DISCUSIN

NanoRNAs
Primer
inicio
de
la
transcripcin
in
vivo
Aqu
se
investig
si
los
ARN
extremadamente
pequeas'',
nanoRNAs'', pueden actuar como cebadores para la iniciacin de la transcripcin in vivo. A
lograr
este
objetivo,
se
determin
el
efecto
de
aumentar
los niveles intracelulares de 2 a? 4 nanoRNAs NT a travs de agotamiento
de Orn (Figura 1). Mediante el uso de secuenciacin de alto rendimiento, hemos
establecido
que
el
aumento
de
los
niveles
de
2
a?
4-nt
nanoRNAs
resultados en TSS dramticos cambiando a una fraccin significativa de
promotores
(Figura
3,
Tabla
S1,
Tabla
S2,
S3
y
tabla).
Estos
cambios dramticos SAT son el resultado del uso generalizado de 2-4 nt
nanoRNAs como cebadores para la iniciacin de la transcripcin. De este modo, nuestros
hallazgos
proporcionar evidencia de que los pequeos RNAs se puede utilizar para iniciar
transcripcin in vivo. Adems, se demuestra por el anlisis de microarrays
que el uso generalizado de nanoRNAs de iniciacin de la transcripcin principal
se correlaciona con los cambios globales en la expresin gnica (Figura
4,
Tabla
S4).
Actualmente no tenemos ninguna informacin con respecto a cmo nanoRNAs
se
producen
en
clulas.
En
principio,
hay
al
menos
tres
caminos
distintos
por
los
cuales
nanoRNAs
pudieran
generarse.
En primer lugar, nanoRNAs podra generarse como productos finales de ARN
metabolismo por enzimas de degradacin de RNA no puede metabolizar
RNAs pequeos. En segundo lugar, nanoRNAs podra ser generada por RNAP
durante la iniciacin de la transcripcin abortiva, un proceso mediante el cual el
RNAP-promotor de la transcripcin complejo inicial se acopla en ciclos
de sntesis y liberacin de? transcripciones 2-15 nt ARN antes de la
iniciacin productiva (Goldman et al., 2009). En tercer lugar, nanoRNAs
podra ser generada por la escisin endonucleoltica de la naciente
El ARN durante la transcripcin. Tales eventos de escisin puede producirse
durante la transcripcin correccin de pruebas (Zenkin et al., 2006) o durante
elongacin de la transcripcin para permitir la elongacin marcha atrs
complejos para reanudar la sntesis de ARN (Borukhov et al, 1992.;
Fish
y
Kane,
2002;
Surratt
et
al,
1991)..
Orn
Suprime
NanoRNA
mediada
Cebado
Nuestros resultados sugieren que las perturbaciones celulares que alteran el
equilibrio
entre
la
transcripcin
nanoRNA
cebado
y
NTP
iniciatranscripcin puede afectar significativamente la expresin gnica global.
En este sentido, nanoRNA enzimas de degradacin tales como Orn
servir
para
suprimir
nanoRNA-priming
transcripcin.
Adems,
factores celulares que influyen en las actividades de nanoRNA-degradantes
enzimas que podra predecirse que modifica el alcance de nanoRNA
cebado
y,
a
su
vez,
influir
en
la
expresin
gnica.

Orn
homlogos
han
sido
identificados
en
b
g
Proteobacteria,
Proteobacteria,
actinomicetos
y
eucariotas
(Mechold
et
al.,
2007, Zhang et al, 1998;. Zuo y Deutscher, 2001). En Firmicutes
tales como Bacillus subtilis, la degradacin se lleva a cabo por nanoRNA
dos anlogos funcionales de Orn, NrnA y NrnB y que no transporten
secuencia
similar
a
Orn
(Fang
et
al,
2009;..
Mechold
et
al,
2007). Orn no es esencial en P. aeruginosa (Jacobs et al., 2003)
(Figura
1)
o
Streptomyces
(Ohnishi
et
al.,
2000).
Adems,
prdida de ambos NrnA y NrnB no altera la viabilidad de Bacillus
subtilis (Fang et al., 2009). En contraste, Orn es esencial en E. coli,
probablemente debido a los efectos txicos de los que se acumulan nanoRNAs
en clulas que carecen de funcin Orn (Fang et al, 2009;. Ghosh y
Deutscher, 1999;
Mechold
et
al,
2007)..
Nuestros
hallazgos
sugieren
que la expresin gnica alterada como consecuencia de la amplia
nanoRNA cebado de iniciacin de la transcripcin podra, en parte o
total,
representan
los
efectos
txicos
de
nanoRNAs
aparentes
en
E.
coli.
NanoRNA
mediada
cebado
como
un
mecanismo
para
alterar
Gene
Expression
El hallazgo de que el uso generalizado de nanoRNAs a la transcripcin primer
iniciacin est acoplado con los cambios globales en la expresin gnica
sugiere
que
nanoRNAs
podra
representar
una
clase
distinta
de
reguladoras ARN pequeos que alteran la expresin gnica a travs
un mecanismo de incorporacin directa en el extremo 50 de un objetivo
Transcripcin de ARN en lugar de a travs de un mecanismo antisentido basada.
Proponemos
por
lo
menos
tres
maneras
distintas
mecnica
que el cebado nanoRNA podra afectar la expresin gnica. En primer lugar, la
estado de fosforilacin del extremo 50 es un determinante clave de
Estabilidad
del ARN
transcrito (Deana
et
al,
2008;.
Mackie,
1998).
Por
lo
tanto,
nanoRNA
mediada
cebado
podra
alterar
transcripcin
estabilidad mediante la alteracin del estado de fosforilacin de los extremos de 50
transcritos primarios. Cebado segundo lugar, con nanoRNAs puede alterar
los TSS, y por lo tanto alterar la secuencia del extremo 50 de la resultante
transcripcin. Las alteraciones en la secuencia del extremo 50 de un naciente
transcripcin puede afectar a la expresin de genes a travs de efectos sobre la
estabilidad del hbrido ARN / ADN en el complejo inicial transcribir
o a travs de efectos sobre la estructura secundaria de ARN que influyen
estabilidad
transcripcin,
transcripcin
de
elongacin,
o
la
transcripcin
atenuacin (es decir, la terminacin prematura de la transcripcin) (Goliger
et al, 1989;. Liu et al, 1994;. Meng et al, 2004;. Qi y Turnbough,
1995;
Telesnitsky
y
Chamberlin,
1989;
Turnbough
y
Switzer, 2008). En tercer lugar, nanoRNA-priming transcripcin iniciacin
potencialmente puede ser ms eficiente que la iniciacin de novo. Para
ejemplo,
la
concentracin
efectiva
media-mxima
para
iniciar

transcripcin de un 2 nt complementaria a las posiciones +1 / +2 ARN

es?
10-veces
menor
que
la
de
un
mononucletido
(Ruetsch
y
Dennis,
1987;
Smagowicz
y
Scheit
1981,).
Por
lo
tanto,
nanoRNAs podran actuar como activadores'''' de iniciacin de la transcripcin a partir de
ciertos
promotores,
en
particular
promotores
que
de
otro
modo
requieren
altas
concentraciones
de
la
NTP
para
iniciar
eficiente
iniciacin.
Los resultados de la secuenciacin de alto rendimiento (Figura 3, Tabla S1,
Tabla S2 y S3 de Mesa) indican que la TSS cambiantes fue significativamente
menos pronunciado en Orn-agotadas las clulas cuando slo el 50
extremos trifosfato se analizaron. Por lo tanto, nuestros resultados sugieren
que
el
grupo
de
2-4
nt
nanoRNAs
que
la
transcripcin
principal
iniciacin en Orn-agotadas las clulas son una mezcla de transcritos
que llevan
un monofosfato 50 o un
hidroxilo 50.
Por
lo tanto,
consideran que es probable que una fraccin significativa de la observada
alteraciones en la expresin gnica se producen debido a cambios en la
fosforilacin de estado de los 50 extremos de las transcripciones primarias
que resultan de la incorporacin de un nanoRNA que lleva un 50
monofosfato o un hidroxilo 50 en los 50 extremos de las transcripciones primarias
durante
la
iniciacin
de
la
transcripcin,
que,
a
su
vez,
impacta
transcripcin
estabilidad.
En resumen, como se esperaba a partir de los resultados obtenidos in vitro, nuestro
resultados demuestran que los pequeos cebadores de ARN,'','' puede nanoRNAs
ser usado para iniciar la transcripcin in vivo. Nuestros resultados se obtuvieron
en las clulas bacterianas en las que la concentracin intracelular de
nanoRNAs fue aumentada artificialmente por el agotamiento de Orn. Por lo tanto,
trabajo futuro se centrar en determinar en qu medida nanoRNAmediated
cebado de la transcripcin se produce en las clulas bacterianas bajo
condiciones fisiolgicas de crecimiento.