INTRODUCCION

Las poblaciones de las bacterias crecen de forma explosiva acumulando grandes

nmeros en su periodo de tiempo muy reducido. Puesto que el efecto de los
microorganismos en la mayora de los casos depende de su nmero, entender cmo
se produce el crecimiento microbiano es importante para poder evitar o reducir sus
efectos nocivos.
El aislamiento de los distintos microorganismos contenidos en una muestra problema
se lleva a cabo sobre la superficie en un medio de cultivo solido contenido en una
placa de Petri. Los medios de cultivo que se van a utilizar depende del tipo de muestra
y los microorganismos presentes en ella, pero deben ser medios slidos en placa. As
se usaran: medios nutritivos generales, medios selectivos, medios diferenciales o bien
medios enriquecidos, si los microorganismos que se van aislar son nutricionalmente
exigentes. Uno de los medios de cultivo que se podran utilizar con este fin es el agar.
Su deficiencia en electrolitos impide la invasin de la placa por microorganismos
mviles, como son las especies del genero Proteus, facilitando as su aislamiento y
posterior identificacin.

OBJETIVOS

Preparar y realizar medios de cultivo de bacterias.

Desenvolverse en el laboratorio utilizando las tcnicas
correspondientes de asepsia y cuidados en la limpieza y proteccin
personal.

MARCO TEORICO
CULTIVO DE MICROORGANISMOS
El cultivo de microorganismos consiste en proporcionarles las condiciones fsicas,
qumicas y nutritivas adecuadas para que puedan multiplicarse de forma controlada.
En general, podemos distinguir cultivos lquidos y slidos en funcin de las
caractersticas del medio y cultivos discontinuos y continuos en funcin de la
disponibilidad de nutrientes en el medio.
MEDIOS DE CULTIVO
Un microorganismo necesita para crecer nutrientes que le aporten energa y
elementos qumicos para la sntesis de sus constituyentes celulares. Dependiendo de
la fuente de carbono que utilizan, los microorganismos se pueden clasificar en
auttrofos si es el CO2 atmosfrico (microorganismos que fotosintetizar) y hetertrofos
si utilizan carbono orgnico. La frmula elemental de un microorganismo es,
aproximadamente, C4H7O2N lo que supone que los componentes de las clulas son:
carbono que representa alrededor del 50% del peso seco, oxgeno (32%), nitrgeno
(14%), fsforo (3%), azufre (en torno al 1%) y otros elementos traza entre los que se
encuentran Fe, K, Mg, Mn, Co, Mb, Cu y Zn. La elaboracin de medios de cultivo
requiere proporcionar los elementos antes citados en una forma asimilable. As, por
ejemplo, el C debe estar en forma de carbono orgnico para los hetertrofos y como
CO2 para los auttrofos, el N en forma de NH4, de NO3 - o de NO2 - o en forma de
aminocidos a los que se pueda tomar su grupo amino; el P debe estar en forma de
PO4 3-, el S procede de aminocidos sulfurados o de SO4 2-, etc. Adems, en ciertos
casos, es necesario aadir a los medios de cultivo algunos aminocidos o vitaminas
que determinados tipos de microorganismos no pueden sintetizar. En el caso de la
levadura del pan (Saccharomyces cerevisiae) la frmula elemental ms concreta es:
C3.72H6.11O1.95N0.61S0.017P0.035K0.056 esta composicin puede variar
ligeramente en funcin de las condiciones de cultivo o de fase de crecimiento. El
conocimiento de la frmula elemental del microorganismo que se cultiva facilita la
formulacin del medio de cultivo ms adecuado para el mismo.
Los medios de cultivo se pueden clasificar en definidos cuando su composicin
qumica se conoce totalmente y complejos cuando no es el caso porque estn
compuestos por mezclas de extractos de materiales complejos (extracto de levadura,
extracto de carne, etc.). Por otra parte, los medios de cultivo pueden ser lquidos o
slidos si se aade algn agente solidificante que no sea consumible por los
microorganismos (normalmente agar). En funcin de los microorganismos que pueden
crecer en ellos, los medios pueden ser generales, selectivos cuando favorecen el
crecimiento de ciertos microorganismos mientras suprimen el de otros (por ejemplo, el
medio SPS para clostridios), diferenciales cuando alguno de sus componentes permite
identificar las colonias de un tipo de microorganismos (por ejemplo medios con
hemates para identificar colonias de microorganismos hemolticos), selectivo-

diferenciales cuando combinan las dos caractersticas anteriores (por ejemplo, el agar
de MacConkey para identificar Escherichia coli), y medios de enriquecimiento que
permiten aislar un tipo determinado de microorganismo a partir de una mezcla una
poblacin mixta de gran tamao.
MTODOS DE AISLAMIENTO
El aislamiento de bacterias a partir de muestras naturales se realiza, en la mayora de
los casos, mediante la produccin de colonias aisladas en cultivos slidos. El
crecimiento explosivo de las bacterias permite producir un gran nmero de ellas a
partir de una nica clula inicial de forma que, tras un periodo de incubacin en las
condiciones ambientales adecuadas, se produce una colonia observable a simple vista
y formada por individuos iguales (un clon bacteriano). Sin embargo, no todos los
microorganismos presentes en las muestras ambientales son cultivables
(microorganismos no cultivables). Esto es debido a dificultades intrnsecas en el cultivo
(microorganismos parsitos de otros), al desconocimiento de los requerimientos
especficos de cultivo, y a la existencia de grupos de microorganismos que deben
mantenerse en equilibrio para poder sobrevivir (casos de sintrofa por ejemplo). Se
estima que en slo en torno al 1% de las bacterias del suelo al 0,1 - 0,01 % de las
bacterias marinas son cultivables. Existen procedimientos de enriquecimiento del
nmero de bacterias de ambientes naturales para facilitar su aislamiento. Uno de ellos
es la Columna de Winogradski que crea un microcosmos para enriquecer el nmero
de ciertos tipos de microorganismos presentes en ambientes naturales con objeto de
facilitar su aislamiento.
CONCEPTO DE CULTIVO PURO
Se denomina cultivo puro (axnico) al que contiene slo un tipo de microorganismos.
Los cultivos puros se inician a partir de colonias aisladas, de manera que todos los
individuos del mismo tengan la misma composicin gentica. Los cultivos puros son
esenciales para poder estudiar las caractersticas de los microorganismos y para
poder identificarlos con seguridad. Sin embargo, cada vez se va conoce ms sobre el
funcionamiento de las comunidades bacterianas lo que debe hacernos reflexionar
sobre el hecho de que un cultivo puro supone unas condiciones no naturales y que,
por consiguiente, la fisiologa de los microorganismos en ambientes naturales puede
ser diferente de la que presentan en condiciones de cultivos puros.
CRECIMIENTO MICROBIANO EN MEDIO LQUIDO
Si la bacteria crece en un medio lquido, en la mayora de los casos las clulas que se
producen en cada divisin continan su vida independientemente formndose una
suspensin de clulas libres. En un cultivo discontinuo de bacterias en medio lquido,
se pueden diferenciar cuatro fases en la evolucin de los parmetros que miden el
crecimiento microbiano:
1.- Fase lag o de adaptacin: durante la que los microorganismos adaptan su
metabolismo a las nuevas condiciones ambientales (abundancia de nutrientes y
condiciones de cultivo) para iniciar la fase de crecimiento exponencial.

2.- Fase exponencial o logartmica: en ella la velocidad de crecimiento es mxima y

el tiempo de generacin es mnimo. Durante esta fase las bacterias consumen a
velocidad mxima los nutrientes del medio. La evolucin del nmero de clulas
durante esta fase se explica con los modelos matemticos que describiremos a
continuacin.

3.- Fase estacionaria: en ella no se incrementa el nmero de bacterias (ni la masa u

otros parmetros del cultivo). Las clulas en fase estacionaria desarrollan un
metabolismo diferente al de la fase exponencial y durante ella se produce una
acumulacin y liberacin de metabolitos secundarios que pueden tener importancia
industrial. Los microorganismos entran en fase estacionaria porque se agota algn
nutriente esencial del medio o porque los productos de desecho que han liberado
durante la fase exponencial hacen que el medio sea inhspito para el crecimiento
microbiano. La fase estacionaria tiene gran importancia porque probablemente
represente con mayor fidelidad el estado metablico real de los microorganismos en
los ambientes naturales.
4.- Fase de muerte: se produce una reduccin del nmero de bacterias viables del
cultivo.
CRECIMIENTO MICROBIANO EN MEDIO SLIDO
Las fases, parmetros y cintica de crecimiento discutidas para el caso de los cultivos
lquidos se presentan tambin en cultivos slidos. La cintica de crecimiento, en este
caso, se puede estudiar siguiendo la evolucin del nmero de clulas viables por
unidad de superficie o por unidad de masa. Cuando una clula aislada e inmvil
comienza a crecer sobre un substrato slido, el resultado del crecimiento al cabo del
tiempo es una colonia. Por consiguiente, se denomina unidad formadora de colonia
(UFC) a una clula bacteriana viva y aislada que si se encuentra en condiciones de
substrato y ambientales adecuadas da lugar a la produccin de una colonia en un
breve lapso de tiempo. Si el nmero inicial de bacterias por unidad de superficie es
muy alto, la confluencia de las colonias da lugar a lo que se llama un csped cuando

se realizan los cultivos en placas de laboratorio. En el caso de microorganismos

mviles (deslizantes) o en el de los hongos filamentosos que tienen un crecimiento
trfico no se producen colonias aisladas sino formaciones ms difusas o miceliares.

MATERIALES Y METODOS:
MATERIALES:

Material biolgico: Escherichia coli.

Placas Petri
Pota objetos
Cubre objetos
Matraces
Pipetas
Tubos de ensayo
Botellas de diferente capacidad.
Reactivos y colorantes: peptona, glucosa, cloruro de sodio, agar cristal
violeta, safranina, alcohol, cetona, lugol.
Equipos: Cmara de flojo laminar, autoclave, microscopio, horno, incubadora.
Otros: micro tubos, mechero, papel kraft, micro pipetas.

PROCEDIMIENTO
Fase A: Preparacin del medio de cultivo

Se utiliza el medio de cultivo AGP (agar, glucosa, peptona), Agar 14g, glucosa
5g y peptona 5g para un litro de agua destilada.
Mezclar en vasos separados: el agar se disuelve en agua fra.
Agregar la solucin a un matraz esterilizado y enrazar a un litro.
Cubrir la boca del matraz con un papel metlico colocar otra cubierta con papel
kraft.
Envolver todo el papel kraft y auto clavar a 120 0c durante 30 minutos.
Terminada la operacin, llevar el matraz a la cmara de flujo laminar.

Fase B: Siembra de bacterias

En las placas Petri previamente esterilizadas (al calor o en autoclave), transferir

el medio de cultivo hasta un tercio de la placa, homogenizar con movimientos
suaves y tapar la placa. Toda esta operacin se realiza en la cmara de flujo
laminar.
Esperar 10 minutos hasta que solidifique el agar.
Con un asa colle esterilizada a la llama coger una pequea porcin del inoculo
de Escherichia coli y sembrar en la placa Petri: el tipo de siembra ser
especificada por el conductor de prctica.
Cerrar la placa Petri dentro de la cmara de flujo laminar.
Etiquetar.

Fase C: Incubacin

La placa Petri se transfiere a la incubadora a una temperatura de 37.5 0C.

La placa Petri se coloca en forma invertida dentro de la incubadora para evitar
el exceso de humedad sobre el cultivo.
Luego de 48 horas la placa estar lista para la evaluacin.

RESULTADOS

CONCLUSION

BIBLIOGRAFIA

http://www.microinmuno.qb.fcen.uba.ar/SeminarioMedios.htm.
http://perso.wanadoo.es/sergioram1/medios_de_cultivo.htm.
http://claudiazambrano.wordpress.com/2011/05/25/medios-decultivosolido-y-liquido/
http://www.britanialab.com.ar/esp/productos/b02/salmoshigagar.htm.