Universidad Nacional de Quilmes

Biotecnologa Vegetal

Gua de trabajos prcticos

TRANSFORMACIN GENETICA DE PLANTAS MEDIANTE

AGROBACTERIUM TUMEFACIENS
INTRODUCCIN
El uso de Agrobacterium tumefaciens como sistema natural para
producir plantas transgnicas, est basado en el hecho de que
durante la interaccin de la bacteria con el tejido vegetal herido, un
segmento de plsmido Ti llamado T-DNA, se transfiere a la clula
vegetal integrndose a su genoma. El DNA transferido
normalmente contiene un nmero de genes que codifican para
enzimas involucradas en la sntesis de hormonas y metabolitos
especficos denominados opinas. Como consecuencia de la
expresin de estos genes, las clulas vegetales transformadas
forman tumores o races (en el caso de la infeccin con
Agrobacterium tumefaciens o rhizogenes respectivamente) con
capacidad de crecimiento autnomo y de producir opinas, utilizadas
por la bacteria como fuente de nitrgeno y de carbono.
Con el objeto de usar este sistema para obtener plantas
transgnicas capaces de expresar un gen deseado se hacen las
siguientes modificaciones al plsmido Ti:
Para que el fenotipo de las plantas transgnicas sea el normal,
se eliminan los genes responsables de la induccin de tumor de
la regin del T-DNA.
A su vez, es necesario incorporar un gen dominante fcilmente
seleccionable (como por ejemplo el gen que confiere resistencia
a antibiticos aminoglucosdicos, como kanamicina).
Por otro lado, pueden incorporarse genes marcadores como el
que codifica para la -glucuronidasa, que permiten conocer la
localizacin de la expresin del marcador en un tejido dado.
Por ltimo, se incluye el gen de inters, que puede conferir
resistencia a insectos, virus, herbicidas, etc.
Para la introduccin de genes en plantas mediada por este sistema
es necesario fundamentalmente disponer de un sistema de cultivo
de tejidos en el que la regeneracin de plantas completas sea
reproducible, y que la especie sea susceptible a la infeccin por
Agrobacterium. Frecuentemente se emplean explantos de hojas
como material inicial para la transformacin. La mayora de los
brotes regenerados de estos explantos parecen ser de origen
unicelular.

Transformacin gentica de plantas de tabaco mediante

Agrobacterium tumefaciens
Se trabajar con la cepa LBA 4404 de A. tumefaciens que lleva el
plsmido p-AL4404 cuyo T-DNA ha sido deletado y que conserva la
regin vir capaz de aportar en trans las funciones de virulencia
necesarias para la transferencia al genoma de la planta de un TDNA presente en el vector de clonado. Figura 1
El plsmido pBI-121 (1) es capaz de replicarse tanto en E. coli
como en Agrobacterium. Posee entre los bordes derecho e izquierdo
del plsmido Ti al gen npt-II como marcador de seleccin que
confiere resistencia a kanamicina y el gen uidA que codifica para la
-glucuronidasa que permite detectar su presencia mediante un
ensayo bioqumico. Ambos genes se encuentran bajo el control de
promotores y seales de terminacin adecuados para su expresin
en plantas (Fig. 1). Este plsmido puede ser manipulado en E. coli
y luego introducido en Agrobacterium por conjugacin o
transformacin. Este ltimo mtodo es el que se utilizaremos en la
prctica.
Durante el cocultivo el contacto de A. tumefaciens con compuestos
fenlicos liberados por los tejidos de la planta (especialmente
acetosiringonas) activa la transcripcin de los operones de la regin
vir. Esto provoca la escisin del T-DNA y por un mecanismo todava
no completamente elucidado, su transferencia e integracin en un
lugar al azar en el genoma de la planta. Las clulas de los discos de
hoja que hayan incorporado este DNA darn lugar a brotes y
eventualmente a plntulas al ser repicadas en medio de
regeneracin adecuado en presencia del agente selectivo. Mediante
la deteccin de los productos codificados por los genes marcadores
(npt-II y uidA) se puede confirmar la presencia del DNA exgeno.
Figura 1
NOTA
El tiempo necesario para obtener plantas transgnicas en condiciones de
ser analizadas para verificar la presencia y expresin del transgn vara
segn las especies entre 3 y 4 meses. Por este motivo, la verificacin de la
transgnesis se realizar utilizando plantas previamente transformadas en
nuestro laboratorio.

pNOS

NPT-II

tNOS

p35S

Uid-A (GUS)

tNOS

RB

LB

pBI-121

T-DNA

vir
pAL4404

pBI121

ch

LBA4404-pBI121

ESQUEMA DEL METODO DE TRANSFORMACION

EXPLANTO

OBTENCION DE DISCOS

COCULTIVO

MEDIO DE SELECCIN
MICROCALLOS

BROTES

ENRAIZAMIENTO

ANALISIS DE LAS MICROPLANTAS

Figura 1
4

TRANSFORMACIN DE A. tumefaciens, CON EL PLASMIDO

pBI-121 (2)
Preparacin de las bacterias
A partir de un cultivo de A. tumefaciens en 200 ml de medio LB,
suplementado con rifampicina y estreptomicina (100 g/ml),
crecido hasta OD600= 0.5 a 26C con agitacin:

Cosechar por centrifugacin a 1100 xg durante 15 min a 4 C.

Lavar con 200 ml de agua estril a 4C y volver a centrifugar
como en el paso anterior.
Resuspender en 1 ml de glicerol 10 % en agua estril.

Transformacin
Mezclar 50 l de las bacterias con 1 g de plsmido (250 ng/l)
y 50 l de LB.
Congelar en N2 lquido durante 5 min y descongelar en bao a
37 C durante 20 min.
(Efectuar paralelamente un control de viabilidad y un control de seleccin).

Repetir el paso anterior de congelacin-descongelacin dos

veces ms.
Agregar 5 ml de LB e incubar durante 6 h a 26 C con agitacin.
Cosechar las bacterias por centrifugacin, resuspender en 100 l
de LB y plaquear en el medio selectivo correspondiente
([antibitico] = 100 g/ml).
Transformacin

Control de
viabilidad

Control de
seleccin

pBI-121 (DNA)

4 l

A. tumefaciens.

50 l

50 l

50 l

Medio LB

50 l

50 l

50 l

Rif

Str
Kan

+
+

+
-

+
+

Suplementar las
placas LB agar con:

NOTA: La caracterizacin de los transformantes se realiza por mapeo de

restriccin de los plmidos purificados a partir de colonias resistentes a los
3 antibiticos.

MINIPREPARACIN DE ADN PLSMIDICO Y MAPEO DE

RESTRICCIN
Se utilizar una modificacin del mtodo de Birnboim and Doly
(1979) (3).
Para preparaciones en pequea escala, se parte de 3 ml de cultivo
bacteriano crecido en LB/antibitico durante toda la noche a 26C
con agitacin.
Cosechar por centrifugacin en microcentrfuga a 4000 rpm,
durante 1 min.
Resuspender en 300 l de solucin hipotnica (Tris-HCl 50 mM pH
8, EDTA 10 mM y RNAsa A 50 g/ml). Agregar 300 l de solucin de
lisis (SDS 1%, NaOH 0,2 N).
Mezclar inmediatamente por inversin varias veces hasta observar
lisis completa del cultivo
Agregar 300 l de solucin de neutralizacin (acetato de potasio 3
M, pH 4,8) mezclar por inversin y dejar en hielo.
Luego de 10 min de incubacin, centrifugar en microcentrfuga
durante 10 min a 12000 rpm.
Transferir el sobrenadante obtenido (aproximadamente 750 l) a
otro tubo, agregar 550 l de isopropanol y mezclar por inversin.
Luego de incubar 5 min en hielo, centrfugar a 12000 rpm durante
10 min y descartar el sobrenadante. Una vez secado el pellet de
DNA, resuspender en 30-40 l de H2O
Para cortar con las enzimas de restriccin adecuadas, se utilizan
alrededor de 5 l de DNA.

TRANSFORMACION DE DISCOS
MEDIANTE AGROBACTERIUM (4)

DE

HOJAS

DE

TABACO

Se Trabajar con hojas provenientes de plantas jvenes de N.

tabacum cv. Xanthi crecidas in vitro.
Obtencin de los discos

Preparar 3 placas de Petri con 20 ml de medio MS lquido (5)

Cortar las hojas ms jvenes y bien desarrolladas y con un
bistur cortar trozos de aproximadamente 1 cm 2 (discos),
colocando los mismos en las cajas a medida que se van cortando

Cocultivo

Agregar 20 l de un cultivo O.N. de LBA4404 (pBI121) a una

de las placas, agitar hasta homogeneizar y dejar reposar durante
2 min.
Transferir los discos a un papel de filtro estril y una vez secos
sembrarlos en los frascos correspondientes.
Agregar 20 l de un cultivo O.N. de LBA4404 a otra de las
placas y proceder de la misma manera que con la anterior.
Transferir los discos de la tercera placa sin Agrobacterium, ya
que son los destinados a los controles de regeneracin y eficacia
del agente selectivo.
Incubar todas las Magentas a 22 C, con un fotoperodo de 16 h
de luz, 8 h de oscuridad, durante 48 h.

Transferencia a medio selectivo

Repicar los discos provenientes del cocultivo a nuevas Magentas

que contienen MS slido suplementado con hormonas, el agente
de seleccin (50 mg/l kanamicina) y el bacteriosttico (200 mg/l
cefotaxime).
Incubar las magentas en las mismas condiciones del cocultivo.

NOTA: Este repique se repite cada 3 semanas. Cuando comienzan a

aparecer los brotes, al cabo de 6 semanas (aproximadamente), y
alcanzan un tamao de alrededor de 10 a 20 mm se repican a medio MS
slido sin hormonas suplementado con el agente de seleccin (50 mg/l
Kan) y el bacteriosttico (200 mg/l cefotaxime). En este medio los brotes
enraizarn (si no lo hicieron en la etapa anterior). Despus de 2 o 3
repiques sucesivos las plntulas que hayan enraizado en medio selectivo
estarn en condiciones de ser pasadas a tierra (rusticacin).

Soluciones
MS30:
Macronutrientes MS 20 X
Micronutrientes MS 200 X
Fe-EDTA 200 X
Sacarosa
Agar
H20
Llevar a pH 5,8 con KOH.

50 ml
5 ml
5 ml
30 g
8g
c.s.p. 1 litro.

VITAMINAS MS:
Myo-inositol
Acido nicotnico
Piridoxina-HCl
Tiamina-ClH
Glicina

100.0 mg/l
0.5 mg/l
0.5 mg/l
0.1 mg/l
2.0 mg/l

HORMONAS:
Benciladenina (BA)
Acido naftalenactico (ANA)

cc. final. 1mg/L

cc. final. 0,1 mg/L

ANTIBITICOS:
Cefotaxime (cef)
Kanamicina (kan)
Rifampicina (rif)
Estreptomicina (str)

200 mg/l
50 mg/l
100 mg/l
100 mg/l

MACRONUTRIENTES:
NH4NO3

33.0 g/l

KNO3

38.0 g/l

CaCl2.2H2O

8.8 g/l

MgSO4.7H2O

7.4 g/l

KH2PO4

3.4 g/l

MICRONUTRIENTES:
KI
H3BO3

166 mg/l
1240 mg/l

MnSO4 .4H2O

4460 mg/l

ZnSO4 .7H2O
Na2MoO4 .2H2O

1720 mg/l

CuSO4 .5H2O
CoCl2.6H2O

5 mg/l

50 mg/l
5 mg/l

SOLUCION QUELANTE DE HIERRO:

FeSO4.7H2O

5.56 g/l

Na2EDTA.2H2 O

7.46 g/l

DETECCIN DE ACTIVIDAD DE -GLUCURONIDASA (6).

La -glucuronidasa es una hidrolasa que cataliza el clivaje de una
gran variedad de -glucurnidos, existen sustratos artificiales,
como el cido 5-bromo-4-cloro-3-indolil--D-glucurnido (X-Glu),
que al ser hidrolizados por la enzima dan lugar a un producto
coloreado.
Procedimiento

Tomar una hojita (o trozo de tejido), de la planta a analizar y

colocarla en un pocillo de una placa de ELISA al que se agrega
200 l del buffer para X-glu.
Incubar luego a 37 C y observar la presencia o ausencia de
precipitado color azul sobre el tejido. El tiempo de incubacin
depende de la permeabilidad del tejido al sustrato.
Lavar con alcohol 70 % para aumentar el contraste y preservar
el material.

BUFFER PARA X-GLU:

NaH2PO4 (pH 7,0)
EDTA
-Mercaptoetanol
Triton X-100
Sarkosyl
X-glu

50 mM
10 mM
10 mM
0.1 %
0.1 %
0.5 mg/ml.

(Agregar X-glu en el momento de usar).

ANALISIS DE PLANTAS TRANSGENICAS MEDIANTE LA

TECNICA DE PCR (7)
Introduccin
La reaccin en cadena de polimerasa (polimerase chain reaction o
PCR) se usa par amplificar un fragmento de DNA que yace entre
dos
regiones
de
secuencia
conocida.
Se
utilizan
dos
oligonucletidos
cebadores
o
primers,
los
cuales
son
complementarios a sendas secuencias que yacen en las cadenas
opuestas del DNA, flanqueando a la zona a amplificar. La mezcla de
reaccin conteniendo un exceso de estos primers, el DNA molde,
los 4 deoxinuclesidos trifosfato y una DNA polimerasa
termoestable se calienta hasta desnaturalizar el DNA molde y se
enfra para permitir la hibridacin de los primers a sus secuencias
blanco y la polimerizacin a partir de los mismos. El ciclo de
desnaturalizacin, hibridacin y polimerizacin se repite varias
veces. Dado que el producto de cada polimerizacin sirve de molde
para la siguiente, cada ciclo duplica la cantidad de producto del
ciclo anterior. El producto mayoritario de la reaccin es un
fragmento de DNA de doble hebra cuyos extremos corresponden a
los extremos 5' de los primers y su tamao a la distancia entre los
mismos.
Los primeros protocolos de PCR utilizaban el fragmento Klenow de
la DNA pol I, que se inactiva a la temperatura de desnaturalizacin
del DNA. Esto obligaba a agregar una alcuota de enzima en cada
ciclo de reaccin, adems de que la temperatura de reaccin
permita frecuentemente el apareamiento inespecfico de los
primers. Para evitar estos problemas se introdujo el uso de la DNA
polimerasa de Thermus aquaticus (Taq DNA pol) que no se inactiva
a 95 C y funciona a elevada temperatura.
Esta tcnica est siendo ampliamente utilizada tanto en ciencia
bsica como aplicada. A continuacin se mencionan algunos
ejemplos de los usos que se le est dando a esta tcnica:
deteccin de DNA de patgenos en muestras de tejido de
pacientes
diagnstico de enfermedades congnitas
anlisis de mutantes
amplificacin de fragmentos de DNA para secuenciar, etc.
Sin embargo la Taq polimerasa tiene la limitacin de producir una
alta proporcin de errores de incorporacin de nucletidos. La
frecuencia es de 2 x 10 -4 nucletidos incorrectos por ciclo, lo cual
es 4 veces mayor que el fragmento Klenow. Esto da como resultado
un promedio de 0,25 % de errores en una reaccin de PCR. La
10

frecuencia de error se ve aumentada por mayores concentraciones

de nucletidos o de Mg2+.
En esta prctica utilizaremos la tcnica de PCR para determinar la
presencia de un transgn en plantas sometidas a un ensayo de
transformacin con A.tumefaciens.
Minipreparacin de DNA de plantas para PCR (8)

Colocar 100-200 mg de tejido en un tubo Eppendorf y agregar

nitrgeno lquido.
Al evaporar el nitrgeno, moler el tejido congelado con un
vstago de punta cnica.
Agregar inmediatamente 700 l de buffer EB, aplicar vortex
hasta resuspender el tejido e incubar por 10 min a 65 C.
Agregar 200 l de AcOK 5 M, aplicar vortex brevemente y
colocar en hielo durante 20 min.
Centrifugar 10 min a 4 C y transferir a otro tubo Eppendorf.
Precipitar el DNA con 1 volumen de isopropanol.
Centrifugar inmediatamente por 1 min en microcentrfuga.
Lavar con etanol 80 % y volver a centrifugar 5 min.
Secar el pellet y resuspender en 50 l de TE.

Protocolo de PCR:
Solucin de DNA:
Colocar en un tubo Eppendorf de 0,5 ml:
DNA de planta
250 ng
H2O
c.s.p. 25 l
Calentar 5 min a 100 C y colocar inmediatamente en hielo.
Mezcla de reaccin:
Colocar en un tubo Eppendorf de 1,5 ml, por cada reaccin de PCR:
Buffer PCR 10x
5 l
dATP 10 mM
1 l
dGTP 10 mM
1 l
dCTP 10 mM
1 l
dTTP 10 mM
1 l
Primer 1 (150 ng/l)
0,5 l
Primer 2 (150 ng/l)
0,5 l
MgCl2 25 mM
3 l
H2O
c.s.p. 25 l
Taq DNA pol 5 u/l
0,25 l

Tomar 50 l de la mezcla de reaccin y mezclarlos con la

solucin de DNA en el tubo de 0,5 ml.
11

Agregar 2 gotas de aceite mineral

Colocar el tubo en la mquina de PCR utilizando el siguiente
programa:
95 C 4 min
95 C 1 min
50 C 1 min 35 ciclos
72 C 1 min
72 C 5 min

Dejar correr el programa durante la noche

Agregar 1 l de RNAsa A 10 mg/ml e incubar 15 min a 37 C.
Tomar 10 l de la mezcla de reaccin y observar en gel de
agarosa.

Soluciones
EB: BUFFER DE EXTRACCIN
Tris pH 8
EDTA pH 8
NaCl
SDS
-mercaptoetanol

50 mM
10 mM
100 mM
1%
10 mM

TE
Tris pH 8
EDTA

10 mM
1 mM

12

DETECCION DE PROTEINAS UTILIZANDO LA TCNICA DE

WESTERN-BLOT
SEPARACIN DE LAS PROTENAS UTILIZANDO GELES DE
POLIACRILAMIDA-SDS:
Gel separador

12% (10 ml)

Acrilamida-bisAcrilamida
(30:1)
Tris-HCl 1.5M pH 8.8
Agua destilada
SDS 10%
Persulfato de Amonio 10%
TEMED

30% 4.0 ml
2.5
3.3
0,1
0.1
5.0

ml
ml
ml
ml
l

Gel concentrador (5 ml)

Acrilamida/bisAcrilamida
(30:1)
Tris-HCl 1M pH 6,8
SDS 10%
Agua destilada
Persulfato de Amonio 10%
TEMED

30% 0,83 ml
0,63 ml
50.0 l
3.4 ml
25 l
5 l

SDS= Dodecil sulfato de sodio

TEMED= N,N,N',N'-Tetrametiletilendiamina
-Hervir las muestras durante 5 min.
-Sembrar 10-20 l por calle en geles de 12 % SDS-poliacrilamida y
se corre a 25 mA. (minigeles 8x8).
-Una vez finalizada la corrida, un gel se teir con 0,5% de Azul de
Coomasie y al otro se le realizar un Western-blot.

13

TRANSFERENCIA
WESTERN BLOT

DE

PROTEINAS

NITROCELULOSA:

Electrotransferencia
-Luego de la corrida sumergir el gel en buffer de
electrotransferencia (50 mM Tris-HCl, pH 7,5; 196 mM Glicina;20%
metanol).
-Cortar un trozo de nitrocelulosa (Schleicher & Schuell, BA 85 0,45
um) del tamao del gel y dejar hidratando unos minutos en el
buffer.
Cuidando no queden burbujas colocar el gel sobre la nitrocelulosa y
con esto hacer un sandwich entre 3 hojas de papel filtro Whatman
3MM y las esponjas tipo Scotch Brite.
-Se emsambla en el cartucho de transferencia y este se coloca
dentro de la cuba de electrotransferencia (Bio-Rad), que luego se
llena de buffer. La transferencia se hace durante toda la noche a 30
V. voltaje constante a 100 V. voltaje constante durante 1 hora.
DETECCION INMUNOLOGICA DE LAS PROTEINAS
ELECTROTRANSFERIDAS
Bloqueo e incubacin con el anticuerpo
-Incubar los filtros durante 30 min. con solucin de bloqueo.
-Incubar con el anticuerpo en una dilucin 1/2000 preparada en
solucin de bloqueo, durante 1 hora con agitacin a temperatura
ambiente,.
-Recuperar el anticuerpo y lavar el filtro 3 veces durante 15 min.
cada lavado con TBS-T.
-Incubar con el anticuerpo anti-IgG de conejo conjugado a fosfatasa
alcalina diludo 1/1000 en solucin de bloqueo, durante 60 min. a
temperatura ambiente.
-Lavar con TBS-T durante 10 min.repetir este lavado dos veces ms
-Lavar una vez con buffer fosfatasa durate 10 min a temperatura
ambiente.

14

-Preparar el revelador .utiliizando los siguientes sustratos:

Bromocloroindoil-fosfato (BCIP) 60 mg/ml en dimetilformamida 100
%.
-Nitro blue tetrazolium (NBT) 50 mg/ml en dimetilformamida 70 %.
Agregar 66 l de NBT y 33 l de BCIP en 10 ml del bufffer
fosfatasa, mezclar, verter sobre la membrana e incubar 3-10 min a
resguardo de la luz.
-Detener la reaccin lavando con agua y secando sobre papel filtro.
SOLUCIONES
TBS:
Tris-HCl 0.05 M pH 7.4, ClNa 0.15 M
TBS-T:
TBS, 0.05% Tween 20
Solucin de Bloqueo:
3% de leche en polvo descremada (Molico), 2% glicina en TBS.
Buffer de siembra:
3% SDS, 3% glicerina, 7% -mercaptoetanol, 0.25% de Azul de
bromo fenol, en TBS
Buffer fosfatasa:
Tris-HCl, pH 9,5, 100 mM; NaCl, 100 mM; MgCl 2, 5 mM
Buffer Tris-Glicina 10x (Para 1 litro):
Tris base
30.3 g
Glicina
144.0 g
Agua destilada csp.
1000.0 ml

15

REFERENCIAS
1- Jefferson, R.A. (1987) Plant Mol.Biol.Rep. 5: 387-405
2- Hofgen R. (1988) Nucleic Acids Res. 16: 9877.
3- Birmboim, H.C. y Doly J. (1979) Nucleic Acids Res. 7: 15131523.
4- Horsch RB, Rogers SG and Fraley RT (1985 ) Transgnic plants.
Cold Spring Harb Symp Quant Biol 50: 433-437
5- Murashige T. y Skoog G. (1962) Physiol. Plant 15: 473-477
6- Jefferson, R.A. (1987) Plant Mol. Biol. Rep. 5: 387-405
7- Saiki R.K., Gelfand D.H., Sytoffel S., Scharf S.J., Higuchi R., Horn
G.T., Mullis K.B., Erlich H.A. (1988) Primer directed enzimatic
amplification of DNA with a thermostable DNA polimerase.
Science 239: 487.
8- Dellaporta S.L., Wood J., Hicks J.B. (1983) A plant DNA
minipreparation: Version 2. Plant Molecular Biology reporter. 1:
19-22.

16

USO DE VECTORES VIRALES PARA LA EXPRESIN

TRANSITORIA DE PROTEINAS HETEROLOGAS EN
PLANTAS.
Adems de la expresin integrativa en el genoma vegetal (plantas
transgnicas), se han desarrollado sistemas basados en vectores
virales para la expresin no integrativa de distintos productos
(Santa Cruz et al., 1996). Dado que los virus usados como vectores
no se transmiten por semilla ni son capaces de integrarse al
genoma vegetal, estos no se transmiten a la progenie y deben
introducirse por inoculacin en cada generacin subsiguiente.
Potencialmente, los sistemas de expresin no integrativa
permitiran obtener niveles de protenas recombinantes tan altos
como los alcanzados por las protenas virales estruc-turales. Debido
a que la infeccin viral sobrepasa los mecanismos regulatorios de la
clula husped, la utilizacin de estos sistemas permitira explotar
los mecanismos de amplificacin viral, eludiendo las restricciones
fisiolgicas impuestas sobre la expresin integrativa.
Aunque se han desarrollado sistemas de expresin basados en virus
a DNA y a RNA, este tipo de vectores se halla an en la etapa de
desarrollo. Los sistemas reportados son variantes de virus
pertenecientes a grupos muy diversos, tales como, cauliflower
mosaic virus (CaMV), tomato golden mosaic virus (TGMV); african
cassava mosaic virus (ACMV); tobacco mosaic virus (TMV), brome
mosaic virus (BMV) y potato virus X (PVX). Se han utilizado
sistemas derivados de estos virus para la expresin de interfern,
inhibidor de la enzima conversora del angiotensina I, tricosantina y
encefalina (Takamatsu et al., 1990).
Clones infectivos y vectores virales
La posibilidad de obtener clones infectivos (como cDNA o como
transcriptos de RNA sintetizados in vitro) a partir de los genomas
de virus vegetales permite disponer de una poderosa herramienta
para estudiar sus mecanismos de replicacin y expresin. La
obtencin de clones infectivos ha permitido adems su utilizacin
como vectores de expresin transitoria (no integrativa) en plantas.
Una vez que el virus infecta una clula, es capaz de replicar su
genoma y movilizarlo hacia otras clulas de la planta dentro de un
perodo de das/semanas

17

En una vector viral tpico, se reemplaza un gen prescindible para la

replicacin por un gen forneo, de forma tal que el promotor
subgenmico (Psg) del gen reemplazado dirige la expresin del
transgn (vector de reemplazo) (Fig. 1). A veces, se conserva parte
del gen viral, producindose una protena de fusin entre un gen
viral y el gen exgeno, pero conservando la actividad de la protena
fornea. En un segundo tipo de construccin, el gen forneo es
insertado dentro del genoma viral intacto (vector de insercin). El
gen de inters es expresado a partir de un Psg adicional, ya sea del
mismo virus o de un virus relacionado (Fig. 1).
Las ventajas de los sistemas de expresin basados en vectores
virales son:
1) permiten niveles de expresin elevados, en comparacin con los
obtenidos mediante expresin integrativa a nivel nuclear;
2) requieren perodos de tiempo mnimos para desarrollar y
ensayar nuevas construcciones genticas. A los 15-20 das post
inoculacin (dpi) el virus ha invadido ya los tejidos de la planta,
pudindose establecer en ese momento el nivel de expresin del
gen de inters;
3) requieren manipulaciones relativamente simples que incluyen el
clonado del gen de inters en el vector, su amplificacin en
bacterias, la transcripcin in vitro y la inoculacin mecnica de
las plantas;
4) requieren la utilizacin de un menor nmero de plantas por
ensayo (por cada construccin a evaluar se inoculan entre 5 y
10 plantas).
En principio, este tipo de vectores debe usarse en sistemas
biolgicamente restringidos para evitar su dispersin al medio
ambiente. Su utilizacin a campo abierto presupone la utilizacin
de sistemas de contenimiento biolgico para bloquear sus
mecanismos naturales de transmisin. En el caso particular de TMV
y PVX (los cuales no son transmitidos por vectores biolgicos) la va
de transmisin principal es la mecnica y se produce a travs de las
maquinarias utilizadas en la labranza. Aunque ello establece
mayores posibilidades de control de la diseminacin viral, an as
es necesario introducir mutaciones y/o deleciones en el vector que
eviten el pasaje del virus recombinante de una planta a otra.
Una caracterstica importante de los vectores basados en virus a
RNA es la relativa inestabilidad en la expresin del gen exgeno.
Ello es debido a la tasa de mutacin relativamente alta asociada a
las RNA replicasas RNA dependientes. Es de esperar que un gen
forneo (neutro desde el punto de vista de la gentica del virus)
mutar a una tasa an mayor, por lo cual se convertira en no
funcional o sera deletado en un perodo de tiempo ms o menos
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corto. Huisman et al. (1992) sugieren que, adems de la inactivacin de la informacin por la acumulacin de mutaciones, la
desaparicin fsica de la informacin por recombinacin del RNA
es un proceso muy rpido. La rapidez con la que este proceso
ocurra es, pues, una cuestin a considerar en el diseo de esta
clase de vectores. Idealmente, el virus quimrico debera
recombinarse lo suficientemente rpido para producir efectos
mnimos en el ambiente, pero no tanto como para impedir que la
produccin de la protena recombinante sea eficiente. Debe
destacarse que estos lapsos se miden en el nmero de
generaciones virales que ocurren a partir de la inoculacin y que,
en un sistema productivo, el ciclo finalizara con la recoleccin del
material vegetal infectado, debindose proceder a una nueva
inoculacin en la siguiente generacin de plantas.
En este trabajo prctico utilizaremos una copia completa de cDNA
de PVX y un vector viral derivado de esta capaz de expresar el gen
marcador Uid-A, a partir de ellos, mediante una reaccin de
transcripcin in vitro obtendremos RNAs infectivos.
Estos RNAs sern utilizados para infectar plantas de tabaco,
finalmente la infeccin se pondr de evidencia mediante el uso de
anticuerpos anti-cpside (clon infectivo) y midiendo la actividad del
gen indicador (vector viral).
Fig.1 Vectores virales desarrollados utilizando al virus PVX

replicasa viral

psg

24 K

CP

12K

poli A

8K

pT7

A) Copia completa del virus PVX (pPVX)

replicasa viral

psg

24 K

GUS

poli A

12K

pT7

8K

B) Vector de reemplazo, el gen Uid-A reemplaza al gen de cpside

del virus PVX (CP)

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replicasa viral

psg
24 K

GUS

psg

CP

12K
8K

pT7

C) Vector de insercin, en este caso el gen Uid-A se agrega a la

copia completa bajo la regulacin de un segundo promotor
subgnomico de cpside (psg)

TRANSCRIPCION IN VITRO
Linealizacin
Se digieren 20 g del plsmido purificado utilizando 50-100 U de la
enzima de restriccin adecuada, en 350 l de reaccin. Se verifica
el corte corriendo una alcuota en un gel de agarosa.
Tratamiento con proteinasa K
A los 350 l del plsmido linealizado se agregan 7 l de proteinasa
K (SIGMA) 5 mg/ml y se incuba 20 min a 37C.
A partir de este punto todas las manipulaciones se deben realizar
en condiciones libres de ARNasa.
Realizar 2 extracciones con fenol:cloroformo:isoamlico (25:24:1) y
una extraccin con cloroformo:isoamlico (24:1).
Recuperar la fase acuosa final y precipitar los cidos nucleicos con
1/2 vol. de AcNH4 y 3 vol. de etanol absoluto fro.
Dejar 30 min en hielo y centrifugar igual que antes.
Lavar el pellet 2 veces con 500 l de etanol 70% fro, centrifugar 5
min a mxima velocidad y eliminar el sobrenadante.
Secar el pellet en un bloque seco a 37C, y resuspendee en T.E.
10:1 pH 7.5 para que quede aproximadamente 0.5g/l
Transcripcin in vitro utilizando T7 ARN polimerasa
Se lleva a cabo la reaccin en las siguientes condiciones:
DNA molde lineal
100 mM DTT
1 mg/ml BSA
5x Tsc Buffer
rRNAsin

2 g totales
5 l
5 l
10 l
1.2 l (50 U)

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poli A

H2O DEPC
c.s.p. 50 l (totales)
Klenow
1 l (10 U)
Incubar 15min a temperatura ambiente y agregar
5x rNTPs (5 mM A, C y UTP; 0.5 mM GTP; )
10 mM CAP [m7G(5')ppp(5')G
T7 RNA polimerasa

10 l
2.6 l
40 U

Incubar 60 min a 37C.

Luego agregar 20 U de T7 RNApol y 10 l de rGTP 2.5 mM, incubar
60 min a 37C.
Al cabo de la primer hora de reaccin tomar 1/10 de la reaccin
para analizar los ARNs transcriptos en un gel de agarosa.

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