TIPOS DE MICROSCOPIA

Luz clara.
Para formar una imagen a partir de un corte histolgico
usa luz visible, por esto la muestra debe ser lo bastante fina
como para que los haces de luz puedan atravesarla.
Tambin se usan mtodos de tincin, segn las
necesidades, con el fin de aumentar los detalles en la
imagen
El campo del microscopio est intensamente iluminado,
mientras que los objetos observados aparecen ms oscuros.
En general con este microscopio se pueden alcanzar los
1000
aumentos,
pudindose
llegar
con
ciertas
modificaciones a 2000 y 3000 aumentos
El ojo humano no logra distinguir objetos de menos de 50
micras de dimetro ni consigue resolver dos lneas
separadas por menos de 100 micras (es decir, las ve como
una sola lnea)

Campo oscuro.
es un microscopio que utiliza un haz enfocado de luz muy
intensa en forma de un cono hueco concentrado sobre el
espcimen. El objeto iluminado dispersa la luz y se hace as
visible contra el fondo oscuro que tiene detrs, como las
partculas de polvo iluminadas por un rayo de sol que se
cuela en una habitacin cerrada. Por ello las porciones
transparentes del espcimen quedan oscuras, mientras que
las superficies y partculas se ven brillantes, por la luz que
reciben y dispersan en todas las direcciones, incluida la del
eje ptico que conecta el espcimen con la pupila del
observador. Esta forma de iluminacin se utiliza para
analizar elementos biolgicos transparentes y sin
pigmentar, invisibles con iluminacin normal, sin fijar la
muestra, es decir, sin matarla. Tambin es bastante

utilizado en la observacin de muestras metalogrficas para

la observacin de detalles en superficies con alta
reflectancia.
El objetivo recibe la luz dispersa o refractada por las
estructuras del espcimen. Para lograrlo, el microscopio de
campo oscuro est equipado con un condensador especial
que ilumina la muestra con luz fuerte indirecta. En
consecuencia el campo visual se observa detrs de la
muestra como un fondo oscuro sobre el cual aparecen
pequeas partculas brillantes de la muestra que reflejan
parte de la luz hacia el objetivo.
El efecto es similar a las partculas de polvo que se ven en
el haz de luz emanado de un proyector de diapositivas en
una habitacin oscura. La luz reflejada por las partculas de
polvo llegan hasta la retina del ojo, lo que las hace visibles.
La luz dispersa permite incluso distinguir partculas ms
pequeas que el poder separador del sistema ptico usado
por transparencia.
Los condensadores que se emplean en microscopa de
campo oscuro son de dos tipos: del tipo paraboloide (tiene
una superficie espejada), y los del tipo cardioide, con dos
superficies espejadas. El empleo de uno u otro es indistinto,
mediante cualquiera de ambos, la luz no incide
directamente en el objetivo (este es el objetivo de estos
condensadores), sino que incide con una apertura numrica
mayor al del objetivo.

Microscopio de contraste de faces

El microscopio de contraste de fases permite observar
clulas sin colorear y resulta especialmente til para clulas
vivas.1 Este aprovecha las pequeas diferencias de los
ndices de refraccin en las distintas partes de una clula y
en distintas partes de una muestra de tejido. La luz que
pasa por regiones de mayor ndice de refraccin

experimenta una deflexin y queda fuera de fase con

respecto al haz principal de ondas de luz que pasaron la
muestra. Aparea otras longitudes de onda fuera de fase por
medio de una serie de anillos pticos del objetivo y del
condensador, anula la amplitud de la porcin fuera de fase
inicial del haz de luz y produce un contraste til sobre la
imagen. Las partes oscuras de la imagen corresponden a
las porciones densas del espcimen; las partes claras de la
imagen corresponden a porciones menos densas. Por lo
tanto estos microscopios se utilizan para observar clulas
vivas, tejidos vivos y cortes semifinos no coloreados.
Florescencia.
El microscopio de fluorescencia es una variacin del
microscopio de luz ultravioleta en el que los objetos son
iluminados por rayos de una determinada longitud de onda.
La imagen observada es el resultado de la radiacin
electromagntica emitida por las molculas que han
absorbido la excitacin primaria y reemitido una luz con
mayor longitud de onda. Para dejar pasar slo la emisin
secundaria deseada, se deben colocar filtros apropiados
debajo del condensador y encima del objetivo. Se usa para
detectar sustancias con autofluorescencia (vitamina A) o
sustancias marcadas con fluorocromos.
El fenmeno de la fluorescencia se produce cuando un
electrn de un tomo absorbe toda la energa de una
determinada longitud de onda de la luz, saltando a otros
orbitales. Es una situacin inestable durante la cual se
emite la mayor parte de la energa que se ha absorbido
(con mayor longitud de onda) y vuelve a desplazarse a su
orbital.
Aprovechando este fenmeno, se han creado los
fluorocromos (tambin conocido como fluoroforos). Para
utilizarlos necesitamos una bombilla que emita luz
ultravioleta y luz visible. Para excitar el fluorocromo
necesitamos un filtro de excitacin que seleccione la

longitud de onda que excita nuestro flurocromo. Los ms

comunes son el DAPI que tie el ncleo de las clulas y el
GFP.
Microscopio Electrico.
Un microscopio electrnico es aqul que utiliza electrones
en lugar de fotones o luz visible para formar imgenes de
objetos diminutos. Los microscopios electrnicos permiten
alcanzar ampliaciones antes que los mejores microscopios
pticos, menores que la de los fotones "visibles".
El primer microscopio electrnico fue diseado por Ernst
Ruska y Max Knoll entre 1925 y 1930, quienes se basaron
en los estudios de Louis-Victor de Broglie acerca de las
propiedades ondulatorias de los electrones.

El limitado dimetro de la apertura no permite que la

informacin detallada alcance la imagen, limitando de
este modo la resolucin.
El contraste de amplitud (que radica en la naturaleza
corpuscular de los electrones) se debe al contraste de
difraccin, provocado por la prdida de electrones del
rayo. Es un contraste dominante en especmenes
gruesos.
El contraste de fase (que radica en la naturaleza
ondulatoria de los electrones) se debe al contraste de
interferencia provocado por los desplazamientos en las
fases relativas de las porciones del rayo. Es un
contraste dominante en especmenes finos.
Existen tambin distintas aberraciones producidas por
las lentes: astigmtica, esfrica y cromtica
El problema de la funcin de transferencia de
contraste (CTF): la CTF describe la respuesta de un
sistema ptico a una imagen descompuesta en ondas
cuadrticas.

El
material
biolgico
presenta
dos
problemas
fundamentales: el entorno de vaco y la transferencia de
energa. Para resolverlos, se utilizan distintas tcnicas
dependiendo del tamao de la muestra:
1. para muestras grandes como rganos, tejidos o
clulas, se utilizan tres tcnicas:
2. la fijacin qumica o la criofijacin;
3. la inclusin en resinas (criosustitucin);
4. la rplica metlica;
para
muestras
pequeas
como
complejos
macromoleculares se utilizan las siguientes tcnicas:
1. la tincin negativa: los agentes de tincin ms usados
son el molibdato amnico, el fosfotungstato sdico y
sales de uranio como acetato y formiato. Todos ellos
presentan las siguientes propiedades: interactan
mnimamente con la muestra y son estables en la
interaccin con los electrones, son altamente solubles
en agua, presentan una alta densidad que favorece el
contraste, tienen un punto alto de fusin, tienen un
tamao de grano pequeo;
2. la rplica metlica: para construir la rplica metlica
se evapora el metal (estao), que se deposita sobre la
muestra a la vez que esta, por el vaco, se disuelve;
3. la criomicroscopa.