Documentos de Académico
Documentos de Profesional
Documentos de Cultura
Abstract: The objective of this research was to evaluate the process of hydrolysis of cellulose present in the
sugar- cane bagasse. Cellulase enzymes from fungi Trichoderma sp, coming from the Amazon biome, and a local
strain of Aspergillus niger, were used. The optimization was accomplished by means of response surface
methodology, which is based on sequential experimental designs. Thus, an initial screening was done using the
Plackett-Burman planning, for the main factors involved in the enzymatic kinetics of cellulose, i.e., substrate
concentration, enzyme extract concentration, temperature, pH, incubation time and agitation. After, the response
surface methodology for optimization of the process was used as to fit a mathematical model at optimized
process conditions. The best results of fermentable reducing sugars obtained from the enzymatic hydrolysis of
cellulose from pretreated sugarcane bagasse were AR = 0,112 g.L-1 with cellulase of Trichoderma sp. and AR =
0,129 g.L-1 with cellulase of A. niger.
Keywords: enzymes. agro-industrial residues. lignocellulolytic fungi. optimization
1
Universidade Estadual do Oeste do Paran (UNIOESTE) Eng. Qumica. Rua Faculdade, 645.
Cep 85903000 E-mail: carinalangaro@hotmail.com. Tel.: 45-3379-7036
2
Universidade Estadual do Oeste do Paran (UNIOESTE) Dep. Engenharia Qumica
salahdmh@gmail.com
3
Universidade Estadual do Oeste do Paran (UNIOESTE) Dep. Engenharia Qumica
mlfiorese@gmail.com
4
Universidade Estadual do Oeste do Paran (UNIOESTE) Dep. Engenharia Qumica
pmunheiro@hotmail.com
5
Universidade Estadual do Oeste do Paran (UNIOESTE) Dep. Engenharia Qumica
juci.deeak@hotmail.com
6
Universidade Estadual do Oeste do Paran (UNIOESTE) Dep. Engenharia Qumica
camila_fochesatto@hotmail.com
7
Universidade Estadual do Oeste do Paran (UNIOESTE) Dep. Engenharia Qumica
laisbertual@hotmail.com
8
Universidade Estadual do Oeste do Paran (UNIOESTE) Dep. Engenharia Qumica
dahiaane@hotmail.com
Toledo/PR.
E-mail:
E-mail:
E-mail:
E-mail:
E-mail:
E-mail:
E-mail:
1 INTRODUO
A gerao mundial de resduos lignocelulsicos anual resulta na poluio do meio
ambiente alm da perda de materiais valiosos que podem ser bioconvertidos em produtos de
maior valor agregado (Howard et al., 2003; Snchez, 2009). No Brasil a indstria sucroalcooleira e as agroindstrias de modo geral so uma excelente representao do
desenvolvimento do Pas. Por outro lado, gera-se uma altssima quantidade de resduos como
o bagao de cana de acar e as palhas e cascas provenientes de gros como milho, trigo, soja,
entre outros. Dentre as vrias biomassas disponveis, a biomassa lignocelulsica uma
matria-prima promissora devido a sua abundncia, disponibilidade e baixo custo (Kang et
al., 2004; Fitzpatrick et al., 2010).
A possibilidade de se produzir combustveis derivados da maior fonte de carbono
existente no planeta, a lignocelulose, incentivou grandes investimentos na indstria de
biocombustveis recentemente (Bansal et al., 2009).
A biomassa lignocelulsica contm altos teores de celulose e outros polissacardeos
em sua constituio qumica, podendo ser hidrolisados em acares fermentescveis
(Scheufele, 2012). Recentemente, h a necessidade de fontes energticas de origem renovvel,
devido diminuio dos combustveis fsseis, viabilizando a converso das biomassas
lignocelulsicas via enzimas hidrolticas.
As etapas envolvidas na produo de biocombustveis (etanol de segunda gerao) e
compostos qumicos a partir de biomassa lignocelulsica consistem de preparo do material,
pr-tratamento visando a quebra da lignina, fracionamento, hidrlise enzimtica da celulose
(sacarificao), fermentao dos acares obtidos na etapa de hidrlise, recuperao do
produto obtido (etanol de segunda gerao).
A sacarificao a etapa crtica na produo do acar fermentescvel. Os
procedimentos usados no pr-tratamento so essenciais para a remoo da hemicelulose da
lignina, para reduzir a cristalinidade da celulose e para aumentar a porosidade dos materiais
(Hsu et al., 2011). A sacarificao enzimtica da celulose pode ser considerada como um
mtodo ambientalmente amigvel e que substitui os tratamentos com cido sulfrico.
O complexo celulsico secretado por fungos filamentosos por fermentao em estado
slido ou por fermentao submersa formado por trs componentes enzimticos
majoritrios, as endoglucanases, as celobiohidrolases (exoglucanases) e as -glucosidases
(Delabona et al., 2013). Estas trs classes de enzimas, individualmente, acarretam alteraes
bastante diferenciadas na estrutura supramolecular da celulose, mas por apresentarem
propriedades complementares, descrevem um alto grau de sinergismo (ou ao cooperativa)
durante a hidrlise ou sacarificao da celulose (Chundawat et al., 2011).
O processo de hidrlise da celulose pode ser afetado por diversos fatores como pH,
temperatura, agitao, concentrao de enzima e de substrato, etc. e a tcnica
convencionalmente utilizada para a sua otimizao a avaliao univarivel. Entretanto, esse
tipo de mtodo demorado e pouco eficiente no que diz respeito a avaliao da interao
entre os efeitos das variveis (Garai e Kumar, 2013).
Assim, este trabalho se justifica pela utilizao da metodologia de superfcies de
resposta cuja finalidade a identificao das condies timas da hidrlise enzimtica com
vistas a obteno de acares fermentescveis.
O objetivo deste trabalho foi avaliar o processo de hidrlise enzimtica da celulose
presente no bagao de cana-de-acar. Para isso foram usadas enzimas celulases produzidas
pelos fungos Trichoderma sp, oriundo do bioma amaznico. Como objetivo especfico
buscou-se a otimizao do processo de hidrlise enzimtica considerando planejamentos
fatoriais sequenciais.
2 MATERIAIS E MTODOS
2.1 SUBSTRATO
Foi utilizado como substrato da hidrlise enzimtica o bagao de cana-de-acar
oriundo de usina sucro-alcooleira da regio de Paranava-PR. O bagao foi previamente
submetido a tratamento alcalino oxidativo, com soluo de perxido 1%, no pH 11,5, apos
retirada do conteudo solvel do residuo lignocelulsico por meio de lavagem com agua
destilada, conforme mtodo adaptado de Aguiar (2010).
2.2 EXTRATO ENZIMTICO
Dois extratos enzimticos de celulase foram testados na hidrlise do bagao de canade-acar:
- extrato de celulase obtido aps fermentao em estado slido (FES) do bagao de
cana-de-acar com o fungo Trichoderma sp, 1382 do bioma amaznico. Esse fungo foi
cedido pelo INPA Instituto Nacional de Pesquisas Amaznicas, sendo reativado em meio
caldo Sabouraud (SAB) em incubadora shaker (Solab SL 222/CFR) a 28 C durante 7 dias.
As condies de fermentao utilizadas foram: adio de nutrientes ao bagao conforme meio
de Mandels & Weber (1969), preparada em tampo fosfato 50mM pH 7,0, temperatura de
30C, umidade na proporo solido-liquido de 1:9. A concentracao inicial de esporos utilizada
foi de 1.107 esporos.g-1.
- extrato de celulase obtido aps fermentao em estado slido (FES) do bagao de
cana-de-acar com o fungo Aspergillus niger, cepa local isolada do solo, cedida pelo
Laboratrio de Bioqumica, Unioeste, Cascavel/PR. O fungo foi reativado em meio Agar
Batata Dextrose (PDA) em estufa microbiolgica (Quimis) a 30C durante 7 dias. As
condies de fermentao utilizadas foram as mesmas do fungo Trichoderma sp. 1382.
Apos as fermentaes, os complexos (extratos) enzimticos da celulase foram obtidos
por extrao com tampo fosfato de sdio 50 mM pH 7,0, na proporo 1:17 em incubadora
shaker (Solab SL 222/CFR) por 2h, a 35C e agitao de 150 rpm. Os extratos enzimticos
foram analisados e obtiveram as seguintes atividades enzimticas (AE) Fpasicas: 0,167 U.mL1
para o extrato obtido de Trichoderma sp. 1382. e 0,098 U.mL-1 para o extrato obtido de
Aspergillus niger.
2.3 HIDRLISE ENZIMTICA
A hidrlise enzimtica realizada nos experimentos com bagao de cana-de-acar
seguiu os preceitos da determinao de atividade enzimtica total (FPase) do complexo
celulsico, que usa papel filtro como substrato, conforme descrito por Ghose (1987). Os testes
de hidrlise enzimtica foram realizados em tubos de ensaio, nos quais foram adicionados o
substrato bagao de cana pr-tratado, na quantidade adequada a cada experimento do
planejamento experimental e 4 mL de tampo citrato 50 mM no pH especificado.
Os tubos foram dispostos em banho-maria ultratermosttico temperatura especificada
no planejamento experimental por alguns minutos. Em seguida foi adicionado 2 mL de
soluo de extrato enzimtico na concentrao do planejamento e os tubos mantidos a
temperatura constante (40, 50 ou 60oC) em banho aquecido termosttico durante 30, 60 ou 90
min de incubao, a agitao foi realizada manualmente a cada 5 ou 10 min (ou sem agitao
nenhuma). Terminada a incubao os ensaios foram submetidos determinao de acares
redutores (AR). Os testes de hidrlise foram feitos para ambos os extratos enzimticos
seguindo planejamentos experimentais.
Varivel
-1
10
5,5
40
4
30
0
0
20
11,0
50
5
60
5
1
30
16,6
60
6
90
10
(1)
3 RESULTADOS E DISCUSSO
Na Tabela 2 observa-se a matriz do planejamento saturado PB12 de Plackett e Burman
para 6 variveis, com quadruplicata no ponto central, com as variveis nas suas formas
codificadas (-1, 0 e +1). Os resultados obtidos para cada ensaio so os acares redutores
(AR) liberados na hidrlise enzimtica da celulose do bagao de cana-de-acar pelo extrato
enzimtico obtido com o fungo Trichoderma sp. e tambm com o fungo A. niger.
Ensaio
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
enzimtico: 11,0 % v.v-1, temperatura: 50C, pH: 5,0, tempo de reao: 60 min e agitao:
manual com intervalos de 5 min. Resultados semelhantes de atividade e AR foram obtidos por
Scheufele et al. (2012).
3.2 PB12 PARA O A. NIGER
Para os resultados de AR obtidos com o extrato enzimtico oriundo do fungo A. niger,
foi possvel verificar (Figura 1b) que as variveis concentrao de extrato enzimtico na
hidrlise e pH se mostraram significativas (p < 0,05). O maior resultado (0,095 g.L-1) de AR
foi observado no ensaio nmero 5 (Tabela 2).
Dessa forma, a hidrlise enzimtica do bagao de cana-de-acar, utilizando complexo
enzimtico obtido do fungo A niger, foi melhor conduzida a partir das seguintes condies
(ensaio 5): concentrao substrato: 30 g.L-1, concentrao de extrato enzimtico na hidrlise:
16,6% v.v-1, temperatura: 40C, pH: 6,0, tempo de reao: 90 min, agitao: sem agitao.
(b)
(a)
(3)T(C)
(2)Enz
-1,31648
(5)tempo inc
(4)pH
-,811528
(2)Enz
6,136196
2,934702
(1)Subs
,6311887
2,223259
(4)pH
-,198374
(6)Agit
(1)Subs
,1983736
(3)T(C)
-1,33396
(5)tempo inc
1,333956
(6)Agit
-,162306
p=,05
Estimativa dos efeitos padronizados (valor absoluto)
-1,51182
p=,05
Estimativa dos efeitos padronizados (valor absoluto)
Figura 1. Grfico de Pareto do planejamento Plackett-Burman PB12 para o extrato enzimtico obtido de (a)
Trichoderma sp. e (b) Aspergillus niger
(1)
Tabela 3. Matriz do delineamento composto central rotacional para duas variveis para os resultados de AR a
partir do extrato enzimtico obtido de A. niger
Conc. Extrato Enz. X1 (% v.v-1)
Ensaio
pH X2
AR (g.L-1)
1
-1 (10,8)
-1 (5,3)
0,013
2
1 (22,5)
-1 (5,3)
0,129
3
-1 (10,8)
1 (6,7)
0,003
4
1 (22,5)
1 (6,7)
0,030
5
-1,414 (8,3)
0 (6,0)
0,003
6
1,414 (25,0)
0 (6,0)
0,129
7
0 (16,6)
-1,414 (5,0)
0,112
8
0 (16,6)
1,414 (7,0)
0,057
9
0 (16,6)
0 (6,0)
0,068
10
0 (16,6)
0 (6,0)
0,091
11
0 (16,6)
0 (6,0)
0,074
12
0 (16,6)
0 (6,0)
0,098
Tabela 4. Tabela de efeitos do DCCR para AR a partir do extrato enzimtico de A. niger
Varivel
Efeito
Erro puro
p-valor
Coeficiente
Erro padro coef.
Mdia/Interc
0,082999
0,007119
0,001356
0,082999
0,007119
(1)Conc. Enz.(L)
0,079888
0,010069
0,004175
0,039944
0,005034
Conc. Enz.(Q)
-0,03262
0,011259
0,062647
-0,016309
0,005629
(2)pH (L)
-0,04627
0,010069
0,019368
-0,023134
0,005034
pH (Q)
-0,01398
0,011259
0,302542
-0,006991
0,005629
1L x 2L
-0,04404
0,014238
0,053592
-0,022019
0,007119
FCalc
p-valor
8,748
3,68614
0,156190
Figura 2. (a) Grfico dos residuos vs. valores preditos e (b) Grfico da probabilidade normal dos resduos, para
os resultados do planejamento DCCR com extrato enzimtico de A. niger
4 CONCLUSES
Os melhores resultados de acares redutores fermentescveis obtidos a partir da
hidrlise enzimtica da celulose do bagao de cana-de-acar pr-tratado foram AR = 0,112
g.L-1 com a celulase de Trichoderma sp. e AR = 0,129 g.L-1 com a celulase de Aspergillus
niger. Conclui-se que os extratos enzimticos oriundos de A. niger, cepa local, e de
Trichoderma sp. do bioma amaznico apresentam nveis prximos de rendimento de
sacarificao do bagao de cana-de-acar em termos de obteno de acares redutores
fermentescveis para fins de produo de bioetanol.
REFERNCIAS
AGUIAR, C.M. Hidrlise enzimtica de resduos lignocelulsicos utilizando celulases
produzidas pelo fungo Aspergillus niger. Toledo: Universidade Estadual do Oeste do Paran,
2010. 118 p. Dissertao (Mestrado). 2010.
BANSAL, P., HALL, M., REALFF, M. J., LEE, J. H., BOMMARIUS, A. S. Modeling
cellulase kinetics on lignocellulosic substrates. Biotechnol. Adv., 27:833848, 2009.
BARROS NETO B., BRUNS, R.E. & SCARMINIO, I.S. Como fazer experimentos Aplicaes na cincia e na indstria. 4.ed. Editora Bookman, 2010.
CHUNDAWAT, S.P.S., BECKHAM, G.T., HIMMEL, M.E. & DALE, B.E. Deconstruction
of Lignocellulosic Biomass to Fuels and Chemicals. Annu. Rev. Chem. Biomol. Eng., 2:121
145, 2011.
DELABONA, P.S., PIROTA, R.D.P.B, CODIMA, C.A., TREMACOLDI, C.R.,
RODRIGUES, A. & FARINAS, C.S. Effect of initial moisture content on two Amazon
rainforest Aspergillus strains cultivated on agro-industrial residues: Biomass-degrading
enzymes production and characterization. Ind. Crops Prod., 42:236242, 2013.
GARAI, D. & KUMAR, V. A Box-Behnken design approach for the production of xylanase
by Aspergillus candidus under solid state fermentation and its application in saccharification
of agro residues and Parthenium hysterophorus L. . Ind. Crops Prod., 44:352-363, 2013.
GHOSE, T.K. Measurement of cellulase activities. Pure and App. Chem., 59:257-268, 1987.
HOWARD, R. L.; ABOTSI, E.; van RENSBURG J. E. L.; HOWARD, S.; Lignocellulose
biotechnology: issues of bioconversion and enzyme production. Afr. J. Biotechnol, 2:.602
619, 2003.
HSU, C.L., CHANG, K.S., LAI, M.Z., CHANG, T.C., CHANG, Y.H. & JANG, H.D.,
Pretreatment and hydrolysis of cellulosic agricultural wastes with a cellulose-producing
Streptomyces for bioethanol production. Biomass Bioenergy, 14:1-7, 2011.
KANG, S. W.; PARK, Y. S.; LEE, J. S.; HONG, S. I.; KIM, S. W. Production of cellulases
and hemicellulases by Aspergillus niger KK2 from lignocellulosic biomass. Bioresour.
Technol., 91:153-156, 2004.
FITZPATRICK, M.; CHAMPAGNE, P.; CUNNINGHAM, M. F.; WHITNEY, R. A. A
biorefinery processing perspective: Treatment of lignocellulosic materials for the production
of value-added products. Bioresour. Technol., 101:89158922, 2010.
MANDELS, M., WEBER, J. The production of cellulases. Adv. Chem. Ser., 95:391-414,
1969.
MILLER, G.L. Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugar. Anal.
Chem., 31(3):426-428, 1959.
MONTGOMERY, D.C. Design and Analysis of Experiments. 4. Ed. New York, USA: John
Wiley & Sons, Inc., 1997.
PLACKETT, R.L. & BURMAN, J.P. The design of optimum multifactorial experiments.
Biometrika, 33:305-325, 1946.
Revista Tecnolgica Edio Especial 2014