homlogo al
gen SLC6A18 humano, se asocia con hipertensin [23]. Adems, el SLC6A19 en
humanos y de ratones recientemente demostr ser capaz de transportar los
aminocidos neutros [16]. Por otra parte, se sabe que mutaciones en el gen
SLC6A19 puede causar la enfermedad renal conocida como trastorno de Hartnup,
que es un trastorno metablico hereditario que involucra el transporte de ciertos
aminocidos (por ejemplo, triptfano e histidina) en el intestino delgado y los
riones.
Una comparacin de las regiones sintticas del genoma del ratn y del humano
revel la presencia de dos genes transportadores hurfanos en el cromosoma
humano 5p15, que posteriormente fueron clasificados como SLC6A18 y SLC6A19
por la organizacin del genoma humano [11]. Se observ una unin relativamente
fuerte entre la hipertensin humana y la regin 5p15 [24] y [28]. Esta regin
codifica los genes de la B Xtrp (SLC6A18) y 0 AT1 (SLC6A19), que son homlogas
a la zona del cromosoma de ratn 13. Estos transportadores SLC6A18 y SLC6A19
son altamente expresados en el rin [11].Adems, la interrupcin del gen

XT2 causa la hipertensin [23]. Tomados juntos, estos resultados indican que los
transportadores de la familia hurfanos pueden causar hipertensin en los seres
humanos. Recientemente hemos llevado a cabo un estudio en el que se inform
de la distribucin de VNTRs de SCL6A18 [29].
Sin embargo, no se encontraron diferencias significativas en la distribucin global
de estos mini satlites, lo que indica que estos polimorfismos no son responsables
de la susceptibilidad de la hipertensin esencial (EH) en la poblacin coreana.
El SLC6A18 y SLC6A19 se encuentran cerca de los telmeros en los brazos p
del cromosoma 5. Los mini satlites humanos son secuencias altamente variables
TR (repeticiones en tndem) que se encuentran principalmente en las regiones
sub-telomericas del cromosoma [12] [25], que es donde se localizan hTERT, sck1 /
SLI, MUC2 y SLC6A18 [13], [17], [18] [29]. Algunos alelos minisatlites estn
asociados con trastornos humanos y con la expresin diferencial de los genes
cercanos[1], [3], [10], [19] [21], y las variantes de VNTR se asocian con un alto
riesgo de una variedad de enfermedades [13] [15].
Por lo tanto, analizamos siete nuevos mini satlites de toda la regin SLC6A19
para determinar si haba alguna importancia funcional putativa a la variacin
allica en estos mini satlites con respecto a la susceptibilidad para la hipertensin
esencial. Para determinar el genotipo de los polimorfismos de SLC6A19, se
analizaron 400 muestras de ADN genmico obtenido de la sangre de individuos
normales, as como a partir de muestras obtenidas a partir de siete familias multi
generacionales. Adems, se investig la posible asociacin de SLC6A19 con
hipertensin en los coreanos.
Materiales y mtodos
Los resultados de anlisis que provienen de la base de datos para el tndem
repiten la regin de SLC6A19. Todas las regiones de secuencias de ADN
analizados en este estudio se basan en secuencias genmicas del SLC6A19
(longitud en 1-101,999 pb,Fig. 1) y se han reunido por la UCSC (> hg18_dna
rango = CHR5: 1.250.001-1352000) y el NCBI (> ref | NC_000005.8 | NC_000005:
1.250.001-1352000 Homo sapiens cromosoma 5, conjunto de referencia; la
secuencia completa).

El software buscador de repeticin del Tandem se utiliz para detectar VNTR y

otras regiones repetidas. Unidades de repeticin entre 10 y 100 pb de longitud que
anot > 300 en el algoritmo del programa se seleccionaron para su posterior
anlisis.

Fig. 1.

Mini satlites en SLC6A18. (A) Estructura de la regin genmica en torno a

SLC6A19. Se prev que 19 exones (cajas negras) codifican a SLC6A19. Las
posiciones aproximadas de mini satlites identificados por el Programa de
Buscador de repeticiones en tndem [4] se indican mediante asteriscos y nmeros
(MS1, 2, 3, 4, 5, 6, y 7). (B) Las secuencias representan siete unidades de
repeticin mini satlite.

Todos los primeros utilizados en este trabajo fueron diseados utilizando software
Primer3 (http://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3_www.cgi) [26]. Los
siguientes cebadores se construyeron sobre la base de la secuencia de
ensamblado por el UCSC: MS1, F-GGGTGCTGCAGGATTTGGGTA & RTCAGGCCCAGCATTCGTATATGT;MS2, F-CCTGGGCCAGCCACTGACTC & RCGAGCACAGCGCAGATTGGA; MS3, F-GCAGAGCCCACACCCTCTCG & RGGGGACAGCTAGGCAGGATGG; MS4, F-GCTGCACTGGGCAGGTGAGA & RTGGCTGGGATGGGCTACTCC; MS5,

F-TGTGTGCATGCATGGGGTGT

&

R-

CGTGCACATGAACACAGGCACA; MS6, F- GCAGCCTGTGAGGCCCTGTC & RATATGGGGGCGGGGCATGT; MS7,

F-CATGGCAATGGTGCCACCTG

&

R-

TGAGGAATGTCCCCAGGCAGA.
Preparacin de ADN genmico a partir de linfocitos de sangre perifrica.
Se analizaron los individuos no relacinados sanos para evaluar el grado de
polimorfismo mini satlite en SLC6A19. Adems, se realiz un estudio de casos y
controles en los que el ADN obtenido a partir de 400 controles sanos se compar
con el ADN obtenido de 205 individuos con hipertensin esencial (Tabla 1). Los
pacientes fueron clasificados como hipertensos cuando tenan una presin arterial
sistlica (PAS) de> 140 mmHg o una presin arterial diastlica (PAD) de> 90
mmHg. Adems, las personas que estaban tomando actualmente la medicacin
para la hipertensin tambin fueron clasificadas como hipertensas. Por el
contrario, los controles normotensos tenan una SBP de menos de 130 mmHg y
una DBP de menos de 85 mmHg. El rango de edades y el sexo de los controles
normotensos e hipertensos se muestran en la Tabla 1. Adems, las muestras que

se obtuvieron de siete grupos familiares multigeneracionales.; cinco familias de

dos de generaciones y dos familias de tres generaciones. Todas las muestras se
obtuvieron de dos hospitales diferentes en dos ciudades diferentes (Dong-A
Hospital Universitario [# IRB-06.10.02 y IRB-07-10-7; Busan, Corea] y Chungbuk
Hospital Universitario Nacional [# IRB-2006 -1; Cheongju, Corea]). Para los
experimentos de PCR, el ADN genmico se aisl a partir de leucocitos perifricos
que fueron tomadas de 400 litros de sangre entera usando el Blood y Cell Culture
DNA Mini Kit (Qiagen, CA).

Fig. 2.
La frecuencia allica y los patrones electroforticos de SLC6A19 mini
satlites. Los patrones allicos de cada mini satlite se muestran en la parte
superior (patrones electroforticos) de cada panel (A-G). La frecuencia
allica, el tamao de los productos PCR y nmero de repeticiones se
indican en la parte inferior de cada panel. Los mini satlites se amplificaron
por PCR apartir del ADN genmico de muestras de control usando
cebadores de diagnstico (Materiales y Mtodos). Se analizaron tres
patrones polimrficos de diferentes genotipos con 6 alelos para MS1 (a), 2
alelos para MS4 (D) y 5 alelos para MS7 (G). Se encontr que las otras

cuatro regiones minisatlite (B, C, E, y F) son monomrficos. Los

marcadores de tamao (M) se dan en pares de bases (pb o 100
marcadores de tamao 1 kb). Patrones de haplotipos se numeran de
acuerdo a cada minisatlite. H muestra la heterocigosidad de cada
minisatlite en los controles.

Anlisis de polimorfismos en los minisatlites SCL6A19.

Los cebadores utilizados para analizar los polimorfismos genticos se disearon
basndose en la secuencia genmica SLC6A19. El ADN del genoma humano
aislado de la sangre completa se amplific utilizando estos cebadores de PCR
bajo condiciones estndar [29]. Los productos de PCR fueron analizados por
electroforesis en gel (1 V / cm) en 1 TAE amortiguador a travs de un gel de
agarosa al 1.0-2.0% en funcin de sus tamaos esperados.
Los anlisis estadsticos. En general, el grado de polimorfismo de un rango de 0 a
1 se incrementa con el nmero de alelos. Para evaluar la probabilidad de que dos
alelos escogidos al azar sean diferente (heterocigoto) en un locus dado, se utiliz
la siguiente frmula:

Donde x i 2 es la frecuencia de los alelos del alelo i TH en cada locus

minisatlite [8].
Los anlisis de regresin se realizaron para determinar las posibilidades ratio (OR)
de la asociacin entre los grupos de control y de casos. La OR se estim
utilizando el logaritmo natural y su error estndar. En su caso, se utiliz una
prueba de ji cuadrado con un grado de libertad para evaluar las diferencias entre
los grupos. Las diferencias significativas se determinaron utilizando un intervalo de
confianza (IC) del 95%. Todas las pruebas fueron de dos caras, con p <0,05 que

se consider estadsticamente significativo. Los anlisis estadsticos se realizaron

con MS Excel con el software estadstico PRUEBA.CHI y R (v2.5.1, www.rproject.org) utilizando la funcin de prueba de chi-cuadrado para calcular los
valores de chi-cuadrado.
Resultados y discusin
Polimorfismos minisatlite en SLC6A19
El ADN genmico SLC6A19 se compone de 19 exones y 18 intrones, y el anlisis
de la secuencia del gen entero SLC6A19 (de la base de datos NCBI y UCSC)
permiti la identificacin de siete repeticiones en tndem. Una bsqueda en la
base de datos de GenBank utilizando el programa BLASTN revel que no exista
similitud significativa entre los siete nuevos minisatlites y regiones previamente
identificadas. Por lo tanto, todos los minisatlites examinados en este estudio son
exclusivos de SLC6A19, y las propiedades que confieren pueden ser directamente
relacionados con la funcin de SLC6A19. La longitud de estas repeticiones, sus
ubicaciones y secuencias de consenso se presentan en la Fig. 1.
El grado de polimorfismo dentro de los minisatlites se examin mediante PCR
utilizando cebadores de diagnstico contra muestras de ADN genmico humanos
aislados de individuos de control. Se analizaron 200 controles para determinar si
eran polimrficos o no; sin embargo, despus se determin que era un minisatlite
locus polimrfico, aumentamos el nmero de muestras. Los seis alelos en la
regin promotora de SLC6A19 - MS1 identificados a partir de las muestras de
control oscilaron de 400 817 a 1,041 mil pb de longitud y contenan 48 a 62 copias
de

la

unidad

de

repeticin (Fig 2.A)

que

mostraron

la

ms

alta

heterocigosidad (h = 0,663 ) en la regin SLC6A19. Adems, SLC6A19-MS2, que

tambin se encontr en la regin promotora, exhibi un patrn monomrfico en las
muestras de control 200 (Fig. 2 B).
Dos regiones minisatlite (SLC6A19-MS3 y -MS4) se identificaron en el intrn
2 (Fig. 2 C y D). No se observaron polimorfismos en SLC6A19-MS3 (Fig 2. C); sin

embargo, SLC6A19-MS4 se encontr que era polimrfica, con 2 a 2,5

repeticiones (Fig. 2 D).Adems, dos minisatlites en el intrn 3 y el intrn 4,
SLC6A19-MS5 y SLC6A19-MS6(Fig. 2 E y F), se encontr que eran monomrficos
en 200 individuos. Por ltimo, el nmero de repeticiones en SLC6A19 - MS7, que
estaba situado en el intrn 9, vari de 6 a 14, con 8 repeticiones estando
presentes en el alelo ms comn (95,4% de frecuencia) (Fig2. G).
En resumen, se identificaron siete nuevos minisatlites en SLC6A19, tres de los
cuales fueron polimrficos y cuatro de los cuales fueron monomrficos. La alta
densidad de los minisatlites en este gen puede estar relacionado con su
ubicacin cerca del telmero, que es similar a lo que ocurre en los genes hTERT y
SLC6A18 [14], [18] [29].

Fig. 3.
Herencia

meitica

de

SLC6A19

minisatlites

en

una

familia

de

tres

generaciones: MS1 (A), MS4

(B) y MS7 (C). Se utilizaron
cebadores
especficos

de
para

PCR
SLC6A19

minisatlites para analizar la

longitud de los minisatlites
en el ADN genmico obtenido
a partir de miembros de la
familia. El pedigr demuestra la relacin entre los grupos familiares utilizado
en este estudio: primera generacin (carriles 1 y 2; el abuelo y la abuela,
respectivamente); segunda generacin (carriles 3 y 4; padres y madres); y
tercera generacin (carriles 5 y 6, los nios de los padres 3 y 4). M
corresponde al marcador de tamao.

Herencia mendeliana de minisatlites polimrficos en SLC6A19

Para realizar un anlisis de la segregacin de los minisatlites polimrficos, se
seleccionaron grupos familiares de dos y tres generaciones (4 y 3 familias,
respectivamente). A continuacin, se recogi sangre de los padres y de 1 a 3
nios de cada familia. Se identificaron alelos del SLC6A19-MS1, -MS4 y -MS7 y su
transmisin remonta de padres a hijos en siete de las familias evaluadas. Los
resultados revelaron que VNTR en SLC6A19 estn sujetos a la herencia
mendeliana (es decir, los nios llevaron 1 VNTR alelo de cada padre; Fig. 3), y los
nuevos alelos minisatlite no se observaron durante este anlisis.
Los minisatlites en el gen SLC6A19 eran meioticamente estables en las siete
familias evaluadas en este estudio, lo que indica que estos polimorfismos podran
ser tiles como marcadores de la segregacin meitica. Tomados en conjunto,
estos resultados sugieren que los marcadores minisatlites SLC6A19 identificados
aqu se podran utilizar para la cartografa de la paternidad y la huella de ADN por
PCR y gel electrofortico simple sin la necesidad de equipo especial.
La relacin entre la hipertensin y la susceptibilidad de los alelos SLC6A19minisatlites
De acuerdo con estudios realizados por Rice et al. [24] y Wu et al. [28], hay
relativamente fuerte vnculo entre la hipertensin humana y 5p15. El SLC6A19
hurfano es altamente expresado en el rin [11] y alelos raros (variantes allicas)
de minisatlites se asocian con un alto riesgo de diversos tipos de
enfermedades [1], [13] [15]. Por lo tanto, en este estudio, se determin la variacin

allica de estos minisatlites para determinar si estaban relacionados con la

susceptibilidad para la hipertensin. Para lograr esto, se compar la distribucin y
frecuencia de los alelos minisatlite SLC6A19 polimrficos (SLC6A19 -MS1, -MS4
y -MS7) de los pacientes con hipertensin, la edad y el sexo, controles
emparejados. El presente estudio fue diseado para examinar la relacin de
variantes minisatlites del gen SLC6A19 con hipertensin arterial en una poblacin
coreana.
Un estudio de casos y controles se realiz para comparar el ADN obtenido de 400
controles de todas las edades con el ADN obtenido de 205 pacientes con
hipertensin(Tabla 1). La tabla 2 resume la frecuencia de los alelos minisatlite
para los genes SLC6A19 -MS1, -MS4 y -MS7 entre los grupos de control y la
hipertensin. Cuando se compararon el grupo control y los grupos de hipertensos,
no hubo diferencias significativas observadas en la frecuencia de alelos de los
minisatlite para los genes SLC6A19 - MS1, -MS4, y -MS7. Para un anlisis ms
detallado, cada alelo minisatlite se agrupo en dos conjuntos (alelos comunes y
raros) en funcin de su frecuencia en la poblacin control. La frecuencia esperada
de alelos raros era 1%. No hubo diferencias en las frecuencias de alelos de la
SLC6A19 - MS1 y -MS4 loci observada entre los controles y los casos
EH (Tabla 2). La Tabla 2 resume la frecuencia de alelos raros y comunes para el
gen SLC6A19 - MS7 entre casos y controles . El gen SLC6A19 - MS7 tiene tres
alelos comunes para 6, 8, y 14 repeticiones y dos alelos raros que son 7 y 9
copias de la repeticin de longitud (Tabla 2 y Fig. 2 G). En los pacientes con
hipertensin arterial, la frecuencia de los alelos raros de SLC6A19 - MS7 fue de
0,98%, mientras que fue de 0,12% en los controles (Tabla 3). El anlisis de estos
datos revel una asociacin estadsticamente significativa entre los alelos raros y
las probabilidades de hipertensin (SLC6A19 - MS7 para la hipertensin: OR,
7,87; IC del 95%, 0,88-70,66; p = 0,029).
La tabla 4 resume la frecuencia de alelos raros de SLC6A19 - MS7 segn la edad
al momento del diagnstico. Una comparacin de los controles y casos mostr las
siguientes diferencias en la relacin de asociacin entre EH y alelos raros en

jvenes y mayores pacientes: ms joven, p = 0,0447 vs. mayor p = 0,237. La

frecuencia de los alelos raros fue mayor en los casos ms jvenes (<60 aos) que
en los casos de mayor edad (60 aos). Estos resultados sugieren que los alelos
raros pueden estar asociados con EH genticamente.

Tabla 2
Frecuencia de alelos SLC6A19- MS1,-MS4, y MS7 en repeticin de casos y
controles

Tabla 3
Frecuencia de SLC6A19- alelos MS7 y el riesgo de hipertensin

Estadsticamente significativa (p <0,05)

Tabla 4.
La frecuencia de los alelos raros en SLC6A19 -MS7 y el riesgo de hipertensin por
edad

Estadsticamente significativa (p <0,05).

En un intento para determinar si los alelos raros en el gen SLC6A19 se asociaron
con otras enfermedades, analizamos su aparicin en pacientes con cncer de
vejiga debido a que SLC6A19 est tambin altamente expresado en el
tero [11]. Cuando se evaluaron 235 pacientes con cncer de vejiga, se encontr

que no hubo diferencias significativas en la distribucin de alelos raros SLC6A19 MS7 entre pacientes y controles de cncer, lo que indica que estos polimorfismos
no son responsables de cncer de vejiga en los coreanos (datos no mostrados).
El papel funcional que desempea SLC6A19 - MS7 no est claro; sin embargo,
pueden estar implicados en la regulacin de la expresin de SLC6A19. Cuando
se analizaron las secuencias minisatellte utilizando el software Transfac
(PARTIDO TM versin pblica 1.0)
(http://www.gene-regulation.com/pub/databases.html),

encontramos el sitio de

unin putativo para el factor de transcripcin Pax5 [9] en la regin de repeticin de

MS7. Pax5 es conocido por interactuar con el CD19, CD79a, y MME
(PubGene. Http://www.pubgene.org).
El gen MME tambin participa en el sistema renina-angiotensina [20], que regula
la vasodilatacin (KEGG, http://www.genome.ad.jp) y se ha sugerido como un
componente importante de la hipertensin [25]. Por lo tanto, la interaccin con
Pax5 puede estar relacionada con la hipertensin. Sin embargo, este estudio se
llev a cabo utilizando el gen completo SLC6A19, que incluye todos los elementos
reguladores putativos, incluyendo intrones.
Los resultados revelaron que una mayor incidencia del alelo raro SLC6A19 - MS7
se asocia con la hipertensin. Este es el primer estudio para caracterizar
minisatlites para el gen completo SLC6A19 en detalle y nuestras observaciones
sugieren que los loci minisatlites de SLC6A19 pueden funcionar como
indicadores de riesgo para la hipertensin.
Agradecimientos
Agradecemos al Dr. Jae Woo Kim (Dong-A Hospital Universitario) por su ayuda recogida de las muestras de
sangres. Tambin agradecemos al Dr. Vladimir Larionov (NCI) por sus tiles observaciones sobre la
preparacin de este manuscrito. Este trabajo fue apoyado por una subvencin (FG06-11-06) del Funcional
Proyecto Genoma Humano 21C Frontier, Ministerio de Ciencia y Tecnologa, Corea.