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2014

Facultad de Biologa
Grado en Biologa
1855: Regulacin Molecular de los procesos
Biolgicos.

[REGULACIN MOLECULAR DE LOS


PROCESOS BIOLGICOS]
Adiv al Erbos
1

Bloque II: Regulacin Molecular De Los Procesos Celulares


Tema 1: Aspectos metablicos del Citosol ............................................. 13
1 Importancia del citosol en el metabolismo (Funciones) ..................................... 13
2 Genoma y proteoma: Origen de la diversidad estructural y funcional de las
protenas ............................................................................................................ 15
2.1 Splicing alternativo ........................................................................................................ 16
2.2 Modificaciones post-traduccionales ............................................................................. 17

3 Ribosomas ....................................................................................................... 17
4 Sntesis de protenas e inhibidores ..................................................................... 1
5 Chaperonas moleculares .................................................................................... 2
5.1 El descubrimiento de las Chaperonas ............................................................................. 3
5.2 El plegamiento de las protenas ...................................................................................... 4
5.3 Funciones de las chaperonas .......................................................................................... 5
5.4 Clasificacin de las HSP ................................................................................................... 6
5.5 Modo de accin de algunas chaperonas ......................................................................... 7
5.5.1 HSP70 y co-chaperonas (HSP20 y HSP40) ............................................................................... 7
5.5.2 HSP90 ..................................................................................................................................... 8
5.5.3 HSP60 (GroEL y GroES) ........................................................................................................... 9

5.6 Resumen ........................................................................................................................ 11

6 Cambios post-traduccionales (CPT) ................................................................... 13


6.1 Cambios post-traduccionales reversibles...................................................................... 13
6.1.1 Fosforilacin/defosforilacin ................................................................................................ 13
6.1.2 Modificacin de los dominios N-terminales de las histonas ................................................. 18
6.1.3 Otras modificaciones covalentes reversibles ........................................................................ 20

6.2 Cambios post-traduccionales irreversibles ................................................................... 21


6.2.1 Adicin de restos hidrofbicos .............................................................................................. 21
6.2.2 Glicosilacin .......................................................................................................................... 25
6.2.3 Cambios por protelisis limitada .......................................................................................... 25
6.2.4 Otros cambios post-traduccionales irreversibles .................................................................. 25

Tema 2: Trfico citosol-ncleo y citosol-mitocondria ............................. 27


1. Trfico citosol-ncleo ...................................................................................... 27
1.1.

El poro nuclear ........................................................................................................ 28

1.2. La lmina nuclear ......................................................................................................... 30


1.3. Trfico de protenas a travs del poro nuclear ............................................................ 31
3

1.3.1. Modelo de importacin a travs del poro nuclear .............................................................. 32


1.3.2. Modelo de exportacin a travs del poro nuclear ............................................................... 33
1.3.3. Modelo simplificado de importacin/exportacin de protenas y mRNA ............................ 33

1.4. El transporte a travs del poro en funcin del tamao de la carga ............................. 34
1.5. Diversidad de carioferinas ............................................................................................ 34
1.6. Complejos proticos asociados a la distrofina ............................................................. 35

2.

Trfico citosol-mitocondria y cloroplastos .................................................... 36


2.1.

El genoma mitocondrial .......................................................................................... 36

2.2.

Destinos de las protenas importadas a los orgnulos energticos ........................ 38

2.3 Transporte a travs de la membrana mitocondrial ...................................................... 39


2.3.1. Seal de localizacin mitocondrial ...................................................................................... 39
2.3.2. Modelo general de transporte a la matriz mitocondrial ..................................................... 41
2.3.4. Modelo general de transporte a la membrana mitocondrial interna ................................. 42
2.3.5. Modelo general de transporte al espacio intermembrana .................................................. 43
2.3.6. Modelo general de transporte a la membrana mitocondrial externa ................................. 44

2.4. Transporte citosol-cloroplasto ..................................................................................... 45

3.

Trfico de protenas al peroxisoma ............................................................... 46

4. Trfico de protenas a los plastidios ................................................................. 46


Anexo I: Dinmica del complejo TIM ................................................................... 47
Anexo II: Seales de localizacin mitocondrial ..................................................... 48
Anexo III: Genes y Parkinson ............................................................................... 49

Tema 3: Proteolisis intracelular ............................................................. 53


1. Procesos regulados por la proteolisis ............................................................... 53
2. El ciclo de los compuestos nitrogenados y la vida media de las protenas ......... 54
3. Protelisis intracelular .................................................................................... 55
3.1 Protelisis intracelular en procariotas .......................................................................... 55
3.2 Protelisis intracelular en eucariotas ............................................................................ 56

4. Sistema ubiquitina-proteasoma (UPS) de degradacin proteica ....................... 57


4.1 La ubiquitina .................................................................................................................. 57
4.2 Sistema de adicin de ubiquitina .................................................................................. 58
4.2.1 Variabilidad en la actuacin del complejo E2-E3.................................................................. 59

4.3 Destino de las unidades o polmeros de ubiquitina ...................................................... 61


4.4 Las protenas de deconjugacin de ubiquitina E4 ......................................................... 61
4.4.1 Regulacin de p53, el equilibrio E3/E4 ................................................................................. 62

4.5 Sistema ERAD de control de calidad y seal UPR .......................................................... 63


4.6 Relacin con el ciclo celular del sistema UPS ................................................................ 64
4.7 Motivos de reconocimiento para los complejos E2-E3 ................................................. 65
4.7.1 Caja de destruccin de ciclinas ............................................................................................. 65
4.7.2 Secuencias PEST .................................................................................................................... 65

5. El proteasoma ................................................................................................. 65
5.1 Relacin entre el Alzheimer y el proteosoma ............................................................... 66
5.2 Inhibidores del proteasoma en el tratamiento contra el cncer .................................. 68

Tema 4: Regulacin del ciclo celular ...................................................... 71


1 Introduccin al ciclo celular .............................................................................. 71
1.1 Transduccin de la seal de divisin y cncer............................................................... 71

2 Regulacin del ciclo celular ............................................................................... 72


2.1 El factor de maduracin de los oocitos (MPF) .............................................................. 72
2.1.1 Regulacin de MPF: ejemplo de cantidad de ciclinas y nivel de fosforilacin ...................... 73

2.2 Protenas inhibidoras de complejos ciclina-CDK (INKs)................................................. 74


2.3 Visin en conjunto de la actuacin de los complejos Ciclina-CDK ................................ 74
2.4 La protena del retinoblastoma (RB) y E2F .................................................................... 76
2.5 Puntos de control del ciclo celular ................................................................................ 76
2.6 Visin global de la regulacin del ciclo celular .............................................................. 78

3 La silimarina un potencial anticancergeno ....................................................... 80

Tema 5: Retculo endoplasmtico I ........................................................ 81


1 Biognesis de lpidos en el retculo endoplasmtico .......................................... 81
1.1 Biosntesis de lpidos y fosfolpidos ............................................................................... 81
1.2 Composicin lipdica de las membranas celulares ........................................................ 82
1.3 Biosntesis y movimientos de lpidos a travs de las membranas celulares ................. 84
1.3.1 Topologa de la sntesis de glicoesfingolpidos de mamferos .............................................. 86
1.3.2 Sntesis de fosfolpidos .......................................................................................................... 86

1.4 Enfermedades ligadas al retculo endoplasmtico ....................................................... 88

2 Las protenas citocromo P450 ........................................................................... 89


2.1 Modo de accin y caractersticas del citocromo P450 .................................................. 90
2.1.1 Modo de accin de Citocromo P450 reductasa .................................................................... 92
2.1.2 Modo de accin de la adrenoxina reductasa ........................................................................ 92

2.2 Otras funciones de P450 ............................................................................................... 92


2.3 Enfermedades relacionadas con el citocromo P450 ..................................................... 94
5

Anexo I: Aislamiento de fracciones subcelulares .................................................. 96


Ejemplo: Aislamiento, caracterizacin y anlisis proteico de la fraccin microsomal del
msculo de ratn ................................................................................................................ 97

Tema 6: Retculo endoplasmtico II ..................................................... 101


1 Transporte al retculo endoplasmtico............................................................ 101
1.1 El pptido lder o pptido seal .................................................................................. 101
1.2 Asociacin del ribosoma al retculo endoplasmtico .................................................. 103
1.2.1 Partcula de reconocimiento de la seal (SRP) ................................................................... 104
1.2.2 Componentes de los translocones y protenas asociadas ................................................... 105

1.3 Transporte post-traduccional en Escherichia coli ....................................................... 106


1.4 Respuesta a protenas mal plegadas (UPR) ................................................................. 106
1.5 Topologa de las protenas de membrana ................................................................... 108
1.5.1 Incorporacin de protenas de tipo I en la bicapa .............................................................. 109
1.5.2 Incorporacin de protenas de tipo II, III y IV en la bicapa .................................................. 109

Tema 7: Glicosilacin de protenas en el retculo endoplasmtico y en las


cisternas del Golgi ............................................................................... 111
1 Las glicoprotenas ........................................................................................... 111
1.1

Funciones de la glicosilacin de protenas ............................................................ 111

2 La glicosilacin de protenas ........................................................................... 112


2.1 Introduccin a los glcidos .......................................................................................... 112
2.2 Donadores activados de azucares para la glicosilacin de protenas ......................... 113
2.3 Introduccin a la N-glicosilacin y la O-glicosilacin................................................... 114

3 El proceso de N-glicosilacin y el plegamiento en el retculo ........................... 116


3.1 La formacin del oligosacrido precursor ................................................................... 117
3.2 Transferencia del oligosacrido precursor .................................................................. 119
3.3 Modificaciones generales sobre el oligosacrido precursor ....................................... 120
3.4 Control de calidad en el retculo endoplasmtico ...................................................... 121
3.4.1 Maquinaria del ERAD ......................................................................................................... 125

3.5 Chaperonas del retculo endoplasmtico.................................................................... 125


3.6 Respuesta a protenas mal plegadas (UPR) ................................................................. 126
3.6.1 Regulacin de los receptores por BiP.................................................................................. 127

3.7 Otras protenas que ayudan al plegamiento en el retculo endoplasmtico .............. 128
3.8 Ensamblado de las subunidades proteicas en el retculo endoplasmtico ................. 130
3.9 Modificaciones de la N-glicosilacin a nivel del aparato de Golgi .............................. 130
6

3.10 Modificaciones en el Golgi con destino al lisosoma.................................................. 133


3.10.1 Receptores de manosa-6-fosfato...................................................................................... 134

3.11 N-glicosilacin en procariotas ................................................................................... 135

4 El proceso de O-glicosilacin........................................................................... 136


4.1 O-glicosilacin de proteoglicanos con xilosa............................................................... 137
4.1.3 Sindecanos y glipicanos como moduladores de la accin proteica .................................... 138

4.2 O-glicosilacin de N-acetilglucosmaina en el citosol .................................................. 139


4.2.1 Regulacin/actuacin de OGT mediante O-glicosilacin de N-acetilglucosamina ............. 140
4.2.2 Relacin de la O-glicosilacin con N-acetilglucosamina y enfermedades .......................... 142

5 Glicosil fosfatidilinositol (GPI) ......................................................................... 143


5.1 Sntesis de glucosil fosfatidilinosiltol ........................................................................... 144
5.2 Beneficios de la utilizacin del enlace por GPI ............................................................ 145

6 Funciones de los glicoconjugados ................................................................... 146


Anexo I: Destino de las protenas en funcin del oligosacrido N-unido y el
plegamiento ..................................................................................................... 147

Tema 8: Trfico vesicular ..................................................................... 149


1 Proceso general de gemacin y fusin de membranas .................................... 149
1.1 Proceso de gemacin ................................................................................................. 150
1.2 Proceso de fusin ........................................................................................................ 152

2 Circulacin de vesculas entre el retculo endoplasmtico y el aparato de Golgi


......................................................................................................................... 154

Bloque III: Regulacin Molecular De La Accin Hormonal


Tema 1: Hormonas liposolubles y receptores intracelulares ................ 157
1 Accin hormonal ............................................................................................ 158
1.1 Protenas carrier de hormonas liposolubles y fraccin libre ....................................... 158
1.2 Caractersticas de la interaccin hormona-receptor................................................... 160

2 Agonistas y antagonistas de los receptores de andrgenos ............................. 160


3 Modelo general del receptor de hormonas liposolubles .................................. 161
3.1 Elementos de respuesta, coactivadores y localizacin de receptores ........................ 162
3.1.1 Co-activadores .................................................................................................................... 163
3.1.2 Elementos de respuesta para los receptores de hormonas esteroideas............................. 163
3.1.3 Localizacin de receptores de hormonas liposolubles ........................................................ 164

4 El receptor de glucocorticoides humano ......................................................... 164


4.1 Motivo de dedos de cinc en el receptor de glucocorticoides ..................................... 164
7

4.2 Estructura y variantes del receptor de glucocorticoides ............................................ 165


4.3 Modelo funcional del receptor de hGR ....................................................................... 166

5 Modelos de actuacin de los receptores nucleares (NR) .................................. 167


5.1 Desensibilizacin de receptores .................................................................................. 168
5.2 Modelo de regulacin del receptor de cido retinoico (RAR)..................................... 169
5.3 Modelo de regulacin del complejo receptor de hormonas esteroideas (SRC) ......... 169
5.4 Estructura y dominios estructurales del receptor de vitamina D ............................... 170
5.5 Acciones genmicas y no genmicas de los receptores de estrgenos...................... 171

Tema 2: Hormonas hidrosolubles y transduccin de seales ............... 173


1 Transmisin de seales .................................................................................. 173
2 Caractersticas de la interaccin hormona-receptor ........................................ 173
2.1 Cintica interaccin hormona-receptor ...................................................................... 174

3 Modelos de transduccin de la seal .............................................................. 176


4 Sistema adenilato ciclasa y AMPc ................................................................... 177
4.1 Receptores 7tm acoplados a protenas G ................................................................... 177
4.2 Estructura de las protenas G trimricas y modelo de actuacin ............................... 178
4.3 Sistema Adenilato ciclasa, AMPc y PKA ....................................................................... 180
4.4 Desensibilizacin de receptores .................................................................................. 182

5 Sistema de fosfolipasa C, IP3 y DAG................................................................. 182


5.1 Sistema de la fosfolipasa C (variante ) ...................................................................... 183
5.2 Sistema fosfolipasa C (Variante ) ............................................................................... 184
5.3 Variantes de PKC ......................................................................................................... 185
5.4 Control de la cantidad de calcio libre en el citosol ..................................................... 186
5.4.1 Calmodulina y Calcio-Calmodulina quinasa ....................................................................... 186
5.4.2 Protenas reguladas por calcio y calmodulina .................................................................... 187
5.4.3 Canales de calcio receptores de IP3 .................................................................................... 188
5.4.4 Evaluacin experimental de los aumentos de calcio .......................................................... 188

6 Sistema de guanilato ciclasa ........................................................................... 189

Tema 3: Factores de proliferacin celular. Origen del cncer ............... 191


1 Receptores con actividad Y-quinasa ................................................................ 191
1.1 Modelo de activacin de receptores con actividad Y-quinasa.................................... 192
1.2 Estructura de los factores de crecimiento .................................................................. 193
1.2.1 El factor de crecimiento transformante.............................................................................. 193
1.2.2 Eritropoyetina (EPO) ........................................................................................................... 193

1.2.3 Factor de crecimiento epidermal ........................................................................................ 194


1.2.4 Factor de crecimiento derivado de fibroblastos ................................................................ 194

1.3 Fosforilacin de tirosinas y dominios .......................................................................... 194


1.4 Rutas de sealizacin en las que intervienen Y-quinasas ........................................... 197
1.4.1 La insulina como factor de crecimiento .............................................................................. 197
1.4.2 La fosforilacin de IRS-1 tambin activa la va de PKB ....................................................... 198
1.4.3 Mltiples cascadas a partir del receptor de insulina .......................................................... 198
1.4.4 Detalles de la activacin de la ruta de las MAPKs .............................................................. 199
1.4.5 Secuencia de transduccin para EPO a travs de JAK (receptor de citoquinas) ................. 201
1.4.6 AKT1 (=PKB) y PTEN ........................................................................................................... 203

2 Vas de sealizacin ....................................................................................... 205


2.1 Receptores con actividad enzimtica intrnseca o asociada ....................................... 206
2.2 Ruta de transduccin para TGF-Smad ....................................................................... 207
2.3 Rutas de transduccin que involucran protelisis ...................................................... 208
2.3.1 Ruta de Wnt........................................................................................................................ 208
2.3.2 Ruta de Hh .......................................................................................................................... 209
2.3.3 Ruta de NFB ...................................................................................................................... 210
2.3.4 Ruta de Notch/Delta ........................................................................................................... 211

3 Anomalas que pueden producir diversas clases de cncer .............................. 212


Anexo I: Ruta de CREB ....................................................................................... 213
Anexo II: Rutas de transduccin de seales en la clula ..................................... 214

Bloque IV: Regulacin Molecular De La Neurotransmisin


Tema 1: Canales inicos que responden al voltaje ............................... 217
1 Extraccin y purificacin de canales ................................................................ 217
2 Trnsito de iones a travs de canales .............................................................. 219
3 Estructura de los canales dependientes de voltaje .......................................... 220
4 Dinmica temporal en la apertura de canales. ................................................ 223
5 Paso de iones a travs de los canales .............................................................. 223
6 Experimentos electrofisiolgicos con el mutante Shaker ................................. 225

Tema 2: Transmisin colinrgica.......................................................... 227


1 Protenas implicadas en la transmisin colinrgica .......................................... 227
1.1

Transportadores de colina (ChTs) ......................................................................... 227

1.2 Sntesis de acetilcolina y transportador vesicular (VAChT) ......................................... 227


1.3 Liberacin de acetilcolina al espacio sinptico ........................................................... 229
9

1.4 Receptores muscarnicos (m-AChR) ............................................................................ 230

2 Drogas que afectan a la sinapsis colinrgica .................................................... 231


3 Colinesterasas (AChE y BuChE)........................................................................ 231

Tema 3: Receptores ionotrpicos ........................................................ 235


1 Sistema glutamatrgico .................................................................................. 235
2 Sistema GABArgico ....................................................................................... 237
3 Receptor de glicina ......................................................................................... 238

Tema 4: Transmisin adrenrgica y receptores metabotrpicos .......... 239


1 Ruta de biosntesis de catecolaminas .............................................................. 239
2 Rutas dopaminrgicas .................................................................................... 240
3 Inactivacin de catecolaminas ........................................................................ 241
4 Sistema dopaminrgico .................................................................................. 241
5 Sistema adrenrgico ....................................................................................... 242
6 Sistema serotoninrgico ................................................................................. 242

Tema 5: Transmisin peptidrgica ....................................................... 245


1 Encefalinas ..................................................................................................... 245
2 Sntesis y acciones de los neuropptidos......................................................... 245
3 Estructura gnica de los neuropeptidos .......................................................... 246
4 Receptores de neuropeptidos ......................................................................... 247

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Bloque II: Regulacin Molecular De Los


Procesos Celulares
TEMA 1 Aspectos Metablicos del Citosol
La construccin del ribosoma y su regulacin. Destino celular de las protenas producidas en
ribosomas libres. Chaperonas moleculares: familias y diversidad funcional. Cambios posttraduccionales en las protenas sintetizadas en ribosomas libres.
TEMA 2 Transporte de Material del Citosol al Ncleo, del Ncleo al Citosol y del Citosol a
la Mitocondria
Seales peptdicas en protenas destinadas al ncleo. Mecanismo molecular del transporte de
protenas y polinucletidos por el poro nuclear. Protenas Ran, importinas y exportinas. Motivos
estructurales de las protenas destinadas a la mitocondria. Translocones y ubicacin de las
protenas en los compartimentos mitocondriales. El genoma mitocondrial, mutaciones y patologas derivadas. Efectos de los antibiticos sobre la actividad mitocondrial.
TEMA 3 Proteolisis Intracelular
Recambio de protenas. Degradacin lisosomal y no lisosomal. Ubiquitina y protenas relacionadas. El sistema ubiquitina/proteasoma y su implicacin en la actividad celular y el cncer.
Proteasomas: estructura, funcin y aspectos evolutivos. Proteasas que se activan por calcio.
Patologas derivadas del mal funcionamiento de las vas degradativas.
TEMA 4 Regulacin del Ciclo Celular
Estapas del ciclo y su regulacin. Ciclinas, proten-quinasas y proten-fosfatasas. Mecanismo
de accin de los factores de crecimiento. Puntos de control de DNA daado. Fallos en la regulacin del ciclo y cncer.
TEMA 5 Funciones del Retculo Endoplsmico-I
Obtencin y caracterizacin de fracciones subcelulares. El retculo endoplsmico. Biognesis
de fosfolpidos, ceramidas y esteroides. El colectivo de protenas citocromo P450. Su mplicacin en la sntesis de lpidos y en la eliminacin de txicos.
TEMA 6 Funciones del Retculo Endoplsmico-II
Sntesis de protenas en ribosomas del retculo endoplsmico. Propiedades estructurales y
funcionales del pptido lder y su receptor. Estructura y funcin de los translocones del retculo.
Insercin de protenas transmembranales en la bicapa lipdica.
TEMA 7 Glicosilacin de Protenas en el Retculo Endoplsmico y en las Cisternas del
Golgi
Glicosilacin de protenas. Justificacin. Glicosilacin en el citosol. Sntesis del oligoglicano
base en el retculo endoplsmico. Sntesis e incorporacin a las protenas de glicosil-fosfatidil
inositol. Control del plegamiento de las protenas y salida hacia el lisosoma o al Golgi. Glicosiltransferasas del Golgi. Clases de oligoglucanos. Lectinas vegetales y animales. Desglicosilacin qumica y enzimtica. Exo- y endo-glicosidasas. Glicmica y sus aplicaciones en medicina.
TEMA 8 Trfico Vesicular
Protenas implicadas en la gemacin. Mecanimo molecular de la fusin de vesculas con las
membranas. Biognesis del lisosoma. Exocitosis. Produccin y regeneracin de vesculas sinpticas. Endocitosis inducida por receptores. Endosomas tempranos y tardos. Transcitosis.

11

12

Tema 1: Aspectos metabolicos del Citosol


El citosol es el medio que rodea a todos los componentes subcelulares (orgnulos, ribosomas,
grnulos de glucgeno, enzimas, protenas del citoesqueleto y vesculas de triglicridos). El
volumen que ocupa el citosol depende de:
-

El tipo celular pudiendo representar el 50% del volumen celular, pero gran parte de

este estar ocupado por vesculas del retculo endoplasmtico, del complejo de Golgi
lo que depende del tipo de clula.
El estado celular, ya que por ejemplo, una clula del sistema inmune no tiene el
mismo desarrollo de retculo endoplsmico cuando est estimulada para producir anticuerpos que cuando no est estimulada, por lo que tambin depende del estado celular.
Dnde hay ms volumen relativo de citosol, en un hepatocito o en miofibra muscular?

El volumen relativo de citosol es mayor en un hepatocito porque en la fibra muscular, aunque el volumen celular es mayor, este est ocupado por el retculo sarcoplsmico.

La concentracin de protena presente en el citosol es muy alta, del orden del 20% (P/v,
20mg/1ml o 20g/100ml). Debido a esa gran concentracin de protenas el citosol tiene un aspecto de gel estructurado.

1 Importancia del citosol en el metabolismo (Funciones)


El citosol es importantsimo en el metabolismo intermediario ya que gran parte de todas las
reacciones fisiolgicas de la clula se van a producir en l.
La glicolisis, gluconeognesis, la biosntesis de cidos grasos (importante para la incorporacin
de restos hidrofbicos a las protenas de membrana), la biosntesis de aminocidos, las interconversiones de aminocidos, la biosntesis de nucletidos, la biosntesis de azucares e interconversiones de azcares, la biosntesis y degradacin del glucgeno, la biosntesis de triglicridos (la degradacin de cidos grasos se realiza en la mitocondria).
Los granos de glucgeno se sitan en el citosol y asociados a ellos estn las enzimas implicadas
en su sntesis y degradacin. El propio grnulo de glucgeno tiene una cubierta proteica (esas
enzimas de sntesis (glucgeno sintetasa) y degradacin (glucgeno fosforilasa). Las unidades
que salen de la degradacin del glucgeno son glucosa-1-fosfato.
El metabolismo del glucgeno est fuertemente regulado por hormonas, unas que favorecen
la degradacin y movilizacin de glucgeno para aportar glucosa en situaciones en las que se
necesite una elevada concentracin de glucosa en sangre, y hay otras que, despus de la comida, cuando los niveles de glucosa son muy altos en sangre, pues ese exceso de glucosa se
acumula en forma de glucgeno. Y otras protenas que responden a las seales reguladoras de
acumulacin o degradacin de glucgeno.

13

Tambin hay gotitas de grasa, que son TAGs. Las enzimas de sntesis (triglicridos sintetasa) y
degradacin (triglicridos lipasa) estn siempre cerca de los TAGs, para que la accin sea inmediata y no tengan que ir buscando esas enzimas por el citosol.
Por ejemplo, para que una protena incorpore un resto hidrofbico ha de ser sintetizada por
los ribosomas libres del citosol. Esto se debe a que la formacin de geranil-pirofosfato y farnesi-pirofosfato, a partir del isopentenil-pirofofasto y el dimetilalil-pirofosfato (que proceden
del cido mevalonico) se produce en el citosol. Por lo tanto la nica va de incorporacin de
poli-isoprenos o cidos grasos a las protenas va a ser mediante su sntesis citoslica.
Otro de los aspectos importantes del citosol es la presencia del citoesqueleto. En el citosol
tiene lugar la remodelacin del citoesqueleto que por una parte determina el movimiento de
algunos tipos celulares, y por otra determina la posicin relativa de los orgnulos subcelulares, lo que afecta a la eficiencia y rapidez de la respuesta a los estmulos.
La red del citoesqueleto proporciona las vas por las que van a circular los elementos del citosol gracias a los motores moleculares (dineinas y quinesinas). Este sistema de conduccin (actina, tubulina,) contribuye a la eficiencia en el acoplamiento de la vescula desde la membrana de salida hacia la membrana de llegada, garantizando, adems, la complementariedad
(las vesculas del retculo endoplasmtico van a ser conducidas a la cara proximal del retculo
de Golgi y no a la cara distal).
Puesto que la red del citoesqueleto regula la actividad celular normal, los fallos en la composicin, el funcionamiento o en la dinmica de los componentes pueden favorecer los problemas
de supervivencia celular o incluso la transformacin en clula neoplsica. El caso ms extremo
es la metstasis o posibilidad de que una clula migre de un tejido afectado mediante la separacin, entrada al sistema circulatorio y deposicin posterior en el tejido aceptor.
Otros de los aspectos por los que el citosol tiene una gran importancia en el metabolismo es
por la presencia de ribosomas. En eucariotas solo existe un tipo de ribosomas que en funcin
de la protena en sntesis se van a encontrar libres o acoplados al retculo endoplasmtico.
Al ser sintetizadas, las protenas pueden portar un pptido seal que provoca el acoplamiento al RE a travs de un receptor de la seal, que posibilita que el pptido sea introducido en el RE mediante un translocon.
El destino de una protena est determinado por la secuencia de aminocidos que contiene en
el extremo amino-terminal (N-terminal) donde puede situarse una seal de trnsito que la
dirigir:
-

Si se trata de un ribosoma libre al citosol, la mitocondria, el ncleo, el peroxisoma o el


cloroplasto.
Si se trata de un ribosoma asociado al RE, al propio retculo, al complejo de Golgi, a la
membrana plasmtica, al lisosoma o exportacin por exocitosis (constitutiva o regulada).

14

La albumina es una parte fundamental del plasma sanguneo que interviene en el transporte de
hormonas (Triyodotironina, tiroxina,) y que es una secrecin constitutiva en el hgado. Por el contrario, la secrecin de insulina desde las clulas islotes del pncreas es una secrecin regulada.

2 Genoma y proteoma: Origen de la diversidad estructural y funcional de las protenas


Entre 1990 y 2001, se realiz un proyecto con el fin de conocer la secuencia de bases de todo
el DNA humano (Proyecto Genoma Humano). El ser humano tiene 3.000millones de pares de
bases (aprox. 25.000 genes) y 46 cromosomas
No hay relacin entre el tamao del genoma (en pares de bases) y el nmero de genes y
nmero de cromosomas entre las distintas especies animales y vegetales. No hay tal correspondencia, lo que determina la plasticidad y las capacidades de una clula y la posibilidad de
establecer comunicacin con otras clulas son los genes.
La unidad funcional es la protena y la unidad informativa es el gen. La ventaja evolutiva y la
capacidad de supervivencia de una clula es cuanto mayor cuanto mayor sea la diversidad de
las protenas.
Organismo
Homo sapiens (humano)
Mus musculus (ratn)
Canis familiaris (perro)
Gallus gallus (gallo)
Danio rerio (pez cebra)
Drosophila melanogaster (mosca de la fruta)
Oryza sativa (arroz)
Caenorhabditis elegans (gusano)
Saccharomyces cerevisiae (levadura)

Tamao (pb)
3.274 millones
3.420 millones
2.385 millones
1.050 millones
1.563 millones
168 millones
487 millones
103 millones
12 millones

N de genes
~25.000
~25.000
~20.000
~18.000
~22.000
~13,000
~44.000
~19.000
~6.000

N cromosomas
46
40
78
66
48
8
24
12
32

15

El conjunto de genes de un organismo seala la informacin que puede expresar la clula (la
capacidad que tiene), la variedad de protenas expresa la capacidad de la clula para hacer
frente a una situacin concreta, la variedad de protenas es altamente variable. Los genes son
los mismos en todas las clulas, pero la composicin de protenas (el proteoma de la clula)
vara y depende del tipo celular, del organismo, del momento del desarrollo del organismo, del
estado celular en ese momento, etc. El proteoma va cambiando para ir adaptndose a cada
situacin, pero los genes son siempre los mismos.
No se sabe cuntas protenas es capaz de fabricar el ser humano (100.000 protenas distintas),
pero esto tiene mucho inters, ya que comparando las protenas de una persona sana con otra
enferma, podramos ver qu protenas son causantes de esa enfermedad o qu protenas, en
su ausencia, causan esa enfermedad.
Se sospecha que la mayora de los 25.000 genes sufren splicing alternativo (90%). Se calcula
que debe de haber unas 100.000 protenas distintas, ya que por cada splicing suelen formarse
unas 4 variantes de la protena.
Hasta la fecha se han identificado 20.000 protenas distintas, que son las ms abundantes.
Como cada ao se van mejorando las tcnicas de identificacin y anlisis de protenas, por
tanto cada ao se irn descubierto cada vez ms protenas. Unas 1.000 protenas distintas se
han identificado en la mitocondria. En el suero sanguneo se han encontrado 3000 protenas y
en el lquido cefalorraqudeo unas 1000 protenas.
La diversidad de protenas aparece por resultado de Splicing alternativo (ensamblado alternativo de los exones y eliminacin de intrones) y transformaciones (o modificaciones) posttraduccionales.

2.1 Splicing alternativo


El Splicing alternativo es la capacidad de producir variantes de la misma protena que proceden del ensamblado de exones comunes y exones no comunes.
En un mismo tipo celular pueden
coexistir dos variantes distintas de
la misma protena puesto que pueden presentar diferente afinidad
por el ligando. El plegamiento de
estas variantes ser diferente y el
sitio de unin al ligado tambin.
Esto hace que dos variantes respondan de diferente manera a un
mismo ligando o a concentraciones
diferentes del mismo.
Este fenmeno de maduracin alternativa tambin puede provocar una variante con idntica
funcionalidad pero diferente localizacin.
Una variante del splicing alternativo puede localizarse en el citosol, mientras que la otra se
localice en la membrana plasmtica. Aunque ambas se sintetizaran mediante ribosomas libres, la variante de la membrana plasmtica podra estar recibiendo un resto de cido palmti16
co o poli-isopreno, adquiriendo una naturaleza anfiflica y por lo tanto siendo incorporada en
la cara citoslica de la membrana plasmtica. En caso de que el resto hidrofbico fuera incorporado en el retculo endoplasmtico esta quedar orientada hacia la matriz extracelular.

2.2 Modificaciones post-traduccionales


Otro de los aspectos que aumentan extraordinariamente la diversidad de las protenas producidas a partir de un nmero limitado de genes son las modificaciones post-traduccionales,
que pueden ser reversibles o irreversibles.
Los cambios post-traduccionales reversibles son:
-

La fosforilacin (Quinasas/Fosfatasas)
Acetilacin (acetilasas/desacetilasas o acetiltransferasas) como en el caso de las histonas y la expresin de genes.
Metilacin (metilasas/desmetilasas o metiltransferasas)
Oxidacin (oxidasas/reductasas)
Adicin de ubiquitina

Este tipo de cambios provocan cambios conformacionales en la estructura de las protenas


modulando o modificando su actividad. Adems segn sea la estructura tridimensional, la protena estar capacitada para alcanzar su destino o no.
Los cambios post-traduccionales irreversibles son:
-

Adicin de restos hidrofbicos como el cido palmtico (16C) o poli-isoprenos. Por


ejemplo la protena del oncogn RAS se encuentra asociada a la membrana y manda
seales para la proliferacin y divisin celular.
Glicosilacin entre la que podemos distinguir dos clases, la O-glicosilacin (adicin de
un oligosacrido mediante interacciones con los grupos hidroxilo de serina y/o treonina) y N-glicosilacin (adicin de los restos al grupo amino de asparragina o glutamina)
Protelisis

Una protena que pierde los restos aadidos durante los cambios post-traduccionales irreversibles pierde su actividad biolgica al perder su estructura tridimensional. En ciertos
casos esta protena puede llegar a ser txica dando lugar a agregados como es el caso de
los priones.

3 Ribosomas
Uno de los compuestos ms abundantes en el citosol son los ribosomas que varan dependiendo de si la clula es eucariota o procariota.
-

Ribosomas Procariotas (70S, 2.800 kD)


o Subunidad 50S
rRNAs 23S y 5S
34 protenas
o Subunidad 30S
rRNA 16S
21 protenas
Ribosomas Eucariotas (80S 4.500 kD)

Subunidad 60S
rRNAs 28S, 5.8S y 5S
45 protenas
Subunidad 40S
rRNA 18S

33 protenas

17

En los organismos procariotas encontramos unos


20.000 ribosomas, mientras que en una clula eucariota podemos encontrar unos 10.000.000 lo que supone
mucho ms de la mitad. Estos ribosomas estn compuestos por dos subunidades indicadas en la pgina
anterior, cada una de las cuales compuestas por varios
rRNAs y protenas asociadas (55 en procariotas y 78 en
ecuariotas).
La sntesis de estas protenas asociadas a ribosomas tiene que estar muy controlada por dos
motivos. En primer lugar por la energa necesaria para sintetizar una protena, y en segundo
lugar porque hay que producir las copias necesarias de acuerdo con la cantidad de rARN disponible. Si esta sntesis no estuviese controlada tendramos dos problemas fundamentales:
-

Las protenas que se asocian con el ribosoma pueden llegar a tener unos 80 kD, lo que
supone un despilfarro energtico.
La sobreproduccin de cualquiera de ellas supone problemas, ya que a grandes concentraciones de una protena, esta puede desplazar a otras del lugar que le corresponde, a pesar de tener menos afinidad por el sitio de unin. Esto provoca ribosomas
no operativos o de baja eficiencia.

En el cuadro se representan las interacciones de las protenas relacionadas con el ARNr 16S de
la subunidad pequea del ribosoma procariota (S =
Small). Podemos clasificar estas protenas en funcin de
su relacin entre ellas y el ARN.
-

Las protenas de la primera fila son aquellas que


interaccionan directamente con el ARNr.
Las protenas de la segunda fila son aquellas
que interaccionan con e ARNr y con las protenas
de primera lnea.
Las protenas de la tercera fila, no interaccionan
con el ARNr, sino que se asocian con las protenas anteriores.

Por ello en estas condiciones, el desplazamiento que podra provocar una desregulacin de la
expresin de las protenas del ribosoma afectara gravemente a la funcionalidad ya que, si por
ejemplo la protena S20 desplazara a S7, ninguna de las que interaccionan con S7 podran unirse. Por ello en los procariotas, las protenas estn organizadas en operones.
Un opern es un conjunto de genes que se van a expresar de manera coordinada, es decir, que
la expresin del primer gen conlleva la expresin de los genes que le siguen. Todas las protenas que intervienen en la biosntesis de las subunidades del ribosoma estn agrupadas en operones de 2 o 3 protenas.

Adems la primera de las protenas expresadas por el opern tiene la facultad de unirse a su
lugar en el ARNr correspondiente y de actuar como un represor de su propio opern unindose al mensajero. Por ello, cuando todos los sitios correspondientes de los ARNr sean ocupados se inhibir la expresin de ms subunidades.
El ritmo de sntesis de protenas es de 15 aa/s, es decir, que el ribosoma se desplaza sobre la
cadena de mRNA a una velocidad de 45 b/s. Por ejemplo, una protena de 75.000 Da, considerando que la masa promedio de un aminocido es de 100 Da, contiene unos 750 aminocidos. Por lo tanto sern necesarios 50 segundos para sintetizar una protena. Pero puesto que
se forma un polisoma en el que varios ribosomas leen el mismo mensajero al mismo tiempo
con cierto desfase entre ellos, en 100 segundos no tendremos 2 copias, sino muchsimas ms.

4 Sntesis de protenas e inhibidores


Uno de los aspectos ms importantes para el control de patgenos y la investigacin bsica es
la inhibicin de la sntesis de protenas en procariotas y eucariotas.
Se conocen una serie de inhibidores que afectan a la sntesis de protenas en procariotas,
mitocondrias y cloroplastos, ya que estos orgnulos proceden de los procariotas (teora endosimbiotica) y presentan los mismos ribosomas.
-

El Cloranfenicol inhibe a la peptidiltransferasa, una ribozima (ARN con accin cataltica no proteica) que transfiere la cadena polipeptdica desde el sitio peptidil (P) al sitio
aminoacdico, para que se vaya formando la cadena.
La Puromicina es un anlogo estructural del Tyr-tRNA (aminoacil de tRNA), de manera
que se engaa al ribosoma, ya que incorpora a la puromicina creyendo que es la TyrtRNA y por tanto ya no puede continuar la elongacin de la cadena polipeptdica.
Tambin puede afectar a eucariotas.
La Tetraciclina y la Estreptomicina se unen a la Subunidad 30S y provoca la lectura
errnea del mRNA.
La Eritromicina se liga al rRNA 23S y detiene la translocacin del ribosoma a lo largo
del mRNA.

En cuanto a los Eucariotas:


-

La Ciclohexidimida acta como el cloranfenicol en procariotas.

La utilizacin de Ciclohexidina nos permite determinar si la recuperacin de actividad de una


protena, previamente inhibida, se produce por la sntesis de novo o mediante su recuperacin a
partir de un pool o reservorio. Para ello se comienza el ensayo inhibiendo a la enzima en cuestin (p.e. AChE con isopropil-pirofosfato) y a continuacin se bloquea la sntesis de protenas
aadiendo Clicloheximida al cultivo. Si tras un tiempo la actividad proteica se recupera querr
decir que hay una reserva de protena inactiva que ha sido movilizada por accin de las chaperonas, pero si no se recupera, querr decir que la recuperacin se deba a la expresin del gen.
Adems la combinacin en experimentos secuenciales con Ciclohexmida, Cloranfenicol y ambos,
nos permiten determinar si una protena procede del genoma nuclear, mitocondrial o de un
reservorio.
1

Puesto que las mitocondrias se ven afectadas por los inhibidores procariticos, los efectos del
consumo de estos compuestos sobre una persona dependern de la cantidad, del genoma y
el proteoma del individuo, as como de la naturaleza del antibitico y del tejido.
Cualquier agente antibacteriano que pueda afectar a nuestras mitocondrias afecta al resto de
la clula tambin. Dependiendo de la naturaleza qumica de estos compuestos, tendrn mayor
o menos dificultad para atravesar la membrana (cuanto ms polar sea, pasar con menos facilidad; cuanto menos polar sea, pasar con mayor facilidad). Tambin depende de la naturaleza
de la membrana mitocondrial externa e interna, que tienen distinta permeabilidad.
Se puede utilizar la Eritromicina, porque no puede cruzar (o casi no puede entrar) la
membrana mitocondrial interna.
Las clulas que se dividen muy activamente tienen muchas ms mitocondrias, por lo son mucho ms vulnerables a estos inhibidores. La vida media de una mitocondrial en una clula normal es de 5 o 6 das. Por eso, para que se afectaran de manera notable las clulas del organismo, tendra que someterse a un tratamiento con antibiticos durante unos 5, 6 o 7 das, para
afectar gravemente a las clulas. Si el tratamiento es de un par de das, por ejemplo, es posible
que solo el 20 o 30% de las mitocondrias de una clula se vean afectadas, pero aun as la clula
seguira funcionando ms o menos de forma aceptable (con el 80% de mitocondrias funcionando). Pero si por ejemplo se ven afectadas ms del 50-60% de las mitocondrias, pues la clula se ver gravemente afectada por esa disminucin de mitocondrias.
Los tratamientos con antibiticos bacterianos tienen que ser lo ms breves posible para que
no afecte mucho a las clulas y adems, que no se cree resistencia por parte de las bacterias.
Tetraciclinas: No pueden pasar a travs de la membrana plasmtica de las clulas de la
mdula sea, porque se crea el complejo tetraciclina-Ca, debido a que en el hueso hay una
gran concentracin de calcio (los huesos estn formados por fosfatoclcico).
Los tratamientos con antibiticos pueden causar trastornos en tejidos del epitelio intestinal,
apareciendo diarreas, se muere la flora intestinal, y algunos antibiticos pueden ocasionar
estado de anemia, porque se daan clulas sanguneas que sufren un recambio rpido y necesitan multiplicar sus mitocondrias.
Tambin hay que destacar que cuando estamos sometidos a un tratamiento con antibiticos,
nos sentimos dbiles y sin fuerzas, porque con el antibitico se ve reducido la sntesis de ATP
en las mitocondrias.

5 Chaperonas moleculares
En la construccin del ribosoma, intervena
los RNA ribosomales y adems un montn de
protenas, donde unas 55 para el ribosoma
bacteriano y en torno a 78 para el ribosoma
de eucariotas.
2

Estas protenas se sintetizan en ribosomas libres, y despus entran al ncleo (a travs de los
poros nucleares), llegando al nucleolo (que es la fbrica de ribosomas). A continuacin se forman las partculas pre-ribosomales (unindose al RNA ribosomal), que salen por los poros nucleares hacia el citosol. Una vez fuera, terminan la maduracin, unindose al RNA mensajero
ambas subunidades ribosomales (pequea y grande) y empieza la sntesis de protenas.
Para que todo esto ocurra de forma rpida y eficiente, hacen falta unas protenas de ayuda
que son las chaperonas.
La secuencia de aminocidos de una protena determina su estructura tridimensional, lo que
quiere decir, que al concluirse la sntesis de la cadena polipeptdica la protena debera estar
plegada. Pero lo que sucede en realidad es que los determinantes estructurales se pueden
situar en el extremo central o en el carboxilo, y por lo tanto, la protena no pueda plegarse
hasta que se haya completado la sntesis.
Cuando una protena presenta los determinantes estructurales en la secuencia N-terminal,
esta se ir plegando conforme sea sintetizada pero si se sitan ms adelante, la protena comenzar a plegarse de forma errnea formando un ovillo. Para evitar este fenmeno, las chaperonas van a mantener la estructura de la protena en sntesis desplegada hasta que los
determinantes estructurales permitan el plegamiento correcto.

5.1 El descubrimiento de las Chaperonas


En 1960, Anfinsen puso de manifiesto que la informacin necesaria para la estructura de una
protena se encontraba en la secuencia de aminocidos en sus experimentos con la ribonucleasa, pero los datos fueron malinterpretados.
El experimento consista en ver como la actividad de la ribonucleasa se desplomaba al aadir
urea (agente desnaturalizante) al medio. Si ahora se introduca la mezcla en una bolsa de dilisis, la urea abandonaba el medio y al poco tiempo la ribonucleasa recuperaba su actividad
biolgica.
Este experimento desemboc en un dogma de la biologa molecular que posterior mente tuvo
que ser matizado: La secuencia de aminocidos de una protena determina la estructura tridimensional.
Pero las condiciones en el interior celular son ms complejas que in vitro. En primer lugar no
hay un solo tipo de protenas, sino miles, y en segundo lugar un mensajero est siendo traducido a la vez por muchos ribosomas, por lo que varias copias de la misma protena se estn
sintetizando progresivamente y muy prximas, por lo que si presenta dominios hidrofbicos,
estas podrn asociarse para formar agregados.
Por lo tanto, en muchas ocasiones, ser necesaria la participacin de otras protenas, denominadas chaperonas, para proteger las regiones hidrofbicas e impedir estos procesos. Las chaperonas, al igual que las dems protenas, van a actuar reduciendo la energa necesaria, o
facilitando el plegamiento, pero sin intervenir al final de la reaccin.

El nombre de Heat shock protein (HSP) o protenas de choque trmico, que reciben las chaperonas, proviene de la observacin de su sntesis cuando se somete un cultivo celular a una
temperatura mayor a la que presenta un funcionamiento ptimo.
Si se introduce un cultivo de linfocitos en una cabina de flujo a 42 C durante 10 minutos,
aunque la clula sigue viviendo, muchas de sus protenas comienzan a desnaturalizarse, lo
que provoca las seales de estrs trmico que desembocan en la sobreexpresin de chaperonas para favorecer el replegamiento y la recuperacin de protenas.
En condiciones normales siempre existe una expresin basal de chaperonas, ya que, como
veremos ms adelante, estas van a tener muchas ms funciones. Para ejercer dichas funciones
precisan de un aporte de ATP, puesto que va a ser su hidrlisis la que produzca la variacin de
energa libre necesaria para dar lugar a procesos desfavorables termodinmicamente.
En general, las chaperonas van a ser inducibles por todos los factores que faciliten el unfolding1 como:
-

Variaciones de temperatura.
Disolventes orgnicos (etanol, propiodioxano,)
Elementos metlicos (Zn, Pb,)

Otra de las funciones que desarrollan las chaperonas es el mantenimiento de la cadena de


aminocidos desplegada para aquellas protenas cuyo destino son los orgnulos celulares, y
que por lo tanto precisan atravesar translocones con un dimetro de poro pequeo (TON y PIN
en la mitocondria). Esta es una funcin tan importante que aquellas levaduras que no sintetizan chaperonas son inviables.
Finalmente, los fallos en la sntesis de ciertas chaperonas estn asociados con enfermedades
como el Alzheimer, la fibrosis qustica o la mucolipidosis (acumulo de material lipdico en los
lisosomas). Quizs no es el agente causal, pero es un factor de riesgo para el desarrollo de la
enfermedad.

5.2 El plegamiento de las protenas


En el entorno celular las protenas se sintetizan como cadenas de aminocidos desplegadas
cuyo estado de energa interna es mximo y por lo tanto muy inestable. Por ello existe la
tendencia natural de reducir esta energa mediante el plegamiento que puede realizarse correcta o incorrectamente, dando lugar a diferentes estados conformacionales.
La parte izquierda de la grfica de la siguiente pgina representa como una protena desplegada va a ir adquiriendo diferentes estructuras conformacionales de plegamiento parcial, hasta
alcanzar el estado nativo en el que posee una estructura tridimensional que le permite llevar a
cabo su actividad cataltica. Cada uno de los sucesivos estados presentan una menor energa
interna, y por lo tanto una mayor estabilidad en los que la protena se estabiliza per se mediante interacciones intramoleculares.

Prdida de estructura nativa, desnaturalizacin.

En algunas ocasiones las protenas se pliegan de manera errnea cayendo en un estado de


energa interna inferior por el que necesitarn de la participacin de las chaperonas para alcanzar el estado de transicin y superar la barrera energtica que les impide alcanzar la estructura nativa. Las chaperonas actan por tanto como catalizadores que reducen la energa necesaria para pasar de un estado a otro, facilitando la adquisicin de la estructura nativa e impidiendo que fruto del plegamiento incorrecto las protenas comiencen a desarrollar interacciones intermoleculares para estabilizarse.
Las protenas admiten cierta flexibilidad conformacional ya que cuando estas interaccionan con el sustrato sufren un cambio conformacional y por lo tanto la estructura nativa no
es un estado fijo e inmvil. Esta flexibilidad es lo que se conoce como ajuste inducido.
Muchas protenas, en su variacin por los estados parcialmente plegados, comienzan a desarrollar interacciones intermoleculares con protenas de la misma clase que conducen a la formacin de agregados, tal y como se representa a la derecha de la grfica inferior.
Los estados de agregacin son peligrosos
ya que suelen ser txicos para muchos
tipos celulares, aunque las chaperonas
van a ser capaces de actuar sobre aquellos
que no sean insolubles, recuperndose
las protenas.
Los agregados pueden ser amorfos, pero
tambin pueden ser oligmeros muy estructurados y estos pueden polimerizarse
para formar fibrillas amiloides muy insolubles. Todos estos estados sern reversibles, siempre y cuando las chaperonas
sean capaces de acceder a ellos.

5.3 Funciones de las chaperonas


Como ya se puede intuir, las chaperonas presentan muchas funciones en el entorno celular.
1) Facilitan el plegamiento del polipptido para alcanzar la estructura nativa.
2) Previenen el plegamiento en aquellas protenas cuyo destino no es el citosol y precisa
atravesar translocones.
3) Importantes en las interacciones protena-protena, protena-RNA y protena-DNA
(histonas).
4) Renaturalizacin de protenas parcialmente desnaturalizadas.
5) Conversin de agregados en unidades proteicas.
6) Colaboracin a la protelisis participando de manera activa en el ciclo de la ubiquitina-proteosoma y en la autofagia.
7) Formacin de agregados con diversos receptores, como el de cortisol, que se sita en
el citosol secuestrado por una chaperona que tapa su sitio de reconocimiento nuclear
5

hasta que la llegada del cortisol produce un cambio conformacional que libera el sitio y
permite su importacin al ncleo y la bsqueda de su elemento de respuesta (secuencia de nucletidos).
8) Transporte de protenas por translocones como en el caso de las chaperonas SecA en
procariotas y BiP en eucariotas. La protena de unin o Binding protein (BiP) facilita la
entrada de protenas al lumen del retculo endoplasmtico en el transporte posttraduccional (no confundir con la introduccin co-traduccional mencionada anteriormente). BiP es por tanto una chaperona que va a empujar protenas sintetizadas, mediante gasto de ATP, al interior del retculo.
9) Control de calidad (plegamiento correcto) a travs de los distintos pasos hasta el destino final de una protena. Las chaperonas son capaces de forzar a las protenas a conseguir su estructura nativa aunque sea necesaria la desnaturalizacin completa para
volver a realizar el plegamiento.
Adems, las chaperonas participan en la progresin del ciclo celular, mantenimiento de los
telmeros, apoptosis, transduccin de seales mitticas, transporte vesicular, inmunidad innata y degradacin proteica.
Conforme aumenta la edad, disminuye la capacidad de sntesis de chaperonas, lo que genera
problemas con la proteostasis (homesotasis del proteoma) dando lugar a neurodegeneracin,
demencias, diabetes tipo-2, patologas por depsitos de material en lisosomas, fibrosis qustica, patologas cardiovasculares y cncer.

5.4 Clasificacin de las HSP


El nmero de chaperonas que se conoce es enorme y est en constante aumento conforme
aumenta las investigaciones al respecto. La tabla con algunas de estas chaperonas puede ser
consultada en el documento anexo donde se indica la localizacin tisular, celular, los sustratos
y algunas enfermedades relacionadas con cada chaperona.
En cualquier caso se han agrupado en varias familias en funcin del tamao molecular en kDa.
-

HPS20
HSP40
HSP60
HSP70
HSP90
HSP100

Para establecer la identidad (parecido) entre las chaperonas de una misma familia se elige una
como prototipo o estndar y se calcula el parecido de secuencia con respecto a las dems.
Puesto que se encuentra en todos los orgnulos debieron aparecer en un momento temprano
de la evolucin, y puesto que estn representadas por muchas familias, su funcin es muy
importante ya que nos encontramos con un sistema de redundancia.
Esta diversidad tambin puede explicarse si se considera que la diana de accin son miles de
protenas con multitud de dominios estructurales diferentes. Cuando una chaperona detecta
6

una protena parcialmente desplegada que ha dejado expuesto un dominio hidrofbico, desarrolla su actividad cataltica golpeando a la protena hasta que recupera su forma nativa. De
esta manera se evita la formacin de agregados insolubles. Pero esto puede pasar con cualquier protena, por lo que es necesario que el centro activo sea flexible para abarcar una gran
cantidad de motivos. Adems, la combinacin de varias chaperonas aportar una cierta especificidad, pero relativa, para establecer una unin de baja afinidad que permitir la salida posterior de la protena.

5.5 Modo de accin de algunas chaperonas


Veamos ahora el modo de accin de algunas chaperonas representativas de la mayora casos
en los que van a participar.
Una protena desplegada pasa por varios estados de plegamiento parcial (estados de Molten o
glbulos de modulo fundido) en los que
presenta varias alternativas favorables
termodinmicamente. Por un lado la
protena puede alcanzar la estructura
nativa, que es el camino favorecido
termodinmicamente (en menor medida la reversin), por otro lado, puede
formar agregados cuya reversin es
muy desfavorable.
En cualquier caso, el plegamiento es un proceso espontneo y termodinmicamente favorable (G < 0), pero el hecho de que el proceso ocurra no conlleva un tiempo definido y por ello
en muchas ocasiones las chaperonas van a intervenir para que el plegamiento se produzca
rpidamente.
Adems, es muy probable que las protenas que presenten los determinantes estructurales
en los extremos C-terminales precisen de la colaboracin de las chaperonas.
5.5.1 HSP70 y co-chaperonas (HSP20 y HSP40)
La HSP70 es una chaperona que presenta tres dominios funcionales:
-

Dominio de unin a nucletidos (ATP/ADP) o nucleotide binding domain con actividad


ATPasa.
Dos dominios de unin a protenas con estados de baja y alta afinidad.

El dominio de unin a nucletidos, en


verde, presenta una actividad ATPasa
basal pero la unin a la protena diana
por medio de los dos dominios de unin,
en gris y amarillo, provoca un cambio
conformacional que provoca la actividad
ATPasa. La hidrlisis de ATP a ADP provoca un tirn molecular que aumenta la
afinidad de los dominios de unin por la
7

protena diana que es golpeada una y otra vez hasta alcanzar su estado nativo. Por lo tanto
la HSP70-ADP presenta una alta afinidad por la protena diana.
Para que se pueda llevar a cabo cada ciclo la protena NEF (Nucleotide Exchange Factor) intercambia el ADP por ATP, haciendo que los dominios de unin a protenas de HSP70 cambien de
alta a baja afinidad. HSP70-ATP es el estado de baja afinidad por la protena diana.
Si la protena sigue presentando regiones hidrofbicas al medio, y por ende, est mal plegada,
entonces an presenta la afinidad suficiente por los dominios de unin a protenas y permanece en lugar activo para recibir un nuevo golpe. Pero si ha adquirido su estructura nativa entonces el cambio de HSP70 a un estado de baja afinidad le permite liberarse.
La HSP40 y HSP20 son co-chaperonas que median en el reconocimiento de protenas mal plegadas, caracterizadas por la exposicin de regiones de al menos 8-10 o 12 aminocidos hidrofbicos2, transportndolas hasta las proximidades de la HSP70 ejecutora y adems promueven
su actividad ATPasa.
Si observamos un ejemplo en el que interviene la protena J (co-chaperona), cuando esta interacciona con una protena
desplegada o mal plegada (1), se
une a ella y la traslada hasta la
HSP70, formndose un complejo
ternario (2) entre la protena J,
la protena diana y HSP70.
A continuacin se produce la
hidrolisis de ATP en HSP70 (3) lo
que provoca su aumento de
afinidad por la protena diana y
un descenso de afinidad por la
protena J.
Ahora NEF interviene y se une a HSP70 (4) provocando la salida del ADP (5) y la entrada de ATP
(6) con el consiguiente cambio conformacional, pasando a un estado de baja afinidad y favoreciendo adems la salida de NEF (7).
Este ciclo puede tener xito y conseguirse la estructura nativa de la protena o puede fracasar.
Cuando tras varios intentos no se consigue plegar correctamente a la protena esta es derivada hacia la degradacin a travs del sistema de ubiquitina-proteosoma o a travs de la autofagia.
5.5.2 HSP90
La HSP90 (Apo-HSP90) es un dmero que presenta tres dominios funcionales:
-

Dominio de unin C-terminal (CD) por donde los monmeros se unen a travs de sus
extremos C-terminales y en ocasiones es denominado pinza molecular.

Arginina y lisina

Dos dominios (uno por monmero) intermedios de unin a protenas (MD).


Dos dominios (uno por monmero) N-terminales de unin a nucletidos (ND).

Esta chaperona presenta tres estados conformacionales diferentes en funcin de los ligandos a
los que se encuentre unida.
La primera conformacin o conformacin de alta afinidad es la
que se produce cuando la HSP90
no interacciona con sus ligandos
(ATP/ADP y una protena desplegada). Se encuentra en un estado
relajado con los monmeros
unidos a travs de CD separados
y exponiendo al medio algunos
residuos hidrofbicos con alta
afinidad por las protenas mal
plegadas.
La segunda conformacin o de baja afinidad se produce cuando HSP90 incorpora ATP en los
dominios ND y una protena desplegada en los dominios MD. La estructura se cierra y el sustrato queda secuestrado por interacciones no covalentes de baja afinidad.
La tercera conformacin o conformacin compacta se produce cuando otras protenas como
AHA1 interaccionan con HSP90 de baja afinidad, provocando la aproximacin de los dominios
ND con ATP unido, que dimerizan y aplastan a la protena que se encuentra unida en MD.
Finalmente se produce la hidrlisis del ATP a ADP +Pi que provoca la vuelta al estado de alta
afinidad inicial, la separacin de los dominios ND y la liberacin de la protena plegada. Posteriormente se libera el ADP + Pi y la chaperona vuelve al estado ms desplegado de alta afinidad.
Tal y como se puede observar en la imagen, el paso de un estado a otro est muy regulado
por protenas que comprueban que la protena unida a HSP90 necesita o no plegarse impidiendo o permitiendo el avance del proceso.
5.5.3 HSP60 (GroEL y GroES)
La familia de chaperonas HSP60, a diferencia de las anteriores, forman estructuras polimricas
de oligmeros (Chaperoninas3) que en procariotas dan lugar a una estructura don forma de
barril compuesto por:
-

GroEL que es un cilindro con 14 subunidades proteicas (HSP60) cuyo interior da lugar a
dos cmaras, una superior y otra inferior separadas por una barrera.
GroES es una especie de tapadera con 7-8 subunidades de HSP60 que interacciona con
los huecos de las cmaras de GroEL.

Existe una tendencia a denominar Chaperonas a las monomricas y Chaperoninas a las polimricas.

Cuando una protena resulta resistente al plegamiento por HSP70, entonces esta se la cede a
GroEL, mediante un intercambio de ADP por ATP (cambio de alta afinidad a baja afinidad), que
la introduce en la cmara abierta (cis).
Puesto que cada complejo presenta dos cmaras estn actuaran de manera cclica y alternativa
por lo que mientras que una cmara puede presentar ATP unido, la otra podr presentar ADP
o el sitio vaco.

Al mismo tiempo que la protena va entrando en la cmara cis de GroEL, se promueve la salida
de 7 ADP en la cmara trans y la separacin de su unidad GroES, al mismo tiempo que 7 ATP se
unen a la cmara cis y promueve la unin de GroES.
Ahora la actividad ATPasa de las subunidades HSP60 se activa e hidroliza el ATP provocando un
cambio conformacional que presionan la protena dentro de la cmara cis hasta conseguir su
estructura nativa. En este estado con ADP, la cmara cis tiene una alta afinidad por la protena,
pero la unin del ATP a la cmara trans provoca la salida del ADP y de GroES de la cmara cis.
Puesto que la cmara presenta el interior tapizado por aminocidos hidrofbicos, en el caso de
que la protena est plegada, la salida de GroES provoca la expulsin inmediata de la protena.
Cabe destacar que la etapa ms larga del ciclo es el plegamiento de la protena.

10

5.6 Resumen
Hemos visto en los apartados anteriores como las chaperonas participan en el plegamiento de
las protenas, pero no hay que olvidar, que esta es solo una de sus acciones.
En la imagen se ha realizado una sntesis de
la importancia de las chaperonas en el plegamiento de protenas en procariotas.
Cuando la cadena polipeptdica comienza a
emerger del ribosoma esta se encuentra
con unas chaperonas unidas que mantienen
la estructura desplegada en el caso de que
se trate de una regin hidrofbica.
A partir de aqu se abren dos posibilidades.
Por un lado la protena puede sintetizarse
completamente y plegarse per se, como
ocurre en el 70% de los casos. Por otro lado
la protena necesitar de la participacin de
chaperonas que la mantengan desplegada
hasta encontrarse con HSP70 (20%) o que
adems necesiten de la participacin de los
complejos GroEL-GroES para finalizar el
plegamiento (10%).
Puesto que es ms rentable no utilizar chaperonas, la mayora de las protenas se pliegan a la
estructura nativa espontneamente, seleccionndose evolutivamente la presencia de los
determinantes estructurales en las regiones N-terminales de la secuencia de aminocidos.
Volviendo a las distintas posibilidades que tiene una protena para plegarse vamos a integrar lo
visto junto con las vas de degradacin. Una protena recin sintetizada pasa a un estado de
plegamiento parcial del que puede derivar en una protena con estructura nativa, paso facilitado por las chaperonas con una importancia relativa de 180, o puede formar estructuras mal
plegadas o misfolded y
agregados proticos.
Tal y como se muestra en
la imagen, la importancia
relativa de la degradacin de protenas va
ubiquitina-proteosoma
es de 600, unas 20 veces
mayor que la degradacin de agregados va
autofgia que tiene una
importancia relativa de
30.

11

Si una clula tiene problemas para conseguir ATP, se acorta la vida celular?
Puesto que la clula tiene daada la funcin mitocondrial y depende de un aporte continuo de ATP la clula va a sufrir, y uno de los problemas se localizar en la falta de chaperonas, lo que provocar un acortamiento de la vida.

Finalmente, en cuanto a la regulacin de la expresin de las chaperonas, tenemos que considerar que su actividad no siempre tiene por qu ser beneficiosa. Un ejemplo de ello es la
regulacin de HSP70 y HSP90 por parte del factor HSF-1 (Factor de transcripcin de chaperonas 1) en el estudio del Parkinson.
El Parkinson se caracteriza por la presencia de estructuras anmalas de -sinucleina que van
desde oligomeros solulbes hasta largos agregados denominados cuerpos de Lewy que aparecen por la polimerizacin de fibrillas insolubles.

Las chaperonas estn muy implicadas en el correcto plegamiento de estas protenas, pero
HSP90 parece promover la formacin y el crecimiento de las fibrillas y agregados, mientras que
HSP70 estabiliza las formas monomricas, inhibiendo la oligomerizacin.
Cuando la clula detecta un aumento en la cantidad de protenas mal plegadas o neurotoxinas
entonces se promueve la actividad de HSP70 y su sntesis a travs de la modulacin positiva de
HSF-1.
La rotenona y el amital son dos toxinas capaces de inhibir el transporte electrnico en la
cadena respiratoria mitocondrial provocando un descenso en la produccin de ATP que
afecta gravemente al sistema nervioso. Esto se debe a que la neurona necesita el ATP para
repolarizar la membrana a expensas de la bomba Na/K

12

Pero HSP90 acta como un secuestrador de HSF-1, evitando la produccin de HSP70, por lo
que parece que promueve la formacin de los cuerpos de Lewis.
Por casos como este, la relacin entre las distintas chaperonas est siendo objeto de profunda
investigacin ya que, por ejemplo, el mantenimiento de la vida til de p53, el guardin del
genoa, mediante una chaperona especfica alargara la vida.

6 Cambios post-traduccionales (CPT)


Los cambios post-traduccionales afectan a la mayora de las protenas, sino a todas. Actualmente se conocen ms de 200 clases de CPTs clasificados reversibles e irreversibles.
El 5% del genoma humano (1200 genes) est dedicado a codificar protenas implicadas en CPTs
y hay que considerar que esto no hace referencia 1200 genes, ya que si consideramos la posibilidad de la maduracin alternativa podramos estar hablando de unas 5000 protenas diferentes, lo que nos indica que estos cambios tienen una importancia trascendental para que la
protena cumpla su funcin. Actualmente se han identificado 250 genes (1000 protenas) dedicadas a la glicosilacin.
Una misma protena puede sufrir varios CPTs diferentes y una protena encargada de realizar
los CPTs puede actuar sobre muchos sustratos.

6.1 Cambios post-traduccionales reversibles


Los cambios post-traduccionales reversibles son aquellos que modifican la estructura tridimensional de las protenas modulando su actividad. Entre ellos destacan la fosforiladin/defosforilacin,
acetilacin/desacetilacin,
metilacin/desmetilacin,
oxidacin/reduccin y adicin de ubiquitina. Se trata de modificaciones por enlaces covalentes.
En este mbito profundizaremos en la fosforilacin/defosforilacin y en las modificaciones de
las colas N-terminales de las histonas.
6.1.1 Fosforilacin/defosforilacin
El grado de fosforilacin de las protenas est mediado por quinasas y fosfatasas que regulan el
fosfoproteoma, que hace referencia al espectro de protenas con fosfato que hay en un tipo
celular en cada momento en funcin de la circunstancia fisiolgica.
En el genoma humano se han anotado genes para ms de 500 protein quinasas (PKs) y ms
de 150 protein fosfatasas (PPs). El motivo por el que hay menos PPs es porque estas actan a
travs de protenas adaptadoras que amplan el rango de sustratos sobre los que pueden actuar. Se cree que estas protenas actan sobre ms de un tercio del proteoma humano, es
decir, sobre unas 30.000-40.000 protenas distintas, ya que, por ejemplo la proten quinasa A
(PKA) es capaz de fosforilar a ms de 100 protenas diferentes.
Existen dos tipos fundamentales de quinasas y sus fosfatasas con protenas adaptadoras alternativas.
-

Las Sern/Treonin (S/T) quinasas/fosfatasas que actan sobre residuos de serina y


treonina como PKA, PKC, Calcio calmodulina quinasa (CCK)
13

Las Tirosin (Y) quinasas/fosfatasas que actan sobre residuos de tirosina como el receptor de insulina y Abl. Pueden ser solubles o estar asociadas a la membrana. Todos
los receptores de factores de crecimiento desarrollan esta actividad.

En cuanto a los sustratos de las PKs tenemos que considerar el ATP-Mg y las protenas sobre
las que actan.
El Mg es un catin divalente que interacciona con las cargas negativas de la molcula de
ATP dando lugar a una geometra que le permite acceder al sitio activo de la quinasa.
Quinasas y fosfatasas regulan casi todos (si no todos) los procesos celulares a travs de puntos clave en el metabolismo, la transcripcin, la traduccin, el ciclo celular, la estabilidad de
protenas, el movimiento celular, la apoptosis, exocitosis regulada, la dinmica del citoesqueleto, la contraccin muscular, la accin hormonal, la transduccin de seales, etc.
Patologas asociadas con la prdida o ganancia de funcin de quinasas/fosfatasas
Existen muchas patologas asociadas a los fallos relacionados con estas enzimas clave para las
clulas.
-

La diabetes de tipo 2 est producida por un fallo en la cascada de quinasas mediada


por insulina.
Las mutaciones en los genes para las protenas SrC (oncogen), Abl (oncogen), fosfoinositol-3 quinasa (PI3K, cataliza el paso de fosfatidil inositol-4,5-bifosfato a fosfatidil
inositol-3,4,5-trifosfato) y factor activado por Ras (Raf), producen cncer.

La quinasa Abl es una protena oncognica con actividad tirosina quinasa (Y-quinasa) que
presenta en su estructura 1 serina, 1 treonina y 9 tirosinas, capaces de ser fosforiladas dando
lugar a unas 2000 variantes. La hiperfosforilacin de la quinasa Abl provoca leucemia mieloide crnica cuyo tratamiento actual consiste en la utilizacin de inhibidores como el Imatinib.
-

Procesos inflamatorios, como artritis y asma, se producen por la activacin defectuosa


de algunas PKs, como JAK, JNK e IKK.
La hiperfosforilacin de tau en Alzheimer y Parkinson.

La protena tau () est asociada a la regulacin de la polimerizacin de la tubilina y presenta


unos 40 sitios de fosforilacin en su cadena polipeptdica. La hiperfosforilacin de esta protena
est relacionada con las enfermedades mencionadas porque se impide su estabilizacin de los
microtbulos e interrumpe el transporte vesicular. Adems comienza a formar placas amiloides.
-

Anomalas en alguna de un total de 30 quinasas pueden llevar a la hipertensin.

Concepto de secuencia consenso o secuon


Si analizamos la secuencia fosforilada por la PKA en las protenas a las que regula observamos
que siempre son fosforiladas en un residuo de serina o de treonina. Pero en una protena de
unos 70 kDa con una media de 700 aminocidos puede haber muchos residuos de serina o
treonina.
14

Por ello la actividad S/T quinasa de PKA y de cualquier quinasa/fosfatasa no se va a realizar


por la mera presencia del resto diana, sino porque este se encuentra situado en un entorno
tal, que la protena ejecutora pueda reconocer un punto de actuacin. Estos entornos no son
ms que secuencias de aminocidos concretas que estn expuestas u orientadas de tal manera
que el resto a fosforilar pueda ser reconocido.
Estas secuencias de aminocidos se conocen como secuencias consenso o secuon, y en el
caso de que en el caso de PKA es
xR[RK]x[ST]B
Donde el aminocido fosforilado es la serina (S), menos frecuente treonina (T), seguidas de un
resto hidrofbico y precedidas por cualquier aminocido (x), una lisina (K) o arginina (R), una
arginina y cualquier aminocido (x).

Ejemplos de regulacin por fosforilacin: Cascada de adrenalina en hepatocito


Un ejemplo tpico de regulacin por fosforilacin es la cascada de amplificacin de la seal que
produce la adrenalina al interaccionar con su receptor 1-adrenrgico en el hepatocito y que
desencadena la movilizacin de glucosa al activar la glucogenolisis.
La unin de una hormona a su receptor es probabilstica, es decir, cada vez que la molcula
toca el receptor se activa, pero cuanto mayor sea la concentracin de hormona, ms toques
de producirn. Este concepto es muy importante ya que las uniones nunca sern de carcter
covalentes.
Esta cascada comienza con un aumento de la concentracin de adrenalina en las inmediaciones del hepatocito que provoca la interaccin (choques) entre la hormona y el receptor. Estos
choques provocan un cambio conformacional que permite la interaccin con la protena G que
desencadena la liberacin de la subunidad Gs.

15

La subunidad Gs es a su vez una activadora de la


adenliato ciclasa (AC) con la que interacciona para
producir unas 20 molculas de AMPc, y son necesarias dos de estas para pasar a PKA a un estado activo.
La PKA ahora fosforila a la fosforilasa b kinasa activndola y esta a su vez a la glucgeno fosforilasa a
activndola para permitir la degradacin del glucgeno a glucosa-1-fosfato que ser liberada como
glucosa a la sangre.
La cascada de amplificacin ha posibilitado que por
cada molcula de adrenalina se liberen hasta 10.000
molculas de glucosa a la sangre. Pero adems, al
mismo tiempo se ha fosforilado la glucgeno sintetasa inactivndola y las fosfatasas son inhibidas por las
protenas inhibidoras de fosfatasa, consiguindose
una para de la glucogenosntesis.
Ejemplos de regulacin por fosforilacin: Cascada de insulina en hepatocito
Los modelos de difraccin de rayos X del dominio
con actividad quinasa del receptor de insulina (IRK)
muestran dos conformaciones diferentes. Este receptor es un dmero en s mismo, (no dimeriza tras la
activacin) que pivota entre una conformacin activa e inactiva.
En estado inactivo el receptor de insulina presenta
una estructura compacta con un dominio pseudosutrato en el centro activo que ocluye el sitio
cataltico. Cuando la insulina choca con el receptor este sufre un cambio conformacional que
libera el centro activo de la subunidad y desarrolla una actividad tirosina quinasa (Y-quinasa),
en primer lugar sobre la otra subunidad (fosforilacin cruzada) y posteriormente con los sustratos con tirosina de la protena.
Una de las primeras protenas fosforiladas por el receptor de insulina es la protena sustrato
del receptor de insulina 1 (IRS-1) en una
tirosina. Ahora IRS-1-P es reconocida por la
fosfatidil inositol 3 kinasa (PI3K) unida a la
membrana, estimulando su actividad para
fosforilar fosfatidil inositol-4,5-bifosfato
(PIP2) a fosfatidil inositol-3,4,5-trifosfato
(PIP3).
El PIP3 es un fosfolpido de membrana que
al tener los tres fosfatos se carga mucho y
es reconocido por la quinasa dependiente
de fosfoinositol 1 (PDK-1), que al anclarse a
16

la membrana es reconocida por la protein quinasa B (PKB).


La PKB es una tambin es una S/T quinasa que es capaz de fosforilar a la glucgeno sintetasa
quinasa 3 (GSK3), pasndola a un estado inactivo. Esto permite la desfosforilacin de la glucogeno sintasa a travs de la protein fosfatasa 1 (PP1, presente en todos los tejidos).
Integracin de la seal de adrenalina e insulina en hepatocitos
El hecho de que en un momento determinado se active o inhiba la glucogenosntesis y la glucogenolisis, va a depender de la cantidad de interacciones positivas o negativas que reciba el
conjunto de receptores.
Los hepatocitos presentan receptores de adrenalina e insulina en grandes cantidades, pero va
a ser el nmero de interacciones de estos con su sustrato (que depende de su
concentracin exterior de hormonas) lo
que determine que va predomina.
Si observamos al conjunto de protenas
descritas sobre el grnulo de glucgeno,
vemos que todas estn asociadas y moduladas por quinasas sensibles a insulina
o adrenalina segn los mecanismos descritos.
Papel de la insulina como factor de crecimiento y protenas G
Hemos visto la actuacin de la insulina como hormona reguladora de los niveles de glucosa en
sangre, pero esta es adems un factor de crecimiento como el factor de crecimiento derivado
de plaquetas, la somatostatina, el factor de crecimiento epidermal, etc.
En cualquier caso, el trmino factor de crecimiento puede hacer referencia tanto al crecimiento de la propia clula, como al de la masa de clulas en s, por lo que algunos denominan a
estos ltimos factores mitticos o factores de proliferacin.
Al igual que en los apartados anteriores,
la accin de la insulina como factor de
crecimiento comienza con la activacin
de la actividad Y-quinasa del receptor que
sufre una fosforilacin cruzada en los
restos de tirosina de sus extremos carboxilo terminales.
Al igual que en el caso anterior, el IRS-1
reconoce estos fosfatos y es fosforilado
en varios de sus residuos de tirosina.
Ahora a diferencia de en el caso anterior
o al mismo tiempo, los residuos de fosfato van a poder ser reconocidos por la
protena de unin a Grb2 (Growth factor
17

receptor-bound protein 2), que cambia de conformacin y se une a la protena Sos (Son of Sevenless).
La unin de la protena Sos a Grb2 la capacita para actuar como un intercambiador de GDP
por GTP en Ras unida a la membrana. La protena Ras-GTP es reconocida por el factor activado
por Ras 1 (Raf-1) y este fosforila a MEK (Mitogen-activated protein kinase kinase) que pasa a
fosforilar a la quinasa regulada por seales externas (ERK).
La ERK fosforilada tiene la capacidad de trasladarse al ncleo porque su fosforilacin libera la
seal de localizacin nuclear que activa el sistema carioferinas (transportadores del poro nuclear), y all comienza la fosforilacin de los factores de transcripcin diana que se unirn a su
secuencia de reconocimiento activando o inhibiendo la expresin de un gen.
La importancia de las protenas G radica en su actividad como intercambiadoras de nucletidos de guanina. Estas son diferenciadas en dos clases:
-

Las protenas G monomricas como:


o Ras que es una protena de la cara citoplasmtica de la membrana plasmtica
y acta como pivote de la transduccin de seales al ncleo.
o Rho que est implicada en la dinmica del citoesqueleto.
o Ran que participa en el ciclo de transporte de protenas citosol-nucleo.
Las protenas G trimricas como:
o Gs(,,) estimuladoras del sistema adenliato ciclasa
o Gi(,,) Inhibidoras de la adenilato ciclasa.

Las mutaciones en protenas como Ras que provocan la prdida de su actividad GTPasa dan
lugar a una activacin constante que desregula completamente la expresin de protenas
desembocando en un cncer.
6.1.2 Modificacin de los dominios N-terminales de las histonas
Las histonas son unas protenas sintetizadas en los ribosomas libres del citosol que entran al
ncleo para estabilizar a la fibra de DNA polimerizndose en octmeros. Estas protenas presentan a pH fisiolgico una gran abundancia de cargas positivas en sus extremos N-terminales,
situndose su punto isoelctrico a un pH superior a 10.
Aminocidos tales como la
lisina (K) o la arginina (R)
proporcionan estas cargas
que son idneas para estabilizar a la hebra de DNA, cargada negativamente por sus
enlaces fosfodister a pH
fisiolgico.
Uno de los puntos de regulacin de la compactacin de la cromatina van a ser las modificaciones covalentes reversibles sobre las colas N-terminales de las histonas, tales como la acetilacin, metilacin y fosforilacin.
18

La acetilacin de histonas conlleva una neutralizacin de carga positiva mediante la adicin de un grupo acetilo (acetato), donado por el Acetil-CoA procedente de la mitocondria
a travs de la lanzadera de Citrato.
Cuando hay abundancia de Acetil-CoA la histona acetil transferasa (HAT) incorpora un resto de acetato al grupo -amino de la lisina y permitiendo la expresin de ciertos genes asociados a un estado de energa disponible.
Cuando los niveles de energa disminuyen, la histona desacetilasa (HDAC) puede realizar la
reaccin contraria liberando el resto acetilo y condensndose de nuevo la cromatina.

La cola de una histona es susceptible de sufrir muchas modificaciones diferentes al mismo


tiempo y adems un mismo aminocido puede sufrir varias diferentes. En la imagen se representan las diferentes modificaciones que pueden sufrir diferentes aminocidos de una histona en lisinas y argininas (ac = acetilacin, me =
metilacin, PS = fosforilacin y u = ubiquitinizacin).
Esto establece un cdigo de modificaciones de
histonas que van a variar para expresar o silenciar una determinada regin gnica o van a
facilitar la reparacin del DNA. Pero el significado de este cdigo todava no se ha establecido.
Estas modificaciones responden al hecho de que en funcin de los restos presentes en un
determinado aminocido y de su entorno, una protena podr o no reconocer la secuencia,
favoreciendo o impidiendo la expresin. Por ejemplo, la el factor de transcripcin BPTF es capaz de reconocer lisinas acetiladas o metiladas en la cola N-terminal de la histona H3, pero en
esta puede haber muchas lisinas con esta modificacin, por lo que lo que reconoce la protena
es una secuencia que presenta la lisina modificada, no solo el resto.
19

El paso de la estructura compacta (heterocromatina) o abierta (eucromatina) depende de la


accin conjunta de protenas que escriben sobre las histonas, las que leen la informacin
y las que borran los cambios. La accin cooperativa de estas protenas decide cundo deben expresarse o silenciarse genes y por cunto tiempo. Tambin regulan los mecanismos de
reparacin del DNA.
6.1.3 Otras modificaciones covalentes reversibles
Otras modificaciones covalentes reversibles son:
-

Incorporacin de cido adenlico (AMP) en glutamina sintetasa de E. coli por adenililtransferasa, una actividad regulada a su vez por uridil-transferasa.
Adicin de metilo (SAM) en restos de cido glutmico de receptores que regulan la
quimiotaxis bacteriana.
Adicin de ubiquitina a histonas y otras protenas de manera reversible (histonas) mediante unos pocos restos, o de manera irreversibles (degradacin proteica).
Incorporacin de ADP-ribosa en histonas, factor de elongacin EF2, subunidades s yi
de las protenas Gs y Gi del sistema adenilatociclasa (reversible o irreversible).

20

6.2 Cambios post-traduccionales irreversibles


Entre los cambios post-traduccionales ms importantes son:
-

Adicin de restos hidrofbicos.


Glicosilacin
Protelisis

6.2.1 Adicin de restos hidrofbicos


La observacin de la membrana plasmtica revela la existencia de dos localizaciones proteicas
de diferente origen.
Las protenas situadas en la cara
citoslica de la membrana plasmtica presentan restos de cidos grasos (palmtico, mirstico,
farnesilo o geranil-geranilo) hidrofbicos, mientras que las
protenas situadas hacia el espacio extracelular (ectoprotenas)
presentan glicosil fosfatidil inositol (GPI) en su extremo Cterminal.
Las ectoprotenas van a ser sintetizadas en ribosomas asociados al retculo endoplasmtico
donde incorporarn a la fosfoetanolamina Cterminal varios residuos de un oligosacridos de
manosa y N-acetil-glucosamina. A continuacin
el conjunto protena-oligosacrido es unido al
fosfatidilinositol (fosfolpido) que porta un par de
diacilglicerol insertos en la membrana, formando
el puente de GPI. La protena anclada ahora viaja
por las cisternas intracelulares hasta ser incorporada a la membrana por exocitosis.
La molcula de inositol es un alcohol que no debe de ser confundido con un glcido, a
pesar de que su estructura cclica recuerde a estos. Ntese que a diferencia de los glcidos, el inositol no presenta una molcula de oxgeno en el ciclo.
En cuando a las protenas que quedan mirando hacia el interior celular, estas se sintetizan en
ribosomas libres en el citosol donde son modificados por la presencia de secuencias de reconocimiento para transferasas especficas y segn el resto hidrofgico que incorporen las vamos
a diferenciar en tres clases:
-

Las protenas que incorporan el cido palmtico (16C) en una cistena (C) o serina (S),
siempre interna en la cadena de aminocidos.
Las protenas que incorporan el cido mirstico (14C) en una glicina (G) N-terminal.
21

Las protenas que incorporan restos de poliisopreno como Farnesil (15C) o geranilgeranilo (20C) en cistenas (C) C-terminales que posteriormente pueden incorporar un
resto metilo.

La adicin de los restos hidrofbicos aporta un carcter anficlico a la protena que la desplaza
hasta la membrana ms cercana desde donde se desplazar hasta su localizacin definitiva.
La adicin de restos hidrofgicos como cambio post-traduccional irreversible es un proceso
que en humanos afecta a ms de 700 protenas entre las que 500 incorporan poliisoprenos,
100 incorporan cido palmtico y otras 100 cido mirstico. En el gnero Tripanosoma se han
identificado ms de 100 protenas unas a la membrana a travs de puentes GPI.
3-Isopentenil pirofosfato y la sntesis de poliisoprenos
El 3-Isopentenil pirofosfato (5C) es la molcula precursora de toda la familia de los isoprenos
presentes en gran cantidad de protenas celulares. Adems es el precursor de muchas molculas como el dolicol (relacionado con la N-glicosilacin) que acepta los azcares que sern transferidos a las protenas.
El dolicol es una molcula anfiptica con un resto alcohol que puede mirar hacia el interior
o el exterior del retculo endoplasmtico gracias a los movimientos de flip-flop. Cuando el
dolicol es cargado en la cara citoslica con la N-acetil-glucosamina y la manosa, se internaliza para glicosolar protenas.

En el citosol encontramos un equilibrio entre los ismeros de dimetilalil pirofosfato y 3Isopentenil pirofosfato, condensados por la preniltransferasa (cabeza-cola) para dar lugar al
geranil pirofosfato (10C).
La condensacin del geranil pirofosfato con una
nueva molcula de 3Isopentenil pirofosfato
da lugar al farnesil pirofosfato (15C) o la condensacin de dos molculas de geranil pirofosfato (cabeza-cabeza) da
lugar al geranil-geranilo.

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Adicin de restos hidrofbicos a protenas G sintetizadas en ribosomas libres


Las protenas G monomricas (Ras, Ran y Rho) son sintetizadas en ribosomas libres y posteriormente son modificadas para anclarse a la cara citoslica de las membranas internas en las
que desarrollarn su actividad.
Las protenas Ras y Rho son sintetizadas con la secuencia CAAX4 en su extremo C-terminal,
que es reconocida por la farnetil o geranil-geranilo transferasa para producir la adicin del
resto hidrofbico en la cistena (1, prenilacin).
La adicin del farnesilo o del geranil-geranilo provoca su anclaje en la cara citoslica del retculo endoplasmtico, donde se le retiran parte de los aminocidos de la secuencia C-terminal
(2) quedando la cistena (C) unida al resto hidrofbico.

A continuacin se produce una carboximetilacin (3) en la cistena (C) donde la S-Adenosil


metionina (SAM) acta como donador de grupos metilo y ahora en funcin de la protena (y de
la variante concreta) seguir un camino u otro:
-

Si la protena de partida era de la familia Rho, la adicin del poliisopreno le impide salir al citosol libremente, por lo que la chaperona GDI (GDP-dissociation inhibitor) la
carga (4a) y la desplaza hasta la cara citoslica de la membrana plasmtica donde participara en la reorganizacin del citoesqueleto.
Si la protena de partida era de la familia Ras, se abren dos posibilidad en funcin de la
variante.

Cistena, alanina, alanina y cualquier aminocido.

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Las protenas K-Ras4A, N-Ras y K-Ras5 viajan en vesculas al Golgi (4b) donde
la palmitoiltransferasa aade un residuo de palmtico (5, palmitolacin) y va en
vesculas a la cara citoslica de la membrana plasmtica. Pero aqu se establece una dinmica donde la prdida del residuo de palmtico (6, despalmitolacin) la devuelve al Golgi para ser palmitolada nuevamente.
Las protenas K-Ras4B se desplazan directamente del retculo endoplasmtico
hasta la cara citoslica de la membrana plasmtica gracias a interacciones inicas de sus cargas positivas con las cabezas polares de los fosfolpidos, cargados negativamente.

Raft lipdico
A diferencia de lo que se pensaba aos atrs, la membrana plasmtica no presenta una composicin homognea de lpidos y protenas. En ella encontramos los raft lipdicos o balsas lipdicas que son dominios de membrana muy estructurados.
Los raft lipdicos son dominios muy ricos en colesterol y esfigolpidos, es decir, molculas anfipticas que se organizan
de manera muy compacta
gracias a que no presentan insaturaciones. Estos
dominios son pobres en
fosfolpidos. En funcin de
la presencia o no de caveolina, se van a diferenciar dos tipos de raft:
-

Los raft caveolares son aquellos cuya protena estructural es la caveolina.


Los raft no caveolares son aquellos cuya protena estructural no es la caveolina, como
por ejemplo la flotilina.
Adems existen otros raft que no presentan protena estructural pero contienen mucho colesterol entre las cadenas de esfigolpidos saturados.

Las protenas de membrana solo alcanzan su funcionalidad en el entorno lipdico adecuado, de


la misma manera que el lpido al que se unen solo alcanza sus propiedades termodinmicas y
termotrpicas en su entorno adecuado. Por ello la relacin lpido-protena es indisoluble.
Por alguna razn ciertos grupos de protenas solo se dirigen a los raft lipdicos como las unidas
a travs de GPI.
El mensajero m de la acetilcolinesterasa (AChE) produce una protena que incorpora GPI
y se sita en la cara externa de los rafts lipdicos, junto a los receptores muscarnicos.
La existencia de los tres mensajeros (m, h y t) se justifica por la necesidad de llevar a la
enzima a diferentes espacios.

Las variantes K-Ras presentan cuatro residuos de lisina (K) en el extremo C-terminal cargados positivamente a pH fisiolgico.

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Los raft lipdicos son dominios dinmicos que se unen y separan constantemente por lo que
solo cuando interaccionen un dominio con, por ejemplo, el receptor de adrenalina y otro con
la protena G, se producir la seal.
6.2.2 Glicosilacin
La glicosilacin de protenas como cambios post-traduccionales irreversibles son la Nglicosilacin y la O-glicosilacin.
La N-glicosilacin se produce en el retculo endoplasmtico donde los restos son incorporados
a asparaginas (N) o glutaminas (Q) internas en un nico oligosacrido.
La O-glicosilacin puede tener lugar tanto en el retculo como en el citosol y consiste en la
introduccin de monosacridos en los restos de serina (S) y/o treonina (T), uno por uno a travs de interacciones con los grupos hidroxilos.
6.2.3 Cambios por protelisis limitada
Los cambios post-traduccionales asociados a la protelisis hacen referencia a la degradacin
selectiva de parte de la cadena de aminocidos con el fin de permitir que esta adquiera su
estructura tridimensional final o pueda desarrollar su actividad cataltica.
El gran ejemplo es la activacin de zimgenos, como el pepsinogeno a pepsina, los factores de
coagulacin de la sangre, del complemento, apoptosis (Caspasas), proinsulina y otras hormonas polipeptdicas, como las del hipotlamo e hipfisis, encefalinas, endorfinas, neuropptidos,
etc.
Tambin se incluyen aqu los cortes de pptidos de destino a orgnulos como aquellas que
entran al retculo y cuya secuencia hidrofbica inicial es cortada, o las seales de trnsito a los
orgnulos energticos y el peroxisoma.
6.2.4 Otros cambios post-traduccionales irreversibles
Otros cambios irreversibles que afectan a las pueden ser:
-

La conversin de formilmetionina en metionina es un proceso tpico en procariotas


donde el inicio de la traduccin siempre comienza con este aminocido. De la misma
manera, en eucariotas todas las protenas comienzan por metioinina, pero luego no la
portan en su secuencia por lo que este resto es retirado en muchos pptidos.
La adicin de grupos prostticos (hemo, biotina,) y metales (Cu, Zn, Mn,) en las protenas permite que estas puedan realizar su actividad cataltica.
La hidroxilacin de residuos, como la prolina y la lisina en el colgeno aporta resistencia a la fibra.
La adicin de carboxilato (-COO) en la posicin de restos de glutamato de la protrombina da lugar a un nuevo aminocido (no proteognico). Esto aporta dos cargas
negativas importantes en la formacin de complejos con calcio que inmovilizan a la
protena en los sitios con heridas para que se convierta en trombina y el tripsinogeno
en tripsina, provocando la coagulacin de la sangre.

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En la reaccin de coagulacin interviene la vitamina K1 y K2 que presenta colas isoprticas. La


enzima clave es la carboxilasa que se ve fuertemente inhibida por la warfarina (tambin un
rodenticida).
En medicina este inhibidor se utiliza en personas que han sufrido una angina de pecho o infarto de miocardio para evitar la formacin de trombos. Anlogamente se ha utilizado el sintrom,
un medicamento que en bajas dosis no realiza su efecto, pero que en dosis altas es muy perjudicial. Es muy complicado ajustar la dosis.

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Tema 2: Tra fico citosol-ncleo y citosol-mitocondria


El trfico entre el citosol y los distintos orgnulos subcelulares hace referencia al trnsito de
vesculas o protenas generadas por los ribosomas libres del citosol y que luego van a ser trasladados hasta sus sitios funcionales ya sea el ncleo, los orgnulos energticos o el peroxisoma.

1. Trfico citosol-ncleo
El ncleo es el destino de numerosas protenas sintetizadas en los ribosomas libres del citosol,
como es el caso de las protenas histnicas, no histnicas, los componentes de la cromatina,
enzimas como las RNA-polimerasas y DNA-polimerasas, factores de transcripcin Todas ellas
presentan en comn un dominio de aminocidos conocido como secuencia de localizacin
nuclear (NLS, Nuclear localization sequence). La NLS es una secuencia de pequeo tamao
(20 aminocidos) que puede presentar dos tipos de eptopo reconocido por las protenas de
transporte:
-

Un eptopo secuencial es aquel reconocido como secuencia de aminocidos lineal. Este tipo de secuencias son reconocidas por los anticuerpos cuando la protena est desnaturalizada o plegada de manera que se muestre completamente.
Un eptopo conformacional es aquel que puede ser reconocido al plegarse la secuencia y por lo tanto no tiene porqu ser lineal, los diferentes aminocidos pueden estar
repartidos por el pptido y reunirse con el plegamiento para permitir el reconocimiento. Este tipo de eptopos no puede ser reconocido por los anticuerpos cuando la protena est desnaturalizada, ya que est es reconocido como un motivo tridimensional.

Estas secuencias son muy ricas en ciertos aminocidos como la lisina (K) y arginina (R), que
segn el tipo de eptopo se presentaran continuas o discontinuas, y en muchas ocasiones estarn ocultas hasta la llegada de una seal extracelular que modifique el factor de transcripcin
para que muestre la NLS.
Podemos ver varios ejemplos de secuencias NLS clsicas, no clsicas e incluso algunas especiales de eptopo conformacional. Tal y como se observa en la secuencia M9, no siempre es tan
fcil distinguir la seal de localizacin nuclear. Las seales se pueden localizar en cualquier
punto de la protena excepto en los extremos, ya que, la importina precisa de un cierto apoyo
para transportar a la protena, por ello generalmente las encontraremos internas en la secuencia de aminocidos.

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La existencia de estos dos tipos de NLS nos permite inferir que no es una condicin estricta
que la protena se encuentre desplegada para ingresar al ncleo, como ocurre en la mitocondria. Adems, como veremos posteriormente, esta secuencia se puede situar en cualquier
punto de la cadena de aminocidos, ya que no ser cortada al llegar a su lugar de accin por la
dinmica nuclear durante la mitosis celular.
Hoy sabemos que el trnsito de protenas entre el citosol y el ncleo es bidireccional, es decir, ciertas protenas ingresan y salen del ncleo en respuesta a factores hormonales gracias a
la presencia de otra seal denominada seal de exportacin nuclear (NES, Nuclear export signal) que las protenas pueden mostrar alternativamente segn las condiciones celulares.
Para poder realizar este transporte la clula cuenta con una compleja batera de protenas
denominadas genricamente como carioferinas (importinas, exportinas, Ran) capaces de
realizar el transporte a travs del poro nuclear.
Las complejas interacciones que se producen entre las carioferinas, as como la gran cantidad
de interrogantes planteados sobre el proceso ha llevado al desarrollo de hasta 6 hiptesis sobre el transporte de protenas entre el citosol y el ncleo.
Un hecho muy importante es que las protenas de localizacin nuclear siempre van a mantener su secuencia de importacin/exportacin, a diferencia de lo que ocurre para las protenas
de localizacin mitocondrial o del retculo endoplasmtico. Esto se debe a que durante la mitosis se produce la desorganizacin de la membrana nuclear, liberndose todo el contenido al
citosol. La conservacin de la secuencia, permite el posterior regreso de las protenas al ncleo
tras la reorganizacin en las clulas hijas.

1.1. El poro nuclear


El poro nuclear es el complejo proteico que permite el trnsito a travs de la membrana nuclear. Su luz debe de ser lo suficientemente grande como para permitir el paso de polinucletidos
acompaados de protenas y las heteronucleoprotenas, as como las partculas preribosomales.
El poro nuclear permite el paso libre de sustancias como el agua, los iones y protenas menores de 20 kDa a favor de gradiente de concentracin. Para las protenas que tienen un tamao
de 40-50 kDa tambin hay un cierto trnsito, pero se imponen resistencias a la difusin, y para
protenas de 60-70 kDa el poro es totalmente selectivo permitiendo el paso solo a travs de la
accin de las carioferinas que reconocen las NLS.
Las partculas preribosomales presentan del orden de megadaltones, por lo que las
protenas generadas en el ncleo van a precisar del acoplamiento con exportinas para
salir al citosol. Existen muchas enfermedades derivadas del mal funcionamiento de los
transportadores de determinadas protenas nucleares.
Al ncleo pasan protenas como las ribonucleoproteinas nucleares heterogneas (hnRNPs), al
citosol salen las partculas pre-ribosomales y los pre-mRNAs, en conjunto a una velocidad de

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1500 protenas por segundo y poro. Todo gracias a la presencia de NLS/NES y la ayuda de ms
de 20 carioferinas (importinas, exportinas y transportinas) con sitios de unin a dominios FG.
El nmero de poros nucleares en las clulas eucariotas ronda las 3.000 unidades, y hasta donde se sabe hoy en da, todos estn formados por las mismas protenas. En el poro nuclear es
un octmero de nucleoporinas (protenas que componen el poro) en el que se pueden distinguir tres partes:
-

Un anillo externo situado en la membrana


externa del que se proyectan al citosol 8 filamentos.
Un armazn o anillo central donde inserto
entre las dos membranas.
Un anillo interno situado en la membrana
interna del que se proyectan otros 8 filamentos unidos en su parte distal formando
la cesta nuclear del que penden unos filamentos intranucleares cortos.

Las medidas de este poro son de unos 200-250 nm de dimetro por unos 80 nm de alto. Pero
la luz til para el paso de protenas ronda los 20-25 nm considerando que la subunidad mayor
del ribosoma tiene unos 18-20 nm.
Una de las caractersticas a destacar del poro nuclear es que las nucleoporinas que las componen presentan agrupaciones peridicas de fenilalanina (F) y glicina (G), conocidas como dominios FG. Estos dominios actan como carriles de entrada que permiten que las carioferinas
salten de uno a otro mediante cambios de
afinidad secuenciales. En la imagen de la
izquierda podemos observar la nomenclatura de las nucleoporinas de un octmero y el
nmero de dominios FG que presentan cada
una. Es importante considerar que el canal
del poro es una va aromtica que proyecta
sus aminocidos hacia la luz, tapizando el
poro, y por lo tanto el dimetro es inferior al
que se observa y depende de la conformacin de los aminocidos para permitir el
paso o no de protenas en funcin de la disponibilidad y las condiciones.
La unidad recurrente del octmero del poro parece estar formada por unas 30 nucleoporinas
diferentes y que adems pueden estar repetidas por lo que la geometra octadrica nos permite considerar que pueden estar repetidas 8, 12, 24 o 32 veces (siempre mltiplos de 8) dando
lugar a unas 500-1000 protenas por poro, que da lugar a un tamao de unos 112 MDa en vertebrados con alrededor de 200 dominios FG.

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Como veremos posteriormente, se necesita Ran (GTPasa), porque la direccin del transporte
va a depender de Ran-GTP, cuya concentracin es muy alta en el ncleo. Tambin participar
Ran-GEF como intercambiadora de GDP por GTP en la cromatina y Ran-GAP como activadora
de la actividad GTPasa de Ran en el citoplasma.
En esta imagen, por ejemplo, podemos observar como las nucleoporinas penden hacia el citosol, y en una ampliacin las asociaciones entre las carioferinas, Ran y sus protenas asociadas.
Tambin se pueden observar los dominios FG discontinuos en azul.

1.2. La lmina nuclear


El entorno en el cual se sita el poro nuclear es la lmina nuclear. La protena estructural que
se sita bajo la doble membrana nuclear es la lamina (no confundir con laminina de la matriz
extracelular) en forma de polmeros a modo de citoesqueleto nuclear a los que se van a anclar
los dems componentes formando la denominada lmina nuclear.

En la membrana nuclear podemos observar la continuidad del lumen con el retculo endoplasmtico, en el que muchas protenas estarn siendo sintetizadas. Adems en l se dispone,
insertas en las membranas, las protenas que anclan la lmina nuclear con el citoesqueleto,
formando un continuo, como es el caso de la nesprina asociada a la actina. Esto supone que el
ncleo se encuentra en una posicin especfica en la clula.
Las protenas LAP son protenas asociadas a la lmina nuclear y a ellas se asocian modificadores de la cromatina (acetilasas, desacetilasas,). Tambin podemos observar emerina y algunos receptores de membrana.

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Si analizamos el gen de la lamina, vemos que por splicing alternativo se da lugar a dos mensajeros (prelamina A y lamina C) que presentan una secuencias de localizacin nuclear y que por
lo tanto es traducido por ribosomas libres en el citosol, y posteriormente entra en el ncleo.

En cambio la emerina es una protena integral de la membrana nuclear interna, y es sintetizada


en ribosomas asociados al retculo, donde se interna en la membrana y difunde hasta llegar a
su localizacin final.
Muchas de las protenas que yacen en la membrana nuclear van a ser sintetizadas en ribosomas asociados al retculo y luego se desplazarn por movimientos laterales hasta alcanzar su
sitio funcional.

1.3. Trfico de protenas a travs del poro nuclear


En el transporte de protenas a travs del poro nuclear van a intervenir las protenas Ran (protena G monomrica con actividad GTPasa) y las carioferinas (importinas, exportinas y transportinas) que van a tener sitios de unin a los dominios FG de las nucleoporinas y van a ir saltando de uno al siguiente gracias al aporte de energa de la hidrlisis del GTP (asociado a Ran)
e indirectamente del ATP (no se conoce su participacin pero es necesario para que se produzca el movimiento).
La direccin del transporte depende directamente de Ran-GTP (elevada concentracin en el
ncleo), cuya cantidad va a depender de la actividad GTPasa intrnseca, regulada por la protena activadora Ran-GAP situada en el citosol. Adems la protena Ran-GEF intercambiar el GDP
por GTP al producirse la reentrada de Ran al ncleo. A su vez, estas protenas van a estar reguladas por diferentes cascadas que omitiremos.
La estructura tridimensional de Ran-GDP muestra una geometra muy compacta con tres bucles. Pero la conformacin de Ran-GTP muestra un gran cambio conformacional donde la adicin de las cargas negativas provoca que el bucle C-terminal se despliegue y aleje de la protena al presentar una gran cantidad de aspartato (D), que a pH fisiologco presenta carga negativa, lo que permite alojar la protena a la que se une.

Todo esto da lugar a la existencia de mltiples hiptesis para el transporte de protenas a travs del poro nuclear.

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1.3.1. Modelo de importacin a travs del poro nuclear


La protena (carga) que tiene que ingresar en el ncleo porta una secuencia NLS que va a ser
reconocida por una importina, en este caso dimrica (-), que reconoce la secuencia de
importacin (1) y formar un complejo con la carga para pasar el poro nuclear (2). En este
caso la subunidad presenta una alta afinidad por la NLS, mientras que la subunidad es la
que tiene la capacidad de reconocer los dominios FG de las nucleoporinas.
Una vez en el interior del ncleo, la alta afinidad de la subunidad por Ran-GTP provoca la
disociacin de la importina (3) que da lugar a un complejo Ran-GTP- y a la subunidad -carga
que termina disocindose y liberando la carga dentro del ncleo.
Puesto que la subunidad es la que interacciona con los dominios FG del poro nuclear, una vez
unida a Ran-GTP, vuelve a atravesar el poro hacia el citosol, donde la protena Ran-GAP activa
a Ran provocando la hidrlisis del GTP en GDP y la disociacin de la subunidad (5).
Para que la subunidad abandone el ncleo es necesario que se una a la protena CAS y a RanGTP (5). Una vez fuera sufrir la hidrolisis del GTP a GDP y todo el complejo se disociar, quedando ambas subunidades listas para comenzar el ciclo.
Cerrado el ciclo de las importinas, es ahora Ran-GDP la que tiene que volver al ncleo. Para
ello el factor de transporte nuclear 2 (NTF2) se une a Ran-GDP y la introduce a travs del poro
nuclear (6). Finalmente el intercambio de GDP por GTP realizado por Ran-GEF provoca la disociacin de NTF2 y Ran-GTP vuelve a entrar en el ciclo.
Segn este modelo la protena G Ran no es importante para la entrada de protenas, pero es
esencial para la salida de las importinas. Adems el gradiente de Ran-GTP contribuye a la salida, mientras que el gradiente de Ran-GDP contribuye a la entrada.

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1.3.2. Modelo de exportacin a travs del poro nuclear


Al igual que en el caso anterior, para la exportacin de una protena desde el ncleo hasta el
citosol ser necesaria la participacin de Ran-GTP.
El proceso comienza con la formacin de un complejo ternario como consecuencia del reconocimiento de la exportina, la NES de la protena de carga y Ran-GTP. Este complejo
ternario atraviesa el poro nuclear a favor
de gradiente de concentracin de RanGTP y su estabilidad se debe a la presencia del GTP.
Cuando el complejo llega al citosol la actividad GTPasa de Ran es activada por RanGAP, lo que provoca la desestabilizacin
del complejo ternario y la disociacin de
las unidades.
Ahora la exportina (mostrando la seal
NLS) y Ran-GDP entran de nuevo al ncleo
de la misma manera que antes.
1.3.3. Modelo simplificado de importacin/exportacin de protenas y mRNA
Una simplificacin de la importacin de protenas propuesta en los anteriores apartados hace
referencia a la participacin de un complejo binario y no ternario.
Segn este una protena con una NLS va a ser reconocida por una importina que la introducir
en el ncleo a travs del poro nuclear. Pero no va a ser Ran-GTP quien provoque la desestabilizacin, sino que la propia importina va a ser capaz de unir GTP y liberar la protena de carga.
Una vez formado el complejo importina-GTP, esta cambia de conformacin y sale al citosol,
donde Ran-GAP, provoca la actividad GTPasa de la importina y se libera el GDP.
Durante la sntesis del mRNA, estos van siendo reconocidos por multitud de protenas que van
formando un complejo alrededor del mensajero, sustituyndose unos por otros y permitiendo
la posterior salida al citosol donde la protena Dbp5 permitir el de ensamblaje de todo el conjunto y la traduccin del mRNA por los ribosomas.

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1.4. El transporte a travs del poro en funcin del tamao de la carga


El transporte de protenas a travs del poro
nuclear presenta diferentes situaciones en funcin del tamao de la protena a transportar.
Cuando la carga son protenas pequeas, en un
mismo poro nuclear se puede estar realizando
un transporte bidireccional donde las cargas y
las carioferinas van saltando de un dominio FG
a otro.
Cuando la carga es de un complejo grande rodeado
de carioferinas, esta precisa establecer numerosos
contactos con los filamentos de la nucleoporinas
para poder avanzar y adems el transporte solo
puede realizarse en una direccin.
Finalmente, quedan las ribonucleoproteinas muy largas (mRNA + protenas) envueltas en carioferinas a modo de cuentas de collar que atraviesan el poro gracias a factores accesorios.

1.5. Diversidad de carioferinas


La existencia de una increble variedad de protenas que entran y salen del ncleo, sin contar
con los factores de transcripcin podra precisar de una ingente cantidad de protenas para
realizar el transporte. Pero la clula ha desarrollado una estrategia intermedia en la que una
serie de importinas y exportinas, junto con protenas adaptadoras y colaboradoras pueden
llevar a cabo el proceso aplicando el principio de redundancia.
Segn el principio de redundancia una protena va a poder ser transportada por distintas importinas, de manera que adems de no saturarse el sistema, el fallo de una carioferina no va a
provocar una deficiencia del sistema.
Adems las carioferinas humanas presentan ortlogos en levaduras, por lo que son un sistema
bastante conservado.

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1.6. Complejos proticos asociados a la distrofina


Las distrofias musculares son enfermedades generalmente graves cuya base molecular radica
en la extraordinaria fragilidad del sarcolema, la membrana celular de las clulas musculares
que est sometida a un fuerte estrs mecnico por los ciclos de tensin relajacin.
El sarcolema est fuertemente reforzado en sus dos caras mediante una lmina basal externa del msculo, y mediante la red del citoesqueleto en su parte interna, quedando apuntalada por una gran diversidad de protenas estructurales.
La matriz extracelular queda
anclada al sarcolema a travs
de la laminina-2 que se une a
los pptidoglicanos (distroglicanos /) y estos a los sarcoglicanos (///). En la cara
interna del sarcolema los pptidoglicanos mencionados se
unen a la distrofina, desmina y
sincoilinas, que anclan el sarcolema al citoesqueleto de la
fibra muscular.
La deficiencia en cualquiera de los elementos estructurales, ya sea por mutacin o por falta de
estos, provoca un estado patolgico ya que todo el conjunto queda debilitado. Por ello se habla de:
-

Enfermedad de Duchenne para la deficiencia en la laminina-2.


Sarcoglicanopata si es una deficiencia de sarcoglicanos.
Distroglicanopata si es una deficiencia en los distranoglicanos.

Pero adems tenemos que considerar las deficiencias en todo el espectro, ya que una mala
glicosilacin de las protenas implicadas tambin dar lugar a un estado patolgico.
El fallo de las protenas provoca un aumento de la permeabilidad del sarcolema que permite la
salida de los componentes al plasma sanguneo, as como la entrada. Uno de los indicadores de
lesin muscular ms utilizados es la identificacin de una alta concentracin de creatinina en
plasma.
Pero lo ms preocupante desde el punto de vista de la clula muscular es la entrada de calcio,
ya que los cambios en la concentracin de calcio son un mensaje que va a activar a las calpainas, las proteasas de la actina y la miosina, destruyendo la masa muscular.
Hoy da se sabe que las mutaciones en la lamina A de la lmina nuclear tambin dan lugar a
una distrofia muscular debido a que el citoesqueleto como conjunto falla, provocando la ruptura del sarcolema. Por lo que, la deficiencia de cualquier protena estructural del citoesqueleto puede afectar a la integridad del sarcolema.

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2. Trfico citosol-mitocondria y cloroplastos


El proteoma mitocondrial est formando por unas 1000 protenas de las cuales solo 13 estn
codificadas por el genoma mitocondrial. Las protenas restantes son sintetizadas por el ncleo
e importadas a la mitocondria.
El motivo por el que estos genes no han sido transferidos al ncleo se desconocen, pero existen dos posibilidades:
-

No ha pasado suficiente tiempo para una transferencia completa.


Las protenas codificadas son demasiado hidrofbicas como para poder ser sintetizadas en el citosol.

En cualquier caso el mitDNA representa el 0,5% del DNA total de una clula y el nmero de
copias vara mucho en funcin del nmero de mitocondrias. Si cada mitocondria tiene 2 o 3
copias estaramos hablando de unas 80-100 copias del genoma mitocondrial.
La teora endosimbitica apoya que el genoma mitocondrial sea DNA circular de doble cadena
desprovisto de histonas, que yace en la matriz mitocondrial y que est controlado por una
herencia maternal.
La importancia de la mitocondria radica en su papel para la supervivencia de la clula participando en el transporte de electrnico, la fosforilacin oxidativa y la respiracin celular. Tambin est muy relacionado con el metabolismo como en el caso del ciclo de los cidos tricarboxilicos, el ciclo de la urea y en la liberacin de citocromo C para determinar los procesos apoptticos durante la morfognesis.
El hecho de que dos genomas codifiquen distintas subunidades de un complejo proteico obliga
a la existencia de una comunicacin fluida entre la mitocondria y el ncleo, establecindose
lo que se conocen como seales retrgradas, de la mitocondria al ncleo, y las seales antergradas, del ncleo a la mitocondria.
El intercambio de seales decrece con la edad produciendo un deterioro de la funcin
mitocondrial que va a favorecer trastornos neurodegenerativos ya que el sistema nervioso central consume mucho ATP.
En el momento en el que la mitocondria lanza una seal S.O.S al ncleo, como el aumento de
los niveles de ROS, este responde mediante un aumento en la produccin de SOD, peroxidasas, glutatin reducido y afines.

2.1. El genoma mitocondrial


El genoma mitocondrial es circular y presenta un tamao de 16 Kb que codifica:
-

7 subunidades del complejo respiratorio I


1 subunidad del complejo respiratorio III
3 subunidades del complejo respiratorio IV
2 subunidades de la ATP sintasa
22 tRNA
2 RNA ribosomales
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Uno de los factores que ms destacan es el hecho de que solo se sintetizan 22 tRNA para 21
aminocidos existentes (solo l triplete de la serina est degenerado y puede ser codificado
por dos tRNA). Esto se debe a que la sntesis de protenas en la mitocondria se va a producir
mediante apareamientos no cannicos en los que el reconocimiento del codn se realizar
sobre dos bases, balancendose la tercera.
En el citosol son necesarios al menos 30 tRNA para sintetizar una protena ya que hay
una preferencia por ciertos tripletes.
Esta traduccin tan laxa aporta un menor grado de fidelidad que facilita las mutaciones durante la sntesis de protenas y adems obliga a cambiar el significado de algunos tripletes de
bases, existiendo una divergencia desde el endosimbionte.
En cuanto a los rRNA se codifica uno de 16 S y otro de 12 S que se modifican y ensamblan en
la propia mitocondria, pero todas las
protenas accesorias son codificadas
por el genoma nuclear, lo que obliga a
la existencia de dos series de protenas
ribosomales, una de las cuales porta la
secuencia de localizacin mitocondrial.
La RNA-pol y la DNA-pol tambin son
importadas.
Existen muchas enfermedades asociadas a mutaciones en los genes mitocondriales que codifican para las
subunidades de los complejos respiratorios ya que por ejemplo, cuando el
complejo 1 no es funcional solo se producen 2 molculas de ATP a travs del
complejo II, en vez de 3.

37

2.2. Destinos de las protenas importadas a los orgnulos energticos


La mitocondria es un orgnulo subcelular que presenta dos membranas y por lo tanto varias
localizaciones:
-

En las dos caras de la membrana mitocondrial externa.


En el espacio intermembranoso.
En las dos caras de la membrana mitocondrial interna.
En la matriz mitocondrial.

Seis localizaciones mitocondriales diferentes entre las que se deben repartir ms de 1000
protenas que se amplan a nueve en el cloroplasto por la presencia de la membrana tilacoidal
y el lumen dentro del estroma.

38

2.3 Transporte a travs de la membrana mitocondrial


El transporte de protenas a la mitocondria se realiza a travs de transportadores de membrana, translocasas o translocones, un holocomplejo formado por varias subunidades accesorias
y un ncleo que organiza el poro de entrada.
El holocomplejo translocon se denomina TOM (Translocase of the outer membrane) y su homlogo en cloroplastos TOC (Translocase at the outer cloroplast membrane). Estos complejos
pueden estar formados por unas 30-40 protenas diferentes que van a guiar a la protena que
entra hasta el poro generado por el ncleo del translocon.

El mecanismo bsico es sencillo y pueden participar chaperonas. Por ejemplo, una protena
sintetizada en ribosomas libres va a ser mantenida desplegada por las chaperonas HSP70 y
HSP90 que van a ser reconocidas por una de las receptoras en TOM. A continuacin la protena
va a pasar de una protena a otra del complejo hasta introducirse por el canal del poro.

2.3.1. Seal de localizacin mitocondrial


Muchas de las protenas que tienen como destino la mitocondria
pasan, independientemente de su localizacin final, por la matriz
mitocondrial. La seal de localizacin en la matriz mitocondrial
presente en la secuencia de aminocidos se sita en el extremo
N-terminal y presenta un tamao de entre unos 20-35 aminocidos.
La secuencia seal presenta gran cantidad de aminocidos cargados positivamente (Lisina y arginina), que quedan distribuidos
de tal manera que dan lugar a una -hlice anfiptica, es decir,
39

una hlice en la que todas las cargas positivas quedan a un lado generando una parte polar y
otra no polar. Pero no todas las protenas van a portar esta hlice, solo las que van o tienen
que pasar por la matriz mitocondrial.

Para poner de manifiesto esta secuencia se gener una protena DHFR (tpica del citosol) quimrica que contena una secuencia de localizacin mitocondrial de 61 aminocidos procedente
del citocromo B, cuya localizacin es el espacio intermembrana de la mitocondria.
El experimento revel que la protena DHFR quimrica era transportada hasta el espacio intermembrana,
pero si se eliminaba una parte de la secuencia, dejando solo 35 aminocidos la protena era transportada a
la matriz mitocondrial.
Esto supone la existencia de dos seales en la secuencia de localizacin del citocromo b, una de ellas
(1-35 aa) es la seal de importacin a la matriz mitocondrial, y la otra (36-61 aa) es la seal de localizacin
en el espacio intermembrana, a donde se dirige tras
pasar por la matriz.
Una vez que la protena entra en la matriz la secuencia de localizacin es cortada por proteasas y se produce el plegamiento adecuado de la protena, que ha tenido que permanecer desplegada para poder atravesar el translocon TOM y el translocon TIM (Translocase of the inner
membrane).
En la actualidad hay dos teoras sobre el motivo por el que las protenas pasan por la matriz
mitocondrial para alcanzar su destino final en otra localizacin:
-

La teora conservativa defiende que para que se produzcan los plegamientos definitivos y las modificaciones adecuadas, todas las protenas tienen que pasar por la matriz
mitocondrial ya que ah es donde se sita la maquinaria especfica de modificacin.
La teora no conservativa defiende que este paso no es necesario.

La realidad es que unas 100 protenas siguen el modelo conservativo y las otras no. Un ejemplo son las protenas que, una vez
dentro de TIM, son incorporadas a la membrana mitocondrial
interna sin tener que pasar por la matriz mitocondrial.
Otra de las conclusiones que se obtuvieron del experimento anterior era la necesidad de que la protena estuviera desplegada
(parcial o completamente) para atravesar los translocones. Si se
adiciona metotrexato, un potente inhibidor de DHFR por su gran
afinidad, esta se pliega y no entra en la mitocondria a pesar de
portar la secuencia de localizacin mitocondrial.

40

2.3.2. Modelo general de transporte a la matriz mitocondrial


Segn lo explicado para la entrada de protenas en la matriz mitocondrial van a intervenir chaperonas (necesidad de ATP), la secuencia de localizacin, el receptor de importacin en la
membrana externa mitocondrial y los complejos TOM y TIM.
Cuando una protena es sintetizada
por los ribosomas libres y lleva una
secuencia de localizacin mitocondrial, las chaperonas citoslicas
(Hsc70) mantienen el pptido desplegado mediante la hidrlisis de
ATP y lo guan hasta un receptor de
importacin en la membrana mitocondrial externa.
Detectada la secuencia de importacin el receptor se une al complejo
TOM, situando la protena para
entrar a travs del poro (Tom40).
Puesto que la protena se dirige a la
matriz mitocondrial el complejo Tim
reconoce la secuencia de importacin y en una zona de contacto
entre ambas membranas esta es
transferida a travs del poro de
TIM.
El trnsito de la protena a travs de los poros se produce gracias a la existencia de un potencial de membrana generado por la gran concentracin de protones en el espacio intermembrana. Puesto que la secuencia seal est carga positivamente entra a favor de gradiente por
el poro de TIM, pero para que la protena completa pase es necesaria la actuacin de otro grupo de chaperonas de la matriz mitocondrial y motores moleculares (PAM) que tiran de ella.
Este mecanismo de tirn molecular es anlogo al que se produce en el transporte
post-traduccional (no confundir con co-traduccional) al lumen del retculo endoplasmtico.
Una vez dentro de la matriz, la secuencia de localizacin es cortada por proteasas y se produce
el plegamiento para obtener la protena nativa.
Al igual que en el citosol, si el plegamiento no se produce de manera adecuada intervendrn
las chaperonas mitocondriales o la protena ser derivada a la degradacin por el proteosoma (tambin presente en la mitocondria).
Este modelo general se vuelve ms complejo si consideramos la cantidad de destinos que podemos encontrar para una protena en la mitocondria. Veamos en los siguientes apartados
modelos generales para que la protena alcance diferentes posiciones.

41

2.3.4. Modelo general de transporte a la membrana mitocondrial interna


Las protenas que se dirigen a la membrana mitocondrial interna pueden disponerse de tres
formas diferentes en funcin de si se internan en la membrana o quedan mirando a alguna de
sus caras. Para ello deben de portar regiones hidrofbicas capaces de permanecer en el entorno de la membrana, pero estas regiones no pueden atravesar de manera adecuada el poro
de los translocones TIM y provocan la detencin del pptido, por ello se denominan secuencias de parada de la
transferencia.
Una protena precursora que presenta en su extremo NTerminal una secuencia de localizacin en la matriz mitocondrial (con hlice anfiptica) y a continuacin una secuencia de parada de la transferencia, muy hidrofbica, va a
ser reconocida por Tom20 y transferida a Tom22 para atravesar el poro de Tom40.
A continuacin la protena es guiada hasta ser reconocida
por el complejo TIM (poro en Tim23/17) y comienza a entrar en la matriz hasta el dominio hidrofbico, que no puede avanzar por el poro. Ahora la secuencia de localizacin
en la matriz es cortada y la protena sufre un desplazamiento lateral en el poro que produce la internalizacin de la
regin hidrofbica en la membrana mitocondrial interna.
El complejo del poro es un entorno en continuo movimiento, flexible en diferentes conformaciones que permiten el movimiento lateral de protenas adems del trnsito de esta a
travs de su luz.
En funcin de la situacin de la seal de parada de la transferencia puede que el pptido quede mirando hacia la matriz o hacia el espacio intermembrana, pero integrado en la membrana
mediante una hlice hidrofbica.
En un segundo caso vemos que una protena puede llevar la secuencia
de localizacin en la matriz mitocondrial adems de un sitio de reconocimiento para la protena Oxa1 y una secuencia hidrofbica.
En este caso la protena pasa por Tom y Tim, pero la secuencia no es lo
suficientemente hidrofbica como para detener el paso y se internaliza
en la matriz con la ayuda de las chaperonas mitocondriales donde la
secuencia de localizacin es cortada. Ahora sufre un plegamiento parcial y es reconocida por Oxa1 que facilita la internalizacin en la membrana mitocondrial interna.
En funcin del nmero de sitios de reconocimiento para Oxa1 y de las
regiones hidrofbicas, la protena entrar ms o menos veces en la
membrana.

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Finalmente una protena en la que se alternan regiones hidrofbicas e hidroflicas, que no porta una secuencia de localizacin mitocondrial tambin puede introducirse en la mitocondria mediante el reconocimiento por Tom70, que la introduce
en el poro de Tom40.
Ahora Tim9/10, unas chaperonas del espacio intermembrana
guan la protena hasta un complejo de Tim22 y Tim54 que
permiten la internalizacin de las regiones hidrofbicas en la
membrana mitocondrial interna sin pasar por la matriz mitocondrial.
Protenas accesorias aparte, solo se ha identificado un complejo
de poro de Tom (Tom40). En cambio s que se conocen varios
tipos de Tim que dan lugar a diferentes tipos de incorporaciones
proteicas en la mitocondria.
2.3.5. Modelo general de transporte al espacio intermembrana
El trnsito de protenas hacia el espacio intermembrana de la mitocondria se puede realizar de
dos formas, pasando por la matriz mitocondrial o no.
Una protena precursora con una secuencia de localizacin mitocondrial y una secuencia de localizacin en el espacio intermembrana puede ser reconocida por
las protena accesorias de Tom e introducirse hasta Tim23/17 donde la secuencia
de localizacin en el espacio intermenbrana impedir que cruce.
Ahora al igual que en los casos anteriores,
sufrir un desplazamiento lateral en la
membrana mitocondrial interna, y la secuencia de localizacin en la matriz ser
cortada. Finalmente una proteasa de la
membrana mitocondrial interna cortar la
protena definitiva que quedar libre al
espacio intermembrana donde adquirir
su conformacin y se le aadirn diferentes grupos prostticos hasta alcanzar el
estado nativo.

La conformacin final de una protena no solo queda definida por su secuencia, sino por
esta y el conjunto de modificaciones y de grupos prostticos que se la aadan.

43

La segunda forma de entrar al espacio intermembrana es la que se produce cuando la protena


no porta una secuencia de localizacin en la matriz, solo la secuencia de localizacin en el espacio intermembrana.
En este caso la protena atraviesa el poro de Tom hasta alcanzar el espacio intermembrana,
donde adquiere su conformacin definitiva.

2.3.6. Modelo general de transporte a la membrana mitocondrial externa


En la membrana mitocondrial externa podemos encontrar, adems del complejo TOM, otro
complejo denominado SAM (Sorting and assembly machinery) que interacta con las protenas
precursoras de los barriles , transportadas por las chaperonas TIM del espacio intermembrana, introducindolas en la membrana mitocondrial externa para formar los oligomeros que
dan lugar a los transportadores.

* Anexo I: Funcionamiento de complejo TIM


* Anexo II: Seales de localizacin mitocondrial
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2.4. Transporte citosol-cloroplasto


El cloroplasto vegetal presenta una cmara extra formada por la membrana tilacoidal que da
lugar a la existencia de otras tantas localizaciones subcelulares.
Se conoce poco sobre las secuencias que determinan la localizacin de las protenas que son
transportadas al cloroplasto, pero se ha detectado la existencia de una secuencia de localizacin en el estroma que puede ir seguida de otra secuencia diferente de localizacin en los tilacoides.
La plastocianina, una protena de localizacin en el lumen tilacoidal porta, en su precursor, las
dos secuencias de localizacin. Atraviesa los complejos TOC y TIC (homlogos a TOM y TIM)
para alcanzar el estroma y una vez dentro, el precursor de la plastocianina sufre un corte proteoltico que retira la secuencia de localizacin en el estroma, para que ahora la secuencia de
localizacin en el tilacoide sea reconocida por la protena SRP cloroplastica (Signal recognition
particle).
SRP interacciona con un receptor en la membrana del tilacoide e introduce el precursor a travs de otra protena poro hasta el lumen tilacoidal, donde se le corta la secuencia de localizacin y adquiere la conformacin final.
En el caso de una protena que liga metales, esta porta la secuencia de localizacin en el estroma y una secuencia de localizacin en el tilacoide que comienza
con dos argininas (R). Cuando atraviesa TOC y TIC se le retira la secuencia de importacin al estroma
dejando a la vista las argininas y
comienza a unir los metales correspondientes plegndose y atravesando un complejo en la membrana tilacoidal.
Finalmente el pptido con las argininas es cortado y la protena adquiere su estructura final en lumen
tilacoidal.
Es importante considerar que las
protenas no entran a travs de
los complejos poro completamente desplegadas ya que eso cuesta
mucha energa y cmo podemos
observar hay casos en los que la
protena pasa casi completamente
plegada.

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3. Trfico de protenas al peroxisoma


La entrada de protenas al peroxisoma vara en cierta
medida con respecto a las anteriores.
La seal de localizacin de transporte al peroxisoma
(PTS) se localiza en el extremo C-Terminal de una protena que va a ser reconocida por un receptor Pex5.
---Ser-Lys-Leu-COO- (--SKL)
A continuacin la protena es transportada hacia el
peroxisoma donde otra Pex interacciona con el complejo y lo transporta hasta el translocon a travs del que
pasa la protena y se libera el Pex5.

4. Trfico de protenas a los plastidios


La seal para el trfico de protenas a los plastidios se sita en el extremo N-terminal de la
protena presentando gran cantidad de serinas que alternativamente pueden aparecer en dobletes.
+

H3N-Met-Val-Ala-Met-Ala-Met-Ala-Ser-Leu-Gln-Ser-Ser-Met-Ser-Ser-Leu-Ser-Leu-Ser-Ser-Asn-Ser-Phe-Leu-Gly-Gln-Pro-Leu-Ser-Pro-Ile-Thr-Leu-Ser-Pro-Phe-Leu-Gln-Gly---

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Anexo I: Dinmica del complejo TIM


El complejo TIM23 est formado por muchas protenas que puede adquirir diversos estados de
asociacin y de conformacin. El ncleo
principal est formado por las protenas
Tim23, Tim17, Tim21 y Tim50, a las que
pueden acoplarse las chaperonas del
motor molecular (PAM) que tiran del
pptido en trnsito.
La dinmica del translocon est muy relacionada con la interaccin de TOM que provoca la
variacin entre estados abiertos y cerrados que permiten o no el paso de protenas a la matriz
mitocondrial.
Inicialmente el complejo TIM 23 se encuentra cerrado gracias a la interaccin de las subunidades Tim50 y Tim21. Pero cuando comienza a entrar una protena a travs del TOM, la interaccin provoca la separacin de las subunidades y la apertura del poro facilitada por interaciones
entre Tim21 y TOM.
La protena comienza el trnsito facilitado por el gradiente de potencial elctrico, pero eventualmente la protena Cox favorece la entrada, y en funcin de cual sea el destino de la protena se podrn dar dos posibilidades:
-

Cuando la protena tiene como destino la membrana mitocondrial externa, su trnsito


se detiene y se integra en ella por difusin lateral.
Cuando la protena tiene como destino la matriz, el motor molecular con las chaperonas (PAM) se acoplan a TIM23 y comienzan a tirar del pptido hasta introducirlo mediante la hidrlisis de ATP.

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Anexo II: Seales de localizacin mitocondrial

48

Anexo III: Genes y Parkinson


El Parkinson (PD) es una enfermedad que afecta al 1% de las personas mayores de 60 aos,
caracterizada por la prdida de neuronas que fabrican dopamina (DA) en los ncleos cerebrales y la aparicin de cuerpos de Lewy (CL, no en todas las variantes de PD). El tratamiento ms
utilizado, pero que pierde eficacia a largo plazo, es suministrar L-DOPA, un anlogo de la dopamina capaz de atravesar la membrana hematoenceflica.
Las regiones cerebrales afectadas son las que controlan el movimiento y la coordinacin por lo
que los enfermos de PD muestran hipocinesia, tremor, bradicinesia, acinesia, rigidez en rueda
dentada e hipertona muscular.
Conforme avanzan los estudios sobre PD se han establecido ciertos factores ambientales como
la exposicin a plaguicidas, disolventes, metales y campos magnticos, pero hoy da se sabe
que existen ciertos componentes genticos:
-

La -sinuclena (ASN) es una protena de 140 aminocidos, muy importante en la sntesis de dopamina que acta como inhibidor de la tyr-hidroxilasas clave en la sntesis
de catecolaminas convirtiendo la tirosina en DOPA y sta a dopamina que puede convertirse en noradrenalina para posteriormente pasar a adrenalina. Tambin interviene
en la transduccin de seales, en la dinmica del citoesqueleto, en la plasticidad neuronal, en el aprendizaje, en la memoria, Las mutaciones en el gen ASN provocan la
formacin de fibras y agregados fribrilares (efecto potenciado por ROS) que dan lugar
a la formacin de placas que en personas jvenes y sanas son elminadas por el sistema
ubiquitina-proteosoma (UPS). Pero con el paso del tiempo el sistema comienza a fallar
dando lugar a la aparicin de PD, demencia, o el exceso de ROS y neurotoxinas naturales provocan la prdida de las neuronas DA.
La parkina es una E3-ligasa del sistema UPS encargada de la degradacin de ASN, por
lo que mutaciones en este gen (hasta 57 en casos de PD temprano en menores de 45
aos) derivan en la aparicin de PD.
El oncogen DJ1 es una chaperona de la matriz mitocondrial inducido por estrs oxidativo y que previene la produccin de ROS. Mutaciones en este gen provocan el aumento de ROS que desencadena la agregacin de ASN derivando en PD.
La quinasa PINK1 o quinasa 1 inducida por PTEN, es otra protena de accin protectora
frente al estrs oxidativo cuya mutacin ha sido relacionada con la aparicin de PD.

Considerando el aumento de los niveles de ROS como un factor determinante en la aparicin


de ROS, muchos de los tratamientos actuales han dado gran importancia al uso de terpenoides, aceites esenciales y dems, como agentes inhibidores de la cadena de transporte de electrones.
El correcto funcionamiento de la mitocondria depende de un equilibrio entre los inductores de
ROS (ROS inducers) y los sumideros de ROS (ROS quenchers). Durante la juventud, las clulas
funcionan normalmente y controlan los niveles de ROS que son necesarios en cierta cantidad
como seales de transduccin o segundos mensajeros.
Recordemos que las ROS son capaces de formar perxidos con los dobles enlaces de los cidos
grasos insaturados (esenciales como el araquidnico) y pueden daar el DNA rompiendo las
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dos hebras. Otro de los efectos negativos es la oxidacin de protenas en restos de cistena,
arginina y lisina, que provoca un cambio en la estructura tridimensional.
A medida que envejecemos, la capacidad de la clula para manejar los niveles de ROS disminuye, bien por la sobreproduccin o porque la comunicacin ncleo-mitocondria ya no es eficiente, y con esa premisa se est estudiando la relacin de ROS con PD, transtornos cardacos,
cncer,
La degeneracin mitocondrial y la sobreproduccin de ROS conducen en ltima instancia a la
neurodegenracin causante del PD, ya que el sistema nervioso (SN) precisa de grandes aportes
de ATP.
Por ello tanto la mutacin de los complejos respiratorios de la cadena de transporte de electrones como su inhibicin mediante qumicos (MPTP, Rotenona o Paraquat) conducen a una
bajada en la produccin de los niveles de ATP, que puede ser atajada mediante inhibidores o
secuestradores de estas sustancias como los triterpenos, creatinina, coenzima Q10 y nicotinamida. En caso contrario se genera una disfuncin mitocondrial.
Por otro lado, la produccin de ROS va a suponer una sobreproduccin de ciertos factores que
afectan a la proliferacin mitocondrial, impidiendo la transmisin del dao e induciendo la
mitofagia. Si no fuese suficiente el ltimo paso es la apoptosis celular.
Adems una sobreproduccin de ROS induce a factores de transcripcin nucleares que van a
promover la expresin de catalasa, superxido dismutasa, glutatin reducido, que disminuyen la cantidad y suprimen la neurodegeneracin si se alcanza un estado de neuroproteccin.
Pero cuando la cantidad de ROS aumenta demasiado se produce la activacin de BAX junto a la
liberacin de citocromo C que conduce a la apoptosis y por ende a la prdida de neuronas.
Esta sobreproduccin tambin produce la formacin de agregados de ASN, la parkina, el oncogen DJ1 y la quinasa PINK1.
En condiciones normales, la parkina se encuentra se encuentra inhibida, pero su unin con
PINK1 la activa y le permite comenzar la degradacin de ASN en el citosol. El acoplamiento
con DJ1 permite al conjunto ligarse a la membrana mitocondrial y actuar como un activo protector frente a la acumulacin de ASN. Pero las mutaciones de PINK1 o Parkina provocan neurodegenracin al no poder interactuar entre ellas. Adems el exceso de ROS tambin perjudica
la accin del proteosoma, por lo que puede interferir con la degradacin de ASN.
Otras protenas como miro/milton participan en el transporte de mitocondrias a travs de los
microtbulos antergrado y retrgrado, en los que intervienen como adaptadores de dineina y
quinesina situados en la membrana mitocondrial externa. La mutacin de estos genes dan
lugar a mitocondrias defectuosas en relacin a la fusin o fisin que conducen a la neurodegeneracin.
Tambin hay que destacar el papel del activador de sirtuina 1 (SIRT1 activator) y el revaratrol,
una agente antioxidante (reductor) de los frutos rojos a base de fenoles que dan lugar a quinonas relativamente inocuas. Las sirtuinas son desacetliasas de lisina dependientes de NAD+
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reguladoras de la actividad mitocondrial como la -oxidacin de cidos grasos y el ciclo de los


cido tricarboxilicos. Tambin destacan los activadores de las AMPK. Todos estos inducen factores de transcripcin que van a detener el estado disfuncional de la mitocondria, la apoptosis
y por ende la neurodegeneracin.

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52

Tema 3: Proteolisis intracellar


La protelisis es el proceso de destruccin de protenas que regula los niveles del proteoma,
tanto en variedad, como en cantidad de protenas a lo largo del tiempo.
Las protenas envejecidas tienen que ser degradadas rpidamente ya que representan un
peligro potencial que puede formar agregados, y aquellas que sufren grandes oscilaciones
en el tiempo tambin para poder regular adecuadamente el metabolismo y el ciclo celular.
La ventaja evolutiva, con respecto al uso de segundos mensajeros, que tiene la regulacin del
proteoma mediante una ruta proteoltica es la inmediatez, pero esto plantea el gran inconveniente de que la protena a degradar debe de estar perfectamente identificada, ya que no
existen estados intermedios, o hay protena o no la hay.
Por ello van a existir una serie de protenas encargadas del reconocimiento de la diana a la que
se enlazar ubiquitina y adems otra serie de protenas relacionadas con el proteosoma que
comprobarn que la protena con ubiquitina es la adecuada, garantizando la degradacin de
los objetivos.

1. Procesos regulados por la proteolisis


Existen muchsimos proceso regulados por la protelisis y su importancia radica en la posibilidad de la manipulacin de la vida media de las protenas. Las terapias actuales estn intentando alargar la vida media de anti-oncogenes a la par que se favorece la degradacin de oncogenes.
La proteolisis interviene en factores como:
-

La transcripcin gnica, a travs de la degradacin de los factores de transcripcin. La


modificacin de la vida media de los factores de transcripcin puede producir un aumento o disminucin de la seal que pueden desembocar en una ganancia de funcin
o una prdida de funcin.
Progresin del ciclo celular, a travs de las ciclinas. La cantidad de ciclinas est regulada por el sistema UPS. En la medida en la que se puedan dirigir las dianas teraputicas
contra la clula tumoral selectivamente se podr favorecer o evitar la proliferacin y la
apoptosis.
La organognesis a travs de la degradacin proteica que se produce.
Respuesta inflamatoria a travs de la degradacin de las pro-citoquinas para evitar
una sobreestimulacin.
El metabolismo del colesterol.
El procesamiento de antgenos para presentarlos en la membrana plasmtica.

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2. El ciclo de los compuestos nitrogenados y la vida media de las


protenas
Desde la propuesta del modelo del DNA, todos los investigadores se volcaron en establecer el
fundamento del dogma de la biologa molecular, las etapas de la replicacin, la transferencia
de informacin del DNA al RNA y la sntesis de protenas. Pero una vez que se estableci el
proceso, se empezaron a preguntar por qu unas protenas tenan una vida media corta o larga.
Aunque las protenas presenten una vida media larga o corta, todas se degradan para ser renovadas. Una persona de unos 70 Kg puede ingerir unos 100 g de protena diarios y degradar
unos 400 g de protena endgena, resultado de la proteolisis de protenas funcionales y no
funcionales.
Esto establece un pool de 500 g de aminocidos, de los cuales 100 g van a ser excretados y los
restantes sern destinados hacia la sntesis de protenas que reemplacen a las degradadas.
Por tanto la importancia de la proteolisis tiene que ser transcendental ya que se han identificado 500-600 proteasas en humanos. La proteolisis limitada (no de degradacin completa)
tambin es necesaria para quitar seales de trnsito o permitir la activacin de receptores.
La vida media de una protena se define como el tiempo que debe transcurrir para que la
cantidad de una protena se reduzca a la mitad.
Para establecer la vida media de una protena en el torrente circulatorio esta es marcada
y se inyecta a un paciente. A continuacin se realizan medidas sucesivas de la cantidad de
protena para observar como su cantidad va decreciendo.
Los grupos de investigacin, a partir de protenas marcadas radiactivamente analizaron la vida
de muchas protenas intentado definir el porqu de la vida media.
Lo que encontraron fue dos grupos de protenas, unas con una vida media corta (horas como
mucho) y otras de vida media larga (das e incluso meses). El anlisis detallado de estas protenas concluy que aquellas que presentaban una vida media corta eran principalmente enzimas reguladoras de cuya cantidad depende la velocidad de un ciclo metablico o un proceso
determinado. Es el caso de:
-

Ornitina descarboxilasa que media la formacin de poliaminas (empaquetan el DNA).


RNA polimerasa I
Tirosina aminotransferasa
Serina deshidratasa
PEP carboxilasa
-hidroxi--metilglutaril-CoA deshidrogenasa, productora del cido mevalnico que
dar colesterol.

Cuyo tiempo de vida media oscila entre las 0,2 h y las 5 h.

Las protenas de vida media larga como:


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Aldolasa
GAPDH
Citocromo b
LDH
Citocromo c
Histonas
Receptores nicotnicos y muscarnicos (otra cosa es que suban o bajen).

Presentan tiempos de vida media que oscilan entre las 118 h e incluso cuatro meses como es
el caso de la hemoglobina.
En definitiva el proteoma va a estar representado por el balance entre la sntesis y degradacin de protenas. Los fallos en cualquiera de los dos extremos van a desencadenar estados
patolgicos ya que no se va alcanzar la homeostasis del proteoma.
La vida media de una protena mutada ser ms corta porque en el momento en el que el plegamiento cambie, ser identificada como aberrante por los sistemas de chaperonas que las
pondrn en marcha hacia la degradacin.
El anlisis bioinformtico de la secuencia de aminocidos de las protenas revel que aquellas
que presentan una vida media larga presentan en sus extremos aminoterminales restos de
metionina, glicina, alanina, serina, treonina o valina, lo que sugiere que estos estabilizan a la
protena, evitando su degradacin a corto plazo
evitando el reconocimiento sencillo por parte del
sistema UPS (ubiquitina-proteasoma). En cambio las
protenas de vida media corta presentaban isoleucina, glutamina, tirosina, glutamato, prolina, leucina, fenilalanina, asparragina, lisina o arginina.

3. Protelisis intracelular
3.1 Protelisis intracelular en procariotas
La protelisis intracelular en procariotas es muy activa debido a la limitacin en la cantidad de
aminocidos a la que estn sometidos. Una vez que una protena cumple su funcin es rpidamente degradada para fabricar otra, ya que no disponen de reservas.
Se han identificado en este sentido, muchas proteasas que actan por defecto degradando
protenas de manera continua a menos que se active algn mecanismo para detenerlas. Por lo
tanto en procariotas la va normal es la sntesis y degradacin continua de protenas, a diferencia de los eucariotas.
Para esta protelisis se han identificado varias proteasas como Lon y ClP que detectan las protenas que no son necesarias o las desplegadas y las degradan mediante cortes proteolticps.
Estas protenas tienen en muchos casos una doble funcin, por un lado son chaperonas y por
otro proteasas, en dos dominios diferentes o mediante dos subunidades.

55

Estas proteasas detectan, como chaperonas, una estructura tridimensional aberrante y la encaminan hacia la degradacin realizando cortes proteolticos cada 60-70 aminocidos. Ambas
actividades son ATP dependientes, es decir, se precisa una molcula de ATP para el reconocimiento y otra molcula para la protelisis.
A continuacin los fragmentos pequeos son degradados por otros mecanismos que no cuestan tanta energa.

3.2 Protelisis intracelular en eucariotas


La clula eucariota presenta dos sistemas de degradacin, la denominada va lisosomal y la no
lisosomal, cuya gran diferencia radica en que la primera funciona a pH cido y la segunda a pH
neutro.
Para determinar la va de degradacin de una protena se puede recurrir a dos estrategias en
las que se comienza marcando una protena:
-

Si utilizamos agentes lisosomotrpicos para neutralizar el pH del lisosoma o disipar el


gradiente con respecto al citosol, las catepsinas encargadas de la degradacin no pueden actuar y por lo tanto si la protena no es degradada, podemos concluir que su degradacin sigue la va lisosomal. Los agentes lisosomotrpicos son la quinina, la clorpina (antimalricos) y el cloruro amnico.
La utilizacin de clulas sin lisosomas o con lisosomas poco desarrollados como los
reticulocitos, permite establecer tambin si una protena se degrada o no por va lisosomal.

En la va no lisosomal de degradacin de protenas eucariticas podemos distinguir dos mecanismos degradativos:


-

El sistema de las calpanas que funciona a pH neutro y alta concentracin de Calcio.


Las calpanas son proteasas dependientes de calcio que estn inactivas a concentraciones normales citoslicas de calcio (0,1 M), hasta que la apertura de los canales de
calcio dependientes de voltaje del RE produce una salida de calcio, aumentando la
concentracin hasta 1-5 M (10-50 veces ms) y activndolas. A continuacin el calcio
es secuestrado por sus sumideros (calmodulina). Los fallos que provocan aumentos en
la concentracin de calcio estn relacionados con distrofias musculares debidas a la
protelisis descontrolada que se provoca por la activacin permanente de las calpanas.
El sistema UPS (ubiquitina-proteasoma) que funciona a pH neutro. El sistema comienza con el reconocimiento de una protena a degradar que presenta expuesta una lisina
a la que se va a incorporar una molcula de ubiquitina. A continuacin se va formando
un polmero de ubiquitina sobre la primera, y esto sucede en varios puntos al mismo
tiempo que la protena va siendo envuelta por los polmeros que la dirigen hacia el
proteasoma. En el proteasoma los polmeros de ubiquitina son retirados y la protena
va siendo desplegada por ATPasas para favorecer su entrada y su degradacin.

La va lisosomal de degradacin de protenas funciona a pH cido a travs de las catepsinas.


En esta va se degradan protenas de membrana procedentes de la endocitosis (receptores y
56

ligandos) as como en las estructuras procedentes de la mitofagia y la degradacin de orgnulos en general.

4. Sistema ubiquitina-proteasoma (UPS) de degradacin proteica


4.1 La ubiquitina
La ubiquitina es una pequea protena de 76 aminocidos, que recibe el nombre de su ubiquidad ya que est presenten en todos los organismos ecuariotas, desde las levaduras hasta los
seres humanos con una variacin de tan solo 3 aminocidos. El resto de aminocidos ocupan
las mismas posiciones en la secuencia polipeptdica, siendo una protena muy conservada evolutivamente. La generacin de organismos Knockout para esta es inviable, por lo que el sistema UPS es consustancial con la vida.
En la secuencia de la ubiquitina podemos encontrar 7 lisinas muy importantes denominadas
segn su posicin como K6, K11, K27, K29, K33, K48 y K63. De estas las lisinas K29 y K48 van a
ser las implicadas en la degradacin de la protena diana.

Estructuralmente esta protena, que se est convirtiendo en la gran estrella del cncer, presenta una gran parte de hoja y una hlice . Es muy importante recalcar la importancia de la
situacin del grupo amino en las lisinas (K) que recordemos, son -amino.
Cuando la ubiquitina se empieza polimerizar sobre la protena diana va a formar un polmero
en el que la ubiquitina entrante se va a enlazar siempre con la misma lisina de la molcula de
ubiquitina precedente. Por lo tanto, el extremo C-terminal de la primera ubiquitina se enlaza
con una de las lisinas expuestas de la protena a degradar, y
a continuacin el extremo C-terminal de otra ubiquitina se
enlaza con la K48 de la primera, y as sucesivamente hasta
formar un polmero de ubiquitina enlazado por K48.
Si observamos el punto de enlace entre las lisinas y la ubiquitina vemos que esta ltima porta una glicina en su extremo C-terminal que da lugar a un enlace isopeptdico (amino + carboxilo), que no debe confundirse con un enlace
peptdico (-amino + carboxilo). El enlace isopeptdico es
una enlace covalente y fuerte que requerir de enzimas
hidrolizantes para su ruptura.
57

Una protena cuya conformacin est alterada o se haya solucionado tendr lisinas expuestas
a las que se unirn las unidades de ubiqutina conducindola hacia la degradacin. Pero no
todo est determinado, en funcin de las circunstancias la protena podr ser degradada por el
proteasoma, o seguir otros caminos.

4.2 Sistema de adicin de ubiquitina


De las 100.000 protenas que se estiman en el proteoma humano podemos suponer que unas
50.000 van a ser degradas por el sistema UPS. Pero no son necesarias otras tantas otras tanas
protenas para su reconocimiento.
La ubiquitina es una protena metablicamente poco activa y que tiene poca tendencia a
reaccionar espontneamente para formar el puente isopeptdico a travs de la glicina del extremo C-terminal. Por ello precisa ser activada a travs de la adicin de cido adenlico (AMP).
La enzima activadora de ubiquitina (E1) cataliza la activacin de ubiquitina mediante la utilizacin de ATP y la liberacin de pirofosfato inorgnico para formar un intermediario con tendencia a reaccionar con la protena E1. El mecanismo de reaccin comienza con:
1) La activacin de la ubiquitina catalizada por E1 que forma un intermedio reactivo
de ubiquitina-AMP.
2) Reaccin del intermediario Ubiquitina-AMP con la enzima E1 que da lugar a la formacin de un enlace tioester con una cistena (C) de E1.
A continuacin interviene la protena de conjugacin de ubiquitina
(E2) que tambin es la donadora de
ubiquitina a la protena diana. Para
que se produzca la reaccin E2 y la
lisina (K) de la protena diana tienen
que aproximarse y por ello la ligasa
de ubiquitina (E3) se encarga de
aproximar a E2-Ubiquitina y la protena diana, a modo de adaptador.
58

En el genoma se han detectado 2 genes para E1, 40 genes para E2 y 600 genes para E3, lo que
ofrece una extraordinaria cantidad de combinaciones E2-E3 que permite actuar sobre miles de
protenas.
4.2.1 Variabilidad en la actuacin del complejo E2-E3
Si observamos detalladamente el mecanismo de adicin de ubiquitina podemos encontrar tres
rutas diferentes en las que la participacin de los componentes E2-E3
vara.
En muchos casos la protena E2ubiquitina es reconocida por la
protena E3, que presenta sitios de
reconocimiento para E2-ubiquitina
y la protena diana, funcionando
como un adaptador.
En otros casos la protena E3 interviene en la adicin de ubiquitina funcionando como un aceptor
de la protena que a continuacin
se la transfiere a la protena dina.
Adems la protena E3 puede ser
un complejo proteico, cuya formacin estar regulada por la intervencin de otras protenas como
es el caso de la familia RING o
puede ser una nica protena como es el caso de la familia HECT.
Las combinaciones de las protenas de conjugacin E2 y unin E3 de ubiquitina explican la
enorme diversidad de protenas diana sobre las que actan. Estas combinaciones se pueden
activar por diversos motivos como:
-

Fosforilacin
Unin de un ligando especfico
Asociacin a una protena

Por otro lado, una protena normal se puede convertir en objetivo da degradar por:
-

Fosforilacin
Disociacin de una protena
Creacin de un extremo N-terminal inestable

59

Fosforlacin de IB como ejemplo de degradacin por el sistema UPS


Veamos el ejemplo de regulacin del factor nuclear B (NFB, formado por las subunidades
p50 y p65) que abunda en todas las clulas y en linfocitos B induce la expresin de las cadenas
de las inmunoglobulinas.
En el citosol de las clulas no estimuladas el NFB se encuentra formando un complejo con la
protena inhibidora IB. El complejo NFB-IB presenta la secuencia de entrada al ncleo
ocluida, pero cuando se produce la seal pertienente, la quinasa IKK fosforila a la subunidad
IB inhibidora, provocando su disociacin del complejo que ahora muestra la seal de trnsito.

Disociacin de IB como ejemplo de degradacin por el sistema UPS


La fosforilacin IB no solo provoca la disociacin sino que adems convierta al inhibidor en
una diana para la incorporacin de ubiquitina que la dirige al proteasoma. Esto se debe a que
el factor inhibidor tambin porta una seal de degradacin tapada por la formacin del complejo.
FOS y JUN son dos pro-oncogenes importantes para el correcto funcionamiento de la divisin celular, pero que al sufrir mutaciones se convierten en oncogenes que desencadenan
la aparicin de cncer.
Le denomina C-FOS y C-JUN a las versiones celulares de los pro-oncogenes que por diversos motivos pueden ser incorporados a un virus, denominndose entonces V-FOS y V-JUN.
Puesto que la tasa de mutacin en la replicacin viral es tan elevada, la probabilidad de
que estos genes muten se hace alta, y al introducir los virus las copias mutadas en la clula
pueden provocar el desarrollo del cncer.
Las protenas Fos y Jun forman un factor de transcripcin dimrico, denominado Ap1, que
se une a los elementos de respuesta del DNA e induce la expresin de los genes de la divisin celular sacando a la clula de la fase G0.
Estos factores se puede degradar por la va UPS cuando son fosforilados, por lo que establecen un buen ejemplo de que la fosforilacin puede marcar el destino hacia la degradacin del factor.
Creaccin de un extremo N-terminal inestable
El aminocido presente en el extremo N-terminal puede afectar a la estabilidad de una protena, por lo que cortes proteliticos en esta seccin pueden alterar la vida media de la protena y
convertirla en una diana para el sistema UPS.

60

4.3 Destino de las unidades o polmeros de ubiquitina


La incorporacin de ubiquitina a una protena no implica necesariamente su degradacin. Una
protena puede recibir la ubiquitina en nmero y conformacin diferentes que implican diferentes opciones desde la regulacin a la degradacin.
En primer lugar una protena puede recibir una unidad de ubiquitina en una lisina (K) o varias,
lo que est relacionado con la regulacin de las histonas, las endocitosis y la gemacin de los
virus.

Por el contrario, la adicin de polmeros en escalera unidos a travs de K48 o zigzagueante a


travs de K29, s que se ha relacionado directamente con la degradacin proteasomal.

Pero la adicin de un polmero lineal unido a travs de K63 se ha relacionado como una seal
de dao en el DNA, el trfico vesicular y la activacin de quinasas.

Tambin se ha encontrado la unin del polmero a travs de K6, pero presenta una funcin
desconocida.
Por lo tanto, en funcin de la conformacin que adquiere el polmero de ubiquitina, va a poder
ser reconocido por una u otra protena que encaminar a la protena marcada hacia una ruta u
otra.
La ubiquitina no es la nica protena pequea que sirve para este tipo de regulacin. Otras
del mismo tipo como SUMO y NEDD, a travs de mecanismos similares a los de E1-E2-E3 con
su propio juego de adaptadores, realizan las mismas funciones aadiendo un nivel ms de
complejidad al proceso.

4.4 Las protenas de deconjugacin de ubiquitina E4


Adems del sistema de activacin, conjugacin y ligasa de ubiquitina existe otras 100 protenas cuya funcin es la de retirar ubiquitina (E4). Estas protenas actan retirando las unidades
de ubiquitina desde los extremos (como lo hara una exopeptidasa) o cortando por el interior
del polmero (como lo hara una endopeptidasa).
61

Como se representa en la imagen, la ligasa de ubiquitina (E3)


puede ir aadiendo unidades
de ubiquitina a la protena
sustrato y conducirla a la degradacin, o puede actuar una
de estas E4, retirando las unidades en el conocido proceso
de deconjugacin de ubiquitina.
El motivo de la sofisticacin de
este sistema radica en que la
clula debe de estar completamente segura de que la protena a degradar es la correcta.
Por ejemplo, el virus del papiloma humano (HPV) es el responsable del cncer de tero porque
provoca la adicin de ubiquitina a p53, el guardin del genoma. La introduccin de una protena propia del virus que funciona como una E3 ligasa de ubiquitina, provoca la adicin de ubiquitina a p53, uno de los anti-oncogenes ms importante por la multitud de funciones que
desempea. Al bajar los niveles de la protena aumenta la frecuencia de daos en el DNA,
pero no se produce la apoptosis, por lo que el virus provoca una proliferacin incontrolada.
4.4.1 Regulacin de p53, el equilibrio E3/E4
La protena p53 se encuentra en un continuo balance entre la adicin de ubiquitina y su retirada. La adicin de ubiquitina est mediada por la protena E3 ligasa Mdm2/Mdmx, mientras que
la retirada de unidades est medida por la proteasa especfica de ubiquitina 7 (USP7).
Entre las funciones de p53 podemos encontrar que es un factor de transcripcin que induce la
propia expresin de su E3 ligasa, por lo que se produce una retroalimentacin. Mdm2/Mdmx
tambin es susceptible de ser degradada por el proceso de adicin de ubiqtuina y al igual que
p53, puede ser rescatada por la accin de USP7 o USP2a.
Con vistas al tratamiento del cncer, se
supone que la perpetuacin del efecto de
p53 es un factor clave y beneficioso como
anti-oncogen que es. Por ello el tratamiento busca alargar la vida del factor de
transcripcin mediante estrategias como:
-

Bloqueo de la accin de
Mdm2/MdmX
Favorecer la accin de USP7
Evitar el reconocimiento de p53
por el sistema UPS.

62

Por ello se han desarrollado ms de 30-40 inhibidores de la accin del proteasoma.


En clulas no estresadas p53 est inactivo en el citosol. En respuesta a una situacin de estrs
como una respuesta oncognica, un dao en el DNA o la hipoxia, p53 se activa y entra al ncleo donde actua como factor de transcripcin para los genes de respuesta al estrs que inhiben la divisin celular a travs de la detencin del ciclo, por apoptosis o por necrosis.

Pero la protena p53 es muy inestable y presenta una vida media corta, por lo que su cantidad
depende de su sntesis y degradacin. Como ya hemos mencionado, uno de los genes expresados es el de la protena MDM2, una E3-ligasa (p53 est controlada por al menos 5 de estas
ligasas) que desva a p53 a su degradacin y por lo tanto es un oncogen. Pero tambin entra en
juego ARF, un inhibidor de MDM2, y por tanto es un anti-oncogen.
MDM2 puede formar complejos con p300 e incorporar polmero de ubiquitina a p53, pero
tambin puede introducir una sola unidad de ubiquitina, desplazando a p53 al citosol, sin degradarla.

4.5 Sistema ERAD de control de calidad y seal UPR


Hasta ahora hemos visto el sistema UPS como un ejemplo de protelisis intracelular, pero
tambin podemos encontrar otros como el control de calidad del ERAD que va derivar a las
protenas mal plegadas hacia la proteolisis.
Una protena cuyo destino es la membrana plasmtica o la excrecin debe atravesar el retculo
endoplasmtico y el aparato de Golgi. Pero antes de dejar el retculo se la somete a un control
de calidad por el que tiene varias posibilidades:
-

Si la protena est bien plegada y responde adecuadamente sigue su camino.


Si la protena no est bien plegada se la conduce a la degradacin en lo que se conoce
como ruta de ERAD (Endoplasmic-reticulum-associated protein degradation).

En el retculo endoplasmtico no hay proteosoma, pero la ruta de ERAD asocia una serie de
chaperonas que van a acerar la protena mal plegada hasta un translocon que la sacar al citosol donde ser degradada por el proteosoma.
Otro caso es en el que se produce como resultado de mutaciones o de condiciones en el que
una gran cantidad de protenas en el retculo estn mal plegadas. En ese momento el retculo
63

nota la falta de chaperonas y se activa la ruta UPR (Unfolding protease response) que manda
seales al ncleo para aumentar la produccin de chaperonas.
En cualquier caso, las protenas mal plegadas del retculo que son translocadas hacia el exterior sufren la adicin de ubiquitina y son conducidas al proteasoma.
La fibrosis qustica es una enfermedad incurable de origen gentico debido a la mutacin
del gen CFTR (27 Exones) que codifica la protena reguladora de la conductancia tranmembrana de la fibrosis qustica (1480 aminocidos). La protena es una ATPasa de tipo ABC (ATP
binding cassette) que acta como un canal de cloruro situado en la membrana plasmtica.
En situaciones normales la protena se sintetiza en ribosomas asociados al retculo desde
donde se desplaza al Golgi para glicosilarse y posteriormente es incorporada a la membrana
plasmtica. Pero sus mutaciones, entre ellas el frecuente cambio de la fenilalanina 508,
modifica el plegamiento de la protena y esta es incapaz de superar el control de calidad de
la va ERAD.
Aunque la protena no es completamente funcional con esta mutacin, se est investigando
la induccin de chaperonas o la utilizacin de qumicos que fuercen el plegamiento en el
retculo de manera que aunque no se pliegue correctamente supere el control de calidad

4.6 Relacin con el ciclo celular del sistema UPS


El proteasoma es importante durante la divisin celular. El ciclo descansa en unos complejos
llamados ciclinas y quinasas dependientes de ciclinas (CKDs), por lo que todo el ciclo va a estar
controlado por quinasas, fosfatasas y el proteasoma, que controla los niveles de cada una.
Durante la interfase comienza la sntesis de las ciclinas mitticas que al unirse a su CDK correspondiente forma el factor promotor de la mitosis (MPF) cuya actividad quinasa permite la continuacin del ciclo celular. A continuacin se le aade ubiquitina a las ciclina durante la anafase, producindose la degradacin por
va UPS y quedando las CDKs inactivas.
La protena APC es el complejo promotor de la anafase, una E3-ligasa
que se encuentra activa cuando su
unidad Cdh1 est desfosforilada. La
retirada del fosfato est mediada por
la fosfatasa Cdc14 que por tanto es
un regulador negativo de las ciclinas
(su actividad permite la adicin de
ubiquitina y la consiguiente bajada de
actividad de MPF). Pero el complejo
ciclina/CDK de G1 es el encargado de
fosforilar la subunidad Cdh1 de APC y
promover la mitosis inactivado a la
E3-ligasa.
64

La progresin del ciclo celular est determinada por el balance entre reguladores positivos (CDKs)
y reguladores negativos (inhibidores de ciclinas dependientes de quinasas, CKIs). Las ciclinas del
tipo D (D1, D2 y D3) son las primeras expresadas durante el ciclo celular. De estas 3, la ciclina D1
es la que ms frecuentemente se sobreexpresa en los casos de cncer humano. El mecanismo de
sobreexpresin de la ciclina D1 puede deberse a la duplicacin gnica, la activacin transcripcional
y la alteracin del sistema de degradacin. De estos posibles mecanismos, la inhibicin de la degradacin va UPS parece ser la causa primaria de la sobreexpresin en tumores humanos.

4.7 Motivos de reconocimiento para los complejos E2-E3


4.7.1 Caja de destruccin de ciclinas
Como hemos visto, las ciclinas estn reguladas por sntesis y degradacin a travs del sistema
UPS. Se ha observado que para que estas sean reconocidas por el sistema de E3-ligasa deben
de llevar una secuencia de en principio 9 aminocidos que van a ser los determinantes de su
degradacin y que se han denominado caja de destruccin de ciclinas, cuya secuencia consenso es:
RXXLXXXXD/N
Esta secuencia se encuentra en ciclinas y otras protenas implicadas como securina (inhibidora
de la separasa de las cormtidas), el factor pVHL (supresor de tumores), y su mutacin ocasiona la aparicin de cncer.
Esta caja de destruccin de ciclinas es por tanto el motivo estructural reconocido por los
complejos E2-E3, para la adicin de ubiquitina a estas protenas.
4.7.2 Secuencias PEST
Las secuencias PEST (Prolina, glutamato, serina y treonina) parecen estar relacionadas con
protenas de vida media corta que son degradadas por el sistema UPS.
PEST
Agrupaciones de estas secuencias (hasta 80) parecen ser un motivo estructural que es reconocido por los complejos E2-E3 encargados de la adicin de ubiquitina.

5. El proteasoma
El proteasoma es una estructura supramolecular cilndrica con un coeficiente de sedimentacin de 26S, formada por un ncleo degradativo de 20S y complejos en los extremos de 19S.
La localizacin del proteasoma es en el citosol (no parece que haya en el retculo, el lisosoma o
el Golgi) y en la mitocondria, donde se produce la sntesis de protenas. Tambin hay proteasomas en el ncleo ya que muchos de los factores de transcripcin van a ser degradados
ah.
En cuanto a sus variantes tenemos tres, el inmunoproteasoma, relacionado con el corte de
fragmentos antgenicos para las clulas Th, el timoproteasoma, relacionado con la diferenciacin de los linfocitos T en el timo, y el proteasoma clsico,
65

Estructuralmente el proteasoma est formado en 4 capas de 7 subunidades (28 en total) presentado dos capas de subunidades
internas que son las que presentan
la actividad proteoltica, y dos capas
de subunidades externas que presentan una treonina (T) nucleoflica
en el extremo N-terminal. Este ncleo central es el que presenta un
coeficiente de sedimentacin de 20S
y est presente, con cierta variacin
en eucariotas, procariotas y arqueas.
En las tapas de 19S, hay protenas que reconocen las colas de poliubiquitina, por lo que una
protena que est marcada por poliubiquitina se tendr que pegar ah. Luego habr protenas
que quitan ubiquitina (USP, proteasas especficas de ubiquitina), otras que despliegan la protena si es que est plegada denominadas ATPasas de clase AAA (ATPasa con varias actividades
biolgicas), y luego otras que la van introduciendo tirando de ella. En total hablamos de unas
25 protenas distintas por lo que en conjunto tendremos 50-55 protenas.
Una vez que estn en el ncleo
proteoltico (zona central de las
subunidades beta), hay subunidades que desarrollan actividad
como la tripsina, otras como la
quimotripsina, etc. Entonces, un
polipptido ms o menos grande lo cortan en varios trozos, y
stos se irn degradando. El
conjunto tendr unos 40-50nm.

5.1 Relacin entre el Alzheimer y el proteosoma


El mal funcionamiento del proteosoma puede estar detrs de enfermedades neurodegenerativas como el Parkinson y el Alzheimer. A propsito del Parkinson hablbamos de la alfasinuclena y la parkina.
Aqu estamos viendo uno de los rasgos histopatolgicos que padecen los enfermos de Alzheimer, la aparicin de estos nudos neurofibrilares, depsitos de localizacin interna en las
neuronas que son como ovillos de protena TAU hiperfosforilada con muchos restos de fosfato.
TAU hiperfosforilada adopta unas conformaciones distintas a TAU normal (TAU es una protena
que est asociada a los microtbulos y que son reguladores de la dinmica de polimerizacin
de alfa y beta tubulina).

66

De manera que una neurona es absolutamente dependiente del trfico vesicular y trfico mitocondrial retrgrado y antergrado. En el soma est el Retculo Endoplsmico y el Golgi, y hay
mitocondrias que se estn sintetizando en el soma pero que tienen que transportarse hasta el
axn. Cuando se interrumpe dicho transporte tenemos un problema. Una de las protenas que
regula esa polimerizacin y formacin de los microtbulos es TAU.
Los nudos son ricos en actividad acetilcolinesterasa y butirilcolinesterasa.
Aqu tenemos el otro rasgo histopatolgico de los pacientes de Alzheimer, las placas seniles.
Estn en los espacios intercelulares, compuestas por el pptido -amiloide, que se genera
por la protelisis de una protena de membrana llamada protena precursora de -amiloide.
Las placas seniles contienen actividad acetil/butirilcolinesterasa, y la gravedad de la
demencia se relaciona con la cantidad de placas seniles en el encfalo.
Algunos investigadores piensan que las placas seniles son neuroprotectoras, como mecanismo
de defensa, y que la enfermedad de Alzheimer deriva ms de los nudos neurofibrilares que de
las placas seniles.
Las placas seniles se generan porque el -amiloide, que se
tiene que degradar por el sistema del proteasoma, no se
degrada y empieza a acumularse. Un conjunto de amiloide da lugar a la formacin de fibrillas, formando
finalmente agregados de -amiloide. Igual que la protena
-sinuclena.
El plano de la bicapa lipdica, la protena se proyecta hacia
el exterior. La inmensa mayora del polipptido est
orientado hacia el exterior, ms del 80%. Aqu es donde
actan las protenas denominadas secretasas (alfa, beta y
gamma secretasas).
El corte secuencial en alfa y beta, de ese trozo se obtienen pptidos no patognicos. En cambio si el corte se
produce entre beta y gamma (no en alfa) encontramos pptidos patognicos: pptido amiloide. No se conoce con exactitud la funcin de la protena precursora de amiloide (APP).

67

5.2 Inhibidores del proteasoma en el tratamiento contra el cncer


Jugando con el proteosoma podemos aumentar la vida media de anti-oncogenes y reducir
la vida media de oncogenes. En el ao 2003,
en la FDA de los EEUU, autoriz por primera
vez el uso en clnica, en enfermos de cncer,
de bortezomib. Es un derivado del cido boronico, y acta como inhibidor del proteosoma. Se utiliza con xito en el tratamiento de
linfomas y leucemia mieloide crnica, es decir,
para distintas clases de cncer derivados de la
sangre.
Se estn dando pasos agigantados hacia la resolucin y mejora de determinados tipos de cncer. Antiguamente la leucemia era sinnimo de condena a muerte, hoy en da la esperanza de
vida de nios y adultos que tienen leucemia, aunque depende del estadio y del tipo de cncer,
ha aumentado significativamente.
Bortezomib lo que hace es inhibir la actividad proteoltica del proteosoma. Vemos aqu una
protena que contiene sucesivos restos de
ubiquitina (6 restos de ubiquitina), entonces
lo que pasa es que en la tapa estn las enzimas que quitan ubiquitina (familia USP,
familia UCHL, familia POH, que son 3 clases
distintas de protenas que quitan ubiquitina).
Aqu lo que vemos es la usp14 y la uchl5, y
como est inhibido el proteosoma, lo que
van a hacer es bloquea la degradacin de la
protena. Esto nos da una acumulacin de
protenas que llevan pequeas cadenas de
poliubiquitina, aunque se le han quitado
algunas. Las enzimas que quitan ubiquitinas
pueden quitarlas de una en una, pero suelen dejar 2, 3 o 4 ubiquitinas, y con eso es
suficiente para que la protena recupere
parte de su funcionalidad.
Esto ocurre en un sistema muy proliferativo, pero es que en una leucemia se dividen las clulas
tumorales muy activamente. Al bloquear la proliferacin celular, al final todas las clulas se
resienten, tanto las tumorales como las sanas. El bortezomid se incluye dentro del cctel de
qumicos que se suministra en la quimioterapia.

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Otro agente que tambin se est utilizando


es el AP15, que es otro inhibidor. Este lo que
hace es evitar la accin de USP14 y UCHL5,
en lugar de bloquear. El proteosoma est
activo, pero se suprime la eliminacin de
ubiquitina, luego tendramos protenas que
conservan la ubiquitina pero que desarrolla,
probablemente, su actividad biolgica.
Para el tratamiento de tipos de cncer que
no sean leucemias o de la sangre se emplean otras tcnicas y agentes.
En el caso de la protena ErbB2 (oncogn),
se sobreexpresa en determinadas clases de
cncer de mama. La POH-1 (enzima que
quita ubiquitinas), alarga la vida de ErbB2
(es una protena que desarrolla actividad
tirosin-quinasa y que aumenta la proliferacin celular). Se degrada va proteosoma, su vida media depende del proteosoma, siendo marcada por ubiquitina. Pero en este tipo de tumor tambin se expresa POH-1, que quita ubiquitina, alargando la vida de este oncogn ErbB2.
En estos tumores, adems de la sobreexpresin gnica de la protena ErbB2, se produce un
aumento de la protena POH1, teniendo al final una cantidad superior de un oncogn (ErbB2)
que hace que la clula normal se convierta en neoplsica.
Si inhibimos la protena POH-1, estamos favoreciendo la degradacin de la protena oncognica, de aqu la importancia de la inhibicin de las protenas que quitan ubiquitinas para el tratamiento de estos cnceres.
En el caso de la protena UCHL5, se sobreexpresa en ciertos tumores y aumenta la supervivencia de las clulas de carcinoma de pulmn, porque reduce la apoptosis. Cuando se silencia
UCHL5, cae Bcl2 (supervivencia, anti-apoptosis) y sube Bax (pro-apoptosis). El uso de bortezomib en leucemias aumenta la cantidad de p53, debido a que aumenta su estabilidad, pero
no por una sobreexpresin.
Luego aumenta CDK-21 y CDK7 (fosfatasas del ciclo celular) y IB (protena inhibidora del factor de transcripcin NFB, que tiene que ver en la proliferacin de clulas inmunes).
La inhibicin del proteosoma en ciertos tumores de la sangre, favorece p53 y detiene el ciclo
celular frenando la divisin, adems se mantiene o se estabiliza protenas que son inhibidores
de factores de transcripcin que tienen mucho que ver con la divisin celular.
Hasta dnde podremos llegar con el empleo de inhibidores del proteosoma? Se est investigando y probando en cncer de colon, pulmn, rin, etc. Se est jugando con 3 procesos celulares: divisin celular, apoptosis y autofagia. Cuando hablamos de necrosis y autofagia tenemos que diferenciar entre auto/macroautofagia y microautofagia. Se ha visto que hay prote69

nas que sirven para alimentar a las clulas en momento de ayuno, siendo protenas que llevan
la secuencia KFERQ.
Si tenemos un cultivo de clulas de fibroblastos y lo ponemos en ayuno, sin suministro de suero, las clulas sobreviven cierto tiempo degradando protenas que son prescindibles. Las protenas que se degradan son KFERQ, son reconocidas por chaperonas de la familia HSP70, que
ve esa secuencia o agrupaciones KFERQ y la lleva a las proximidades del lisosoma. All se encuentra la protena de reconocimiento LAMP-2 (protena de membrana asociada al lisosoma).
La protena llega con la chaperona, llega al receptor que est en la membrana del lisosoma,
siendo capturada e introducida en el interior del lisosoma.
En ratas en ayunas, las protenas que se degradan son tambin las mismas, con esta secuencia.
Por ello, parece que estas secuencias KFERQ sirven para marcar protenas prescindibles. Esta
degradacin selectiva de protenas ocurre en todos los tejidos, excepto en cerebro y testculo.
Una clula tumoral tiene unas caractersticas muy particulares: es absolutamente dependiente
del suministro de sangre, puesto que necesita un aporte continuo de nutrientes debido a que
tiene un metabolismo muy activo, hasta el punto que hacen uso de estas protenas prescindibles. De esta manera, podemos atacar a la clula tumoral ponindole cloroquina?, agentes
lisomotrpicos para que no pueda degradar protenas con el lisosoma, y stas terminan muriendo, entrando en autofagia.
A travs de los antgenos de histocompatibilidad y las diferencias de los receptores que tengan
las clulas normales y las tumorales, seremos capaces de distinguirlas, evitando as atacar a las
clulas sanas, centrndonos solamente en las tumorales.

70

Tema 4: Reglacion del ciclo cellar


1 Introduccin al ciclo celular
El estudio de la regulacin del ciclo celular implica el conocimiento de dicho ciclo. La salida de
fase G0 a G1 est promocionada por el aumento de la ciclina D que va formar complejos con
CDK4 y CDK6. A continuacin, para el paso de G1 a
fase S se produce un aumento de ciclina E que va a formar complejos con la CDK2 y
la progresin en fase S est
mediada por el aumento de
ciclina A, que forma complejos con la CDK2 tambin.
Finalmente para entrar en
fase G2 y que se produzca la
mitosis se produce un aumento de ciclinas A y B unidas a CDK1. Por tanto el
orden de actuacin de las
CDKs es 6-4-2-1 y para las
ciclinas es D-E-A-B.
Hoy da se sabe que las CDKs activas son heterodmeros que presentan una subunidad cataltica (quinasa) y una subunidad reguladora (ciclina). Son sus combinaciones las que intervienen a lo largo del ciclo celular, pero ante un defecto en una de ellas, otra puede sustituirla, ya
que es un caso de redundancia.
Cuanta ms cantidad de ciclina, ms actividad quinasa se produce y ms rpida ser la velocidad de funcionamiento del ciclo celular.
Pero la complejidad de las relaciones entre cada uno de los protagonistas del ciclo celular hace
que a pesar de conocer las protenas implicadas, no se conozca el proceso con todo detalle.

1.1 Transduccin de la seal de divisin y cncer


En una clula hay diversos receptores para factores de crecimiento que transmiten seales
positivas o negativas a la clula. Por ejemplo, el factor de crecimiento transformante (TGF) es
un factor de no crecimiento que se opone a la divisin celular.
En circunstancias normales, una clula va a recibir una seal positiva que va a desencadenar la
actividad Y-kinasa dando lugar a la fosforilacin cruzada y a la activacin secuencial de las protenas GrB2, SOS, RAS, RAF, MEK y ERK, muchas de las cuales son quinasas que van a mandar
otras tantas seales fosforilando protenas.

71

Una de estas protenas que se van a fosforilar son FOS y JUN que dimerizan y entran al ncleo
para unirse a los elementos de respuesta que van a dar lugar a la expresin de los genes de las
ciclinas de la fase G1 (Ciclina D, CDK6 y CDK4), adems del factor E2F.
Para que se produzca toda la cascada el impulso debe de ser lo suficientemente duradero y
por ello cada protena implicada presentar un tiempo de actuacin, permitiendo que los niveles de expresin superen el umbral que permite la progresin del ciclo celular.
Pero hay que tener en cuenta que la sobreproduccin tambin es peligrosa. Las cantidades de
cada protena tienen que producirse en un momento dado, ser suficientes y a continuacin
decaer para progresar de fase. Esto establece varios niveles que pueden llevar a la produccin
de cncer:
-

La sobreproduccin del factor de crecimiento conduce a una sobreestimulacin de toda la cascada que puede inducir al cncer.
Mutaciones en un receptor de factores de crecimiento son oncognicas porque hay
variantes truncadas que expresan actividad de manera constitutiva y por lo tanto se
considera al receptor como un pro-oncogn.
Mutaciones en RAS que aumentan el tiempo de actividad son oncognicas.
Mutaciones en cualquiera de las protein kinasas que intervienen (RAF, MEK o ERK)
producen cncer.
La sobre expresin de los oncogenes FOS y JUN deriva en cncer, as como su transformacin a V-FOS y V-JUN (viral mutada) que impide su degradacin.
Las mutaciones que provocan una sobreproduccin de las quinasas o una atenuacin
de las fosfatasa que inhiben la ruta, tambin es un factor desencadenante de cncer.

2 Regulacin del ciclo celular


El ciclo celular est controlado por tres niveles:
-

Cantidad de ciclinas y CDKs


Quinasas y fosfatasas
Protenas inhibidoras (INKs)

2.1 El factor de maduracin de los oocitos (MPF)


El factor promotor de la maduracin (MPF) o factor de maduracin de los oocitos de sapo fue
descubierto trabajando con oocitos de sapo. Este descubrimiento se realiz al transferir material citoplasmtico desde un oocito detenido en metafase hasta otro oocito no fertilizado. Este
tratamiento provocaba la mitosis del oocito no fertilizado y el compuesto aislado del citosol
que provocaba este efecto era un complejo de ciclina-CDK que se denomin MPF.

72

Como ya vimos en el tema anterior, el MPF presenta una actividad quinasa y su degradacin
est regulada por APC activo, una E3 ligasa, que determina la adicin de ubiquitina a la ciclina
del complejo y su consiguiente degradacin por la va UPS.
El complejo APC est activo siempre y cuando su subunidad Cdh1 no presente fosfato, ya que
cuando es fosforilado por el complejo Ciclina-CDK de G1 queda inactivo. La actuacin de Cdc14,
una fosfatasa, retira el fosfato de Cdh1, activado a APC y degradando la ciclina.

2.1.1 Regulacin de MPF: ejemplo de cantidad de ciclinas y nivel de fosforilacin


Si observamos el modelo de regulacin del factor promotor de la mitosis constituido por la
ciclina y el CDK, vemos que la quinasa dependiente de ciclina presenta varios restos importantes en su estructura que pueden estar fosforilados:
-

La tirosina 15 (Y15) cuya fosforilacin es inhibidora.


La treonina 161 (T161) cuya fosforilacin es activadora.

Cuando los niveles de ciclina mittica aumentan, estas forman los MPF inactivos que van a ser
fosforilados por la quinasa Wee1 en la posicin Y15 (inhibidora). A continuacin el complejo
MPF va a ser fosforilado en la posicin T161 (activadora) por la quinasa CAK, pero permanecer inactivo por la inhibicin de Y15.
El estado activo del complejo MPF, que permite fosforilar a sus sustratos, solo se alcanza por la
accin de la fosfatasa Cdc25, que retira el fosfato de la posicin Y15 dejando libre el sitio cataltico.

73

Las deficiencias en la quinasa Wee o en la fosfatasa Cdc25 provocan la aparicin de clulas de


gran tamao que no progresan en el ciclo celular, porque no pueden entrar en fase M. Pero un
exceso de Cdc25 o un dficit de Wee, provocan la aparicin de clulas muy pequeas que se
dividen rpidamente, ya que la primera es un acelerador del ciclo, mientras que la segunda es
un freno.

2.2 Protenas inhibidoras de complejos ciclina-CDK (INKs)


Adems del estado de fosforilacin de los complejos ciclina-CDK pueden participar otras protenas como inhibidoras.
A mediados de la fase G1, el complejo Ciclina-CDK de la fase S est formado y amordazado por
la protena inhibidora Sic1, que es una INK. La clula no va a progresar a la fase S hasta que el
complejo Ciclina-CDK de la fase G1 (Ciclina-D + CDK4/6) fosforile a la protena inhibidora Sic1, lo
que provoca la separacin del complejo y el reconocimiento de esta por el sistema de degradacin UPS.

Esto deja libre al complejo Ciclina-CDK de la fase S que comienza a fosforilar a las protenas de
la maquinaria de replicacin activndolas.

2.3 Visin en conjunto de la actuacin de los complejos Ciclina-CDK


Al principio de la fase G1 se forman los complejos pre-replicativos sobre los orgenes de replicacin del DNA. Alcanzada la fase media-tarda de G1 se da el pistoletazo de salida con la formacin de los complejos ciclina-CDK de G1 que fosforilan a Cdh1 inactivandolo. Al mismo tiempo, estas ciclinas activan la expresin de las ciclinas de la fase S cuyos complejos van a estar
amordazados por Sic1.
La fosforilacin de Sic1 por estas mismas ciclinas de G1 permite la entrada en fase S, donde los
complejos ciclinca-CDK de la fase S activan a los complejos de pre-replicacin, introducindose
las primasas, helicasas y DNA polimerasas necesarias.

74

Ya en fase G2/M la accin del MPF (Ciclina-CDK) desencadena la mitosis mediante la fosforilacin de los tetrmeros de lamina. Finalmente la reactivacin de APC por la fosfatasa Cdc14
produce la degradacin de MPF y la vuelta a interfase.

En este cuadro podemos ver la actuacin secuencial de las quinasas y fosfatasas que intervienen a lo largo del ciclo celular, as como las fases mitticas.

75

2.4 La protena del retinoblastoma (RB) y E2F


La protena retinoblastoma (RB) fue el primer anti-oncogen descubierto, ya que su falta o
deficiencia provoca la aparicin del retinoblastoma, un cncer ocular.
La RB es una protena vigilante que a mediados de la fase G1 se encuentra formando un complejo con el factor de transcripcin E2F, actuando como un factor inhibidor de la expresin al
que se asocian protenas histonas-desacetilasas, promoviendo la compactacin del DNA.
Cuando los niveles de ciclina-D + CDK4/6 aumentan, se fosforila a la protena RB provocando la
disociacin de E2F. El factor E2F acta ahora como un factor de transcripcin que se une a sus
elementos de respuesta promoviendo la expresin de varios genes entre los que se encuentra
el mismo (retroalimentacin positiva), la ciclina-E y la CDK-2, cuyos complejos mantienen el
nivel de fosforilacin de RB (retroalimentacin positiva).

La falta o deficiencia de RB provoca una estimulacin continua de las ciclinas-E y CDK2 que
conlleva un exceso de divisin celular.

2.5 Puntos de control del ciclo celular


Para una mayor comprensin del funcionamiento de los puntos de control del DNA vamos a
comenzar con la definicin de las protenas implicadas:
-

ATM y ATR son dos quinasas que se activan ante un dao en el DNA, la primera cuando se rompen ambas hebras y la segunda cuando se rompe una o hay DNA no replicado.
p53 es un factor de transcripcin que induce la expresin de muchsimas protenas
como p21CIP.
p21CIP es la protena inhibidora del ciclo celular que realiza su accin sobre los complejos Ciclina-CDK.
Chk1 y Chk2 son dos quinasas que frenan la accin de la fosfatasa Cdc25.
Cdc25 es la fosfatasa que activa a MPF.
APC es una E3-ligasa de ubiquitina.

En el ciclo celular podemos encontrad cuatro puntos de control para el dao del DNA o que
no est replicado, que van a estar mediados por la actuacin, en primer lugar de los sensores
ATM/ATR.

76

Centrados en la fase G1, cuando se detecta la rotura de una o dos de las hebras del DNA (4a) se
produce la activacin de ATM/ATR que van a fosforilar a p53, estabilizndola, lo que provoca
la expresin de las protenas p21CIP que van a inhibir al complejo Ciclina D-CDK4/6.
En el inicio de la fase S y durante esta hay otro control del DNA (4b y 4c) donde en su caso se
vuelven a activar ATM/ATR pero que adems de fosforilar a p53 e inhibir al complejo Ciclina
E/ACDK2, van a activar a las quinasas Chk1/2. Estas quinasas fosforilan a la fosfatasa Cdc25
impidiendo que realice su actividad cataltica y por lo tanto que se retire el fosfato inhibidor
del centro activo de los complejos de ciclina de esta fase.
En la entrada a la fase M (1 y 4d) vamos a encontrar un sistema anlogo a lo ya explicado que
va a consistir en un control de daos del DNA a travs de p53 y un control de DNA no replicado
a travs de la inhibicin de Cdc25, que van a actuar sobre los complejos de las ciclinas A/BCDK1.
Finalmente en anafase y telofase (fase M) respectivamente tenemos la inhibicin por Mad2
de la APC-Cdc20, una E3 ligasa de ubiquitina que permite la degradacin de la securina (cemento entre las cromtidas) en el caso de que no se hayan alineado las cromtidas. Y a continuacin el control de la segregacin de cromtidas que cuyos efectores inhiben a la fosfatasa
Cdc14 y por lo tanto impide la degradacin de las ciclinas B por el complejo APC-Cdh1, hasta
que no se ha finalizado.

77

En la siguiente imagen
podemos ver estas interacciones entre las protenas implicadas y como
afectan concretamente a
los complejos de ciclina
de cada fase, indicndose el punto de control en
el ciclo celular. Ntese
como cada Cdc25 puede
frenar en distintas etapas. La protena p38 es
facilita la respuesta a
estmulos de estrs como las citoquinas

2.6 Visin global de la regulacin del ciclo celular


Todo comienza con la llegada del factor de crecimiento que induce la expresin de la ciclina D
de la fase G1. En este momento, las CDK4/6 se encuentran inhibidas mediante la protena INK4.
La separacin del inhibidor INK4 provoca la formacin de los complejos CiclinaD-CDK4/6 y el
avance del ciclo. Pero este proceso est frenado por la actuacin de p21, en el caso de que se
haya producido un dao en el DNA, o las inhibidoras p15-p27.
La formacin de los complejos CiclinaD-CDK4/6 de la fase G1 permite ahora que estos fosforilen al complejo RB-E2F-histonadesacetilasa, permitiendo que el factor de transcripcin vaya al
ncleo y estimule la sntesis de las ciclinas A/E de la fase S.
Estas ciclinas van a formar los complejos CiclinaE-CDK2 de la fase S que van a fosforilar ms
protenas RB, retroalimentado el sistema y la fosforilacin de histonas. Al mismo tiempo los
complejos CiclinaA-CDK2 van a fosforilar y activar las DNA polimerasas para comenzar con la
replicacin del DNA o quedar inhibida por CIP/KIP en equilibrio segn las seales.

78

En el caso de que se produzca un dao en


el DNA en la fase M, podemos observar el
funcionamiento detallado del sistema del
punto de control. El dao es captado por
ATM/ATR que van a estabilizar a p53,
activando a p21 y esta inhibir la fosforilacin de los complejos CiclinaA/B-CDK1.
Al mismo tiempo se activan Chk1/2 que
fosforilan a la fosfatasa Cdc25 impidiendo
la activacin de los complejos de ciclina
mencionados.
Pero cuando nos enfrentamos al tema de
la regulacin del ciclo celular hay demasiadas incognitas. Un tipo celular no recibe una sola clase de un factor de proliferacin, sino que presenta una poblacin
de receptores para cada factor que inducen seales contrapuestas o sinrgicas.
La clula procesa esta informacin, pero cada una de las cascadas que lleva asociadas son muy
complejas y por ello muy difciles de comprender y de investigar.
Dado que buena parte de la regulacin descansa sobre la actuacin del proteasoma, en muchos casos se utilizan inhibidores de este o factores citostticos que prevengan la divisin celular.
Un buen ejemplo de esta complejidad se encuentra en
el modelo de la regulacin de la activacin de p53 por
Chk2 en respuesta a la radiacin ionizante. Esta radiacin activa a ATM cuando se rompen dos hebras del
DNA. La quinasa ahora fosforila Chk2, pero tambin
puede actuar sobre p53 aumentando su estabilidad y
produciendo una detencin del ciclo celular. Pero la
fosforilacin de Chk2 sobre p53 conduce a la apoptosis
celular.
La protena p53 puede ser modificada por muchas quinasas y acetilasas diferentes que modulan su funcin. La fosforilacin o desfosforilacin de varios residuos de serina (S) pueden tener
un gran impacto sobre la estabilidad de p53. Estudios con anticuerpos especficos para residuos fosforilados han establecido que las serinas (S) 6, 9, 15, 20, 33, 37 y 46 de p53 son sitios
de fosforilacin en las clulas con dao en el DNA y la fosforilacin de diferentes residuos presenta efectos distintos. Se ha propuesto que la fosforilacin de las serinas (s) N-terminales 15,
33 y 37 permiten la modificacin de una lisina (K) C-terminal a travs de la mejora del reclutamiento de las protenas co-activadoras p300/CBP/PCAF. En contraposicin, se requiere la
fosforilacin de S20 para estabilizar a p53 en respuesta a un dao en el DNA. La S20 impide
que Mdm2 se una a p53 y la convierta en una diana del sistema UPS.
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3 La silimarina un potencial anticancergeno


La silimarina es una molcula con propiedades antitumorales que se extrae del cardo (Silybum
marianum) y cuyos efectos, que quedan descritos en la imagen, favorecen la detencin del
ciclo celular, la desaparicin de la inflamacin, baja la actividad de muchas proteasas (impidiendo que una clula anide en un tejido al romper la matriz) y atena los factores oncognicos.

80

Tema 5: Retclo endoplasmatico I


Sntesis de fosfolpidos, ceramidas y esteroides. Citocromo P450
El retculo endoplasmtico es el conjunto de elementos de membrana en el interior celular que
ejerce un gran papel en la biosntesis y glicosilacin de protenas, as como en la detoxificacin.
Estos tres aspectos son la clave de su importancia ya que:
-

La biosntesis de protenas en el retculo marca su destino en la clula.


Modificaciones de las protenas como la glicosilacin proporciona a la protena unas
caractersticas diferentes (menor vulnerabilidad a proteasas).
La detoxificacin es el proceso gracias al cual se ha mantenido la vida sobre el planeta.
La mayora de los compuestos son hidrofbicos por lo que si no se produjera este efecto, quedaran adosados a la membrana plasmtica impidiendo el funcionamiento de
las protenas y del sistema de transporte de iones.

1 Biognesis de lpidos en el retculo endoplasmtico


El retculo endoplasmtico es el lugar donde se sintetizan los lpidos como el colesterol, la cardiolipina, los esfingolpidos y los fosfolpidos (fosfatidilcolina y fosfatidiletanolamina). Tambin
se sintetizan otros esteroles como los glucocorticoides, los mineralocorticoides y los gestgenos.

1.1 Biosntesis de lpidos y fosfolpidos


La fabrica celular de lpidos y fosfolpidos es el retculo endoplasmtico, desde donde van a
pasar a los diferentes orgnulos subcelulares en forma de vesculas de transporte que contienen, adems, el material proteico.
Los componentes para la fabricacin de los cidos grasos (Acil-CoA y glicerol fosfato) se localizan en el citosol, pero las enzimas necesarias para su sntesis estn adosadas a la cara citoslica de la membrana del retculo endoplasmtico.
Recordatorio: La adicin de dos restos de cido graso al glicerol fosfato genera el diacilglicerol fosfato o cido fosfatdico (PA). Si se le quita el fosfato tendremos el diacilglicerol
(DAG) y si se aade una colina tendremos la fosfatidilcolina, tambin denominada lecitina.
Partiendo desde la fosfatidilcolina (PC) podemos obtener la lisofosfatidilcolina (LPC) al retirarle el cido araquidnico (AA). La LPC puede formar cido lisofosfatdico (LCA) y el AA
dar lugar a los eicosanoides.

81

Obsrvese como los puntos de insaturacin se localizan en la posicin 2 del glicerol fosfato.
Recordatorio: La ceramida puede dar lugar a esfingosina (Sph) y esta a esfingosina-1fosfato (S1P). Tambin es el precursor para la sntesis de esfingomielina (SM), ceramida-1fosfato (C1P) y Glucosil ceramida (GlcCer).

Recordatorio: el fosfatidilinositol (PI) puede presentarse en varios estados de fosforilacin


hasta el fosfatidilinositol-3,4,5-trifosfato (PIP3).

Todos estos elementos son fuertemente hidrofbicos y presentan una distribucin diferente
entre las distintas membranas celulares.

1.2 Composicin lipdica de las membranas celulares


La composicin lipdica de las membranas celulares vara muchsimo, por ello se habla de perfil
lipdico o lipidoma haciendo referencia a esta composicin.
La comparacin del contenido relativo de los lpidos en las diferentes membranas que se
muestra en la tabla nos indica la existencia de una discontinuidad entre el retculo endoplasmtico liso y rugoso. Esto se debe a que la cantidad de protenas vara a lo largo del retculo, el
entorno es diferente, y por ello solo aquellas protenas que estn solubles podrn difundir a
cualquier cisterna, mientras que las ancladas al citoesqueleto vern su movilidad reducida. Las
diferentes porciones del retculo endoplasmtico rugoso presentan un empaquetamiento y
orden especial que determina una composicin proteica y lipdica concreta. Por su parte, el
retculo endoplasmtico liso tambin presenta estas caractersticas que limitan la difusin de
algunos lpidos y protenas.
El anlisis de los componentes mayoritarios en cada membrana nos revela que:
-

La membrana plasmtica es siempre la que tiene el mayor contenido relativo de colesterol.


La membrana mitocondrial interna es la ms rica en cardiolipina, el lpido del msculo cardaco porque estas clulas presentan muchas mitocondrias.

82

La membrana lisosomal es la que presenta los niveles ms altos de esfingolpidos.


Aunque tambin hay niveles apreciables en el retculo endoplasmtico liso y el Golgi.
- En las membranas internas predomina la presencia de fosfatidilcolina.
- La fosfatidiletanolamida es abundante en todas las membranas, pero siempre en
BIOGNESIS
DE LPIDOS EN EL RETCULO ENDOPLSMICO
menor proporcin que la fosfatidilcolina.

El estudio pormenorizado del contenido relativo de los distintos fosfolpidos y esfingolpidos en


las membranas celulares revela que la relacin de colesterol/fosfolpidos (animals) o ergosterol/fosfolpidos (yeast/plants) es de 1 y 0,5 respectivamente para la membrana plasmtica.
En el retculo endoplasmtico la relacin CHOL/PL o ERG/PL es de 0,15 y 0,1 respectivamente y
en la mitocondria de 0,1 para ambos. Para el endosoma la relacin CHOL/PL o ERG/PL es de
0,5 y 0,1 respectivamente. Todo esto indica una menor cantidad de colesterol en las membranas subcelulares en general salvo en el endosoma animal que recibe una gran aportacin de
colesterol procedente de la membrana plasmtica.

83

En el retculo endoplasmtico vamos a encontrar casi la variedad total de lpidos y fosfolpidos,


ya que es la fbrica de estos. Entre ellos tenemos en orden de abundancia fosfatidilcolina (PC),
fosfatidiletanolamida (PE), fosfatidilinositol (PI), fosfatidilserina (PS) y cido fosfatdico (PA),
adems de otros como galactosilceramida (GalCer), colesterol (CHOL) y triglicridos varios
(TG).
En las vesculas del aparato de Golgi volvemos a encontrar a la fosfatidilcolina (PC) como el
ms abundante, pero tambin encontramos fosfatidiletanolamida (PE) y en menores cantidades fosfatidilinositol (PI), fosfatidilserina (PS), esfingomielina (SM), glucosilceramida (GluCer),
fosfatidilinositol-4-fosfato (PI4P), esfingolpidos (ISL) y glucoesfingolpidos (GLS).
La mitocondria es ms restrictiva y la variedad de fosfolpidos que presenta es ms limitada
como la fosfatidilcolina (PC), fosfatidiletanolamida (PE), fosfatidilglicerol (PG), cardiolipina (CL)
y cido fosfatdico (PA).
En el endosoma tardo hay fosfatidilinositol-3,5-bifosfato (PI3,5P2), fosfatidilcolina (PC) fosfatidiletanolamida (PE), esfingomielina (SM) y bis-monoglicerol-fosfato (BMP), mientras que en
las vesculas que llegan encontramos fosfoinositol-3-fosfato (PI3P).
Finalmente en la membrana plasmtica encontramos gran cantidad de fosfatidilinositol en
todas sus variedades en lo que se conocen como fosfoinostidos. Adems tambin hay ceramida (Cer), esfingosina (Sph), esfingosina-1-fosfato (S1P) y diacilglicerol (DAG).

1.3 Biosntesis y movimientos de lpidos a travs de las membranas


celulares
A modo de sntesis introductoria, en la cara externa
del retculo endoplasmtico tenemos el glicerolfosfato al que una acil transferasa le introduce un
resto de cido graso en la posicin 1, y a continuacin
otra le mete un segundo resto de cido graso que
suele ser insaturado. A continuacin acta la fosfatasa
que retira el fosfato de la posicin 3 y una CDP-colina
transferasa cataliza la introduccin de colina-fosfato y
libera citidina monofosfato (CMP), y da lugar a la fosfatidilcolina (PC). Este mismo proceso sucede con la
fosfatidiletanolamida (PE) y la fosfatidilserina (PS).
La mayor parte de los glicerofosfolpidos ensamblados en el retculo endoplasmtico son fosfatidilcolina (PC), fosfatidiletanolamida (PE), fosfatidilinositol (PI), fosfatidilserina (PS) y cido
fosfatdico (PA). El retculo endoplasmtico tambin sintetiza ceramida (Cer), galactoceramida
(GalCer), colesterol (CHOL) y ergosterol (ERG). El retculo endoplasmtico y las reservas lipdicas participan en la sntesis de triglicridos (TG) y de esteres de cidos grasos.
Puesto que las enzimas implicadas se localizan en la cara externa del retculo, la fosfatidilcolina
(PC) se va acumulando en la monocapa externa, pero tambin van a haber enzimas (Translocasas) que favorecen el movimiento de flip-flop, evitando que la monocapa externa se haga
ms extensa que la interna. Pero este movimiento de flip-flop espontaneo est restringido
84

salvo que una protena con huecos hidrofgicos y mediante el gasto de ATP, pase los lpidos de
un lado a otro. Este movimiento est facilitado por las flipasas y flopasas.
Adems, las scramblasas facilitan el intercambio de fosfolpidos a favor de gradiente, sin gasto
de ATP.

poner lo de abajo
poner lo de abajo

Pero en las cisternas del Golgi no se puede producir estos

Major glycerophospholipids assembled in


movimientos
por que no se (PtdCho;
encuentran estas protenas. La
the
ER are phosphatidylcholine
PC),
phosphatidylethanolamine
(PtdEtn;
fosfatidilcolina
(PC) y la esfingomielina
(SM) que queda en
PE), phosphatidylinositol (PtdIns; PI),
la cara interna no puede salir a la externa, porque no hay
phosphatidylserine (PtdSer; PS) and
transportadores,
peroThe
el ER
diacilglicerol
phosphatidic
acid (PA).
synthesizes(DAG) y la ceramida
also
Cer,
galactosylceramide
(GalCer),
(Cer) si. El lumen del Golgi es el lugar de sntesis de la escholesterol and ergosterol. Both the ER and
fingomielina
(SM), los in
glicesfingolpidos
lipid
droplets participate
steryl ester and complejos (GSLs)) y
triacylglycerol
(TG) synthesis.
el inositol esfingolpido
(ISL)The
de Golgi
levaduras. Las protenas P4
lumen
is
the
site
of
synthesis
of
son las translocasas dependientes de ATP que van a permisphingomyelin (SM), complex
tir la salida a la monocapa
de la fosfoetanolamida
glycosphingolipids
(GSLs) andextertna
yeast
inositol
sphingolipid
(PE) y la
fosfoserina(ISL)
(PS).synthesis.
PtdCho is also synthesized in the Golgi, and
may be coupled
protein secretion
the
Aproximadamente el 45% de los fosfolpidos
de latomitocondria
sonatfosfatidiletanolamida,
cilevel of its diacylglycerol (DAG) precursor.
do fosfatdico y cardiolipina, que son
sintetizados45%
autnomamente
por el
Approximately
of the phospholipid
in orgnulo.
mitochondria (mostly PtdEtn, PA and
En la membrana plasmtica la fosfatidilcolina
(PC),is la
esfingomielina (SM) y los glicoesfingolcardiolipin (CL))
autonomously
synthesized
by the organelle.
BMP
(bis
pidos complejos (GSLs) no puede pasar
a la monocapa
interna,
mientras
que si encontramos
(monoacylglycero) phosphate) is a major
translocasas P4 para fosfatidiletanolamida
(PE) in
y fosfatidilserina
(PS).ofEsto
phospholipid
the inner membranes
latesupone la existencia
endosomes.donde la
de una asimetra entre ambas monocapas

fosfaticilcolina es ms abundante en la monocapa


externa, mientras que la fosfatidilserina (PS) y la fosfatidiletanolamida (PE) son ms abundantes en la
monocapa interna. La distribucin asimtrica es vital
para la morfologa de la membrana, ya que la gran
cabeza de aminocuaternario presente en la fosfatidilcolina (PC) se tiene que situar en la parte exterior de
la curvatura, mientras que la fosfatidilserina (PS) y la
fosfatidiletanolamida (PE) no presentan impedimentos estricos en la parte interna de la curvatura.

85

Otra anotacin importante es que aunque se sabe de la existencia de lanzaderas que toman
los lpidos de una membrana y los llevan a otra, se sabe de la existencia de puntos de contacto
como los que se encuentran entre la mitocondria y el retculo, que permiten un cierto transito
de lpidos.
1.3.1 Topologa de la sntesis de glicoesfingolpidos de mamferos
La ceramida (Cer) es sintetizada en el retculo endoplasmtico, donde la base esfingonoide
puede ser desaturada o hidroxilada. En clulas especializadas, la ceramida puede ser convertida en galactosilceramida en el lumen del retculo endoplasmtico, por la galactosil transferasa
(CGalT), tambin denominada GalT-1. Las dems transferasas de galactosa se localizan exclusivamente en el aparato de Golgi, esta es solo para lpidos.

A continuacin la ceramida y la galactosilceramida viajan al aparato de Golgi, donde la glucosiltransferasa (CGlcT), activa en el lado citoslico, sintetiza la glucosilceramida (GlcCer) que debe
ser translocada al lumen para poder ser convertida en otros compuestos. Existe un amplio
repertorio de transferasas que introducen restos glucosdicos en diversas posiciones.
1.3.2 Sntesis de fosfolpidos
La sntesis de fosfolpidos se realiza a partir del glicerol-3-fosfato (G3P) al que se le aade un
primer cido graso para formar el liso-cido fosfatdico (Lyso-PA), y un segundo cido graso
para formar el cido fosfatdico (PA).
El cido fosfatdico puede seguir dos vas, la normal y la especfica del hgado para formar los
diferentes fosfolpidos.
En la va normal se aade citidina difosfato (CDP) al cido fosfatdico (PA) quedando CDP-DAG
y liberndose un fosfato. La ruptura de este enlace pirofosfato aporta la energa necesaria para
catalizar el reemplazo del grupo CMP por inositol, G3P, o serina para formar fosfoinositol (PI),
PGP (precursor de cardiolipina), o fosfatidilserina (PS) respectivamente.
86

Topol
glycos
Ceram
where
desatu
specia
conve
by the
called
CGlcT
the Go
GlcCe
the Go
LacCe
transfe

La fosfatidilserina (PS) puede ser descarboxilada para dar fosfatidiletanolamida (PE), que a su
vez puede ser metilada para producir fosfatidilcolina (PC).
Synthesis of

ph
choline; Etn, et
monolyso-CL;
P-ethanolamine
pyrophosphate
Synthesis
ofen
p
provides
the
choline;CMP
Etn, w
et
replace
monolyso-CL;
or
PS, respectiv
P-ethanolamine
dephosphorylat
pyrophosphate
from
PG and
Synthesis
of C
p
provides
the
en
the
pyrophosph
choline;
Etn, et
replace
CMP
w
the
chemical en
monolyso-CL;
Centrados a nivel de la mitocondria y el transporte lipdico hacia el orgnulo, podemos ver que
or PS, respectiv
vacant
primary
hay zonas en las que el retculo y la membrana mitocondrial externa se aproximan y contactan.
P-ethanolamine
dephosphoryla
La sntesis de cardiolipina comienza con la conversin del cido fosfatidico en CDP-DAG, padecarboxylated
pyrophosphate
from
PGPC.
and C
sando ambos hasta la membrana mitocondrial interna. A continuacin el CDP-DAG sufre una
to
yield
provides
theAl
en
serie de reaccin por enzimas mitocondriales que dan lugar a la cardiolipina.
the
pyrophosph
synthesized
replace CMPvia
w
the
chemical
en
Kennedy
pathw
or PS, respectiv
vacant
primary
transport
event
dephosphoryla
decarboxylated
aminoglycerop
from PG and C
to yieldsynthesiz
PC. Al
C)
thePA
pyrophosph
synthesized via
biosynthetic
the chemicalrea
en
Kennedy
pathw
ER/MAM
or be
vacant primary
transport
event
the
action of Cd
decarboxylated
aminoglycerop
OM,
mitochond
to yield
PC. Al
C)
PA
synthesi
Cds1,
CDP-DA
synthesized
via
Para la fosfatidiletanolamida y la fosfatidilcolina, el cido fosfatidico es activado mediante CDP
biosynthetic
re
Crd1,
CL pathw
synth
Kennedy
a CDP-DAG en la propia membrana del retculo, donde es condensado con una molcula de
ER/MAM or b
phosphatidylgl
transport event
serina y viaja a la membrana mintocondrial interna. Una vez all, se cataliza la descarboxilacin
the
action
of m
C
P-Etn
a fosfatidiletanolamida y vuelve hasta la membrana del retculo donde se le aade la colinaPem2,
y
aminoglycerop
OM, mitochon
es exportado de nuevo a la mitocondria.
phosphatidylgl
C) PA synthesi
Cds1, CDP-DA
decarboxylase;
biosynthetic re
Crd1, CL synth
ER/MAM or b
phosphatidylgl
the action of C
Pem2, P-Etn m
OM, mitochon
phosphatidylgl
Cds1,
CDP-DA
decarboxylase;
Crd1, CL synth
phosphatidylgl
Pem2, P-Etn m
phosphatidylgl
decarboxylase;
87

1.4 Enfermedades ligadas al retculo endoplasmtico


Se conocen unas 10.000 enfermedades monognicas (que dependen exclusivamente de un
gen) como la fibrosis qustica, distrofia muscular de Duchenne, etc. Destacan en el mbito de
este tema las enfermedades causadas por acumulacin de material lipdico en el lisosoma
(mucolipidosis).
Por endocitosis se forman primero los endosomas primarios y luego los endosomas tardos, y
esos endosomas tardos terminan en el lisosoma, para la degradacin. Entre los materiales a
degradar estn los lpidos y las protenas embebidas, donde son muy abundantes los ganglisidos, sobre todo en la neurona, a nivel del sistema nervioso central.
Hay una serie de enfermedades por la acumulacin de material lipdico (ganglisido GM1,
GM2, GM3,etc.), conocindose por gangliosidosis (para GM1), sialidosis, enfermedad de Gaucher, , dependiendo de la deficiencia de una protena aparecen las distintas enfermedades,
siendo deficiencias en un solo gen.
Esta acumulacin del material lipdico (o tambin llamadas estas enfermedades de inclusin
de material lipdico en el lisosoma), que pueden ser ganglisidos, colesterol, etc. o cualquier
otro material que no se pueda digerir en el lisosoma, provoca su acumulacin lo que desemboca en el aumento de tamao y la progresiva prdida de funcionalidad celular.
Esto les sucede por ejemplo a las neuronas. Los nios que nacen con este tipo de enfermedad
presentan un severo retraso mental, muriendo a los pocos aos de edad, dependiendo de la
variante de la enfermedad. Son enfermedades gravsimas que se detectan por amniocentesis.
Si se detecta en los primeros estadios hay tratamiento.
La terapia que se ha ideado para el tratamiento de estas enfermedades es la administracin
de chapeoronas (qumicas) como inhibidores competitivos que fuerzan el plegamiento de la
protena, mejorando su actividad cataltica o permitindole llegar hasta su destino a pesar
de no ser totalmente funcional.
Una protena normal se va a plegar correctamente al sintetizarse en el retculo a pH neutro,
con destino al lisosoma. Pero cuando las protenas mutadas predominan en formas mal plegadas que no van a ser funcionales.

88

La administracin de chaperonas qumicas puede forzar un buen plegamiento, suficiente como


para pasar los controles de calidad del retculo y viajar al Golgi, desde donde es transportada al
lisosoma, cuyo pH provoca la disociacin de la chaperona. Aunque esto puede suponer una
prdida de conformacin, la protena va a presentar cierta actividad cataltica, que en muchos
casos ser suficiente para realizar su funcin, ya que sin la chaperona, no habra superado el
ERAD del retculo, o incluso podra haber comenzado a agregarse.
Pero este tipo de tratamientos solo es aplicable a enfermedades monogenticas cuya causa
se conoce. La aplicacin en enfermedades multifactoriales como el Alzheimer o el Parkinson es
inviable.
En cualquier caso es necesario que la chaperona qumica pueda atravesar la membrana plasmtica, siendo homlogos no hidrolizables, no transformables, de un sustrato. Si lo que falta
es la sialidasa, porque la protena est pero no tiene el plegamiento adecuado para tener actividad biolgica, se pone un homlogo del cido silico de manera que a travs del ajuste inducido se pega al centro activo y obliga al plegamiento de la protena. Quizs la protena, una vez
plegada, no adquiera el 100% de su actividad cataltica, pero con que tenga el 20-30% ya es
suficiente, para que el desarrollo del sistema nervioso central del nio afectado sea medianamente normal, dependiendo del grado de recuperacin.

2 Las protenas citocromo P450


Se calcula que hay unos 100.000 xenobiticos, siendo productos de la industria qumica que se
emplean como aditivos alimentarios, cosmticos, etc. Gracias a estos citocromos p450 se ha
podido mantener la vida en el planeta, ya que aparecen como una adaptacin al medio.
El citocromo P450 recibe su nombre por presentar un grupo prosttico hemo que cuando
se reduce con ditionito (agente reductor) y luego se burbujea la disolucin resultante con
monxido de carbono (CO) se forma un complejo que presenta un espectro de absorcin
con un mximo entre 446 y 452 nm.
Las primeras protenas del citocromo P450 aparecen para desempear una funcin fisiolgica
esencial como la transformacin de colesterol en sales biliares, andrgenos y gestgenos, como enzimas con actividad hidroxilasa. Pero los fenmenos de duplicacin gnica permitieron
la variacin suficiente como para que estos citocromos se fueran especializando adems en la
detoxificacin, es decir, la eliminacin de productos que generalmente se va a conseguir aumentando la solubilidad de los txicos.

Por ejemplo, el benceno y sus derivados que al ser metabolizados se convierten en fenoles y
difenoles, mucho ms hidrosolubles que pueden ser conjugados con cido clico en el rin,
para formar colatos o con el cido hiprico, y ser eliminados con la orina.

89

2.1 Modo de accin y caractersticas del citocromo P450


En humanos se han detectado unos 57-58 citocromos P450 que en estado basal presentan un
Fe3+ unido. Cuando el sustrato reducido entra en el sitio activo, entonces P450 capta un electrn procedente del NADPH reducindose a Fe2+.
Ahora entra una molcula de
oxigeno que provoca la dismutacin de P450 (oxidacin) formndose especies inestables del oxgeno que van a pivotar en equilibrio entre varias estructuras de
resonancia y el anin superxido.
Finalmente se recibe el segundo
electrn procedente del NADPH y
el oxgeno, que ahora tiene dos
cargas negativas, forma el anin
perxido que va a oxidar el sustrato reducido y el NADPH captando
los dos protones para liberar el
sustrato oxidado y H2O.
Quin es el aceptor de oxgeno? Dnde entra el primer electrn? Dnde entra el segundo electrn?
A nivel celular, hay dos sistemas o grupos de protenas del citocromo P450, unas localizadas
en el retculo endoplsmico y otras en la mitocondria:
-

En el retculo, los electrones pasan del NADPH hasta la protena NCR (NADPH Citocromo p450 Reductasa, que es una flavoprotena porque tiene como grupos prostticos FADH2 y FMNH2, que son estables cuando reciben los dos electrones, pero pueden
soltarlos o los dos a la vez o de uno en uno). Esos electrones son cedidos al citocromo
p450, que cuando toma los electrones y pasa al estado reducido. En estado reducido
puede pasar a estado oxidado a travs de la reduccin del sustrato. La NCR es una de
las pocas protenas que tiene dos grupos prostticos, ya que la mayora de las protenas tienen uno de estos dos grupos, pero no los dos al mismo tiempo).

En el sistema mitocondrial los electrones pasan desde el NADPH a la protena NAdR


(NADPH Adrenodoxina Reductasa, es una flavoprotena que tiene el grupo prosttico
FADH2). De ah los electrones pasan a la adrenodoxina, la cual transfiere los electro90

nes al propio citocromo p450, que luego lo pierde ya al sustrato para pasar del estado
reducido al oxidado (igual que en retculo). La adrenodoxina es un transportador que
tiene cluster de grupos Fe-S asemejndose en cuanto a estructura a la ferredoxina.

Se habla de transporte electrnico microsomal, para aumentar la solubilidad y para fabricar


ciertos metabolitos.
Los miembros de la gran familia de citocromo P450 presentan homologa de la secuencia, debido a que los aminocidos que sujetan el grupo hemo son muy similares. (Familias de CYP1 = CYP1A,
CYP1B, etc.).
Para que pertenezcan a la misma familia (CYP1A y CYP1B), la homologa en la secuencia tiene que ser al menos de un 40%. Dentro de
la misma familia (CYP1A) aparecen varias subfamilias, que para que formen parte de esta familia tienen que presentar una homologa de al menos el 50-55%.
Prcticamente todas las familias de P450 las tenemos distribuidas por todos los tejidos, aunque hay poco en cerebro y msculo esqueltico. Sin embargo, el hgado es muy rico en p450,
debido a que es el rgano que se encarga de la detoxificacin.
El perfil de p450 es distinto segn el tejido, as como entre distintas especies animales. No
podemos comparar el espectro de absorcin de citocromo p450 de animales de distintas especies, debido a que la exposicin a genes diversos es distinta, siendo incluso el perfil de p450
diferente entre personas (individuos de la misma especie). Esto quiere decir, que el efecto de
diversos frmacos (vida media del frmaco en la sangre, por ejemplo), es diferente segn el
individuo. Dependiendo del rango de p450 que tenga una persona, la dosis de un frmaco
puede variar, por lo que se habla de medicina personalizada
El citocromo P450 es una protena inducible (del repertorio de p450 va a ser inducible aquella
variante necesaria para metabolizar un determinado agente). Si a un animal le administramos
una dosis de barbitrico (sedante, como por ejemplo: veronal), la cantidad de la variante de
p450 necesario para metabolizar el barbitrico aumenta a nivel transcripcional (es decir, a
nivel de cantidad de mensajero) y postranscripcional (es decir, la vida media del mensajero),
cuanto ms resistente sea al tratamiento o a la accin de las ribonucleasas se estarn produciendo ms cantidad de protenas.
Los barbitricos son una familia de frmacos derivados del cido barbitrico que actan como sedantes del sistema nervioso central y producen un amplio esquema de efectos, desde sedacin suave
hasta anestesia total. Tienen un alto potencial de adiccin y la sobredosis puede causar la muerte
El alcohol se metaboliza a travs del sistema P450. El etanol por el citocromo p450 se oxida a acetaldehdo y luego pasa a actico. Por lo que no debemos consumir medicamentos y alcohol al mismo
tiempo, pues si el citocromo est ocupado trabajando con el alcohol no puede estar trabajando con
el sedante, por lo que si se consumen las dos cosas, estaramos alargando la accin del sedante.

91

2.1.1 Modo de accin de Citocromo P450 reductasa


La citocromo P450 reductasa presenta:
-

un dominio de unin a FMN


(azul)
un dominio de unin a FAD
(amarillo)
un dominio de conexin (rojo)
Un dominio de unin a FAD y
NADPH (verde)

Los electrones van a pasar desde el NADPH hasta el FADH2 y luego al FMN, que se los cede al
citocromo P450, reducindolo. Estos electrones pueden llegar de dos en dos o de uno en uno,
ya que el citocromo va a poder recibir un electrn del NADPH, pero adems otro del citocromo
B5 (adosado a la membrana). El donador de electrones para el citocromo B5 (desde la citocromo B5 reductasa) es el NADH, por lo que en funcin del balance de poder reductor, los
electrones procedern en principio del NADPH o del NADH.
2.1.2 Modo de accin de la adrenoxina reductasa
Existen tres modelos tericos para explicar el trasiego de electrones desde la adrenosina reductasa por la adrenoxina, hasta el citocromo P450:
-

El modelo binario establece que el trasiego de electrones a travs de las protenas se


produce mediante interacciones binarias entre
dos de las protenas en cada momento.
El modelo ternario establece la formacin de un
complejo ternario que implica la interaccin de
las tres protenas en el momento del flujo electrnico.
El modelo cuaternario establece la existencia de
dmeros entre adrenosina reductasa-adrenosina
y adrenosina-P450 que van a interaccionar a
travs de la adrenosina para realizar la transferencia de electrones, formando un complejo
cuaternario.

2.2 Otras funciones de P450


Como ya se coment al inicio de este apartado, la funcin primaria de las protenas P450 era
participar en las reacciones metablicas como hidroxilasas del retculo endoplasmtico y de la
mitocondria.

92

En la biosntesis de hormonas derivadas del colesterol el citocromo P45017 tiene una actividad 17-hidroxilasa en varios puntos de la ruta, como por ejemplo en la conversin de la pregnenolona a hidrixipregnenolona.

Los citocromos P450 estn implicados en:


-

Formacin de epxidos de derivados del cido araquidnico.


Formacin de derivados de la vitamina B3.
Biosntesis de cidos biliares.
Generacin de hormonas esteroideas.

93

2.3 Enfermedades relacionadas con el citocromo P450


Existen tres tipos de variantes allicas por las que una persona puede sufrir una enfermedad
relacionada con los genes de P450:
-

Delecin del gen que conduce a la ausencia de un tipo particular de P450.


Mutacin en el gen que pueden dar lugar a:
o Bajo nivel de enzima
o Enzima inestable.
o Enzima con especificidad de sustrato diferente.
Duplicacin del gen que conduce a un aumento de la cantidad de P450 que puede ser
beneficioso o perjudicial.

El hecho de que P450 actu sobre un metabolito no significa que el producto sea ms inofensivo que el sustrato, en algunas ocasiones, como el caso de los epoxiderivados del antraceno o
el naftaleno, estos son ms perjudiciales y cancergenos que los compuestos de los que proceden.
La siguiente tabla muestra variantes de citocromos que metabolizan medicamentos que se
utilizan para la depresin, psicosis, lcera, cncer, problemas de corazn, etc. Hay frmacos
contra distintas enfermedades, que se metabolizan a travs de cit. p450.

94

UMs = metabolizadores ultrarpidos (un metabolizador ultrarpido es aquel que tiene copias
mltiples o superenzimas, con el centro activo idneo para metabolizar determinados frmacos. A lo mejor a ese individuo le tienen que administrar 200 veces la dosis normal.
PMs = metabolizadores pobres (un metabolizador pobre a lo mejor con el 40% de la dosis
normal tiene ya suficiente).
Si hay 57 tipos de cit. p450 y uno de ellos est suprimido, apenas se notar el efecto, ya que,
otro puede desempear su funcin en cierta medida.

95

Anexo I: Aislamiento de fracciones subcelulares


El estudio del retculo endoplasmtico mediante estudios funcionales requiere del aislamiento
de este. Para ello, la primera consideracin consiste en elegir un tejido que presente gran
cantidad de retculo endoplasmtico. Un buen tejido sera el hgado de rata, nunca se elegira
el msculo esqueltico, que presenta mucho retculo sarcoplasmtico pero apenas retculo
endoplasmtico.
El primer paso del procedimiento de aislamiento consiste en el homogeneizado del tejido
(hgado a una concentracin del 20% p/v) en potter manual con medio tamponado isotnico
con el interior del retculo (Tris 20 mM pH 7.5 y sacarosa 0.32 M) y antiproteasas para evitar la
degradacin de protenas. Puesto que algunas proteasas calcio-dependientes actan a muy
baja concentracin de calcio (incluso con la del agua destilada), se suelen aadir EDTA (secuestrador de calcio) para que no se activen.
A continuacin, se centrifuga el homogenizado a 1,000 g durante 10 minutos quedando un
precipitado (P1) con el debris celular (membrana con protenas y restos) y la fraccin nuclear, y
un sobrenadante (S1).
Ahora se centrifuga S1 a 10,000 g durante 10-20 minutos, obtenindose un precipitado (P2)
con la fraccin mitocondrial, y un nuevo sobrenadante (S2).
Se centrifuga S2 a 100,000 g durante 40-60 minutos, obtenindose un precipitado (P3) con la
fraccin microsomal (membrana del retculo endoplasmtico, el aparato de Golgi y restos de
membrana plasmtica) y un sobrenadante (S3). Para separar los componentes de la fraccin
microsomal de P3 en fracciones enriquecidas (nunca al 100%) se recurre a la centrifugacin en
gradientes de densidad continuos o discontinuos de sacarosa.
Finalmente, si se centrifuga S3 de nuevo a 100,000 g durante 2-3 h se obtiene un precipitado
(P4) que contiene la fraccin ribosomal, y un sobrenadante (S4) que contiene los componentes
solubles del citosol.

Una vez separadas las diferentes fracciones subcelulares, tendremos que asegurarnos de que
son aquello que deberan, y para ello se emplean miden concentraciones de enzimas o protenas que marcan exclusivamente una fraccin u orgnulo determinado.
96

Orgnulo
Retculo endoplasmtico
Aparato de Golgi
Matriz mitocondrial
Lisosoma
Citosol
Membrana plasmtica
Retculo sarcoplasmtico
Peroxisoma
Balsa lipdica

Marcador
Aril sulfatasa, BiP
Galactosil transferasa, COP-I
Succinato deshidrogenasa
-hexosaminidasa, -glucuronidasa
Lactato deshidrogenasa
Na/K-ATPasa (sensible a ouabana)
Ca-ATPasa
Catalasa
5-nucleotidasa, Fosfatasa alcalina

Para determinar la riqueza del orgnulo cuyo marcador se est analizando existen tablas que
establecen las unidades de actividad por miligramo de protena (U/mg) del marcador para una
fraccin pura. Por lo que si estoy analizando la succinato deshidrogenasa de la matriz mitocondrial (100% = 5,000 U/mg) y obtengo un valor de 4,000 U/mg, tendr una preparacin de
matriz mitocondrial al 80%.

Ejemplo: Aislamiento, caracterizacin y anlisis proteico de la fraccin


microsomal del msculo de ratn
En un caso experimental para distrofia muscular de carcter recesivo se presentan dos ratones, uno silvestre (Lama2+/?) y uno enfermo (Lama2dy/Lama2dy). Fenotpicamente los ratones Lama2dy no pueden producir merosina (la cadena 2 de la laminina) por lo que presentan
una deficiencia de laminina-2 y muestran un distrofia.
Por ello se lleva a cabo un aislamiento de la fraccin microsomal del msculo de ratn sano y
enfermo, con el fin de compralas.
El protocolo comienza con la homogeneizacin del musculo (cada ratn por separado) en medio isotnico (KCl 100 mM; 40ml/10g de msculo) y se centrifuga 20 minutos a 8.500 g. Se
obtiene un sobrenadante (S1) que contiene principalmente membranas y algo de la fraccin
del derbis celular y ncleos. Tambin se obtiene un precipitado (P1) que contiene la fraccin
mitocondrial.
A continuacin, para extraer la mxima cantidad posible de fraccin microsomal, se vuelve a
repetir el homogenizado y la centrifugacin sobre P1, obtenindose un nuevo sobrenadante
(S2).
S1 y S2 se filtran a travs de gasas y se someten a una centrifugacin de 30 minutos a 100.000
g, obtenindose un precipitado (P3) que contiene la fraccin microsomal. Esta fraccin se homogeniza y lava (KCl 600 mM; 10ml/10g msculo) parar retirar la actina y miosina del aparato
contrctil del msculo y se vuelve a centrifugar 30 minutos a 100.000 g.
El nuevo precipitado (P4) se vuelve a homogenizar y lavar con KCl, se incuba 30 minutos a 4C,
y se vuelve a centrifugar en las mismas condiciones.
Finalmente se obtiene un precipitado (P5) que contiene la fraccin microsomal del msculo y
se homogeniza en tampn isotnico (Sacarosa 250 mM; 1ml/10g).
97

Obtenidas las vesculas de la fraccin microsomal podemos analizar sus propiedades bioqumicas en el musculo normal (VMN) y distrfico (VMD), midiendo el rendimiento de protenas Tal
y como se observa en la tabla el msculo distrfico presenta un mayor rendimiento de protenas.
A continuacin se analiza la actividad de varias protenas diferentes que se presentan en las
membranas. Tal y como se puede observar en la tabla, se ha detectado un fuerte descenso de
la actividad calcio-ATPasa en el msculo distrfico, adems de un aumento de las actividades
de las magnesio-ATPasa y Sodio/potasio-ATPasa.
Las primeras son canales o bombas de calcio
que estn presentes
en la membrana muscular, pero no en las
dems. Las segundas
son canales o bombas
que generalmente se
presentan en mayor
medida en la membrana plasmtica.
Por lo tanto, podemos concluir que las membranas derivadas del msculo distrfico contienen
ms membrana plasmtica que el msculo normal, lo que se correlaciona con el mayor contenido de colesterol.
Pero tenemos que considerar que esta medicin se est realizando sobre el conjunto de membranas de la clula por lo que es necesario realizar un fraccionamiento de los microsomas con
el fin de separarlas. Este fraccionamiento se realiza sometiendo la muestra de microsomas a
un gradiente continuo de sacarosa (25%-50%) durante toda la noche.

98

Este tratamiento supone la separacin de 4 fracciones de con membrana, una superior con
muy poca densidad que se corresponde con la membrana plasmtica, y tres fracciones de
retculo sarcoplasmtico de densidad baja, media y alta.
Cuando comparamos las actividades de las distintas protenas analizadas en cada fraccin,
podemos observar un alto contenido en sodio-ATPasa y acetilcolinesterasa (AChE) entre otras
tpicas de la membrana.
En cambio las fracciones de retculo sarcoplasmtico presentan una mayor actividad de CalcioATPasa, adems de actividad AChE.
Las diferencias entre las membranas del retculo sarcoplasmtico se deben a que este est
formado por cisternas y elementos longitudinales capaces de formar tradas (vesculas muy
pesadas cargadas de calcio). La distribucin de protenas y las cantidades varan a lo largo de
estas, produciendo retculo con diferentes densidades.
Una vez caracterizado el tipo de microsomas se realiz un anlisis de la composicin de protenas de las vesculas microsomales mediante un ensayo electroforesis con el fin de observar
diferencias entre los patrones proteicos del msculo normal y distrfico.
El anlisis del patrn muestra dos
bandas mayoritarias que se corresponden con los tamaos de CalcioATPasa y Calsecurina (CSQ). Estas
bandas son mucho ms intensas en
el patrn del musculo normal por lo
que no solo hay menos actividad de
estas protenas en el msculo distrfico, como se ha determinado
anteriormente, sino que adems
hay menos protena.
Para confirmar estos resultados se realiz un ensayo de Western Blot con anticuerpos especficos para Calcio-ATPasa y Calsecurina que mostraa idnticos resultados.

99

Las balsas lipdicas son elementos de membrana ricos en colesterol y esfingolpidos, que son
en detergentes.
Por ello, si
homogeneizamos
la membrana
muscular
en un medio
Iinsolubles
SOLATI ON
OF LI PI D RAFTS,
AS
TRI TON X-100-RESI
STANT
M EM BRANES,
con tritn-X100
y se centrifuga
enAL
un AND
gradiente
de sacarosa,Clas
balsas lipdicas
FROM
M USCLES
OF NORM
DYSTROPHI
Lama2dy
M I CEquedan sobre
el gradiente, viajando a travs de todo este.

Caveolin 3

Tube Top
Normal M uscle

Dystrophic M uscle

La membrana
deldystrophin,
msculo normal
muestra unofsolo
tipo de in
balsas
lipdicas,
mientras que en
As for
the deficiency
laminin-2
Lama2dy
mice
produces
an
increase
in
caveolin-3
and,
therefore,
of
caveolae
in the
msculo distrfico encontramos dos. Si ahora analizamos las diferentes fracciones
del gradiensarcolemma
te, concretamente la presencia de caveolina (protena estructural de rafts), podemos observar
como en el msculo distrfico hay muchas ms poblaciones de rafts.
C.J. Vidal: Targeting of AChE to lipid rafts

Por lo tanto, la patologa distrfica no solo afecta a los perfiles proteicos, sino tambin a la
composicin lipdica de las membranas en relacin a la mayor necesidad de reparaciones que
precisa.

100

Tema 6: Retclo endoplasmatico II


Sntesis de protenas e insercin en la membrana
El retculo endoplasmtico no es una entidad estanca, sino que en funcin del estado celular
va a presentar un mayor o menor desarrollo, relacionado con la produccin de protenas.
Cuando una rata se empieza a intoxicar con barbital se activa el sistema del citocromo p450,
por lo que el retculo se engrosa por la induccin en la sntesis de protenas. En el caso de los
linfocitos B, su estimulacin para la produccin de anticuerpos tambin hace aumentar de
tamao el retculo, ya que la inmunoglobulina va a adquirir su estructura terciaria en el retculo y va a pasar al Golgi, donde se va a obtener la glicosilacin definitiva.
El acoplamiento de las subunidades catalticas y reguladoras de una protena tambin se produce a nivel del retculo endoplasmtico.
La importancia del retculo endoplasmtico para la sntesis de protenas es vital, ya que se estima que alrededor del 30% de todas las protenas (30.000) son sintetizadas en ribosomas
asociados al retculo.

1 Transporte al retculo endoplasmtico


1.1 El pptido lder o pptido seal
Para que una protena se sintetizada en el retculo endoplasmtico precisa portar una etiqueta
conocida como pptido lder o pptido seal cuya funcin es asociar el ribosoma que comienza la traduccin al retculo endoplasmtico rugoso.
El descubrimiento de esta secuencia de aminocidos se produjo en los aos 70, cuando los
experimento de ingeniera gentica permitieron la sntesis de globinas quimricas con secuencias de la -galactosidasa de Escherichia coli. Este experimento revel que la introduccin de
esas secuencias dirigan a la globina hacia el retculo, por lo que permita la asociacin de los
ribosomas a las membranas y la transferencia desde un espacio celular a otro.
El experimento clave para comprender la importancia del pptido seal consisti en introducir
el mensajero de una protena que tiene que ingresar en el retculo, los ribosomas y los materiales necesarios para la sntesis de protenas en un tubo de ensayo. Tras la sntesis se aadi la
fraccin microsomal que contena el retculo y se determin el tamao de la protena.

101

Al mismo tiempo, en otro tubo de ensayo se situaron los mismos componentes, pero aadiendo la fraccin microsomal desde el principio, y se midi el tamao de la protena.

Los resultados indicaron que la protena del primer ensayo era ms grande que la del segundo,
esto se debe a que al no ingresar la protena en el retculo, no se corta el pptido seal. En el
segundo caso se produjo la entrada de la protena al retculo donde inmediatamente se le corto el pptido.
La caracterizacin del pptido lder que dirige a las protenas al lumen del retculo endoplasmtico determin que se trataba de una secuencia N-terminal con un tamao de 25-35 aminocidos, cuya naturaleza se corresponda con la organizacin de un ncleo hidrofbico que
ocupa entre 10-15 aminocidos. Esta secuencia es retirada de la protena al entrar al lumen.

En la actualidad conocemos dos tipos de seales que mandan una protena al retculo; Por un
lado est la secuencia de importacin el retculo, que es el pptido lder mencionado cuya secuencia puede ser:
+

H3N-Met-Met-Ser-Phe-Val-Ser-Leu-Leu-Leu-Val-Gly-Ile-Leu-Phe-Trp-Ala-Thr-Glu-Ala-Glu-Gln-Leu-Thr-Lys-Cys-Gly-Val-Phe-Gln-----

Pero tambin podemos encontrar una secuencia especial de retorno al retculo para aquellas
protenas que son transportadas en las cisternas hacia el Golgi y tienen que regresar, ya que el
transporte es bidireccional. La secuencia se denomina KDEL y se sita en el extremo C-terminal
de todas las protenas solubles del retculo, para que regresen a este si van al Golgi o si han
escapado al citosol. Cuando las protenas son de membrana la secuencia es KKXX.
----Lys-Asp-Glu-Leu-COO- (--KDEL)

102

Aunque las dimensiones del pptido lder son muy variables a lo largo de la escala evolutiva,
presenta siempre una divisin en tres secciones y una serie de caractersticas en comn:
-

Comienza siempre con una metionina (M).


En la primera seccin N-terminal presenta un aminocido con carga positiva como la
arginina (R) o la lisina (K).
La segunda seccin consta de aminocidos muy hidrofbicos como leucina (L) y triptfano (W).
La tercera seccin, muy prxima al punto de corte de la secuencia seal, presenta
siempre un aminocido muy pequeo como glicina (G), alanina (A) o serina (S) en una
posicin inmediatamente anterior al lugar de corte.

1.2 Asociacin del ribosoma al retculo endoplasmtico


La traduccin del mensajero que contiene una secuencia seal para el retculo comienza como
la de cualquier otro. Los 30 primeros aminocidos elongados ya portan el pptido seal, pero
el entorno del tnel del ribosoma los mantienen extendidos hasta que cuando se han traducido los 70-80 primeros aminocidos, la cadena polipeptdica comienza a salir del tnel al entorno citoslico y se pliega espontneamente para formar el ncleo hidrofbico.
La aparicin del ncleo hidrofbico (motivo estructural), en el extremo N-terminal de la cadena polipeptdica en crecimiento, es la seal necesaria para que el conjunto sea reconocido por
la partcula de reconocimiento de la seal (SRP), que se une al polipptido e interacciona con
el ribosoma, deteniendo la traduccin.

103

Ahora la SRP unida al pptido lder es reconocida por el receptor de la partcula de reconocimiento de la seal (SRPR), que se encuentra adosada a un translocon cerrado en la membrana
del retculo, lo que provoca la induccin de la actividad GTPasa que ambos tienen produciendo
la hidrlisis del GTP unido y cambiando de conformacin. La SRP es liberada y el translocon se
abre para permitir la entrada del polipptido que reanuda su traduccin.
Inmediatamente despus de entrar el extremo N-terminal del polipptido, una peptidasa de la
seal corta el extremo con el pptido lder y el polipptido va entrando conforme se sintetiza,
al mismo tiempo que la oligosacaril transferasa va N-glicosilando las asparraginas (N) cada vez
que reconoce una secuencia NXS/T.
Finalmente, las chaperonas ayudan al plegamiento de la protena y al terminarse la traduccin
el ribosoma se disocia y el translocon se cierra.
1.2.1 Partcula de reconocimiento de la seal (SRP)
La partcula de reconocimiento de la seal (SRP) es una riboprotena (ARN + protenas) formada por una molcula de ARN y 6 protenas diferentes:
-

P54 es un monmero que reconoce al ncleo hidrofbico del pptido seal.


P19 es un monmero.
El heterodmero P68/P72 es necesario para la translocacin de la protena.
El heterodmero P9/P14 que interacciona con el ribosoma para impedir la traduccin.

Esta estructura en horquilla le permite unirse al ncleo hidrofbico e introducirse en el ribosoma. Si observamos su geometra y orientacin espacial por difraccin de rayos X podemos
observar el hueco hidrofbico que sirve para la unin de la riboprotena con el ncleo hidrofbico.
Adems, el pptido lder presenta un resto con carga positiva en su primera seccin (R/K) que
se ha relacionado con la correcta fijacin del motivo a la SRP. Si este aminocido es retirado, el
reconocimiento ya no es bueno.

104

La SRP es una riboprotena con actividad GTPasa que tiene un punto isoelctrico muy alto
(carga positiva a pH fisiolgico), esto se debe a que precisa interaccionar con polinucletidos
(que tienen carga negativa a pH fisiolgico), al igual que las histonas.
1.2.2 Componentes de los translocones y protenas asociadas
Aunque todo parece indicar que existe ms de una clase de translocn en el retculo, se ha
confirmado que el translocn Sec 61 participa en el transporte co-traduccional. Esta relacin
se estableci a partir de la utilizacin de agentes que causaban crosslinking qumico entre el
mensajero y el translocon, dando lugar a enlaces covalentes que paralizaban el proceso, lo que
permita su observacin.

Si observamos su tamao relativo con respecto al ribosoma podemos hacernos una idea de lo
grande que es el ribosoma. Estas protenas del translocon Sec 61 presentan una gran homologa a lo largo de la escala evolutiva.
El translocn Sec61, al menos a nivel del retculo endoplasmtico, est formado por 4 unidades
formadas por tres pptidos denominados Sec61, Sec61 y Sec61, por tanto doce pptidos
en total que se organizan para formar un barril que permite la existencia del canal.
Otro conjunto de protenas que pueden formar el translocn, esta vez implicadas en el transporte post-traduccional son la Sec 62, 63, 71, 72 y Ssh1. Estas protenas mantienen una gran
homologa entre ellas.
Cuando una cadena polipeptdica presenta en su extremo N-terminal un pptido lder, este es
reconocido por el complejo del translocn (doble sentido) y es introducido al lumen del retculo donde se le retira la seal, a menos de que esta se encuentre interna en la secuencia.
Hasta ahora se pensaba que aquello que
entraba en el retculo ya no poda abandonarlo, pero esto se ha desmentido ya
que depende del translocn que participa, por ejemplo en el caso de ERAD. En
cualquier caso, para que una protena
entre en el retculo mediante transporte
post-traducional es necesario que algo
tire de ella. Las chaperonas BiP son protenas que, mediante el gasto de ATP, van
105

a pivotar entre conformacin de alta y baja afinidad para tirar de la protena e introducirla en
el lumen del retculo.
Asociado a cualquiera de los dos translocones se encuentran tambin las siguientes
protenas:
-

Protena de membrana asociada a la


cadena en translocacin (TRAM,
Translocating chain-associated membrane protein).
Protena asociada a la translocacin
(TRAP, Translocation-associated protein) que est formada por cuatro
subunidades () que puede actuar
como una tapadera (LD).
Complejo oligosacariltransferasa.
Peptidasa de la seal.

1.3 Transporte post-traduccional en Escherichia coli


El transporte post-traduccional en mamferos es muy similar al que se produce en bacterias. El
translocon de E. coli est formado por 4 subunidades SecA/Y/E/G, donde SecA tiene una funcin anloga a la chaperona BiP, es decir, presenta conformacin de alta afinidad unida a ATP y
baja afinidad cuando no lo tiene.
El proceso comienza con el reconocimiento de la seal en la protena por SecA que estimula la
entrada de ATP y el cambio a la conformacin de alta afinidad que agarra y empuja la protena
hacia el translocon.

Cuando se desarrolla la actividad ATPasa de SecA se produce el cambio de afinidad y se libera a


la protena para iniciar un nuevo empuje.

1.4 Respuesta a protenas mal plegadas (UPR)


La existencia del control de calidad de las protenas en el retculo endoplasmtico obliga a que
estas estn perfectamente plegadas en su estructura tridimensional ptima antes de partir al
aparato de Golgi.

106

ribosome
station fu
proteins p
TM segm
the transl
EM imag
complex
ribosoma
respectiv
by LD. Im
TRAP (i.
Note the
which ha
channel t
passes. M
only a de
dimers . I
include th
assembly

Este control de calidad va a depender en gran medida de los niveles de calcio, ya que el retculo es uno de los de los depsitos ms importantes para la homeostasis del calcio.
El retculo es un lugar donde hay una gran concentracin de chaperonas, ya que es el lugar donde se produce el plegamiento de la protena, y en muchos casos las chaperonas
que deciden si una protena puede o no partir al Golgi van a ser ligantes de calcio. Dos
chaperonas que van a ser muy importantes para el correcto plegado de las protenas son:
-

Disulfuro ismeras (DSI) cuya funcin consiste en establecer los enlaces disulfuro
correctos entre las cistenas (C) para que una protena adquiera su conformacin
final. Este proceso sucede mediante prueba y error hasta que la protena alcanza
el punto de energa interna mnima o mxima estabilidad.
Cis-Trans prolil isomerasa es una enzima cuya funcin es la de romper la prolina
(P) y voltearla. La prolina (P) es un aminocido con un gran anillo pentagonal rgido
que puede plantear problemas estricos a la hora de que una protena adquiera
conformaciones helicoidales, por ello en muchas ocasiones se hace necesaria la
isomerizacin de Cis a Tans mediante la ruptura del enlace.

La respuesta a protenas mal plegadas (UPR, Unfolded protein response) es el sistema que
tiene la clula a modo de alarma ante una aumento de protenas mal plegadas en el retculo
endoplasmtico.
El estudio profundo de este tipo de alarmas ha revelado la existencia de tres vas de sealizacin ante el aumento de protenas mal plegadas en el lumen del retculo endoplasmtico:
-

En la membrana del retculo hay unos receptores Ire con un extremo citoslico y un
extremo mirando al lumen que en condiciones normales (bajo nmero de protenas
mal plegadas) se encuentran unidos a la chaperona BiP.
Cuando la cantidad de protenas mal plegadas aumenta, las cantidad de chaperonas
BiP unidas al receptor disminuye, porque estas son necesarias para colaborar con el
plegamiento, y esto provoca la dimerizacin de los receptores que sufren
una fosforilacin cruzada por su actividad quinasas en el lumen, y comienzan a desarrollar una actividad nucleasa en el dominio citoslico.
En el citosol hay un mRNA inmaduro
(no competente para la traduccin)
que gracias a la accin nucleasa de los
receptores es cortado y empalmado
(Splicing) comenzando la traduccin
de factores de transcripcin de la expresin de chaperonas que van al ncleo.

107

La activacin de otros tipos de receptores llevan a un aumento de factores de trascripcin asociados a la expresin de las protenas del ERAD que dirige a los pptidos
mal plegados al citosol donde son degradados por el proteasoma.
Otros receptores sensibles a la cantidad de protenas mal plegadas producen la fosforilacin de factores de traduccin que detienen o ralentizan la sntesis de protenas. En
funcin del nivel de fosforilacin se ralentizar ms la traduccin.

Si despus de activarse estas alarmas la situacin no vara la clula activa la va apopttica


como se produce en el caso de la -sinucleina o cuando la cantidad de protenas -amiloide va
aumentando, formando fibras y agregados que disparan la apoptosos con la consecuente prdida de neuronas colinrgicas y el desarrollo de Alzheimer.

1.5 Topologa de las protenas de membrana


Uno de los grandes problemas de la biologa molecular fue la topologa de las protenas de
membrana. Se precisaba un modelo para explicar como estas protenas se disponan en la
membrana quedando con los extremos hacia un lado u otro si el primer extremo en entrar al
retculo era siempre el N-terminal.
Atendiendo a su disposicin en la membrana podemos clasificar a las protenas de membrana
en cuatro clases fundamentales:
-

Las protenas de tipo I (Glicoforina, LDLR, protena HA de la gripe, receptor de insulina,


receptor de hormona del crecimiento) son aquellas que presentan el extremo Nterminal en el lumen del retculo, del Golgi, o en el espacio extracelular (considere el
transito de protenas a travs de los compartimentos celulares), y el extremo Cterminal en el citosol. Estas protenas han perdido su pptido lder.
Las protenas de tipo II (receptor de asialoglicoproteina, receptor de transferrina, precursor de sacarosa-isomaltosa, galactosiltransferasa del Golgi, sialiltransferasa del Golgi y protena HN de la gripe) son aquellas que presentan el dominio N-terminal en el
citosol, mientras que el dominio C-terminal se ha introducido en el compartimento
celular o en el exterior celular.
Las protenas de tipo III (Citocromo P450) son aquellas cuyo extremo N-terminal apenas entra en lumen del compartimento celular en el que se encuentre, presentando la
parte mayoritaria de la protena en la seccin C-terminal externa.
Las protenas de tipo IV (Receptores acoplados de protenas G, transportadores de
glucosa, canales de calcio dependientes de voltaje, bombas de molculas pequeas
ABC, canal CFTR de cloruro, translocon Sec61, conexina) son aquellas que atraviesan
la bicapa en varias ocasiones quedando el extremo C-terminal fuera cuando el nmero de veces es impar o dentro cuando es par, en cuyo caso quedan ambos extremos en
la misma cara.

108

1.5.1 Incorporacin de protenas de tipo I en la bicapa


La sntesis de protenas de membrana del tipo I comienza con la asociacin del ribosoma que
ha empezado a sintetizar la protena con el translocon. El extremo N-terminal de la secuencia
de aminocidos entra en el lumen del retculo en donde se le retira inmediatamente la seal
de entrada.
La traduccin continua hasta que una secuencia de parada de la transferencia entra en el
translocn y debido a su naturaleza muy hidrofbica se detiene la transferencia y espontneamente difunde hacia la membrana formando una hlice. Esto provoca el cierre del translocn, por lo que la traduccin continua pero dejando la secuencia de aminocidos fuera del
lumen.

Incorporation of transmembrane proteins in the bilayer

1.5.2 Incorporacin de protenas de tipo II, III y IV en la bicapa


La sntesis de protenas del tipo II, III y IV comienza como la anterior en el canal del translocn,
pero la presencia de una serie de aminocidos con carga positiva (K y A) impiden la entrada
del extremo N-terminal por el canal, quedando desplazado, mientras el resto de la protena
sigue entrando.
Cuando aparece una secuencia hidrofbica, esta se atora en el translocon y difunde a travs de
la bicapa, mientras que el ribosoma sigue introduciendo el extremo C-terminal a travs del
translocon, lo que provoca la disposicin de la protena invertida.

La seal de cargas positivas que impide la entrada de parte de la protena debe situarse antes de la seal de
detencin de la transferencia para
producir la inversin, en caso contrario el curso del polipptido ser el
normal ya que se le impedir la entrada a la secuencia que venga detrs de
la secuencia hidrofbica (extremo Cterminal).
109

Alternancia de secuencias para la produccin de los diferentes tipos de protenas


A partir de las combinaciones de secuencias hidrofbicas, aminocidos con carga positivas y
secuencias de parada de la transferencia podemos establecer como queda cada fraccin de
una protena de membrana segn su tipo.

El estudio de estos motivos en las protenas se realiz a travs de el establecimiento de los


perfiles de hidrofobicidad de una protena. Estos se establecen a partir de una secuencia de
aminocidos sobre la que se va calculando (relativamente) cual es el grado de hidrofobicidad
de los aminocidos y del entorno que van generando en la secuencia.
La representacin de esos valores en un grafica otorga altos valores a aquellos lugares en los
que es muy probable que contenga una de estas regiones transmembrana que quedan atoradas en los translocones.

110

Tema 7: Glicosilacion de protenas en el retclo endoplasma tico y en las cisternas del Golgi
La Glicosilacin es el proceso de adicin de restos de azcar a las protenas, pasando a denominarse glicoprotenas. Se trata de un proceso que se produce en el retculo endoplasmtico,
en el Golgi y en el citosol.

1 Las glicoprotenas
Las glicoprotenas son protenas que tienen unidos, de modo covalente, uno o varios hidratos
de carbono (oligosacridos generalmente). A diferencia de los proteoglicanos, la proporcin de
azcares es mucho menor.
Existen muchos tipos de glicoprotenas
que pueden ser de membrana o de
secrecin:
-

Las glicoprotenas de membrana desempean funciones relacionadas con la adhesin y el


reconocimiento intercelular. En
la mayor parte de los casos la
Glicosilacin de las protenas de
membrana se producir en el
dominio extracelular de la
membrana.
Las glicoprotenas de secrecin
son solubles y representan la
mayor parte de las protenas
del plasma sanguneo.

1.1 Funciones de la glicosilacin de protenas


Los azcares de las glicoprotenas desempean varias funciones destacadas, en muchos casos
por si como hidratos de carbono, y en otros por ser reconocidos mediante una protena (lectina) de modo especfico. Las lectinas son protenas que reconocen especficamente azcares, al
mismo tiempo que tienen una funcin proteica.
Los hidratos de carbono son molculas hidroflilicas que van a quedar proyectadas hacia la
superficie de la protena de una manera mvil (enlaces no fijos). Esto les permite ejercer muchas funciones como:
-

Proteger de la protelisis, ya que los hidratos de carbono no son sustrato de la proteasa. Por ejemplo, la fibronectina glicosilada de la lmina basal es ms resistente a la
accin de proteasas.
Ayudar al plegamiento correcto como funcin estructural ya que los hidratos de carbono N-unidos son aadidos durante la sntesis de la cadena polipeptdica determi111

nando en gran medida el modo de plegamiento de la protena. Los oligosacridos Ounidos pueden estabilizar la conformacin plegada de una protena disminuyendo su
libertad conformacional o reduciendo su flexibilidad. Los oligosacridos tambin son
marcadores del mecanismo de plegamiento en el retculo, asegurando que las
protenas no abandonen el retculo
hasta que estn plegadas correctamente
(Ciclo
calsecuestrina/calreticulina).
Direccionamiento a su destino,
por ejemplo, los restos de manosa-6-fosfato dirigen a la protena
a los lisosomas.
Determinar la estabilidad en la
clula (p53)
Determinar la permanencia en la
sangre (Ceruloplasmina)
Reconocimiento en superficie celular (Leucocitos, espermatozoides, bacterias, virus, toxinas).

2 La glicosilacin de protenas
2.1 Introduccin a los glcidos
Antes de comenzar con el proceso de glicosilacin realicemos un repaso observando la tabla
Glicosilacin de protenas
en la que se muestran sus nombres y la representacin utilizada.
Se ha creado una simbologa estndar para la representacin de azcares:
-

Las hexosas se representan con


crculos.
Las N-acetilhexosaminas con un
cuadrado.
Las hexosaminas con un cuadrado divido diagonalmente en
dos colores.
Los cidos urnicos tambin se
representan con un cuadrado
divido.

El color determina de que azcar han derivado, por ejemplo, la glucosa se representa con color
azul, por lo que sus derivados tendrn color azul. Adems tambin encontramos los cidos
silicos como el cido N-acetilneuramnico.
Recordemos tambin que las aldohexosas son azcares de seis carbonos epmeros de la glucosa, como la manosa y la galactosa. Las aldopentosas como la xilosa son azcares de cinco carbonos epmeros de la ribosa.
112

El cido N-acetilneuramnico (cido silico) es un azcar cido que tiene un grupo carboxilato
(carboxilo, procedente de la oxidacin del ltimo carbono) y por tanto carga negativa que preGlicosilacin
deelprotenas
senta
glicerol como uno de sus sustituyentes.

2.2 Donadores activados de azucares para la glicosilacin de protenas


Los donadores activados de los restos azcar para la sntesis de la porcin sacardica de las
glicoprotenas son los nucletidos-azcar. Estos nucletidos de azcar presentan el carbono
anomrico del azcar activado por su unin a un nucletido, generalmente un nuclexido difosfato (No para cidos silicos) mediante un enlace ester fosfato.
Cada uno de estos precursores nucletido-azcar consta
de un azcar unido a un nucletido disinto:
-

UDP
o
o
o
o
o
GDP
o
o

Glucosa (UDP-Glc)
Galactosa (UDP-Gal)
N-acetilglucosamina (UDP-GlcNAc)
N-acetilgalactosamina (UDP-GalNAc)
Xilosa (UDP-Xyl)
Manosa (GDP-Man)
Fucosa (GDP-Fuc)
113

CMP (citosina monofosfato)


o cido N-acetilneuramnico (CMP-NeuAc)

Estos nucletidos-azcar se sintetizan en el citosol mediante una reaccin general de condensacin entre un azcar fosfato y generalmente un nucletido trifosfato (NTP) catalizada una
NDP-azcar pirofosforilasa dando lugar a un nucletido-azcar y PPi (hidrolizado por una pirofosfatasa para que la reaccin sea exergnica e irreversible).

2.3 Introduccin a la N-glicosilacin y la O-glicosilacin


Los azcares de las glicoprotenas se pueden unir a estas mediante dos tipos de enlaces:
-

El enlace N es aquel que se produce por la unin al grupo amida de una asparagina
(N). Se habla de N-glicosilacin y azcares N-unidos que suelen ser grandes, complejos
y ramificados.

El enlace O es aquel que se produce por la unin al oxgeno del grupo hidroxilo de la
cadena lateral de una serina (S) o treonina (T). Se habla de O-glicosilacin y azcares
O-unidos que suelen tener entre 1-4 restos de oligosacrido.

114

Esto diferencia a las glicoprotenas de los proteoglicanos que presentan largas cadenas de polisacrido O-unidas.
Vemos el ejemplo de la glicoforina glicosilada (N y O-glicosilada) que presenta todos los restos
de glicosilacin en el dominio externo de membrana.

Otro ejemplo de la importancia de la glicosilacin es la eritropoyetina (EPO), una hormona


secretada por los riones cuya funcin es la estimulacin de la produccin de eritrocitos. La
EPO es una glicoprotena de 165 aminocido que presenta N-glicosilacin en tres restos de
asparagina (N) y O-glicosilacin en una serina (S). La porcin de hidratos de carbono representa un 40% de su peso y su funcin es la de evitar que la hormona sea retirada prematuramente
de la sangre.
La EPO se utiliza en clnica
para tratar anemias provocadas por la quimioterapia contra el cancer. Se obtiene como
un recombinante para uso
teraputico en un tipo celular
capaz de glicosilar.
Tambin es usada en el mundo del deporte ya que al aumentar el hematocrito, aumenta la capacidad de transporte de oxgeno en la sangre
y el rendimiento deportivo,
pero se puede distinguir la
EPO natural de la recombinante analizando el patrn de
glicosilacin.

115

3 El proceso de N-glicosilacin y el plegamiento en el retculo


La N-glicosilacin
un proceso que se inicia exclusivamente en el retculo endoplasmtico y
Glicosilacin de es
protenas
continua en el aparato de Golgi, a
diferencia de la O-glicosilacin
que segn el tipo se iniciara en el
retculo, en el Golgi o en el citosol.
Esto supone que las protenas
que se van a N-glicosilar son
aquellas que se sintetizan en el
retculo endoplasmtico rugoso a
travs de ribosomas asociados al
retculo. Estas protenas van a
sufrir, por tanto, cuatro tipos
principales de modificaciones
post-traducionales:
-

Glicosilacin (retculo y Golgi).


Formacin de puentes disulfuro (retculo).
Plegamiento y ensamblado de subunidades para protenas multimricas (retculo).
Cortes proteolticos (retculo, Golgi y vesculas de secrecin).

Los oligosacridos N-unidos solo se pueden incorporar a restos de asparagina (N) que estn
localizados en la secuencia consenso:
-Asn-X6-Ser/Thr- (-NXS/T-)
Por lo tanto podemos identificar cuales son los sitios de posible N-glicosilacin con un vistazo a
la secuencia de la protena, pero la utilizacin de estos sitios depender entre otras cosas de
la estructura de la protena y del tipo celular en que se exprese.
Todos los oligosacridos N-unidos
tienen en comn un pentasacrido
central o pentasacrido nuclear
formado por 5 restos monosacardicos que constan de dos restos de Nacetilglucosamina (GlcNAc) y tres
restos de manosa (Man). Estos
restos se encuentran unidos a otros
dando lugar a la gran diversidad de
oligosacridos N-unidos que podemos encontrar de manera natural.

Cualquier aminocido menos la prolina (P)

116

3.1 La formacin del oligosacrido precursor


El proceso de la N-glicosilacin comienza con la sntesis de un oligosacrido de 14 restos, denominado oligosacrido precursor u oligosacrido nuclear (core), sobre el dolicol fosfato, que
una vez completo es transferido en bloque a la protena. El oligosacrido precursor est conservado en eucariotas en general (plantas, animales y hongos).
Este oligosacrido de 14 restos est formado por dos restos de N-acetilglucosamina unidas por
enlaces 1,4, nueve restos de manosa unidas por enlaces 1,2 1,3 y 1,6, y tres restos de
glucosa unidos por enlaces 1,2 y 1,3. Generalmente se abrevia la composicin como G3M9.
Si analizamos estructuralmente el oligosacrido lo ms cercano a la protena son los dos restos
de N-acetilglucosamina (GlcNAc a y b) unidos por enlaces 1,4. A continuacin la primera manosa (c) es un punto de bifurcacin del que parten dos ramas:
-

La rama A con la siguiente


manosa (d) unida por enlace
1,3 y que termina con los
tres restos de glucosa (l, m y
n).
Las ramas B y C que parten de
la siguiente manosa (e) unida
por enlace 1,6. Esta manosa
(e) es un nuevo punto de bifurcacin que da lugar a la
rama B por enlace 1,3 a la
siguiente manosa (h), y la rama C por enlace 1,6 a la siguiente manosa (j).

Los enlaces entre las manosas no ramificadas son 1,2, las primeras dos glucosas de la rama A
estn unidas por enlace 1,3 (sensibles a glucosidasa II) y la ltima a travs de enlace 1,2
(sensibles a glucosidasa I).
El dolicol fosfato sobre el que se sintetiza el oligosacrido precursor es un lpido especializado
de la membrana del retculo endoplasmtico de carcter isoprenoide
formado por un nmero variable de
unidades de isopreno (11-24 unidades
en funcin de la especie). Este lpido
acta como transportador y el azcar
va a quedar unido al grupo fosfato.
Aunque la ruta de sntesis del oligosacrido precursor comienza con el dolicol fosfato, este
quedar unido a travs de un puente pirofosfato (grupo pirofosforilo) por lo que en muchos
casos se hablar del dolicol pirofosfato.

117

El oligosacrido precursor de 14 restos se sintetiza en la membrana del retculo endoplasmtico por la adicin sucesiva (1 by 1) de los restos de monosacridos, gracias a enzimas de membrana.
El proceso comienza en la cara citoslica del retculo y termina en la luz, siendo los dadores
monosacardicos activos en la cara citoslica UDP-GlcNAc y GDP-Man, mientras que los de la
cara luminal sern los dolicoles fosfato-azcar (derivados del dolicol fosfato y un azcarnucletido activado), capaces de cambiar su orientacin en la membrana.
1) Partiendo desde el dolicol fosfato en la cara citoslica del retculo, la primera reaccin
que sucede en la sntesis del oligosacrido precursor es caracterstica y consiste en la
transferencia de la fosfo-N-acetilglucosamina sobre el dolicol fosfato desde la UDPGlcNAc, con la liberacinn de UMP. Esta reaccin es caracterstica porque a diferencia
de las restantes se transfiere al monosacrido y el grupo fosfato, establecindose el
puente pirofosfato sobre el dolicol.
2) La segunda reaccin consiste en la adicin de la segunda unidad de GlcNAc utilizando
como donador la UDP-GlcNAc y liberando UDP.
3) En tercer lugar, mediante 5 reacciones consecutivas se aaden 5 restos de manosa a
partir de GDP-Man.
4) Una vez aadidas las manosas se produce un cambio de orientacin del dolicol fosfato
en la bicapa que transloca el oligosacrido en sntesis a la cara luminal del retculo mediante la participacin de una enzima tipo translocn.
5) Una vez en el lumen se aaden los 4 restos de manosa restantes, pero en este caso el
donador es el dolicol fosfato-manosa, que en la cara citoslica recibi el azcar a partir de su nucletido-azcar.
6) Finalmente se aaden las 3 glucosas a partir de dolicol fosfato-glucosa, tambin procedente de su nucletido-azcar.

118

3.2 Transferencia del oligosacrido precursor


Una vez sintetizado el oligosacrido precursor sobre el dolicol fosfato, el siguiente paso consiste en su transferencia a la protena con una asparagina (N) que pueda ser N-glicosilada en una
cadena peptdica en crecimiento en el retculo endoplasmtico.
La enzima que cataliza la transferencia del oligosacrido precursor es la oligosacaril transferasa (OST) y lo que transfiere es el oligosacrido precursor a la protena dejando el dolicol pirofosfato en el lumen del retculo.
La oligosacaril transferasa (OST) es una protena compuesta por diferentes unidades en funcin del la especie estudiada. En humanos la enzima est compuesta por 7 subunidades (Riboforina II, OST48, Riboforina I, DAD1, STT3A/B,
OST4 y N33/Tusc3 o IAP) cuya subunidad cataltica es STT3 (que puede ser una de las dos isoformas A y B).
Esta protena se sita en la cara luminal del retculo a la espera de que una protena muestre un dominio de Nglicosilacin para actuar.

Ahora este dolicol pirofosfato se vuelve a translocar a la cara citoslica del lumen donde una
fosfatasa hidroliza el enlace difosfato, reciclando el dolicol fosfato para volver a aceptar una
unidad de fosfo-N-acetilglucosamina.

En la imagen se han resaltado 5 de los restos del oligosacrido que forman el pentasacrido
nuclear. El posterior tratamiento de los oligosacridos N-unidos (todos empiezan as) en el
retculo y en el Golgi dar lugar a los distintos oligosacridos unidos, pero siempre conservando el pentasacrido.
119

Es muy importante remarcar que la adicin de este oligosacrido precursor de 14 restos durante la sntesis proteica va a afectar en gran medida al plegamiento del polipptido.
El estudio de este proceso se ha venido realizando mediante un antibitico denominado tunicamicina que bloquea la primera etapa de la sntesis del oligosacrido precursor, es decir, la
adicin de fosfo-N-acetilglucosamina y por lo tanto afecta a la sntesis de todos los oligosacridos N-unidos. Se trata de una anlogo estructural del azcar-nucletido UDP-Nacetilglucosamina necesario.

Otro de los antibiticos utilizados es la bacitracina, un compuesto que impide la regeneracin


del dolicol fosfato a partir del dolicol pirofosfato.

3.3 Modificaciones generales sobre el oligosacrido precursor


La adicin del oligosacrido precursor a la asparagina (N) de una protena en el retculo es el
inicio a una serie de procesamientos que se van a dar inicialmente en el retculo y posteriormente en el Golgi.
Partiendo desde la transferencia del oligosacrido precursor de 14 restos (G3M9), las dos primeras modificaciones que va a sufrir en el retculo endoplasmtico va a ser la eliminacin sucesiva de dos de las glucosas de la rama A (2 y 3) por la glucosidasa I y II respectivamente. A
continuacin se podr eliminar la tercera glucosa (3) e incluso una de las manosas (4).
N-glicosilacin

120

La adicin de las glucosas al oligosacrido precursor supone la seal de que este est listo
para ser transferido, por lo que le primer paso tras la transferencia ser su retirada. Adems
la glucosa proximal a la protena va a poder ser retirada y aadida cclicamente, ya que como
veremos va a estar implicada en el plegamiento de la protena.
Si analizamos el procesamiento del oligosacrido asociado al plegamiento de la protena en el
retculo endoplasmtico, debemos recordar que las protenas sintetizadas en este espacio
celular van a sufrir procesos de plegamiento, ensamblado de subunidades y formacin de
puentes disulfuro.
Este procesamiento debe ofrecer la estructura correcta de la protena y por ello, asociado a las
modificaciones del oligosacrido precursor se encuentra el sistema de control de calidad del
plegamiento que nos va a asegurar que las protenas estn correctamente plegadas y ensambladas para partir del retculo al Golgi.

Para que estos procesos de plegamiento se produzcan de manera adecuada destacan tres grupos de protenas chaperonas como la calnexina, calreticulina y BiP, que se van a unir a las protenas segn se sintetizan, evitando la agregacin.
El sistema mejor caracterizado de control de calidad en el retculo va a implicar a calnexina
(CNX), calreticulina (CRT) y la glicosilacin de las protenas.

3.4 Control de calidad en el retculo endoplasmtico


La eliminacin de las dos primeras glucosas del oligosacrido precursor (G1M9) da lugar al
reconocimiento de la protena N-glicosilada por las chaperonas Calnexina (membrana luminal)
o calreticulina (soluble en el lumen), que tambin son lectinas.
El reconocimiento por el dominio lectina de estas chaperonas supone una ayuda para el plegamiento correcto de la protena, al mimos tiempo que se va a retener en el retculo a aquellas
protenas mal plegadas.
Adems Calnexina y calreticulina ayudan con la formacin de los puentes disulfuro de las
protenas recin sintetizadas ya que van a interaccionar con la protena ERp57 (tioldiosulfuro

121

oxidoreductasa o disulfuro isomerasa), aadiendo o quitando los puentes disulfuro hasta que
se alcance el estado de menor energa interna y mxima estabilidad.
A continuacin la glucosa restante es eliminada por la glucosidada II dando lugar a la forma M9
que puede seguir tres caminos distintos:
-

Si la protena est correctamente plegada abandona el retculo en direccin al Golgi


pudiendo perder alguna manosa ms.
Si la protena no se ha plegado correctamente, normalmente se le aadir de nuevo
un resto de glucosa mediante la enzima UDP-glucosa glicoprotena glucosiltransferasa
(UGGT), lo que establece el ciclo Calnexina/calreticulina (ciclo de la monoglucosa) que
la retiene en el retculo para volver a intentar el plegamiento. La UGGT presenta un
dominio C-terminal que transfiere glucosa (cataltico) y un dominio N-terminal detector de restos hidrofbicos expuestos en las protenas mal plegadas. La mayora de
protenas pasan por este ciclo, al menos una vez.
Si la protena no consigue plegarse correctamente, en algunos casos, ser destinada a
un proceso que la va a sacar al citosol donde ser degradada por el proteasoma. Se dice que la protena se va a retrotranslocar o dislocar al citosol y se conoce como ERAD o
degradacin asociada al retculo endoplasmtico. El ERAD est mediado por las protenas similares a manosidasa que estimulan el ERAD (EDEM, ER-Degradation Enhancing 1,2-Manosidase-like protein).

122

La porcin luminal de la calnexina (CNX), anloga a la calreticulina, presenta un dominio de unin a carbohidratos
(domino lectina) que estructuralmente es una sndwich (dos hojas en paralelo), y un brazo largo denominado
brazo P, rico en prolina capaz de interaccionar con la disulfuro isomerasa (ERp57).
Esta disulfuro isomerasa presenta dos centros activos con dos cistenas (-CXXC-)capaces de catalizar el intercambio de puentes disulfuro.

Un hecho a tener en cuenta sobre este sistema de control de calidad es que no solo se va a
poder reglucosilar la forma 9M del pptido precursor, sino tambin formas con menos manosas, siempre y cuando mantengan la manosa aceptora de glucosa en la rama A.

Continuando con el procesamiento del oligosacrido precursor tras el ciclo calnexina/calreticulina, pasado un cierto tiempo, la manosidasa I del retculo endoplasmtico (ER
ManI) va a eliminar la manosa terminal de la rama B dando lugar al oligosacrido M8B.
Esta nomenclatura indica el nmero de manosas y aquella rama que es diferente a las restantes por lo que la siguiente forma en la que se pierde la manosa terminal de la rama C sera la
M7A, ya que la rama A es ms larga que las dos restantes.
123

La presencia del M8B en una protena determina en este caso dos posibles vas para la protena:
-

Si la protena est bien plegada es reconocida por los receptores de carga hacia el Golgi (ERGIC-53, VIPL o VIP36).
Si la protena est mal plegada el oligosacrido es reconocido por las protenas EDEM
que la destina a hacia el ERAD.

Las protenas con M8B puede continuar sufriendo ms prdidas de manosas dando lugar a
otras formas como M7A, M6 y M5, que van a ser reconocidas por la protena OS-9 y destinadas
al ERAD.

* Anexo I: Destino de las protenas en funcin del oligosacrido N-unido y el plegamiento.


Todas estas protenas encargadas de reconocer la forma del oligosacrido son lectinas y como
tales reconocen un azcar concreto y van a poder encaminar a una protena hacia una va concreta en funcin de los restos que presente el oligosacrido precursor.

Esto se debe a la afinidad que tienen las lectinas por cada oligosacrido. Hay lectinas que solo
unen un oligosacrido concreto, siendo muy selectivas. Pero otras pueden unirse a varios diferentes siendo selectivas, pero admitiendo una cierta variabilidad.

124

La extensa desmanosilacin que tiene lugar en el retculo endoplasmtico da lugar a dos seales o propiedades del oligosacrido que dirigen
a la protena marcada a la degradacin:
-

Por un lado, la eliminacin de la manosa


terminal (g) de la rama A, saca a la protena irreversiblemente del ciclo calnexina/calreticulina, ponindose fin a la
fase de plagado.
La eliminacin de la manosa terminal (k)
de la rama C, expone a la manosa (j)
unida por enlace 1,6 que puede ser reconocida por OS-9 para derivar la protena ERAD.

3.4.1 Maquinaria del ERAD


En la membrana del retculo endoplasmtico se sitan los complejos ERAD, encargados de
transporta a las protenas mal plegadas desde el lumen del retculo al citosol, para aadirle
ubiquitina y posteriormente ser degradadas por el proteasoma.
El proceso de salida de la protena mal plegada al citosol desde el retculo se denomina retrotranslocacin o dislocacin debido a que se ha denominado translocacin a la entrada.
La maquinaria del ERAD en mamferos est compuesta por una serie de protenas que van a
llevar a las glicoprotenas a su degradacin. Estas protenas son:
-

Lectinas OS-9 y EDEM, que dirigen a las protenas mal plegadas al complejo ERAD.
SEL1L, Derlina-2/3 y BiP, que participan en la interaccin entre las lectinas y el translocon.
HRD1, una ligasa de ubiquitina que aade los restos al polipptido que la va
atravesando.
p97 es una ATPasa que impulsa la retrotranslocacin.
El proteasoma que digiera
a la protena una vez que
se encuentra en el citosol.

Tambin participa en este proceso la protena ERdj5, una disulfuro isomerasa que elimina los
puentes disulfuro para favorecer la salida al citosol.

3.5 Chaperonas del retculo endoplasmtico


Las chaperonas calnexina y calretculina del retculo endoplasmtico ayudan en gran medida al
plegamiento de las protenas, pero adems va a haber otras chaperonas, denominadas en muchos casos chaperonas hidrofbicas que van a reconocer secuencias de 8-12 aminocidos
hidrofbicos expuestos en protenas mal plegadas.

125

La chaperona BiP de la familia de las


HSP70 del retculo favorece el plegamiento de las protenas con ciclos de
plegado y liberacin que mantiene a las
protenas mal plegadas en el retculo
endoplasmtico a partir del gasto de
ATP.
Entre las funciones de BiP en el retculo podemos destacar:
-

Ayuda al plegamiento en el retculo de las protenas mal plegadas y mantiene a las


protenas mal plegadas en el retculo.
Dirige a las protenas mal plegadas al ERAD
Es un regulador de protenas transductoras transmembrana del estrs del retculo
endoplasmtico (PERK, IRE1 y ATF6).
Interviene en la translocacin post-traducional en levaduras.
Relacionada con los procesos de apoptosis, ya que interacciona con la caspasa 7 del
retculo e impide la activacin de protenas pro-apoptticas de la familia Bcl2, como
Bax.
Hasta ahora solo hemos hablado del reconocimiento
de las protenas glicosiladas por las lectinas (EDEM y
OS-9) que las dirigen al ERAD, pero tambin existe
complejos ERAD para protenas no glicosiladas en
los que van a intervenir las chaperonas hidrofbicas
como BiP.
La chaperona BiP es capaz de dirigir a los polipptidos mal plegados hasta los complejos de retrotranlocacin donde interaccionan con HERP (anloga a
SEL1L). Adems tenemos los elementos comunes
como HRD1 (ligasa de ubiquitina), p97 (ATPasa),
derlina-1 y el proteasoma.

3.6 Respuesta a protenas mal plegadas (UPR)


Un proceso importante en relacin al plegamiento en el retculo endoplasmtico es la denominada respuesta a protenas mal plegadas (UPR, Unfolded protein response) que fue introducido
en el tema anterior.
En ciertas situaciones se puede producir una disfuncin del retculo en la que se da un desequilibrio entre la capacidad de plegar protenas del orgnulo y el nmero de protenas que
debe plegar. Estas son situaciones como la falta de glucosa e hipoxia, que desencadenan una
falta de energa, o infecciones virales y problemas con la regulacin del calcio. El envejecimiento tambin es un factor que afecta a la capacidad de plegar las protenas que presenta el
retculo.

126

El retculo chequea el nivel de plegamiento y cuando se acumulan protenas mal plegadas se


pone en marcha la UPR, un complejo sistema de sealizacin mediado por iniciado por tres
receptores denominados genricamente como transductores transmembrana del estrs del
retculo endoplasmtico:
-

Kinasa dependiente de inositol 1(IRE1, Inositol requiring kinase 1)


Kinasa semejante a PKR del retculo (PERK, PKR7-like ER kinase)
Factor de transcripcin activante 6 (ATF6, Activating transcripction factor 6)

La UPR consta de tres procesos o tipos de respuesta que son la adaptacin, alarma y apoptosis:
-

Durante la fase de adaptacin la clula intenta restablecer el equilibrio en el plegamiento mediante:


o La inhibicin de la traduccin de un modo general para reducir el nmero de
protenas a plegar.
o El aumento de la expresin de chaperonas para aumentar la capacidad de
plegamiento del retculo
o El aumento de la degradacin de protenas mal plegadas por el ERAD.
La fase de alarma se produce cuando los esfuerzos de la clula por paliar el desequilibrio fallan. Esta fase se caracteriza por la reduccin del bloqueo de la traduccin y una
reduccin de expresin de las protenas pro-supervivencia (anti-apoptticas) como
Bcl2.
Finalmente la clula entra en apoptosis o autofagia.

3.6.1 Regulacin de los receptores por BiP


Los transductores transmembrana del estrs del retculo endoplasmtico se encuentran en
condiciones normales unidos a la protena BiP, impidiendo su activacin. Cuando el nivel de
protenas mal plegada aumenta, BiP es desplazada de los receptores y estos comienzan a
dimerizar y activarse provocando la UPR.
El modo de actuacin de IRE1 se explic detalladamente en el tema anterior, pero a modo
de resumen, recordemos que se encuentra
unido a BiP en la membrana del retculo.
Cuando se producen condiciones de estrs
que desplazan a BiP, dimeriza y sufre una
fosforilacin cruzada, comenzando a desarrollar actividad RNA-endonucleasa en el dominio citoslico. Esta actividad permite el splicing citoslico del pre-mRNA de XBP1
(XBP1u), una protena de unin a la caja X
(XBP1s) y por tanto un factor de transcripcin
que va al ncleo para aumentar la expresin

Protein kinasa activada por ARN de doble cadena (PKR, double-stranded RNA-activated protein kinase)

127

de chaperonas, protenas implicadas en la degradacin de ERAD y protenas implicadas en la


apoptosis como CHOP.
La activacin de PERK tambin est medida por la separacin de la protena BiP en respuesta a un aumento de
protenas mal plegadas en el retculo, lo que permite su
dimerizacin y el desarrollo de su actividad fosforilasa
sobre el factor eucaritico de iniciacin de la traduccin
eIF2, inactivndolo y produciendo un bloqueo general
de la traduccin.
A este bloqueo escapa el factor de traduccin activante 4
(ATF4), que es traducido por un proceso independiente
de CAD, por lo que puede ir al ncleo e inducir la expresin de genes que participan en la UPR.

El ATF6 es el nico de los tres receptores que no dimeriza. Cuando la


protena BiP es desplazada se desplaza hacia el Golgi, donde sufre
dos cortes protelticos por la S1P y S2P, que liberan un fragmento
citoslico (ATF6f), que es en s un factor de transcripcin que induce
la expresin de los genes propios de la va.
El mecanismo de actuacin de ATF6 es anlogo al de otras protenas, como las implicadas en el metabolismo del colesterol donde
SREBP, que se situaba en el retculo, se desplazaba hacia el Golgi
donde sufra los corte proteolticos que liberaban el factor de
transcripcin que viajaba al ncleo para expresar las protenas
necesarias en la sntesis de colesterol.

La respuesta a protenas mal plegadas est implicada en determinadas enfermedades que


incluyen la diabetes, la progresin tumoral y las enfermedades neurodegenerativas como el
Alzheimer, el Parkinson y la esclerosis lateral amniotrfica (ALS).

3.7 Otras protenas que ayudan al plegamiento en el retculo endoplasmtico


Adems de las chaperonas mencionadas hay otras protenas que tambin colaboran con el
plegamiento en el retculo endoplasmtico, las tiodisulfuro oxidoreductasas (disulfuro isomerasas) y las peptidil-prolil isomerasas.
Las tiodisulfuro oxidoreductasas o protenas disulfuro isomerasas (PDIs) colaboran
con la formacin de los puentes disulfuro
correctos entre los restos de cistena (C) de
las protenas. Estos puentes se forman por
128

la unin oxidativa de dos grupos tiol y por ello para generarlos ser necesario otro puente disulfuro. Los puentes disulfuro son imprescindibles para el establecimiento de la estructura
terciaria y cuaternaria (anticuerpos) de las protenas. Pero como normal general, estos solo se
puede realizar en el lumen del retculo endoplasmtico por lo que solo se van a localizar en
protenas de secrecin y en la porciones exoplsmicas (no citoslica) de las protenas de membrana.
En funcin del estado de la protena disulfuro isomerasa hablaremos de la creacin o disociacin de un enlace disulfuro:
-

Cuando nos encontramos ante un puente disulfuro incorrecto, la encargada de actuar


es la PDI en su forma reducida (SH HS). El grupo tiol de la PDI ataca al puente disulfuro
incorrecto, lo rompe y se forma un puente disulfuro PDI-Cisteina. El grupo tiol de la
protena que ahora queda libre ataca a otro de los puentes disulfuro de la protena, lo
disocia y queda formando un nuevo puente disulfuro. Finalmente el proceso se repite
para liberar la PDI formndose un segundo puente disulfuro intramolecular.

Para formar un puente disulfuro intramolecular de novo, la encargada de actuar es la


PDI en su forma oxidada (S-S). En este caso se produce una ataque desde el grupo tiol
de la protena sobre el puente disulfuro de PDI y se genera uno nuevo. A continuacin
otro grupo tiol de la protena ataca a este puente disulfuro quedando uno nuevo sobre la protena y liberndose PDI reducida (SH-HS).

Las PDIs pueden ser oxidadas desde su forma ditiol gracias a la accin de otras protenas como
ERO1. Estas protenas no saben si un puente disulfuro es correcto o no, simplemente los van
intercambiando hasta que la estabilidad conformacional de la protena es tal, que ya no pueden actuar.

129

Las PDIs son una familia de protenas muy diversas que presentan esta funcin de intercambio
de puentes disulfuro y que pueden presentar uno o varios centros activos, con normalmente,
dos cistenas (C) separados por dos aminocidos cuales quiera.
-CxxCOtra de las protenas necesarias para el plegamiento de las protenas son las peptidil-prolil
isomerasas encargadas de acelerar la isomerizacin Cis-Trans o Trans-Cis de los enlaces peptdicos donde el segundo aminocido es una prolina (P) en regiones no plegadas de las protenas. Esta reaccin de isomerizacin suele ser la etapa limitante en el plegamiento de las protenas.
Los enlaces peptdicos, en general siempre estn en configuracin Trans, pero
algunos donde el segundo aminocido es
una prolina (P) cuyo nitrgeno forma
parte de un anillo ser necesaria la isomerizacin para el correcto plegamiento
de la protena.

3.8 Ensamblado de las subunidades proteicas en el retculo endoplasmtico


Para finalizar con el proceso de plegamiento en el retculo endoplasmtico falta comentar que
en este espacio celular tiene lugar el ensamblado de las protenas oligomricas, como es el
caso de la hemaglutinina del virus de la gripe.
La hemaglutitina es una protena trimrica formada por tres cadenas polipeptdicas que se
ensamblan, en primer lugar interaccionando por sus hlices y finalmente interaccionando
por sus cabezas globulares.
Esta protena representa un ejemplo de la necesidad de la glicosilacin para el adecuado plegamiento ya que si se aade tunicamicina o se muta una de las asparaginas (N) glicosiladas por
una glutamina, el plegamiento no se produce de manera adecuada.

3.9 Modificaciones de la N-glicosilacin a nivel del aparato de Golgi


El aparato de Golgi es el siguiente orgnulo
que deben atravesar todas las protenas Nglicosiladas. El Golgi es un conjunto de sacos
membranosos aplanados que establecen el
principal centro de distribucin celular. Presenta un lado Cis al que llegan los materiales
procedentes del retculo y un lado Trans del
que parte las vesculas que llevan los materiales a la membrana plasmtica, la secrecin o
los lisosomas.

130

Durante su paso por el Golgi los oligosacridos N-unidos a las protenas van a ser procesados
en una serie de reacciones ordenadas catalizadas por glicosilasas y transferasas que se van a
distribuir conforme al orden de estas
reacciones por las cisternas del aparato:
-

Eliminacin de manosas en las


cisternas Cis y medias del Golgi
con manosidasas diferentes a
las del retculo.
Adicin de N-acetilglucosamina
(GlcNAc) y fucosa en las cisternias medias del Golgi.
Adicin de galactosa (Gal) y
cido silico (p.e. Neu5Ac) en
las cisternas Tras del Golgi.

Paralelo a estos procesos se va a producir la adicin de grupos fosfato en la


CGN y TGN para las protenas lisosomales.
Dado que estas reacciones, en caso de suceder en su totalidad (no suceden siempre) lo hacen
siempre en el mismo orden, vamos a estudiar el proceso completo. Partiendo de la protena
con G3M9, que llega en el retculo endoplasmtico, recordemos que se le retiraban los azcares y una manosa, llegando al aparato de Golgi como M8.
-

La primera etapa (2) que se produce en la cara cis del Golgi consiste en la retirada de
tres manosas por la accin de la manosidasa I del Golgi que da lugar a la forma M5.
La segunda etapa (4) que se puede llevar a cabo al mismo tiempo que la siguiente,
consiste en la retirada de dos manosas ms por la manosidasa II del Golgi dando lugar
a un oligosacrido con tres manosas que constituye el pentasacarido nuclear comn a
todos las protenas N-glicosiladas.
Las tercera etapa (3), que se puede llevar a cabo al mismo tiempo que la anterior consiste en la adicin de N-acetilglucosamina por la N-acetilglucosamina transferasa I del
golgi en la rama A del pptido precursor.

131

A continuacin se pueden aadir galactosa y cido silico para dar lugar a los oligosacridos
complejos. Los donadores monosacardicos del proceso son los nucletidos azcar estudiados
anteriormente que entran al lumen del aparato de Golgi mediante antiporter nucletidoazcar/nucletido.
La retirada de la primera de estas manosas por la manosidasa II del retculo convierte a la protena en
resistente a la accin de la endoglicosidasa H, por lo que podemos detectar las protenas que han
pasado por el Golgi medio, ya que sus oligosacridos no sern degradados.

Conocer el estado de glicosilacin de una protena supone conocer cmo avanza sta en la va
secretora:
-

El procedimiento consiste en realizar una electroforesis de la protena con SDS despus del tratamiento con la endoglicosilasa adecuada. La protena desglicosilada tendr un tamao ligeramente menor y por lo tanto avanzar ms rpidamente.
Otro procedimiento consiste en la utilizacin de lectinas para un determinado azcar
que se incorpore en una regin concreta del Golgi. Por ejemplo, la aglutinina del germen de trigo reconoce a la N-acetilglucosamina aadida en el Golgi medio. La fitohemaglutina (lectina de cacahuete) reconoce a los azcares con galactosa y por lo tanto a
los que pasan a travs del Golgi Trans.

El procesamiento de los oligosacridos N-unidos en el aparato


de Golgi puede dar lugar a tres tipos fundamentales de oligosacridos maduros:
-

N-oligosacridos ricos en manosa en los que todas sus


ramas acaban en manosas y solo presentan azcares
que estaban en el precursor de 14 restos.
N-oligosacridos complejos en los que no hay manosas
terminales por la adicin en todas sus ramas de azcares en el Golgi.
N-oligosacridos hbridos que son una mezcla de ambos tipos y se forman cuando tras la adicin de la primera N-acetilglucosamina ya no se quitan ms manosas.

Pero esto son solo clases fundamentales ya que los oligosacridos N-unidos pueden ser muy
variados apareciendo los bicatenarios, trecatenarios, tetracaternario y muchas modificaciones
como la adicin de fucosa en el ncleo pentasacridico o incluso N-acetilglucosamina entre las
ramas (bisectriz).

132

3.10 Modificaciones en el Golgi con destino al lisosoma


Hasta ahora hemos visto lo bsico de la sntesis y el procesamiento de los oligosacridos Nunidos en relacin al destino al Golgi. A partir de aqu el procesamiento vara en funcin del
detino, como es el caso de las protenas lisosomales (hidrolasas) que van a portar restos de
manosa-6-fosfato en el oligosacrido N-unido.
El proceso de adicin del grupo fosfato a la manosa se lleva a cabo en dos etapas en la cara cis
del aparato de Golgi.
1) Adicin de fosfo-Nacetilglucosamina
en el grupo hidroxilo
(-OH) del C6 de una
manosa del oligosacrido N-unido por
la fosfotransferasa.
2) Eliminacin de Nacetilglucosamina
por la accin de una
fosfodiesterasa dejando el fosfato en
la manosa.
En esta reaccin el donador es un nucletido-azcar, con la consiguiente liberacin de UMP u
adems es idntica a la primera etapa de la sntesis del precursor oligosacardico.
La fosfotransferasa es una enzima que va a reconocer una seal en la superficie de la protena
lisosomal, por lo que solo aadir el fosfato a estas.

El proceso de transferencia de fosfato a la manosa es el que falla en la denominada enfermedad celular I (I de inclusin). Los lisosomas son orgnulos que degradan materiales celulares y
de endocitosis, por lo que si las enzimas encargadas no son capaces de alcanzar su destino,
estos materiales (glicolipidos y glicosaminoglicanos) se acumulan en el lisosoma. Las enzimas
hidrolasas son secretadas al torrente sanguneo y en la orina.
La glicosilacin es por tanto muy importante para:
-

Dirigir a la protena a su destino celular.


Evitar enfermedades.

Los restos de manosa-6-fosfato sern ms adelante reconocidos por el receptor (lectina) que
provocar la formacin de vesculas destinas a los lisosomas.

133

3.10.1 Receptores de manosa-6fosfato


Hay dos tipos de receptores de manosa-6-fosfato:
-

Receptor de manosa-6-fosfato
dependiente de cationes (CDMPR).
Receptor de manosa-6-fosfato
no dependiente de cationes
(CI-MPR).

A simple vistas ambos receptores soy


muy diferentes, pero el dominio encargado de la unin a la manosa-6fosfato (MRH) est muy conservado
en ambos casos. El CD-MPR acta
como un dmero y presenta en cada
cadena un solo dominio MRH, mientras que el CI-MPR tiene 15 dominios
MRH, de los culas 3 unen manosa-6fosfato.
La superposicin de los dominios de unin a manosa-6-fosfato de ambos receptores muestra
claramente esta homologa.

Este receptor es un buen ejemplo de interaccin entre una lectina y su ligando. Si analizamos
cuales son los aminocidos que intervienen en el reconocimiento vemos como la manosa-6fosfato se une, a travs de sus grupos hidroxilo, por puentes de hidrgeno. Adems de esto:
-

La histidina 105 (H105) del receptor y a veces otros aminocido se unen por puentes
de hidrgeno a los oxgenos del grupo fosfato, lo que es la base de la especificidad de
la interaccin.
El aspartato 103 (D103) y el grupo fosfato interacionan a travs del magnesio (catin
divalente) en el receptor dependiente de cationes.
134

El glutamato 133 (E133) es imprescindible para la unin de la manosa, pero al descender el pH al llevar al lisosoma (endosoma) se protona, provocando la prdida de afinidad del receptor por la carga y la consiguiente liberacin.

3.11 N-glicosilacin en procariotas


La N-glicosilacin es un proceso que se da, con ciertas variaciones, en todos los reinos eucariticos y procarioticos.

Una de las diferencias fundamentales es que en bacterias, el aceptor del olicosacrido precursor no es el dolicol fosfato, sino el undecaprenol fosfato.
La N-glicosilacin es frecuente en eucariotas y arqueas, no tanto, pero tambin existe en bacterias. La O-glicosilacin es ms frecuente en eucariotas y bacterias que en arqueas.

La glicosilacin en bacterias est reducida, pero puede ser


muy importante para la vida como en el caso del patgeno
gastrointestintal Campylobacter jejuni donde la glicosilacin
es lo que le permite ser infectivo.

135

4 El proceso de O-glicosilacin
El enlace O es aquel que se produce por la unin al oxgeno del grupo hidroxilo de la cadena
lateral de una serina (S) o treonina (T). Se habla de O-glicosilacin y azcares O-unidos que
suelen tener entre 1-4 restos de oligosacrido.
La idea que vamos a tratar es la de la adicin de un nico resto de azcar, directamente sobre
la protena al que posteriormente podrn unirse otros.
El proceso de O-glicosilacin se puede dar en tres lugares diferentes en mamferos:
-

En el citosol la O-glicosilacin se produce mediante la adicin de N-acetiglucosamina


(GlcNAc) en residuos de serina o treonina.
En el retculo endoplasmtico la O-glicosilacin se produce por la adicin de glucosa,
manosa o fucosa en residuos de serina o treonina, y la adicin de galactosa en residuos de hidroxilisina (Hyl) como es el caso del colgeno.
En el aparato de Golgi la O-glicosilacin se produce por la adicin de Nacetilgalactosamina, xilosa y N-acetilglucosamina en residuos de serina o treonina.

Cabe aclarar que a pesar de que la adicin de N-acetilglucosamina O-unida se produzca tanto
en el citosol como en el Golgi, se trata de procesos totalmente diferentes y permiten la aparicin de estos azcares en protenas de secrecin o de superficie.
Otro cosa importante es que la adicin de N-acetilgalactosamina se va a diferenciar de los
dems procesos de O-glicosilacin en que en este caso van a existir muchas enziamas (20)
que intervendrn en el proceso denominadas N-acetilgalactosamina transferasas, mientras
que en los dems procesos de O-glicosilacin participaran como mucho un par de enzimas.
Los dos tipos ms frecuentes de O-glicosilacin con mucha diferencia son:
-

Adicin de N-acetilgalactosamina (GalNAc) que da lugar a la glicosilacin tipo mucina.


Esta glicosilacin suele tener entre 1-10 restos de monosacridos pudiendo presentar
ms de 50 estructuras en funcin de los enlaces y los monosacridos aadidos.
Adicin de la xilosa presente en los proteoglicanos que presentan largas cadenas de
glicosaminoglicanos (GAGs). Esta glicosilacin pude tener ms de 100 restos de monosacridos.

136

Los fallos asociados a la O-glicosilacin son causantes de muchas enfermedades, pero muchas
de ellas provocan la muerte del animal antes de nacer por su letalidad. Un ejemplo es la deficiencia de las enzimas responsables de la manosilacin que provocan la aparicin de distrofia
muscular. Esta enfermedad se produce porque el -distroglicano tiene azcares O-unidos que
comienzan por manosa, y estos son necesarios para la unin con la lmina basal.

4.1 O-glicosilacin de proteoglicanos con xilosa


Los proteoglicanos o proteoglucanos son macromolculas que presentan una o varias cadenas
de polisacridos denominados glicosaminoglicanos (GAGs) unidos covalentemente a una protena ncleo.
Los proteoglicanos son componentes
muy importantes de las matrices extracelulares y otras protenas unidas a la
superficie de la membrana plasmtica.
Estos glucosaminoglicanos (GAGs) son
polisacridos en los que alternan generalmente un resto de cido urnico
(glucuronico, idurnico) con una Nacetilexosamina o N-sulfoexosamina
que en muchos casos tienen grupos
sulfato.
Estos GAGs como el condroitin sulfato,
el heparan sulfato, el queratan sulfato
o el dermatan sulfato, tienen muchas
cargas negativas procedentes de los
carboxilatos del cido urnico y los grupos sulfato. Adems la carga positiva
que podra tener la hexosamina (por el
grupo amino) ha
sido retirada mediante la adicin de un grupo acetato o sulfato.
O-Glicosilacin:
Proteoglicanos

137

Los GAGs como el condroitin


sulfato se unen a la protena
ncleo por un puente tetrasacardico siendo el azcar
directamente unido a la protena una xilosa. La serina a la
que se unen est frecuentemente en esta secuencia:
-SGxG-

4.1.3 Sindecanos y glipicanos como moduladores de la accin proteica


Entre los proteoglicanos destacan dos tipos que presentan heparan sulfato, los sindecanos y
los glipicanos.
-

Los sindecanos son protenas que presentan una porcin transmembrana y portan de
3-5 cadenas de GAGs de heparan sulfato, adems de condroitin sulfato. Puede ser liberado de la membrana por accin de proteasas.
Los glipicanos son protenas unidas a la membrana por un enlace de glicosil fosfatidiliO-Glicosilacin:
Proteoglicanos
nosiltol
(GPI). Puede
ser liberado de la membrana por la accin de fosfolipasas.

Las cadenas de heparan sulfato que presentan estos dos presentan una serie de dominios Nsulfatados (NS, sulfatados en el grupo amino) con abundantes grupos sulfato, y dominios Nacetilados (NA, acetilados en el grupo amino) sin sulfato. Por ejemplo, podemos ver uno de
estos dominios NS donde el cido idurnico (IdoA) que sera N-acetilglucosamina es Nsulfoglucosamina,
conProteoglicanos
ms cargas negativas.
O-Glicosilacin:

138

Los GAGs interaccionan con diversos ligandos


modulando su actividad mediante su unin a los
O-Glicosilacin
dominios NS.
Una protena al unirse a un dominio NS
puede cambiar su conformacin activa,
como ocurre a la antitrombina cuando
al unirse a un dominio NS especfico
(secuencia), puede interaccionar con el
factor Xa, inhibiendo la coagulacin
sangunea.

O-Glicosilacin

La unin de dos protenas a dominios


NS adyacentes les brinda la aproximacin necesaria para interaccionar,
como tambin le ocurre a la antitrombina y a la trombina, produciendo una
inhibicin de la coagulacin sangunea.
Otro tipo de proceso es el que ocurre cuando una protena se une a los dominios NS de los
proteoglicanos de la superficie de la membrana plasmtica, aumentando su concentracin
local, como es el caso de la lipoprotein
lipasa. En el metabolismo de los triacilgliceroles, las clulas captan los cidos grasos
cuando el quilomicrn pasa cerca de la
membrana y es degradado por las lipoproten lipasas. Si esta degradacin se produce
cerca de la membrana plasmtica la reabsorcin es ms eficiente.
Finalmente tenemos el caso de los receptores y
su ligando, como ocurre para el factor de crecimiento de fibroblastos (FGF). La unin del FGF y
del receptor a dominios NS de los proteoglicanos
aumenta la concentracin local de ambos en un
punto, facilitando su interaccin y la formacin
de complejos.

4.2 O-glicosilacin de N-acetilglucosmaina en el citosol


La adicin de un nico resto N-acetilglucosamina O-unida a restos de serina (S) o Treonina (T),
es una modificacin post-traduccional muy importante que ocurre en el citosol (tambin en el
ncleo y en aparato de Golgi, pero con otras enzimas).
La caracterstica ms destacada de este tipo de O-glicosilacin es que, a diferencia de todas las
anteriores, es reversible, de manera que hay enzimas que la van a realizar y otras que la retiran. La glicosiltransferasa encargada de aadir N-acetilglucosamina es la O-unida-Nacetilglucosamina transferasa (OGT), y la hexosaminidasa encargada de retirarla es la Nacetilglucosaminidasa (OGA). Siendo el donador la UDP-N-acetilglucosamina.
139

En el genoma humano se presenta un


nico gen para OGT situado en el
cromosoma X, pero que sufre splicing
alternativo para dar tres isoformas.
Se trata de una protena homodimrica que presenta:
-

Una porcin N-terminal reguladora.


Una porcin C-terminal cataltica con la actividad transferasas en cuyo extremo hay un
dominio de unin a PIP3 (PPO, Phosfatidylinositide 3,4,5-trisphosphate targetin domain).

La OGA presenta un dominio N-terminal cataltico con actividad hexosaminidasa y un dominio


C-terminal histona acetiltransferasa (homlogo, actividad no comprobada).

Este proceso de O-glicosilacin se presenta en gran cantidad de protenas clave en rutas de


sealizacin como la propia OGT, SP-1 (factor de transcripcin), p53, APP (Alzheimer), RNA
polimerasa II, Tau (Alzheimer) y Clatrina AP-3. Por lo tanto, la adicin de N-acetilglucosamina
O-unida debe de ser un componente de regulacin importante tal y como la regulacin por
fosforilacin lo es.
4.2.1 Regulacin/actuacin de OGT mediante O-glicosilacin de N-acetilglucosamina
La actividad de la OGT est controlada a tres niveles:
-

Por la concentracin de su sustrato UDP-N-acetilgluco-samina, un nucletido azcar


cuyos bajos niveles representan un indicador o sensor de una baja concentracin de
glucosa por su conexin a travs de la ruta de biosntesis de hexosaminas (HBP).
Por el dominio PPO que detecta los aumentos de PIP3 en la membrana plasmtica tras
la activacin de PI3K, lo que supone la translocacin a la membrana para actuar sobre
las protenas de esa zona.
Por CaMKIV (Protena kinasa IV dependiente de calcio-calmodulina) que activa a OGT
fosforilandola.

140

La activacin de OGT supone la O-glicosilacin de protenas que puede afectar a varios procesos:
-

La glicosilacin de factores de transcripcin como SP-1 supone su translocacin al ncleo y la expresin de


protenas.
La glicosilacin de protenas afecta a
la estabilidad (vida media), como en
el caso de p53 que supone un aumento de su estabilidad.
La glicosilacin de protenas tambin
puede afectar a su fosforilacin ya
que si este proceso se realiza sobre
un resto de Serina (S) o treonina (T)
susceptible de ser fosforilado, ambas
modificaciones sern excluyentes.

Un ejemplo de este tipo es el factor CRTC2 (coactivador de CREB en hepatocitos) que permanece en el
citosol cuando S70 y S171 se encuentran fosforiladas, pero la adicin de N-acetilglucosamina en estos
restos permiten su migracin al ncleo donde se expresan los genes de la gluconeognesis.

N-acetilglucosaminidacin y fosforilacin como modificaciones excluyentes


El modo en el que la adicin de N-acetiglucosamina y la fosforilacin son excluyentes depende
O-Glicosilacin: O-GlcNAc
de muchos factores y puede suponer varios quebraderos de cabeza para su estudio.

O-Glicosilacin:
El O-GlcNAc
caso ms simple es aquel en el que el resto de serina o treonina es el mismo que se
fosforila o se le aade N-aceltilglucosamina
como sucede en C-myc y ER-.
Pero tambin existen casos en los que la presencia de dos residuos susceptibles alternativamente de estos cambios estn muy prximos en la secuencia, por lo que si uno
de ellos es glucosilado o fosforilado, el
otro no podr ser modificado, lo que establece una regulacin reciproca como
sucede en el caso de p53 y de la RNA polimerasa II.
Esta proximidad entre dos residuos susceptibles tambin se puede dar como resultado de la conformacin
proteica y por lo tanto no tienen porque estar prximos
Hu FEBS L 2010
en la secuencia. Es el caso de la CaMKIV.
Finalmente tenemos la posibilidad de que la actividad
de la protena sea regulada por el estado de modifica141

cin de sus residuos de manera independiente, por lo que para dos sitios de modificacin
puedan darse las tres posibilidades de que uno sea susceptible de la glicosilacin y el otro de
fosforilacin.

4.2.2 Relacin de la O-glicosilacin con N-acetilglucosamina y enfermedades


La adicin de N-acetilglucosmina O-unida en restos de serina o treonina est implicada en enfermedades importantes como las neurodegenerativas, la diabetes y el cncer.
Fallos en este proceso podran estar detrs de
enfermedades como el Alzheimer produciendo la
formacin de los nudos neurofibrilares por la
protena Tau y por otra parte las placas seniles
ricas en pptido -amiloide producido por la protena APP, ya que ambas protenas son sustrato
de la OGT.
Una de las observaciones empricas en las que
radica esta suposicin es que en un cerebro sano
o sin Alzheimer, la protena Tau presenta mucha
N-acetilglucosamina O-unida, mientras que en los
cerebros con Alzheimer la protena Tau presenta
poco de este monosacrido y est hiperfosforilada.
En cuanto a p53, la protena supresora de tumores, en situaciones normales se encuentra fosforilada,
siendo
reconocida por la ligasa de ubiquitina (Mdm2) y degradada por la va UPS. En
O-Glicosilacin:
O-GlcNAc
situaciones de estrs la p53 es glicosilada y queda protegida de la degradacin.

142
Ozcan BBA 2010

La relacin de las deficiencias de la OGT con la diabetes radica en que varias de las protenas
que participan en la cascada de transduccin de la seal de insulina son su sustrato. Entre estas protenas se encuentra IRS-1, PI3K, PKB (=AKT) y la propia glucgeno sintasa.
Por ejemplo, la PKB es una protena cuyo estado activo es el fosforilado, inhibiendo a GSK3 y
permitiendo la sntesis de glucgeno. Cuando OGT se transloca a la membrana por el aumento
de PIP3 glicosila a PKB poniendo fin a la cascada de sealizacin.

5 Glicosil fosfatidilinositol (GPI)


La formacin del anclaje de glicosil fosfatidilinositol (GPI) es un proceso que se produce en el retculo endoplasmtico en el que la protena queda unida a la membrana mediante un puente de
azcares enlazados con dos cadenas hidrocarbonadas.
La estructura concreta del puente GPI vara en
funcin del tipo celular e incluso de la protena,
pero siempre tiene una serie de componentes
comunes, y dado el lugar en el que se genera,
siempre est asociado a protenas de membrana
que miran hacia la matriz extracelular.

143

Esta estructura comn del anclaje de


GPI est formada por:
-

GPI

Fosfatidilinositol al que se que


se unen las dos cadenas hidrocarbonadas (R1 y R2).
Ncleo tretrasacardico variable con manosa, glucosamina,
Etanolamida unida covalentemente al extremo C-terminal de
la protena a travs del grupo
amino.

5.1 Sntesis de glucosil fosfatidilinosiltol


El proceso de sntesis del puente de GPI, al igual que en el caso de los oligosacridos N-unidos,
comienza en la cara citoslica del retculo y termina en la cara luminal. Adems tambin es
sintetizado independientemente y posteriormente se transfiere a la protena.
Los precursores que dan lugar al GPI son el fosfatidilinositol, la UDP-N-acetilglucosamina, el
dolicol fosfato-manosa y la fosfatidiletanolamina.
El proceso de sntesis comienza en la cara citoplasmtica del retculo endoplasmtico:
1) Se le aade una molcula de N-acetilglucosamina al fosfatidilinositol presente en la
membrana.
2) Se desacetila la N-acetilglusoamina quedando una molcula de glucosamina unida.
3) El lpido se transloca a la cara luminal del retculo endoplasmtico y sufre la acilacin
del inositol (adicin de grupo acilo) como el palmitato (=palmitoilo).
4) Adicin de manosas y glcidos del ncleo tetrasacardico.
5) Adicin de fosfoetanolaminas (se aaden ms de las que formaran parte del GPI)
6) Transferencia del anclaje GPI preformado a la cadena polipeptdica inmadura.
7) Eliminacin del grupo acilo del inositol y transferencia hacia el Golgi donde se producen algunos cambios en los lpidos y los hidratos de carbono que forman parte de la
estructura.

144

Uno de los cambios importantes que va a sufrir el GPI en el Golgi va a ser la sustitucin del
enlace ester del cido graso
en Estr.
posicin
1 del glicerol por un enlace alkilo (ter, alcoholGPI:
y sntesis
alcohol).
Adems, cabe mencionar que en algunas ocasiones el grupo acilo del inositol se mantiene en el
puente GPI maduro.

Otro de los cambios ms usuales es la sustitucin del cido graso en posicin 2 del glicerol,
que suele ser poliinsaturado originalmente, por uno saturado como el cido esterico
(=estearato).
Las protenas que quedan unidas a GPI son las protenas transmembrana de tipo I con una
hlice transmembrana y el extremo N-terminal mirando hacia el lumen del retculo. Estas protenas presentan una seal de 15-25 restos hidrofbicos que queda atrancada en el translocn
y dan lugar a la hlice transmembrana. Antes de esta secuencia presentan otra en la parte
luminal, pero muy cercana a la membrana que es reconocida por la GPI transaminidasa que
va a cortar a la protena en
ese punto y la transferir al
GPI preformado.
-G/A-D/N-S/CEl proceso supone la eliminacin de la zona Cterminal de la protena
original y la protena queda
anclada siempre a la cara
luminal del retculo endoplasmtico.

5.2 Beneficios de la utilizacin del enlace por GPI


Las protenas ancladas a la membrana plasmtica mediante un enlace de GPI pueden ser cortadas por la fosfolipasa C que corta entre el glicerol y el fosfato.

145

Adems el enlace por puente de GPI permite una difusin ms libre en la bicapa, ya que una
protena anclada por GPI est relacionada con la monocapa externa, mientras que las protenas transmembrana presentan interacciones con el citoesqueleto, dificultando su difusin.
El anclaje por GPI generalmente dirige a las protenas a los dominios apicales de la membrana
de las clulas polarizadas (epiteliales) y en muchos casos se concentran en los rafts lipdicos.

6 Funciones de los glicoconjugados


Los glicoconjugados son molculas que presentan muchos tipos de funciones:
-

Los glcidos son molculas muy ricas en informacin ya que las lectinas son protenas
que reconocen especficamente azcares en todos lo reinos, incluidos los virus.
o El ejemplo clave es del las selectinas (lecinas que intervienen en el proceso de
reconocimiento y adhesin celular) que van a participar en la extravasacin de
leucocitos (selectina-P, Selectina-E y selectina-L) en la implantacin del embrin en el endometrio (selectina-L) y en la fertilizacin de vulos.
o Tambin es muy importante en el reconocimiento intercelular por parte de las
bacterias (Helicobacteri pylori y las lceras de estmago).
o Tambin hay lectinas virales como la hemaglutinina del virus de la gripe, necesaria para la infeccin.

Dada la gran cantidad de lectinas y su importancia para las interacciones entre clulas y patgenos, estas son la diana farmacolgica de numerosos tratamiento que van a competir por los
receptores de los oligosacridos con el fin de impedir que el virus reconozca los oligosacridos,
como en el caso del tamiflu y la relenza, dos medicamentos anlogos de los azcares que
reconocen los virus e impiden la infeccin.

Los glcidos tambin regulan la permanencia de una glicoprotena en el plasma sanguneo. La mayora de las protenas plasmticas estn glicosiladas con cido silico
(cido N-acetilneuramnico) y conforme envejecen, van perdiendo estos restos glicosdicos por lo que son captadas por el receptor de axialoglicoprotenas del hepatocito
que reconoce las galactosas expuestas en los oligosacridos produciendo la endocitosis y degradacin de la protena.

146

Anexo I: Destino de las protenas en funcin del oligosacrido N-unido y el plegamiento

147

148

Tema 8: Trafico vesiclar


El trfico vesicular engloba a los procesos por los que las protenas y otras
molculas como los lpidos son transportados de un compartimento celular
a otro mediante vesculas de transporte.
Este trfico vesicular puede ser divido
en dos procesos principales:
-

La va o ruta secretora que porta las protenas sintetizadas en


el retculo que pasan a travs
del Golgi para ir a la membrana
plasmtica, la secrecin o los
endosomas.
La va o ruta endoctica que
comienza con la invaginacin
de la membrana plasmtica
para introducir los materiales
dentro de la clula para llevarlos hasta el endosoma.

1 Proceso general de gemacin y fusin de membranas


El estudio del trfico vesicular debe comenzar con el establecimiento de la idea de la gemacin
y fusin que se va a producir en las membranas.
El proceso general de gemacin consiste en la evaginacin de la membrana que captura parte
de las protenas a transportar (carga), para dar lugar a una vescula de transporte.
Esta vescula ser transportada gracias al citoesqueleto hasta un compartimento aceptor (target), fusionndose con su membrana.
149

Algunas de estas vesculas de transporte presentan cubiertas proteicas bien caracterizadas por
lo que se conocen como vesculas recubiertas (Coated vesicles), diferencindose en funcin de
la protena estructural de la cubierta en:
-

COP I (CGN RE y entre las cisternas del Golgi, pero siempre transporte retrgrado)
COP II (RE CGN, transporte antergrado)
Clatrina (TGN MP/END, transporte antergrado)

Proceso general

1.1 Proceso de gemacin


La gemacin es un proceso que se produce gracias a la polimerizacin reversible de los complejos de protenas de cubierta (solubles en el
citosol) sobre la membrana dadora. Esta cu150

Proceso general

bierta tiene dos funciones principales:


-

Genera la curvatura necesaria para


que se produzca la gemacin gracias a su forma y fuerte unin con
los lpidos.
Selecciona la carga que portar la
vescula.

El mecanismo de seleccin de la carga depende de que la protena a transportar por la vescula


sea soluble o est integrada en la membrana:
-

Las protenas integradas en la membrana presentan en su porcin citoslica seales


de clasificacin (Sorting signals) que van a ser reconocidas por las protenas de la cubierta.
Las protenas solubles en el lumen del orgnulo van a ser reconocidas por receptores
de carga integrados en la membrana, que portan en su porcin citoslica seales de
clasificacin.

Estas seales de clasificacin casi siempre son secuencias de aminocidos muy cortas. En el
caso de protenas solubles es por ejemplo la manosa-6-fosfato cuyo receptor de carga va a ser
el receptor
de manosa-6-fosfato.
Proceso
general

El ensamblado y desensamblado de la cubierta est regulado por la presencia en los tres tipos
de vesculas recubiertas por la presencia de protenas pequeas de unin a GTP con actividad
GTPasa que son protenas monomricas similares a Ras y forman parte de la superfamilia de

151

las GTPasas de protenas interruptoras (Switch) que se presentan activas unidas a GTP e inactivas unidas a GDP. Hay dos tipos de estas:
-

Sar1 es la que acta en vesculas recubiertas de COPII.


ARF es la que acta en vesculas de COPI y clatrina.

Sar1-GDP es una protena inactiva y soluble en el citosol que cuando interacciona con un factor
intercambiador de nucletidos de guanina Sar1-GEF (= Sec12 de la membrana del retculo endoplasmtico) intercambia GDP por GTP.
Sar1-GTP presenta una conformacin abierta que expone su extremo N-terminal hidrofbico,
el cual se inserta en la bicapa
lipdica citoslica del retculo. Se
forma as el cimiento que promueve la polimerizacin de la
cubierta de COPII sobre la membrana del retculo que fuerza la
gemacin.
Pasado cierto tiempo la actividad
GTPasa de Sar1-GTP hidroliza el
GTP a GDP provocando la disociacin de la cubierta sobre la vescula ya formada.

1.2 Proceso de fusin


Una vez tenemos la vescula sin cubierta proteica, el siguiente paso consiste en la fusin con la
membrana diana adecuada. Este proceso se conoce como docking de la vescula o atraque.
En este proceso van a tener mucha importancia las protenas Rab, otras protenas pequeas
de unin a GTP de la familia de las GTPasas de
protenas interruptoras (Switch).
Rab-GDP se presenta soluble en el citosol,
pero cuando interviene un GEF, sufriendo el
intercmabio de GDP por GTP, Rab-GTP se
ancla a la membrana de la vescula a travs de
un resto isoprenoide.
Rab-GTP es reconocida por el efector de Rab
(receptor) en la membrana de destino y comienza el proceso de fusin mediado por las
protenas SNARE.
Ms adelante, una vez que se produzca la fusin Rab hidrolizar su GTP y se liberara al citosol.

152

Una vez que la vescula ya est en las proximidades de la membrana, gracias a la accin de Rab
y su efector, para que se produzca la fusin van a intervenir dos tipos de protenas SNARE:
-

v-SNARE estn presentes en la vescula


t-SNARE estn en la membrana diana (target)

Proceso general: Fusin


Segn el proceso de fusin las SNARE que intervienen van a variar, por ejemplo, en la exocitosis va a intervenir la v-SNARE del tipo VAMP (VesicleAssociated Membrane Protein) concretamente la
VAMP-2 (Sinaptobrevina 2), y las t-SNARE sintaxina y
SNAP-258 (SiNaptosome-Associeated Protein).
Estas protenas van a interaccionar formando un
complejo SNARE en el que las porciones citoslicas se
enrollan para formar un haz de 4 hlices muy estable
(VAMP-2+Sintaxina+2xSNAP-25) que aproximar las
membranas hasta que se fusionan.
La estabilidad del complejo SNARE de 4 hlices se
debe a la existencia de un patrn repetitivo entre las
diferentes hlices con aminocidos de caractersticas
similares cada 7 restos. Este patrn permite que la
interaccin se produzca entre aminocido hidrofbicos que quedan mirando hacia el interior de la hlice
y las fuerzas hidrofbicas los mantengan unidos.
Adems se van a formar puentes de hidrgeno muy fuertes entre una arginina (R) de las vSNARE y una glutamina (Q) de cada t-SNARE, contribuyendo a la estabilidad del haz. Por ello en
muchas ocasiones se denominar a las t-SNARE como Q-SNARE y a las v-SNARE como RSNARE.

No confundir con SNAP (Soluble NSF Attachment Protein)

153

Tras la fusin de las membranas los complejos SNARE tienen que disociarse mediante la participacin de un hexmero de NSF (NEM9-Sensitive Factor) y SNAP (Soluble NSF Attachment Protein) que hidrolizando ATP, desacoplarn la cremallera de SNARE.

2 Circulacin de vesculas entre el retculo endoplasmtico y el


aparato de Golgi
Las protenas que deben ir del retculo endoplasmtico al aparato de Golgi presentan una seal
de clasificacin (Sorting signal) que va a variar en funcin de su naturaleza:
-

Las protenas de membrana presentan una seal di-acdica con dos aminocidos cidos que va a ser reconocida por Sec24 de la cubierta de COPII.
Asp-X-Glu

Las protenas de membrana residentes en el retculo que son transportadas al Golgi por error o por intervenir
en el trfico vesicular, pero que deben volver al retculo, presentan en
su extremo citoslico una secuencia
KKXX reconocida por las protenas
COPI y COPI de la cubierta de COPI.
Lys-Lys-X-X

Las protenas solubles residentes en


el retculo que vallan por error al Golgi van a presentar una secuencia
KDEL que ser reconocida por el receptor de KDEL para su vuelta al retculo.
Lys-Asp-Glu-Leu

NEM (N-etil maleimida)

154

Bloque III: Regulacin Molecular De La


Accin Hormonal

TEMA 1 Propiedades Funcionales de las Hormonas Liposolubles


Clasificacin y propiedades de las hormonas. Propiedades de la interaccin hormonareceptor. Hormonas liposolubles: transporte por el plasma. Alternativas para la activacin
de receptores intracelulares. Dominios estructurales de los receptores. Elementos de respuesta a hormonas. Agonistas y antagonistas sintticos y sus efectos. Co-activadores y
co-represores. Acciones genmicas y no genmicas. Diversidad de genes regulados por
las hormonas esteroideas.
TEMA 2 Mecanismos de Accin de las Hormonas Hidrosolubles
Transduccin de seales hormonales. Receptores transmembranales y sntesis de segundos mensajeros. Protenas G trimricas. AMP cclico, generacin y efectos. Protenquinasas y proten-fosfatasas. Fosfolipasa C: activacin y sntesis de inositol-tris-fosfato y
diacilglicerol. Variantes de proten-quinasa C y sus efectos celulares. Calmodulina y sus
funciones. GMP cclico. xido ntrico.
TEMA 3 Funciones de los Factores de Proliferacin Celular
Factores de proliferacin celular. Receptores con actividad tirosn-quinasa intrnseca o
diferida. Dominios SH1, SH2 y SH3. MAP quinasas. Receptores con actividad tirosnfosfatasa. Otros receptores. Origen del cncer: protooncogenes, oncogenes y antioncogenes.

155

156

Tema 1: Hormonas liposolbles y receptores intracellares


La comunicacin intercelular, as como la que se produce entre las clulas y los tejidos, puede
llevarse a cabo mediante cuatro formas fundamentales:
-

La comunicacin dependiente de contacto es aquella que se produce mediante el contacto directo de dos clulas a travs de protenas de la membrana que actan como
seales. Cuando una de estas protenas de membrana colisiona con el receptor adecuado se produce la transduccin de la seal que puede ser transmitida a ambas clulas.

La comunicacin paracrina es aquella que se produce a travs de un mediador qumico liberado por una clula y detectado a nivel local de donde se produce la liberacin.
Un ejemplo concreto sera la sealizacin autocrina en la que la propia clula capta el
estmulo emitido por ella como es el caso de los receptores -adrenrgicos que son
autoreguladores. Entran en este grupo las prostaglandinas, prostacilcinas, linfoquinas y
citoquinas.

La comunicacin sinptica se caracteriza porque la distancia que recorre el neurotransmisor es muy pequea y los mediadores son liberados al espacio sinptico.

La comunicacin endocrina es aquella en la que el mediado qumico viaja largas distancias a travs del torrente sanguneo.

157

1 Accin hormonal
Las hormonas se han clasificado generalmente segn su naturaleza qumica en funcin del
compuesto del que derivan. Podemos establecer por tanto cuatro clases fundamentales:
-

Hormonas derivadas de aminocidos como


las que derivan de la tirosina (adrenalina) y
la tiroxina (tri- y tetraiodotironina que son
liposolubles).
Hormonas polipeptdicas que representan la mayor variedad de lo que se entiende
como hormonas. Presentan un tamao variable desde hormonas de 2-3 aminocidos
hasta 100-150 aminocidos. Son la insulina, el glucagn, todas las hormonas del eje del
hipotlamo e hipfisis, la hormona del crecimiento (GH), todas las del tracto gastrointestinal Estas hormonas presentan una naturaleza hidrosoluble y pueden reaccionan
de dos formas:
o Con receptores de la membrana como los receptores de somatotropina, receptores de LH dando lugar a una transduccin de la seal a travs de segundos mensajeros que desencadenan la seal a nivel de protenas.
o Con receptores de la membrana que tambin pueden actuar a travs de segundos mensajeros pero cuyo cambio es a nivel gnico y por lo tanto ms lento.
Las hormonas de naturaleza esteroidea incluyen a los gluco- y mineralocorticoides,
adrengenos, estrgenos, gestgenos, el cido retinico (vitamina A), el 1-25-dihidroxi
vitamina D2, D3 Se trata de hormonas no hidrosolubles (liposolubles) que van a tener paso libre a travs de las membranas que se van a unir a receptores intracelulares.

Los derivados del cido retinoico que presentan algunos productos


de belleza, sobre todo si se usan junto con radiacin solar pueden
unirse a receptores nucleares que llevan a la transcripcin de
genes que pueden conllevar efectos perjudiciales.

Las hormonas eicosanoides derivadas del cido araquidnico como las protaglandinas,
prostaciclinas y tromoboxanos (derivado del cido araquidnico) son hormona liposolubles que van a unirse a receptores de membrana desencadenando la liberacin de
segundos mensajeros.

La cantidad de hormonas que circulan por el torrente sanguneo es extraordinariamente baja,


en el mejor de los casos del orden nanomolar (10-9), por lo que para determinar si una persona
presenta un problema hormonal es necesario recurrir a pruebas de radio-inmunoensayos (RIA)
en los que se utilizan anticuerpos y ligandos radiactivos para evaluar las concentraciones hormonales.

1.1 Protenas carrier de hormonas liposolubles y fraccin libre


Las hormonas liposolubles como las que se vierten desde la tiroides y la corteza adrenal son
muy hidrofbicas, por lo que van a precisar de protenas de transporte general o protenas

158

carrier, como la albmina u otras ms especficas. La regulacin de los niveles de este tipo de
protenas va a afectar a la cantidad de hormona disponible (libre).
La albmina es una protena carrier del torrente circulatorio que tiene la capacidad de unir
compuestos tan diversos como la bilirrubina o los derivados del cido glucurnico gracias a
una estructura con huecos de regiones hidrofbicas. La unin de hormonas liposolubles a la
albmina siempre ser con una unin o afinidad muy baja, con respecto a protenas carrier
ms especficas.
La globulina ligante de corticoesteroides (CBG, Corticosteroid
binding globulin) es una protena carrier especfica que une al
80% de los 17-hidroxiesteroides. Por ejemplo, el cortisol en
el torrente circulatorio se presenta en un 70% unido a CBG,
un 22% unido a albmina y un 8% libre que puede formar
agregados y es la que entra en la clula.
La globulina ligante de hormonas sexuales (SHBG, Sexual
hormone-binding globulin) liga especficamente andrgenos y
estradiol, pero con menos afinidad que la albmina. La cantidad de SHBG se reduce durante la pubertad, por lo que el
nivel de testosterona libre (89-87% con albmina, 10% con
SHBG y 1-3% libre) aumenta provocando la aparicin de los
caracteres sexuales secundarios.
La globulina ligante de andrgenos (ABG, Androgen-binding
globulin) suministra la testosterona para la sntesis de protenas
en espermatozoides, y la globulina ligante de tiroides (TBG,
Thyroid-binding globlulin) transporta las hormonas tiroideas.
La fraccin de hormona liposoluble libre en el torrente circulatorio es la que es capaz de entrar en la clula y unirse a sus
receptores, de manera que, por una parte nos encontramos las hormonas formando un complejo con las protenas carrier (CH) y la hormona libre (H) que oscila entre el 3-10% del total.
Estas concentraciones se encuentran en realidad en un equilibrio en el que tambin van a participar los receptores (R), ya que sern los que formen complejos con las hormonas (HR), retirando hormona libre del equilibrio y desplazndolo hacia la disociacin de la protena carrier,
de acuerdo con la ley de accin de masas.

Posteriormente la liberacin de la hormona por parte del receptor puede invertir el desplazamiento para recuperar el equilibrio.
En trminos de constante de afinidad y de disociacin, la afinidad del receptor por la hormona
es altsima, es decir, su constante de afinidad oscila entre 109-1012 M-1, por lo que el equilibrio
est muy desplazado hacia la formacin de complejos hormona-receptor. Por ende, la constante de disociacin es muy baja, del mismo orden pero en negativo, lo que significa que la

159

hormona y el receptor se encuentran muy poco disociados a una determinada concentracin


de ambos.

1.2 Caractersticas de la interaccin hormona-receptor


Al igual que la interaccin antgeno-anticuerpo, la interaccin hormona-receptor es una interaccin de alta afinidad (constante de afinidad muy alta, constante de disociacin muy baja)
pero de carcter no covalente y se trata de una interaccin saturable, al igual que la de una
enzima con su sustrato.
Segn los casos, se trata de una interaccin muy especfica y estereoespecfica, ya que no
presenta la misma afinidad por todos los estereoismeros.
Es una interaccin sensible a los agentes que modifican o cambian la estructura del receptor
o del ligando (hormona). Por ejemplo, un cambio en la secuencia de la somatostatina (polipeptdica) cambia su afinidad por el receptor, y las mutaciones en los receptores estn relacionadas con muchas patologas, tanto si provocan un aumento como un descenso de la afinidad.
Los receptores presentan ligandos que actan como agonistas (su unin al receptor mimetiza
el efecto del ligando natural) y otros como antagonistas (ocupan el receptor pero no lo activan).

2 Agonistas y antagonistas de los receptores de andrgenos


Los receptores de andrgenos y estrgenos del interior celular, tienen huecos hidrofbicos
porque el estrgeno es hidrofbico. Por lo que un determinado plaguicida o un compuesto
aromtico se puede unir a estos huecos aunque con baja afinidad. En cualquier caso la ocupacin o no depender tanto de la afinidad como de la concentracin del compuesto ya que a
altas concentraciones de ciertos plaguicidas los renacuajos tardan 2 das en hacer la metamorfosis (Activacin de receptores de hormonas sexuales), mientras que lo normal es que tarden
24 das.
En el caso de los receptores de andrgenos uno de sus agonistas naturales la androstenediona (andrgeno). El dianabol (metandrostenolona) es un andrgeno sinttico prohibido que se ha
utilizado para el engorde del ganado y el aumento de la masa
muscular. Su abuso se ha relacionado con adenomas hepatocelulares que son el paso previo a un hepatoma o cncer de hgado.

Los esteroides anabolizantes inducen la secrecin de testosterona en hombres, que da lugar a la atrofia del testculo y al
aumento de las mamas. En las mujeres, el efecto conlleva una
disminucin de la ovulacin y de la secrecin de estrgenos,
adems de una regresin de la mama.

160

El tamoxifeno y el raloxifeno son reguladores de los receptores de estrgenos que actan


como antagonistas en unos tejidos y agonistas en otros.
El tamoxifeno es un compuesto utilizado en la terapia contra el cncer de mama tras la mastectoma total o parcial y la aplicacin de la quimioterapia o la radioterapia, para que evitar
que el cncer reaparezca. Pero a largo plazo, la administracin de tamoxifeno se ha relacionado con la induccin del cncer de tero.
Este efecto, inhibidor por una parte (antagonismo) e inductor por otra (agonismo), se debe a que el receptor de estrgenos va a desencadenar respuestas diferentes en funcin
del tejido. En el tejido mamario, el tamoxifeno provoca la
inhibicin de una ruta de transduccin que culmina con el
reclutamiento de moduladores que promueven la expresin
de oncogenes. Por el contrario, en el tero esta ruta culmina
con el reclutamiento de moduladores impiden la expresin
de oncogenes, por lo que su inhibicin provoca la expresin.
Al fin y al cabo el receptor de estrgenos estrogenos es un factor de transcripcin que se une
al DNA una vez activado, pero en unos casos ser para reclutar Co-activadores y en otros Corepresores, que segn el tipo celular sern comunes o no, desencadenando respuestas diferentes.

3 Modelo general del receptor de hormonas liposolubles


Se han caracterizado ms de 50 genes humanos para los distintos receptores intracelulares
de hormonas liposolubles y en muchos no se conoce el ligando, es decir, muchos de ellos son
genes putativos (homlogos de secuencia), cuyo funcionamiento no se ha comprobado. Por
ejemplo, se conoce la existencia de receptores de compuestos aromticos con esta estructura
y que son inductores de cncer, por no se ha caracterizado el ligando.
Todos los receptores de hormonas liposolubles presentan una estructura general comn formada por entre 500 y 1000 aminocidos que consta de:
-

Regin o dominio de unin al ligando (225-285 a) en la porcin C-terminal.


Regin o dominio de unin al DNA (65-70 a) en la porcin central.
Regin o dominio de trans-activacin (100-500 a), que es variable, en la porcin Nterminal.

161

Atendiendo a la homologa de secuencia (identidad de aminocidos) de los dominios de los


diferentes receptores, podemos observar que el dominio de unin al DNA est muy conservado (homologa 42-94%), el dominio de unin al ligando est algo menos conservado (homologa 15-57 %) lo que es lgico porque aporta la especificidad en la unin con las diferentes hormonas, y finalmente la regin de trans-activacin no presenta homologa.
Es lgico pensar que el dominio de unin a hormonas presente homologa ya que por ejemplo, el cortisol no dista mucho del estradiol o la testosterona, estructuralmente hablando, por lo que la zona que
constituye los huecos hidrofbicos tendr que presentar semejanzas. En cambio no es lo mismo la
estructura de la tiroxina la del cido retinoico por lo que en ese caso habr menos homologa de secuencia entre ambos receptores.

3.1 Elementos de respuesta, coactivadores y localizacin de receptores


El dominio de unin al DNA de los receptores intracelulares de hormonas
liposolubles se va a unir a los elementos de respuesta a hormonas en el
DNA (secuencias de pares de bases).
Mientras que el dominio unin al ligando, en el caso del receptor de estrgenos, presenta entre sus hlices la denominada hlice 12 que sobresale de la
protena cuando el ligando no est unido en el hueco.
La unin de la hormona al receptor provoca un cambio de conformacin que retrae la hlice
12 y permite que el factor de transcripcin (receptor) sea reconocido por los moduladores
(Co-activadores/represores).

Los antagonistas del receptor de estrgenos, como el tamoxifeno, provocan un cambio de conformacin parcial que impide que el receptor sea reconocido por los moduladores.

Tambin el receptor de estrgenos al que la unin del estradiol provoca la conformacin compacta con capacidad de unin al DNA y los co-activadores.

162

Pero como ya hemos mencionado, el tamoxifeno se une con ms afinidad al receptor provocando una conformacin plegada, pero diferente, que no es competente para el reclutamiento
de co-activadores.
3.1.1 Co-activadores
Una de estas familias de co-activadores son los de la familia p160 que presentan varios dominios importantes en su secuencia:
-

El dominio bsico de hlice-bucle-hlice que presenta una estructura de pinza que se


une al DNA.
El dominio PAS que participa en las interacciones protena-protena.
El dominio de interaccin con el receptor de hormonas nucleares que presenta en su
secuencia secuencias de LXXLL que son los que se unirn al receptor hormonal con la
hlice 12 plegada.
El dominio de interaccin con otros co-activadores como P300 y CBP10.

3.1.2 Elementos de respuesta para los receptores de hormonas esteroideas


En la tabla podemos observar los elementos de respuesta a hormonas (HREs, Hormone response Elements) a los que se unen
los receptores de hormonas esteroideas como el receptor de andrgenos, el receptor de glucocorticoides, el de cido retinoico (vitamina
A), el de vitamina D y el de las hormonas tiroideas. Adems de otros
receptores (RX) que forman heterodmeros con los receptores del
cido retinoico o el de vitamina D.
Si observamos la secuencia del elemento de respuesta (secuencia de pares de bases) los receptores de cido retinoico, los de vitamina D y los de hormonas tiroideas se unen al mismo
elemento de respuesta, solo diferenciado por el tamao de la regin bisagra. Esto se debe a
que estos receptores dimerizan (Como FOS, JUN, NFB,) dando lugar a homodmeros. Pero

10

CBP = CREB binding proten, CREB = CRE-binding protein y CRE = cAMP response element.

163

cuidado, como hemos mencionado antes, algunos de ellos puede dimerizar con otros receptores y dar lugar a heterodmeros.
Esto establece dos puntos de colisin (unin) con el DNA para los receptores dimerizados, que
en el caso de interactuar con otros co-activadores o co-represores presentarn 4 puntos colisin con el DNA [2x(1 del receptor + 1 por cada co-activador)]. Si no hay dimerizacin adecuada no se produce una fijacin adecuada al DNA.
Los experimentos que implican el estudio de receptores y el modo de accin de estos son
complicados porque la cantidad de estos que presenta una clula es muy pequea. Para identificarlos hay que llevar a cabo un seguimiento que permita su purificacin, requirindose en
muchos casos ligandos radiactivos.
Adems, es necesario utilizar tejidos con un alto contenido de receptores de esta clase, como
son el tejido mamario, el ovrico o los testculos.
3.1.3 Localizacin de receptores de hormonas liposolubles
Los receptores de hormonas liposolubles ejercen su accin en el ncleo, pero se van a distribuir entre el citosol y el ncleo, segn el tipo.
-

Los receptores de glucocorticoides se localizan en el citosol y no entran al ncleo hasta que unen el ligando.
Los receptores de andrgenos y estrgenos se sitan en el ncleo, pero en un estado
no competente, como unidades independientes que precisan del ligando para dimerizar y formar los homodmeros.
Los receptores heterodimricos como los de las hormonas tiroideas, los de cidos retinoicos, el de la vitamina D2 o D3, se sitan siempre unidos a su elementos de respuesta pero asociados a co-represores en ausencia del ligando. Esto se debe a que el
sitio de interaccin con el modulador es excluyente, es decir, o tiene unido un corepresor o tiene unido un co-activador.

4 El receptor de glucocorticoides humano


4.1 Motivo de dedos de cinc en el receptor de glucocorticoides
El dominio de unin al DNA del receptor de glucocorticoides presenta un motivo estructural
conocido como dedos de cinc caracterizado por la presencia de molculas de cinc coordinadas
a travs de cuatro restos de cistena (C).

164

Adems, esta estructura alberga el loop que permite la dimerizacin de los receptores (negrita) cuya deteccin se realiz porque la mutacin de la alanina (A458) a treonina (T) impide la
dimerizacin o la hace defectiva.
Si no se produce esta dimerizacin no hay un posicionamiento correcto y fijo sobre el DNA lo
que impide la expresin adecuada de los genes.

4.2 Estructura y variantes del receptor de glucocorticoides


El gen del receptor de glucocorticoides humano codifica para una estructura en la que vamos a
encontrar 4 dominios diferentes:
-

Dominio NTD (N-terminal domine) en el extremo N-terminal que es regulador.


Dominio DBD (DNA binding domain) en el centro por el que se produce la unin al
DNA.
Dominio HR (Hinge regin) que es la regin bisagra.
Dominio LBD (Ligand-binding domain) en el extremo C-terminal que es el de unin al
ligando.

En funcin del proceso de maduracin del mensajero podremos encontrar dos variantes (isoformas) resultado del empalme alternativo del exn 9 (hGR) o 9 (hGR), que presentan
diferente nmero de aminocidos.

Dentro de estos dominios estructurales se han caracterizado varios dominios funcionales que
determinan el modo de actuacin de los receptores de glucocorticoides. Estos receptores se
encuentran solubles en el citosol interaccionando con chaperonas en ausencia del ligando.
Cuando la hormona liposoluble difunde al citosol e impacta con el receptor este
muestra sus secuencias de
localizan nuclear (dominio
funcional) y es importado al
ncleo.

165

Adems de las dos secuencias de localizacin, los receptores de glucocorticoides presentan


dominios funcionales de trans-activacin (en NTD), de dimerizacin11 (de DBD-LBD) y una regin de unin a las protenas de choque trmico (HSPs).
Podemos observar el mecanismo de funcionamiento en el que el receptor de glucocorticoides
se encuentra amordazado en el citosol por las HSPs, hasta que la aparicin del ligando lo libera
y entra al ncleo donde dimeriza y se une a sus elementos de respuesta.
El receptor de glucocorticoides, como muchos otros, puede formar homodmeros o heterodmeros con otros factores
de transcripcin, pero en
este ltimo caso, es el factor
de transcripcin el que determina el elemento de respuesta, que ser el suyo propio.
Eventualmente el ligando se
disocia del receptor y las exportinas los vuelven a transportar al citosol.

4.3 Modelo funcional del receptor de hGR


El modelo general de actuacin de los receptores de hormonas hidrosolubles que se ha mencionado con anterioridad es aplicable a todos ellos y se basa en el cambio conformacional sobre la hlice 12 que produce la unin del ligando.
Si observamos uno de estos receptores sin el ligando unido, podemos ver como las protenas
inhibidoras interaccionan con el lugar de unin al ligando y por lo tanto van a competir por
ese lugar, pero tienen menos afinidad.

Cuando el ligando interviene la protena inhibidora es desplazada y el receptor sufre un cambio


conformacional que lo pliega y le permite unirse al DNA dando lugar a una estructura sobre la
que se ensamblan los co-activadores que van a permitir la transcripcin gnica.

11

Las mutaciones en las regiones de dimerizacin afectan negativamente a la funcionalidad del receptor.

166

Concretamente podemos observar la estructura del hGR cuando presenta unido un agonistas
(hlice plegada) y cuando presenta un antagonista (hlice extendida). Esta hlice 12 es crtica
para construccin de la maquinaria de transcripcin.

Cuando el receptor de glucocorticoides (GR) une a su ligando forma dmeros que se unen a sus
elementos de respuesta (GREs)
y son reconocidos por coactivadores como p160, CAF y
p300/CBP, formando conjuntos
de hasta 30-40 protenas que
representan la maquinaria de
transcripcin en la que se introducen las RNA polimerasas.
Como podemos ver, la regulacin de los niveles de GR se
produce a travs de la va UPS.

5 Modelos de actuacin de los receptores nucleares (NR)


Para entender como los receptores de hormonas liposolubles tenemos que tener en cuenta
que estos receptores nucleares (NR), para permitir la expresin de genes, van a tener que modificar la estructura de la cromatina a fin de que las polimerasas, helicasas y toda la maquinaria
de transcripcin pueda acceder.
Este cambio en la estructura de la
cromatina est mediada por las
protenas remodeladoras de la
cromatina que van a ser reclutadas por los receptores unidos a su
elemento de respuesta en el DNA.
Entre estos remodeladores tenemos las histonas desmetilasas
(HDMs), las histonas desacetilasas
(HDACs), ATPasas, Histona metiltransferasas (HMTs), histona ace167

tiltransferasas (HATs) en muchos casos dependientes del gaso de ATP y que en funcin de la
situacin van a actuar como co-activadores o co-represores activando o silenciando la expresin gnica.
Por ejemplo la hipoacetilacin y la metilacin de la histona H3 en la lisina9 (H3K9) se relaciona
con una represin por condensacin de la cromatina, mientras que la hiperacetilacin o la
metilacin en la histona H3 en la lisina 4 (H3K4) se relaciona con expresin por cromatina descondensada.
Algunos factores de crecimiento tambin van a colaborar con esta remodilacin mediante la
fosforilacin de protenas que va a llevar a la activacin de los receptores.
Por lo tanto, los complejos correguladores pueden estar bajo el control de rutas de sealizacin extra- e intracelulares que perciben los cambios en el entorno y el estado nutricional de
la clula y desencadenan cambios epigenticos apropiados.
En algunos casos, como en los receptores de hormonas liposolubles heterodimricos que se
presentan unidos a sus elementos de respuesta pero de forma no competente (las hormonas
tiroideas, los de cidos retinoicos, el de la vitamina D2 o D3), cuando no presentan ligando, la
hlice 12 acta como lugar de unin reconocido por los complejos de co-represores que mantienen el promotor silenciado.

Cuando llega el ligando, la hlice 12 se pliega, como si de un interruptor se tratase, y los complejos de co-activadores entran unindose a las secuencias LXXLL y provocando la remodelacin de la cromatina que permite la transcripcin.

5.1 Desensibilizacin de receptores


Un concepto importante es la desensibilizacin de receptores que se produce como respuesta
a una exposicin prolongada a un ligando. Llega un momento en el que, a pesar de que se
mantengan los niveles de ligando, no se produce ms respuesta.
Los dos motivos que explican este hecho es porque se produce una bajada en la afinidad del
receptor por el ligando o porque la cantidad de receptores disminuye. En muchos casos esta
bajada en el nivel de receptores se debe a que ellos mismos actan como reguladores negativos de los genes que los codifican, por lo que mientras que se produce la respuesta se reprime
la sntesis de receptores hasta que llega un momento en el que son degradados.
En otras ocasiones el receptor acta como una seal de expresin de ribonucleasas que degradan al mensajero que codifica el receptor. En cualquier caso, la forma ms rpida de desensibilizacin es la degradacin del receptor.

168

5.2 Modelo de regulacin del receptor de cido retinoico (RAR)


En ausencia de ligando, el receptor de cido retinoico (RAR) se encuentra unido a los elementos de respuesta (RARE) como un heterodmero con otros receptores (RXR). Este complejo
unido al DNA recluta al complejo N-CoRr (HDAC) con actividad histona desacetilasa que conduce a una estructura de cromatina reprimida. Adems otras protenas que interacionan con NCoR impiden la entrada de la polimerasa y de los factores generales de transcripcin, por lo
que se silencia an ms la expresin.

Cuando el cido retinoico se une a RAR las protenas del complejo N-CoR se disocian de los
heterodmeros y reclutan co-activadores como N-CoA, SRCs, P300/CBP, y el complejo PCAF
(HATs) relacionado con la acetilacin de histonas. La consecuente remodelacin de la cromatina que se produce permite la entrada de la polimerasa y de los factores generales de transcripcin.

5.3 Modelo de regulacin del complejo receptor de hormonas esteroideas (SRC)


Cuando los receptores de hormonas esteroideas (NR) unen su ligando (H) exponen sus motivos de unin para co-activadores rocos en leucina (L), lo que permite el reclutamiento del coactivador SRC (familia p160) en la regin potenciadora (Enhancer) de los genes diana con estos
elementos de respuesta.

169

Adems SRC interacciona a travs de un dominio rico en glutamina (Q) con CBP, p300, CAF,
CARM1 y PRMT1 que son co-activadores comunes dando lugar a la remodelacin de la cromatina mediante las actividades acetiltransferasa y metiltransferasa que permite el ensamblado
de los factores generales de transcripcin y de la RNA polimerasa II.

5.4 Estructura y dominios estructurales del receptor de vitamina D


La estructura de los receptores de vitamina D (VDR) es muy parecida a la de los anteriores, ya
que tambin presenta un dominio de localizacin nuclear, un dominio de unin con el DNA, un
motivo en dedos de cinc y una zona de unin al ligando.

Las regiones de activacin son las que tambin estn comprometidas con la dimerizacin que
se va a llevar a cabo para formar heterodmeros con los receptores de otras proteinas (RX).
Estos heterodmeros se unen a los elementos de respuesta y reclutan a co-activadores como
CBP, p300, remodeladores de la cromatina, proteinas activadoras de la familia p160 hasta
formar un holoenzima de 30-40 protenas que da lugar al complejo de transcripcin al que se
acopla la RNA polimerasa.
La importancia de la vitamina D radica en que su falta provoca raquitismo ya que es muy importante para la formacin del hueso. Su efecto permite retener el fosfato y el calcio necesarios para dar lugar al hidroxiapatito que lo forma.
Adems la vitamina D o la 1,25-dihidroxi-vitamina D como hormona est relacionada con la
regulacin de la proliferacin celular y la apoptosis, ya que es capaz de inducir la expresin de
50-60 genes en distintos tipos celulares.
Esta hormona detiene la progresin del ciclo celular en el paso de G1 a S, bien directamente o
mediante la induccin de factores de crecimiento como el factor de crecimiento transformante
(TGF, factor de no crecimiento).
La detencin es producida porque se va a promover la expresin de los inhibidores de los
complejos Ciclina/CDK, como p21 y p27, que contribuyen a la cada de la actividad quinasa y
conducen a la recuperacin de la protena retinoblastoma (RB) formada por p107 y p130, que
se une a E2F. Impidiendo la expresin de ciclinas.

170

Tambin afecta a la proliferacin inhibiendo la sealizacin por RAS bloqueando el receptor


del factor de crecimiento epidrmico (EGFR) que activaba a RAS, Raf, MEK y ERK para la sntesis de los genes anti-apoptticos y de proliferacin.
Finalmente la vitamina D induce la apoptosis directamente va inhibicin de la anti-apopttica
Bcl2 y mediante la activacin de la pro-apopttica Bax.

5.5 Acciones genmicas y no genmicas de los receptores de estrgenos


Los receptores de estrgenos pueden dar lugar a acciones directamente sobre el genoma,
como factores de transcripcin y no genmicas reclutando complejos proteicos que disparan
cascadas de transduccin.
En cuanto a las acciones genmicas el elemento de respuesta del receptor de estrgenos se
denomina ERE, y a l se unen directamente los receptores dimerizados a los cuales se les pueden unir posteriormente co-activadores.
Pero tambin se puede unir a otros factores de transcripcin como Fos y Jun (oncogenes que
forman el complejo AP-1), que lo necesitan para poder iniciar la expresin.
En muchas ocasiones estos complejos de factores de transcripcin formados van a tener que
ser fosforilados para ser activos y el propio receptor de hormonas esteroideas va a poder for-

171

mar complejos con PI3K, las quinasas de Src (SrcK), Ras y protenas G, que van a disparar la
cascada de transduccin que lleva a la fosforilacin.
En general hasta hace poco se consideraba que todas las acciones de los receptores se producan exclusivamente en el ncleo mediando como activadores o represores, pero ahora se
ha descubierto que estos tambin pueden promover acciones en el citosol que afectan a esta
regulacin a travs de otras protenas.

172

Tema 2: Hormonas hidrosolbles y


transdccion de senales
La inmensa mayora de las hormonas son de naturaleza polipeptdica y por lo tanto hidrosolubles lo que les impide atravesar las membranas celulares. Esto hace que precisen de receptores de membrana con los que van a colisionar provocando un cambio conformacional en el
receptor que lo va a capacitar para interaccionar con otras protenas y eventualmente para
exaltar actividades enzimticas propias del receptor o la produccin de segundos mensajeros.
Afortunadamente, el nmero de segundos mensajeros no es muy elevado por lo que podemos
nombrar AMPc, GMPc, xido ntrico (NO), diacilglicerol (DAG), cambios en la concentracin de
calcio e inositoles trifosfato (IP3).

1 Transmisin de seales
La transduccin de la seal producida por la colisin entre un ligando y el receptor es la
transmisin de un estmulo que informa a todos los componentes implicados en la respuesta.
Las clulas responden a gran variedad de estmulos como antgenos, glicoprotenas, seales de
desarrollo, componentes de la matriz extracelular, factores de crecimiento, hormonas, luz,
toque mecnico, neurotransmisores, nutrientes, olores, feromonas y sabores.
Pero en muchos casos, el fin de todas estas seales ser la produccin de segundos mensajeros que provocarn un cambio en el potencial de membrana que va a llegar hasta regiones
particulares del cerebro para integrar e interpretar las seales.

2 Caractersticas de la interaccin hormona-receptor


Podemos definir cuatro caractersticas fundamentales para la interaccin entre una hormona y
un receptor:
-

Se trata de una interaccin especfica ya que para cada receptor hay un ligando preferente, es decir, un ligando que presenta alta afinidad por un receptor concreto, aunque este puede ser estimulado por una gran cantidad de molculas similares como los
receptores y adrenrgicos que responden ante adrenalina.
Es un proceso de amplificacin ya que la interaccin que provoca la seal presenta
una estequiometria 1:1 pero la activacin del receptor produce cambios en ms de
una protena o da lugar a ms de un segundo mensajero por lo que la seal se amplifica. Por ejemplo, la activacin de adenilato ciclasa (AC) a travs de protenas G da lugar
a la produccin de gran cantidad de AMPc que a su vez activa a muchas molculas de
protein quinasa A (PKA) y esta fosforila a muchas protenas.
Se trata de un proceso sujeto a la desensibilizacin de receptores, es decir, que se
produce una atenuacin de la respuesta cuando la seal permanece en el tiempo o es
excesivamente intensa. En muchos casos la propia activacin del receptor desencade-

173

na un mecanismo de feedback o regulacin negativa que desencadena la desconexin


del propio receptor o su eliminacin de la superficie celular.
Se trata de un proceso en el que va a producirse una integracin de la seal ya que en
la membrana plasmtica hay toda una poblacin de receptores que pueden producir
seales positivas o negativas que dan lugar a un aumento o descenso de la actividad
de AC. Por ejemplo, el caf disminuye la actividad de la fosfodiesterasa encargada de
la degradacin de AMPc.

Los eventos que se pueden producir a lo largo de la transduccin de la seal quedan reflejados
a continuacin. En muchas ocasiones al principio de la seal suele generarse un conjunto de
protenas asociadas que se denominan generalmente como rel (Scaffold) que van a actuar
una a continuacin de la otra de forma concatenada. Estas protenas pueden estar reunidas
gracias a la participacin de una protena estructural que las aproxime para aumentar la eficiencia del mecanismo.
A continuacin se produce la amplificacin de la seal mediada por la produccin del segundo
mensajero que va a activar a
numerosas protenas que a su
vez actuaran sobre otras que
van a estar moduladas por
otros procesos y por lo tanto,
en este punto se produce la
integracin de seales positivas y negativas.
Finalmente llegamos a la modulacin de la seal donde se
va a producir un aumento de
protenas activadoras y un
descenso de las inhibidoras
para que los factores de
transcripcin queden libres o
activados y eventualmente
ingresen al ncleo para unirse
a sus elementos de respuesta
en el DNA y se produzca la
transcripcin gnica.

2.1 Cintica interaccin hormona-receptor


Los experimentos sobre la interaccin ligando-receptor se realizan mediante la utilizacin de
ligandos radiactivos, como por ejemplo, muscarotoxina radiactiva para el receptor nicotnico.
Generalmente la cintica se representa situando una cantidad creciente de ligando en abscisas
y no es todo radiactivo, sino que se realiza el experimento con una mezcla de ligando radiactivo y no radiactivo cuya concentracin puede variar desde 1-100 nM.

174

En 10 tubos de ensayo se introducen las mismas cantidades de protena (que sabemos que
presentan receptores), como por ejemplo 1 mg, se deja un tubo sin ligando (blanco) y a los
dems se les aaden concentraciones crecientes de ligando.
Se incuban los tubos durante un determinado tiempo y a continuacin se pasa el contenido
por un filtro que solo va a dejar pasar las molculas de bajo peso molecular, es decir, el ligando
no unido.
A continuacin pasas los filtros por un contador de centelleo (mide radiactividad)
empezando por el blanco, que nos va a
ofrecer el background inespecfico que
restaremos a las mediciones de receptor
con concentraciones de hormona crecientes, obtenindose la cantidad de ligando
por miligramo de protena. Esta curva es la
que se representa como unin total.
Esta unin es saturable, por lo que si se va aumentando la concentracin de ligando, llegar un
momento en el que no se ligue ms, pero las clulas o las membranas utilizadas presentan
muchas ms protenas de las que nos interesan y a las que tambin se puede pegar el ligando.
Por ello se repite el experimento con un antagonista del receptor concreto obtenindose solo
la seal del ligando que se ha unido inespecficamente porque los huecos en los receptores van
a estar ocupados por el antagonista.
Se resta este valor a la curva de unin y obtenemos los datos de unin especfica.
A partir de estos datos podemos hacer una representacin de la hormona ligada al receptor y
la relacin entre ligando unido y ligando libre. Esto simplifica el proceso porque cuando tu
realizas un experimento lo que puedes medir es la cantidad de ligando que se ha unido a una
protena y el resto que ha quedado libre. Por lo que si situamos en ordenadas la cantidad de
ligando (unido y libre), y en abscisas la cantidad de ligando unido, obtendremos una recta de
pendiente 1/Kd, es decir, la constante de disociacin, que cuanto menor sea, ms afinidad
tendr el receptor por la hormona.

175

Podemos observar los valores de la constante


de disociacin para diferentes agonsitas naturales de los receptores de adrenalina. La propia
adrenalina presenta Kd=5, el isoproterenol
Kd=0,4 y el antagonista Propranolol Kd=0,0046
por lo que este ltimo es un antagonista increblemente afn al receptor.

3 Modelos de transduccin de la seal


Existen varios modelos de transduccin de la seal que implican a diferentes tipos de receptores y que desencadenan la produccin de diferentes actividades.
El caso ms estudiado es el de los receptores 7tm que en presencia de ligando se activan y
producen la activacin de enzimas que desencadenan la produccin de segundos mensajeros a
travs de protenas G trimricas.
Los receptores de factores del crecimiento, dimricos per se o monomricos que dimerizan,
van a expresar actividad Y-quinasa en presencia del ligando fosforilando a toda una serie de
protenas que llegarn hasta los factores de transcripcin.
Otros clase de receptores son los monmeros que presentan un dominio extracelular de
unin al ligando y un dominio citoslico cataltico. El prototipo es el receptor de la guanilato
ciclasa (GC) de membrana, que ante la interaccin con el ligando va a provocar la generacin
de GMPc en el corazn, produciendo vasoconstriccin y vasodilatacin.
Luego tambin tenemos los canales inicos que responden a ligandos. Se trata de protenas
oligomricas en las que la interaccin con el ligando da lugar a una conformacin abierta por la
que pueden pasar iones a favor de gradiente de concentracin.

176

Quedan los receptores de hormonas liposolubles ya estudiados que atraviesan la membrana y


finalmente los receptores de adhesin como las integrinas que unen molculas de la matriz y
generan cambios conformacionales que pueden modificar la dinmica del citoesqueleto, como
en el caso de la morfognesis y la embriognesis.

4 Sistema adenilato ciclasa y AMPc


4.1 Receptores 7tm acoplados a protenas G
Los receptores 7tm estn formados por siete hlices transmembrana que se asocian en su cara
citoslica a protenas G trimricas que van a desencadenar el proceso que activar a una protena de membrana inactiva.
Cuando el ligando se une al receptor 7tm se produce un cambio de conformacin que afecta a
la protena G trimrica unida por dos puntos a la membrana. La subunidad G sea estimuladora o inhibidora est unida a la membrana mediante un resto de cido palmtico y la subunidad
G mediante una cola de polisopreno.
La activacin de 7tm provoca la separacin de G que en caso de ser activadora interacciona
con una tercera enzima, como la fosfolipasa C (PLC).

En mamferos se han identificado 24 genes para la subuindad G, 5 para la subunidad G y 11


para la subunidad G, que pueden alternarse para dar lugar a miles de combinaciones.
Dado que se han identificado ms de 1000 tipos de receptores 7tm, cada uno de ellos tendr
asociada una combinacin diferente de protenas G sin necesitar el mismo nmero de genes.
Este fue uno de los grandes problemas en los aos 60, ya que este tipo de receptores parecan
unir miles de ligandos diferentes desencadenando diferentes respuestas y no era posible que
los 7tm tuvieran miles de huecos de unin con ligandos, por lo que hasta el descubrimiento de
las protenas G como intermediarais entre el receptor y el sistema de transduccin, no se lleg
a comprender como se produca el proceso.

177

Los receptores 7tm presentan el extremo N-terminal en el exterior y el C-terminal en el interior relacionado con la protena G.
Cuando la protena G est en reposo presenta una molcula de GDP, pero cuando el receptor
se une al ligando provoca el intercambio de GDP por GTP que provoca la disociacin de la
subunidad Gs (activadora) hasta que la propia actividad GTPasa de la subunidad lo hidroliza y
desconecta el sistema.
Pero no tenemos que olvidar que las subunidades G/ tambin tienen actividad biolgica, como en el caso de la motilidad cardiaca donde la adrenalina estimula y la acetilcolina inhibe la
velocidad del ritmo cardaco. Esto se debe a que los receptores muscarnicos de acetilcolina
estn acoplados protenas Gi que disminuyen la actividad de adenilato cilcasa, pero adems las
subunidades y abren canales de potasio que favorecen la hiperpolarizacin de la membrana, atenuando la motilidad cardaca desde dos puntos.
Para saber si un proceso est mediado por una protena G se utilizan homlogos no hidrolizables de GTP que se unen a las subunidades G que van a impedir que el proceso que estamos
estudiando pare, por lo que si medimos el aumento del proceso en s, como la liberacin de
un compuesto, y vemos que tras aadir el homlogo este se vuelve constitutivo, podremos
determinar que hay protenas G implicadas.
Si la estructura del GTP sera GDP-O-P, homlogos no hidrolizables pueden ser GDP-S-P o
GDP-NH-P, que presentan un tamao parecido pero no pueden ser hidrolizados por la clula
por presentar nitrgeno o azufre, en vez de oxgeno.

4.2 Estructura de las protenas G trimricas y modelo de actuacin


La protena G monomrica Ras puede ser utilizada como modelo de la subunidad G de las protenas G trimricas.
En la estructura podemos diferenciar:
-

Centro de activacin donde se introduce el


GTP-Mg.
Interruptor switch I con un resto de glicina
(Gly60).
Interruptor switch II con un resto de treonina
(Thr35).
Resto de alanina (Ala146).
Estos aminocidos son muy importantes porque son
los que se encargan de excluir al ATP del centro de
activacin, permitiendo solo la entrada del ATP-Mg.
La unin del GTP a la protena se produce a travs
de la interaccin entre los oxgenos del ltimo
fosfato con la treonina y la glicina generando una
estructura muy compacta que puede interaccionar
con adenilato ciclasa, pero en el momento en el que
178

se hidroliza, la conformacin se abre y cambia radicalmente, imposibilitando la activacin.


En cualquier caso, sean protenas G estimuladoras (s) o inhibidoras (i) van a ser activas por el
intercambio de GDP por GTP que se produce gracias a protenas del tipo GEF (factores de intercambio) como Rh* (rodoxina excitada), -AR*(factor beta adrenrgico)y Sos que encontramos en el sistema de receptores para los factores de proliferacin (sistema de las MAPK).
Esto genera una protena G activa que
va regular otras enzimas aguas abajo
como la fosfodiesterasa de GMPc
(bajando los niveles de GMPc producido por guanilato ciclasa), Raf (que
tambin poda ser activada por Ras) y
Adenilato ciclasa.
Volviendo a la protena G activada,
tanto esta como Ras presenta una
actividad GTPasa intrnseca que va a
ser exaltada por otras enzimas como
GAP y RGS, que son moduladoras de
la actividad GTPasa. Esto provoca la
hidrlisis del GTP y la inactivacin de
la protena G.
En una protena Gs (activadora) normal, la actividad GTPasa termina con la seal del receptor
deteniendo la activacin de adeniliato ciclasa. Pero la toxina del clera, en presencia de NAD+
produce la separacin de la nicotinamida del ADP dando lugar a ADP-ribosa que se une a una
arginina de la subunidad (ribosilacin) inhibiendo completamente la actividad GTPasa y
provocando la activacin constitutiva de adenilato ciclasa, por lo que el AMPc se dispara. El
efecto sobre las mucosas intestinales es la aparicin de nauseas, diarrea y deshidratacin.
Por otra parte, la toxina de Bordetella pertusi se une a las proteinas Gi bloquendolas, por lo
que se favorece la accin de Gs y tambin aumenta la cantidad de AMPc.

179

En el caso de la motilidad cardaca vamos a encontrar implicadas a las protenas G. Por un lado
la acetilcolina frena el ritmo cardaco, por otro la adrenalina lo acelera.
Existen dos tipos de receptores de acetilcolina:
-

Los receptores muscarnicos (M1-5) actan asociados a protenas G donde podemos diferenciar entre:
o M1, M3 y M5 que estn acoplados a la produccin de IP3 mediante aumentos
de calcio.
o M2 y M4 acoplados a protenas Gi que bajan la actividad de adenilato ciclasa.

El receptor colinrgico muscarnico N2 es el que predomina en la musculatura cardaca y por


ello su activacin provoca una bajada del ritmo cardaco mediada por Gi, y adems las
subunidades y , se acoplan a canales de potasio que desencadenan una hiperpolarizacin de
la membrana, relajando el msculo.
-

Los receptores nicotnicos son canales inicos.

Existen multitud de estos sistemas enzimticos y cada uno de ellos especializado en diferentes
actividades, tal y como se muestra en la tabla donde se indica el tipo de protena G trimrica y
las subunidades que median en la funcin.

4.3 Sistema Adenilato ciclasa, AMPc y PKA


La enzima adenilato ciclasa es una protena
monomrica adosada a la membrana plasmtica que a expensas de ATP-Mg produce AMPc. El
AMPc es una molcula que va a estar regulado
por dos sistemas, la propia adenilato ciclasa,
que lo produce, y la fosfodiesterasa (PDE) de
AMPc que lo degrada a AMP.
Para facilitar la transduccin de la seal hasta la
proteinkinasa A (PKA), en muchas ocasiones el
sistema de adenilato ciclasa se encuentra aso180

ciado a PKA mediante protenas de anclaje como AKAP79 (protena estructural de anclaje de
PKA a adenilato ciclasa) o la gravina (ADAP250) que se asocia a la membrana.
PKA consta de dos subunidades catalticas (azul) y dos subunidades reguladoras (rojo) que
presentan menor afinidad por las primeras que el AMPc, por ello cuando la concentracin aumenta desde 1 M a 5 M, la subunidad cataltica es desplazada por el AMPc, liberndose.
Cada una de las subunidades reguladoras presenta dos sitios de unin para AMPc por lo que
sern necesarias 4 molculas de
AMPc para provocar el cambio conformacional que disminuye la afinidad por la subunidad cataltica hasta
en 10.000 veces.
Las subunidades catalticas de PKA
son activas en el momento en el que
son liberadas, debido a que las
subunidades catalticas funcionan
como un dominio pseudosustrato
que impedan la actividad enzimtica
de PKA.
La PKA regula a un gran nmero de protenas a travs de su actividad S/T quinasa cuyo sitio de
fosforilacin se caracteriza por presentar arginina (R) o lisina (K) en posicin -1/-2. Para hacernos una idea de las seales reguladas a travs de AMPc como segundo mensajero tenemos la
tabla de la derecha.

El modelo de actuacin del sistema comienza con la unin del ligando al receptor que activa a
una protena G que va a interaccionar con adenilato ciclasa. El aumento en la concentracin de
AMPc provoca la liberacin de PKA que va a fosforilar a protenas como CREB, que se nir a su
elemento de respuesta (CRE) al dimerizar y reclutar co-activadores como CBP y P300.
Como podemos ver a propsito del receptor de glucocorticoides, este es un punto en el que
ambas vas van a desencadenar el mismo efecto.

181

4.4 Desensibilizacin de receptores


Uno de los aspectos ms importantes que ya se han comentado con posterioridad es la desensibilizacin de los receptores que se produce por una exposicin prolongada al ligando y que
desencadena una disminucin de la afinidad por el ligando o una disminucin del nmero de
receptores.
La unin del receptor al ligando lo convierte en sustrato de las propias quinasas a las que activa, como PKA, dando lugar a un sistema de retroalimentacin negativa. Esta fosforilacin se
clasifica como homorica al ser producida por PKA, o heteromrica cuando se da a travs de
una quinasa especfica como ARK (quinasa del receptor -adrenrgico). En cualquier caso, el
reclutamiento de las quinasas dependen de protenas como las subunidades y de protenas G disociadas.
Una vez que el receptor es fosforilado su afinidad por la -arrestina
aumenta, y esta recluta a adaptinas
que van a interaccionar con la clatrina para formar vesculas endocticas que internalizarn los receptores hacia el endosoma temprano.
Es en este momento en el que el
ligando es liberado del receptor, ya
que si se introdujera en la vescula
endoctica seguira estimulando al
receptor.
Los receptores permanecern en
los endosomas hasta ser desfosforilados por protein-fosfatasas mientras la oleada de hormonas disminuye.

5 Sistema de fosfolipasa C, IP3 y DAG


Otro de los segundos mensajeros que van a
actuar en las rutas de transduccin celulares es
el inositol 1,4,5-trifosfato (IP3). Se trata de un
ciclohexano hexol (no azcar, no hay oxgeno
en el ciclo) que presenta seis grupos hidroxilo,
tres de los cuales estn enlazados a fosfato.
El IP3 es una molcula muy hidroflica que va a
actuar como segundo mensajero y no debe ser
confundido con los inositoles-fosfato que presentan el fosfato en posicin 3, que suele estar
relacionada con el anclaje de protenas.
182

5.1 Sistema de la fosfolipasa C (variante )


La fosfolipasa C se activa mediante la unin de un ligando a los receptores 7tm asociados a
protenas Gq que provocan el intercambio de GDP por GTP, dando lugar a la separacin de la
protena G.
La protena Gq activa a la fosfolipasa C que va a
dar lugar a dos segundos mensajeros a partir
del fosfatidilinositol 4,5-bifosfato:
-

El IP3 que se va a desplazar hasta los receptores de IP3 en el retculo endoplasmtico, que son canales inicos de calcio que responden a ligando. Cuando se
produce el impacto, los canales se
abren durante un corto periodo de
tiempo provocando una salida masiva
de calcio que va a ser receptado inmediatamente por los sistemas pertinentes.
El diacilglicerol (DAG) que va a difundir
por la cara citoslica de la membrana
plasmtica para activar a la proteinquinasa C (PKC) junto con el calcio liberado. La vida media del DAG es corta ya
que va a ser rpidamente eliminado por
las fosfolipasas A1 y A2.

Se ha comprobado que la activacin de PKC est medida por el calcio gracias a que la adicin
de EDTA (acomplejante de cationes divalentes) impide su activacin.
En cuanto a las concentraciones de cada uno de estos segundos mensajeros en el caso del IP3 puede variar desde 109
hasta 10-8 mientras que el calcio oscila entre 10-7 (0,1 M)
hasta 10-6 (1 M), pudiendo alcanzar en algunas ocasiones 5
M.
La PKC est implicada en la proliferacin celular por lo que la utilizacin de esteres de forbol,
que mimetizan las acciones del DAG van a provocar una activacin muy poderosa del sistema
que inducir la formacin de tumores.

183

Pero estos steres presentan una vida media muy larga y por ello sobreactivan a la PKC, como
es el caso de acetato de miristoilforbol. Aunque la naturaleza de sus colas hidrofbicas y del
propio ncleo es distinta, tiene una gran afinidad por PKC y provoca una proliferacin celular
excesiva, lo que demuestra la relacin de la quinasa con la iniciacin del ciclo celular.
A groso modo, PKC activa a numerosos factores de transcripcin como AP1 (Fos y Jun), muy
importantes en el paso de G0 a G1. En la tabla podemos ver algunas de las seales que actan
a travs de la fosfolipasa C, el IP3 y las variaciones en la concentracin de calcio.

Adems, algunos factores de transcripcin como Tubby precisa de la accin de la fosfolipasa


C (no de PKC) para activarse. El factor de transcripcin Tubby se encuentra asociado a la membrana plasmtica a travs del fosfatidilinositol-4,5-bifosfato, por lo que hasta que la fosfolipasa
C no separe el DAG y el IP3, no queda libre, mostrando sus seales de importancin al ncleo.

5.2 Sistema fosfolipasa C (Variante )


Adems de lo ya comentado, existe una variante de la fosfolipasa C, la PLC que se va a activar
a travs de receptores con actividad Y-quinasa, como el del factor de crecimiento derivado de
plaquetas.
Cuando PDGF impacta con el receptor se produce la fosforilacin cruzada que da lugar a la
aparicin de restos de Y-fosfato en el dominio citoslico, que pueden ser reconocidos por protenas como PI3K, GAP y la PLC, que se activa, en este caso sin la intermediacin de protenas
Gq.

184

El motivo por el que esta PLC puede interaccionar con el receptor se debe a que presenta
dominios SH2 y SH3 que le va a permitir unirse a los restos de Y-fosfato.

5.3 Variantes de PKC


La familia de las PKC presenta unas 12 variantes que quedan englobadas, segn su dominio
regulador en tres grupos, las clsicas (c-PKCs), las no clsicas (n-PKCs) y las atpicas (a-PKCs).
Cada una de estas se dividen en clases dentro de las cuales vamos a encontrar diferentes dominios:
-

Las c-PKCs se caracterizan por la necesidad de unir calcio, son las clsicas ya estudiadas y van a presentar una regin exclusiva de unin a calcio. Dentro de estas encontramos las , I, II y .
Las n-PKCs no precisa de calcio y se van a diferenciar entre ellas por la regin bisagra.
Dentro de estas encontramos las , , y .
Las a-PKCs tampoco precisa de calcio para su activacin y dentro de ellas encontramos
las y las isoformas / .

Todas ellas presentan un dominio pseudosustrato, el sitio de unin para DAG y esteres de forbol, dedos de cinc con restos de cistena, la regin de unin a ATP y la regin cataltica.

185

5.4 Control de la cantidad de calcio libre en el citosol


El control de la cantidad de calcio libre en el citosol se controla a travs de sumideros:
-

El propio retculo endoplasmtico presenta bombas de calcio que introducen constantemente el catin en contra de gradiente de concentracin.
La mitocondria tambin es capaz de acumular calcio a expensas de la fuerza protnmotriz.
En el citosol podemos encontrar protenas ligantes de calcio que captan el calcio libre,
reduciendo sus niveles como es el caso de la calmodulina.
En la membrana plasmtica tambin vamos a encontrar una bomba de calcio y un antiporter con sodio, que permite mantener la concentracin citoslica baja.

El retculo plasmtico es
el principal almacn de
calcio, pero su salida y
retirada por otros sistemas pueden provocar
que se vace. Para impedirlo existen puntos
de contacto entre el
retculo y la membrana
plasmtica a travs del
acoplamiento de protenas que van a introducir calcio directamente al retculo endoplasmtico a favor de
gradiente de concentracin.

5.4.1 Calmodulina y Calcio-Calmodulina quinasa


La calmodulina es un una de las protenas ligantes de calcio que van a actuar como un sensor,
cambiando su conformacin en funcin de la concentracin del catin. Existe toda una familia
de estas protenas.
Estructuralmente, la calmodulina presenta forma de mancuerda que en sus extremos puede
unir un par de tomos de calcio (4 en total). Cada una de esas zonas de unin se describen
como una mano EF en la que participan una hlice E y una hlice F, siendo la primera la que
une ambos motivos en la estructura de mancuerda.

186

Cuando la concentracin de calcio pasa del estado basal (0,1 M) al entorno de 0,5 M, la
calmodulina liga clcio y sufre un cambio conformacional que expone regiones hidrofbicas
que le van a permitir interaccionar con gran variedad de protenas como la calcio-calmodulina
quinasa que es una S/T quinasa.
Un ejemplo de acontecimientos relacionados con la calmodulina es la exocitosis de las vesculas sinpticas que depende de la concentracin de calcio en la terminal. La concentracin de
canales de calcio dependientes de voltaje es muy alta en la terminal sinptica y cuando llega
un potencial de accin estos se abren, aumentando la concentracin de calcio. El aumento de
la concentracin de calcio es detectado por la calmodulina, que activa a la calcio-calmodulina
quinasa 2 que comienza a fosforilar a las protenas del citoesqueleto, liberando las vesculas
que se fusionan con la membrana para verter su contenido al espacio sinptico.
Procesos como la secrecin de saliva, insulina y otras hormonas como la histamina son tambin dependientes de calcio.
La calcio calmodulina quinasa es una protena oligomrica con un dominio cataltico y un
dominio inhibitorio que va a presentar memoria.
Cuando la calmodulina con calcio se une a la quinasa, esta sufre un cambio conformacional
que mediante el uso de ATP realiza una primera autofosforilacin alcanzando el estado de
activacin completa.
Al bajar la concentracin de calcio, la calmodulina se disocia, pero la quinasa sigue parcialmente activa (50%) debido a la autofosforilacin hasta que las fosfatasas correspondientes
retiren el resto de fosfato.
Por lo tanto, la actividad de calcio-calmodulina quinasa va a depender de la concentracin de
calcio, la disponibilidad de calmodulina y fosfatasas.
5.4.2 Protenas reguladas por calcio y calmodulina
Entre las protenas reguladas por los niveles de calcio a travs de la calmodulina podemos citar:
-

Adenilato ciclasa en el cerebro.


Calcio-calmodulina quinasa I-IV (CaMK I-IV)
Liberacin de calcio desde el retculo sarcoplasmtico a travs de canales dependientes de calcio.
Calcineurina (fosfoprotein fosfatasa 2B)
Fosfodiesterasa de AMPc
Canales olfativos abiertos por AMPc
Glutamato descarboxilasa (GlutamatoGABA). El glutamato es, junto a la acetilcolina,
uno de los neurotransmisores excitatorios a nivel de sistema nervioso, pero el GABA es
inhibitorio, por lo que altos niveles de glutamato pueden desencadenar convulsiones,
mientras que altos niveles de GABA conducen a un estado depresivo. La descarboxilasa
utiliza fosfato de piridoxal como cofactor.
Quinasas y sintasas varias como la xido ntrico sintasa, que cataliza la formacin del
segundo mensajero.
187

PI3K (oncogn) que fosforila a los fosfolpidos de inositol en posicin 3 (anclaje a quinasas dependientes de fosfoinostidos relacionadas con la supervivencia celular). Por
lo que la fosfatasa correspondiente sera un anti-oncogen.
Bomba de calcio de la membrana plasmtica que va a funcionar o no dependiendo de
la concentracin de calcio y por ende de calmodulina.

5.4.3 Canales de calcio receptores de IP3


Los receptores de IP3 situados en la membrana del retculo endoplasmtico son canales que se
abren por la unin del ligando. Estos receptores se encuentran agrupados gracias al citoesqueleto formando islas de canales que estn mayoritariamente cerrados a bajas concentraciones
de IP3 por lo que la concentracin
de calcio es muy pequea.
Cuando la concentracin de IP3 es
suficientemente alta, toda una de
estas islas de receptores se abre y
se produce un disparo en los niveles de calcio. Por los efectos de la
difusin del IP3 estas islas se van
abriendo y cerrando progresivamente dando lugar a una onda de
calcio, que va recorriendo la superficie del retculo.
Finalmente el IP3 va siendo degradado rpidamente por las fosfatasas que retiran el fosfato de la
posicin 4 o 5, inactivndolo como segundo mensajero.
5.4.4 Evaluacin experimental de los aumentos de calcio
Dado que el mensaje producido al final es el cambio en la concentracin de calcio para evaluar este cambio en el laboratorio tenemos varias estrategias.
Mediante el uso de electrodos especficos para medir los niveles de calcio podemos evaluar la
capacidad de la fraccin microsomal para acumular calcio. Para ello comenzamos calibrando el
electrodo mediante una preparacin a la que aadimos calcio y EDTA alternativamente, comprobando que se produce una bajada al aadir el quelante.
A continuacin en una preparacin ponemos la fraccin microsomal y calcio, y medimos el
nivel de calcio libre con el electrodo. Si el retculo est en condiciones adecuadas, la adicin de
ATP-Mg pondr en marcha las bombas de calcio y se producir una bajada en la seal.
Estableciendo en que unidades cae la cantidad de calcio libre, podemos determinar el acmulo
de calcio por cantidad de protena. Es decir, que si hemos utilizado 0,1 mg de retculo y se ha
producido una cada del orden de 500 nmoles de calcio, la capacidad de acmulo ser de 5
mol de calcio por cada mg de protena.
188

Una vez hecho esto, se puede evaluar el funcionamiento de los canales de calcio mediante la
adicin de IP3 o una pequea cantidad de detergente que libera todo el
calcio que haya en el retculo.
Otro sistema que nos permite evaluar los niveles de calcio son los indicadores metalocrmicos, molculas
que cambian de color en funcin de
la concentracin de un determinado
in, en este caso el calcio, cuyo indicador ms utilizado es Fura-2.
Fura-2 es una molcula permeable y
penetra en el interior de la clula y
permite un seguimiento in vivo de
las variaciones en la concentracin
de calcio, lo que permite el estudio
de receptores como los muscarnicos
(M1, M3 y M5).

6 Sistema de guanilato ciclasa


Otro de los segundos mensajeros que se puede generar en una clula es el GMPc producido
por la guanilato ciclasa a partir de GTP-Mg que conlleva la liberacin de pirofosfato.
Existen dos variedades de guanilato ciclasa en funcin de su localizacin:
-

La guanilato ciclasa de membrana est inserta en la membrana plasmtica y


presenta dos variantes:
o La guanilato ciclasa que es receptor de ANF (factor natriuretico cardaco).
o La guanilato ciclasa que es receptora de guanilina y endotoxinas.
La guanilato ciclasa solbule que cordina elementos como el hierro (hemo) y
que es activada por el xido ntrico
(NO).

El xido ntrico es una molcula fabricada por la xido ntrico sintasa que presenta una gran
variedad en cuanto a formas y distribucin (inducible, endotelia, neural,). La reaccin de
sntesis comienza con la arginina (R), y mediante la adicin de oxgeno y la utilizacin de poder
reductor (NADPH) se produce citrulina, y una molcula de xido ntrico.

189

El xido ntrico es en realidad un radical libre que presenta un electrn desapareado en su


orbital ms externo, por lo que su vida media es muy corta (s) y es rpidamente transformado en nitrito y posteriormente a nitrato.

Pero este tiempo es suficiente para activar a la guanilato ciclasa y aumentar al concentracin
de GMPc, que posteriormente ser degradado por la fosfodiesterasa de GMPc.
Uno de los efectos del GMPc es provocar la relajacin de la musculatura lisa (vasodilatador)
por ello a las personas con una angina de pecho se les administra una pastilla de nitroglicerina
(libera NO) bajo la lengua.
Por ejemplificar esta relajacin
muscular de manera natural, la
acetilcolina se une a los receptores de las clulas de los endotelios que presentan receptores mucarnicos (M1, M3 o
M5) dando lugar a la activacin
de la PLC que conlleva un aumento en la concentracin de
IP3 y de calcio-calmodulina, que
como vimos anteriormente es
un activador de la xido ntrico
sintasa.
La produccin de xido ntrico y su difusin a travs del tejido estimula a los receptores de NO,
en la musculatura lisa que producen la activacin de guanilato ciclasa y dan lugar a la formacin de GMPc que activa a la proteinquinasa G (PKG S/T quinasa) que va a fosforilar a las protenas que conducen a la relajacin muscular.
En la medida en la que se active a guanilato ciclasa o se bloquee la accin de las fosfodiesterasas de GMPc esta enzima permanecer ms tiempo activada.
La viagra (Sildenafil) es un compuesto que bloquea la
accin de la fosfodiesterasa de GMPc 5, y por ello
mantiene elevados niveles de GMPc y acta como un
vasodilatador.

190

Tema 3: Factores de proliferacion cellar.


Origen del cancer
En 1982 se produjo un hallazgo trascendental que sentara las bases del estudio del cncer y
fue el descubrimiento de la protena Src con actividad Y-quinasa. La protena Src o protena
del sarcoma de Rous presenta una variante celular C-Src y una variante de origen viral V-Src.
Cuando un organismo era infectado con el virus portador de V-Src desarrollaba tumores, por lo
que se estableci una relacin directa entre la actividad Y-quinasa y la proliferacin celular, y
por ende, un punto de estudio clave contra el cncer.

1 Receptores con actividad Y-quinasa


El estudio de los receptores con actividad Y-quinasa revelo que todos estaban formados por un
dominio externo, un dominio transmembrana y un domino citoslico que era el que desarrollaba la actividad cataltica Y-quinasa.
El dominio citoslico presenta una actividad intrnseca muy baja que es exaltada cuando el
dominio externo recibe el impacto del ligando, pero este ltimo presenta una gran variabilidad pudiendo encontrarse dmeros, como el receptor de insulina (INS-R), otros que dimerizan
como el receptor del factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF-R) que presenta dominios tipo IgG, el receptor del factor de crecimiento de los endotelios vasculares (VEGF-R), el
receptor del factor de crecimiento epidermal (EGF-R). Tambin aparecen dominios externos
ricos en leucina como es el caso del receptor del factor de crecimiento neural (NGF-R). Pero
todos ellos con el mismo dominio citoslico de actividad Y-quinasa.

En estos receptores podemos establecer tres niveles de actividad, por un lado la actividad
basal propia, por otro la actividad que presentan cuando se unen al ligando y finalmente el
nivel de actividad mximo tras producirse la autofosforilacin cruzada.
La mayora de las clulas se encuentran quiescentes hasta que reciben en sus receptores el
impacto de un factor de crecimiento que desencadena un aumento en la cantidad de ciclinas
mitticas que permiten el paso de G0 a G1.
191

La mayora de estos receptores desarrollan actividad Y-quinasa, pero tambin podemos encontrar algunos ejemplos de receptores con actividad S/T-quinasa, e incluso algunos con actividad
Y-fosfatasa, ya que muchas protenas van a ser activas en su forma desfosforilada.

1.1 Modelo de activacin de receptores con actividad Y-quinasa


En la actualidad se conocen ms de 50 receptores distintos con actividad Y-quinasa, pero se
van a distinguir entre ellos los que desarrollan la actividad de manera directa y los que lo hacen a travs de otras protenas que son reclutadas tras el impacto del factor de crecimiento.
Los receptores que desarrollan actividad Y-quinasa de manera directa (RTKs, Receptor tyrosine kinases) cuando se unen a su ligando cambia de conformacin y dimerizan, permitindose
la fosforilacin cruzada, primero de los labios inhibidores del dominio citoslico y a continuacin de todo el dominio citoslico.

Los receptores que no presentan actividad Y-quinasa intrnseca, como el receptor de citoquinas, presentan asociadas protenas Y-quinasas como JAK (Janus kinase) o SrC, cuya actividad es
exaltada al dimerizar el receptor, provocando la fosforilacin cruzada de los labios inhibitorios
que presentan y a continuacin del resto del dominio citoslico.

La dimerizacin de los receptores monomricos fue uno de los problemas importantes de la


biologa molecular ya que la mayora de los receptores se encuentran como monmeros empaquetados en los Rafts lipdicos dispersos. Por ello, hasta que no se produzca la coalescencia
que los aproxime gracias a las protenas del citoesqueleto no podra haber activacin. Pero
claro, la pregunta resida en el mecanismo de aproximacin de los monmeros antes de la
activacin.

192

En esta tabla podemos ver algunas de las protenas sealizadoras que actan a travs de RTKs.
Protena sealizadora
Factor de crecimiento epidermal (EGF)
Insulina
Factores de crecimiento tipo
insulina (IGF1 e IGF2)
Factor de crecimiento neural (NGF)
Factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF)
Factor estimulador colonial
del macrfagos (MCSF)

Receptor

Algunas respuestas representativas

EGFR

Estimulacin de la supervivencia celular, crecimiento y proliferacin, o diferenciacin de algunos tipos celulares. Acta como una
seal inductiva en el desarrollo.

Receptor de
insulina
IGF receptor 1

Estimula el crecimiento celular y la supervivencia de muchas clulas.

Trk A

Estimula la supervivencia y el crecimiento de algunas neuronas.

PDGFR
MCSFR

Factor de crecimiento de
fibroblastos

FGFR

Factor de crecimiento de los


endotelios vasculares
(VEGF)

VEGFR

Estimula la utilizacin de carbohidratos y la sntesis de protenas.

Estimula la supervivencia, crecimiento, proliferacin y migracin


de varios tipos celulares.
Estimula la proliferacin y diferenciacin de monocitos/macrfagos.
Estimula la proliferacin de varios tipos de clulas e inhibe la
diferenciacin de clulas precursoras. Acta como una seal inductiva en el desarrollo.
Estimula la angiognesis.

1.2 Estructura de los factores de crecimiento


1.2.1 El factor de crecimiento transformante
El factor de crecimiento transformante (TGF) es un ligando dimrico cuya estructura facilita la
dimerizacin de receptores, ya que una de las dos unidades que lo forman se asociar a un
monmero. Presenta un tamao de entre 50-70 aminocidos y es resistente a la accin proteoltica. De los nueve restos de cistena (C) que presenta cada monmero 8 estn comprometidos en puentes disulfuro intracatenarios y uno de ellos une ambos monmeros mediante un puente intercatenario (enlace covalente).
Este tipo de factores se vierten desde
las clulas secretoras por va endrocrina al torrente circulatorio.

1.2.2 Eritropoyetina (EPO)


La eritroproyetina (EPO) presenta una estructura
monomrica con un par de hlices laterales que dan
lugar a una estructura casi simtrica que va a permitir la interaccin con dos receptores monomricos al
mismo tiempo, facilitando el proceso de dimerizacin, a pesar de no ser un dmero en s.
En cualquier caso, los receptores deben de estar
prximos entre s.
193

1.2.3 Factor de crecimiento epidermal


En el caso del receptor del factor de crecimiento epidermal ya no es el propio factor el
que media la dimerizacin de los receptores,
sino el cambio de conformacin que este
provoca, permitiendo a los monmeros interaccionar a travs de una regin bisagra
que exponen al unirse al ligando.
Una de las suposiciones sobre el porqu de la
necesidad de la dimerizacin radica en que
la actividad Y-quinasa debe estar muy controlada, ya que si se prolonga se desarrolla
un cncer.

1.2.4 Factor de crecimiento derivado de fibroblastos


El factor de crecimiento derivado de fibroblastos es
una protena que contiene restos de heparan sulfato
que van a establecer interacciones entre ambos monmeros del receptor permitiendo su dimerizacin.

En este caso sin la presencia de estos azcares ambos receptores no podran interaccionar, ya
que se sitan entre ambos impidiendo la repulsin.

1.3 Fosforilacin de tirosinas y dominios


Como ya se coment en el tema anterior, el impacto del
factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) sobre
su receptor (PDGFR) provoca en primer lugar la fosforilacin del sitio cataltico y posteriormente la de restos de
tirosina (Y) ms alejados.
Los restos de Y-fosfato son en realidad puntos de interaccin para protenas que presentan dominios SH2 (dominio
194

de homologa 2 con Src). Los dominios SH2 son dominios estructurales que permiten la interaccin con restos de Y-fosfato y aminocidos adyacentes.
La unin a travs de los dominios SH2 no provoca un cambio conformacional en la protena,
pero su aproximacin a la actividad Y-quinasa del receptor promueve la fosforilacin de la
protena que interacciona y el consiguiente cambio que la capacita para realizar una funcin.
Las protenas que encontramos con este tipo de dominios y que van a interaccionar con estos
receptores son la fosfolipasa C- (PLC), que va a generar DAG e IP3, PI3K, que desencadenaba
la ruta de activacin de PKB, y otras protenas reguladoras como GAP (GTPase-activating protein).

La protena Src tiene tres dominios muy importantes:


-

Dominio SH2 de reconocimiento de Y-fosfato.


Dominio SH3 de reconocimiento de prolina.

La Src o protena del sarcoma de Rous es una protena oncognica que presenta un estado inactivo autoinhibido cuando
uno de sus restos de tirosina se encuentra fosforilado y es
reconocido por su dominio SH2. Adems presenta un dominio SH3 que se une a restos de prolina (P) de la propia protena.
Cuando acta una fosfatasa sobre Src o por una mutacin
pierde el dominio que porta la tirosina da lugar a una protena mutante que se encuentra activa constitutivamente,
algo que ocurre habitualmente en versin viral del gen (VSrc).
Cuando esto ocurre, la protena desarrolla actividad Yquinasa reconociendo a otras a travs del dominio SH2 y
SH3 fosforilandolas.
195

En el caso de la glucoqueno sintetasa quinasa 3 (GSK3) va a ser una


serina fosforilada la que se introduzca en el sitio cataltico inactivandola. GSK3 reconoce protenas a fosforilar en restos de S/T por
la presencia en primer lugar de una serina fosforilada y una serina
susceptible de serlo.
En humanos sea han clasificado ms de 90 protenas con dominios
SH2 y ms de 24 con dominios PTB (similares a SH2 pero no homlogos). Estos dominios presentan un tamao de unos 100 aminocidos que generan un canal para acomodar al resto de Y-fosfato y a
los aminocidos circundantes (secuon).
Generalmente los dominios SH2 interaccionan con un resto de Yfosfato al que se denomina posicin 0, y con los siguientes tres
aminocidos denominados como +1, +2 y +3.
Por ello dentro de los dominios SH2 se encuentran
diversos tipos entre los que encontramos unos que
reconocen aminocidos cargados negativamente
(Src, Fyn, Hck y Nck), otros que interaccionan con
aminocido alifticos en posiciones desde +1-+5
(PLC-C y SHP-2)
Por ello podemos establecer una multifuncionalidad proteica en funcin de los dominios funcionales
que presenten en su secuencia.
La protena Grb2 es un adaptador que acopla la
accin del receptor de insulina (IRK) con Sos para activar a la glucgeno sintasa. Esta interaccin se produce a travs de los dominios SH2 y SH3 que presenta la protena.

La protena estructural Shc presenta dominios SH2 y PTB, y como hemos visto Src presenta
dominios SH2, SH3 y un dominio Y-quinasa.

La protina Shp2 es una Y-fosfatasa que presenta dominios SH2, adems del propio de la actividad cataltica. Por lo que cuando este interacciona con el receptor fosforilado produce una
interrupcin de la activacin.

196

La protena Ras-GAP se encarga de exaltar la actividad GTPasa de Ras y presenta adems de


los dominios SH2 y SH3, un dominio PH que liga fosfolpidos de inositol con fosfato en posicin
3 y el dominio C2 de asociacin a los fosfolpidos de la membrana mediante calcio.

La protena STAT es un factor de transcripcin que presenta un dominio SH2, junto con un
dominio de unin al DNA y uno de activacin de la transcripcin (TA).

La protena SOCS es una reguladora de la seal que presenta SH2 y un dominio que facilita la
actividad de una E3-ligasa de ubiquitina que se relaciona con la degradacin de receptores a
travs del sistema UPS.

Finalmente la protena PLC- que produce el IP3 y el DAG como segundos mensajeros est
formada por una gran multitud de dominios como PH, SH2, SH3, C2,

Debemos entender que la interaccin de estos dominios con sus secuencias sustrato o sus
ligandos produce en mayor o menor medida la activacin de la enzima y por lo tanto segn las
teclas que toquemos tendremos unos efectos u otros.
La activacin permanente de la fosfolipasa C por parte de los steres de forbol desencadenan
cncer. Pero si en cualquiera de los estmulos que es capaz de percibir PLC- se produce un
exceso de activacin, tambin ha a desencadenar el cncer.

1.4 Rutas de sealizacin en las que intervienen Y-quinasas


1.4.1 La insulina como factor de crecimiento
Cuando la insulina impacta contra el receptor de insulina IRK induce la autofosforilacin cruzada en los restos de tirosina del dominio citoslico. Estos restos de Y-fosfato son reconocidos
por diversas protenas con dominios SH2, como IRS-1 (Sustrato del receptor de insulina 1) que
presenta un dominio tipo PTB, que al interaccionar con el receptor fosforilado acerca a la protena para ser fosforilada tambin.
A continuacin, Grb2 se une a los restos de Y-fosfato de IRS-1 a travs de sus dominios SH2,
siendo competente para interaccionar con Sos a travs de los dominios SH3.
La interaccin Grb2-Sos permite a este ltimo catalizar el intercambio de GDP por GTP en Ras,
que entonces une y activa a Raf-1.

197

Raf-1 es una S/T quinasa que va a


fosforilar a MEK en dos residuos de
serina (S) dando lugar a un cambio
de conformacin que la capacita
como quinasa. La quinasa MEK es
un tanto especial, porque presenta
los dos tipos de actividad quinasa,
es decir es una Y-quinasa y una
S/T-quinasa al mismo tiempo.
Ahora MEK fosforila a ERK, una de
las conocidas como MAP quinasas
(MAPK), en un residuo de tirosina
(Y) y otro de treonina (T) provocando un cambio de conformacin que
le permite su importacin al ncleo
donde acta como factor de transcripcin directamente o fosforilando a otros factores que dimerizan y
se activan provocando la expresin
de genes implicados en la divisin
celular.
1.4.2 La fosforilacin de IRS-1 tambin activa la va de PKB
La fosforilacin de IRS-1 se produce en varios restos de tirosina (Y), por lo que se van a establecer varios puntos de reconocimiento para diferentes protenas. Uno de ellos activa a PI3K a
travs de un dominio SH2 dando lugar a la produccin de inositol-3,4,5-trifosfato al que se va a
unir PKB o PDK1 (quinasa dependiente de fosfoinostidos).
Adems la propia PKB va a poder
ser fosforilada por PDK1, activndose y fosforilando a GSK3 en un
residuo de serina, inactivndola.
Esto desencadena la activacin de
la glucgeno sintasa.
Como podemos ver hay 5 quinasas implicadas, el receptor, PI3K,
PDK1, PKB y GSK3.
1.4.3 Mltiples cascadas a partir del receptor de insulina
El propio receptor de insulina activado puede ejercer su accin Y-quinasa sobre otros receptores como GPCR, desencadenando de manera adicional la va de las MAPK a travs de Grb2,
Sos, Ras, Raf-1, MEK y ERK.

198

Pero es que la va de PKB comentada en el apartado anterior tambin est implicada en la internalizacin del GPCR. Cuando PKB fosforila en serinas (S) al receptor este es reconocido por
la -arrestina e internalizado.

1.4.4 Detalles de la activacin de la ruta de las MAPKs


Comenzando dese el principio, la unin de las hormonas provoca la dimerizacin y fosforilacin del receptor en residuos de tirosina. A continuacin Grb2 se une a travs de su dominio
SH2 a estos restos de Y-fosfato y a continuacin interacciona con Sos a travs del dominio SH3.

Esto permite a Sos posicionarse para producir el intercambio de GDP por GTP en Ras, que pasa
a un estado activo.

199

Mientras Ras no hidroliza el GTP est activo, favoreciendo la activacin de Raf-1. La protena
Raf presenta un dominio regulador, y un centro cataltico amordazado por la protena 14-3-3
(Truco: suma 20). Cuando ambos dominios presentan fosfato el complejo de Raf est inactivado por la protena 14-3-3, pero la interaccin con Ras provoca la desfosforilacin del dominio
regulador y la liberacin de Raf.

Esta activacin de Raf es un punto crtico de la cascada. Inicialmente el conjunto est amordazado presentando Raf fosfato en las serinas 259 y 621. La activacin conlleva una serie de
cambios y la actuacin de la proteinfosfatasa 2A, la quinasa Src y otras dos de naturaleza desconocida que van a fosforilar el dominio cataltico en serinas, tirosinas y treoninas, permitiendo la separacin de 14-3-3.

200

La cascada contina con la


fosforilacin de Mek y de las
MAPKs.
La activacin de ERK o MAPK se
produce mediante una fosforilacin de MEK en Y185 y T183,
situados en el labio de activacin y que promueven el cambio de conformacin que permite la entrada al ncleo y el
desarrollo de la actividad cataltica.
Pero ERK puede actuar como
quinasa de otros factores de
transcripcin directamente, o
como intermediario.

1.4.5 Secuencia de transduccin para EPO a travs de JAK (receptor de citoquinas)


El receptor de eritropoyetina (EPO) no presenta actividad Y-quinasa intrnseca, sino que va a
presentar asociado una protena denominada JAK que ser la quinasa. Cuando EPO interacciona con el receptor se produce un cambio conformacional que activa a la protena JAK, dando
lugar a la fosforilacin cruzada en restos de tirosina del propio receptor.
Estos restos de Y-fosfato pueden ser reconocidos por el dominio SH2 de Grb2, desencadenando la ruta de las MAPK. Pero tambin van
a ser reconocidos por la protena STAT (transductores de la seal y activadores de la transcripcin).
La protena STAT presenta dominios SH2 que
la aproximan a la actividad Y-quinasa de JAK.
Al fosforilarse estos dominios SH2 le sirven
para dimerizar dando lugar a homodmeros
que exponen secuencias de importacin al
ncleo (NLS) donde van a actuar como factores de transcripcin.
Adems de estos dos sistemas que emanan
del receptor de EPO, tambin encontramos
201

otros asociados a los restantes restos de Y-fosfato, como es el caso de PI3K que se fosforila y
genera zonas PH en la membrana todo para desencadenar la activacin de PKB.
Pero la activacin del receptor debe de ser lo ms breve posible y para ello tenemos dos mecanismos de desactivacin de la seal.
-

Por un lado la SHP1 es una Y-fosfatasa que se encuentra inactiva hasta que el receptor
se fosforila y se une a JAK a travs de sus dominios SH2, desfosforilando al receptor.
Por otro lado tenemos las protenas SOCS que son E3-ligasas de ubiquitina que van a
comenzar a pegarse a travs de sus dominios SH2 al receptor para encaminarlo a su
degradacin va UPS. Estas protenas tambin actan estableciendo una competitividad por el receptor en funcin de su concentracin, ya que van a impedir que los dominios SH2 de otras protenas reconozcan los restos si estn en mayor concentracin.

Puesto que no es lo mismo desconectar que eliminar un proceso, ambos mecanismos van a
estar fuertemente regulados y la actuacin de uno u otro depender del estado de la clula.
Vemos todo el abanico de posibilidades que se abren desde la activacin del receptor de EPO
como ejemplo de un receptor de citoquinas tpico.

Como ya se ha comentado, la PI3K introduce restos de fosfato en la posicin 3 del anillo de


inositol generando una gran diversidad de fosfolpidos de inositol que van a ser reconocidos
por diferentes protenas.
202

Cuando se genera una zona en la membrana con inositol-3,4,-bifosfato, es reconocido por la


protena PKB citoslica que al interaccionar con estos a travs de su dominio PH se despliega y
se ancla a la membrana.

El anclaje de PKB a la membrana no supone una activacin total, ser necesario que otra quinasa denominada PDK1 (quinasa dependiente de fosfoinostidos) que tambin se activa por la
unin al inositol-3,4-bifosfato fosforile a PKB en el labio de activacin.
Por lo tanto PKB solo muestra un 100% de actividad cuando est unida a la membrana y fosforilada. PKB y PDK1 son S/T quinasas.
1.4.6 AKT1 (=PKB) y PTEN
Existen dos protenas que son muy importantes para la regulacin de las cascadas de transduccin porque van a actuar alternativamente activando y desactivando seales.
La protena AKT1 (=PKB) es una quinasa que presenta un dominio PH de reconocimiento de
fosfolpidos de inositol que le permite anclarse a la membrana como ya hemos visto. Existe
una versin viral activada constitutivamente que produce el desarrollo de cncer por lo que es
un oncogen.

La protena PTEN o fosfatidilinositol-3-fosfo fosfatasa no es muy especfica ya que va a actuar


retirando los fosfatos en posicin 3 independientemente del fosfatidilinositol, por lo que contrarresta la accin de PI3K (oncogn) siendo PTEN un anti-oncogen.

203

En esta imagen podemos ver cmo afectan una serie de situaciones de estrs como la inflamacin o el estado de hipoxia a las rutas activadas por citoquinas y factores de crecimiento.

Cuando el receptor manda las seales se activa PI3K que va permitir la activacin de PKB (AKT)
y que adems estimula a la xido ntrico sintasa que va a favorecer al factor de crecimiento de
los endotelios vasculares, y por otra parte va a fosforilar a IKK activandola. Esto provoca la
fosforilacin del factor NFB, separndolo de su inhibidor y favoreciendo la expresin de genes. Tambin se inhibe a GSK3 que inhiba a la -catenina, permitiendo la transcripcin de
muchos otros genes.
Pero todo este proceso est inhibido por PTEN ya que va a impedir la activacin de PKB (AKT)
en caso de hipoxia o inflamacin.
La enfermedad del hgado graso es una patologa que puede evolucionar hacia una cirrosis y
eventualmente hasta un cncer heptico. En el desarrollo de esta enfermedad estn implicadas las vas en las que intervienen PI3K/AKT (PKB) y GSK3.
En muchas ocasiones los tumores se desarrollan a bajas concentraciones de oxgeno por un
abastecimiento insuficiente que acomoda a las clulas a vivir en condiciones de hipoxia. Estas
condiciones estimulan la formacin del factor de hipoxia (HIF-2) que impide la oxidacin de
compuestos grasos desencadenando el hgado graso.
Como podemos ver, los cidos grasos libres (FFA) activan la ruta de PI3K/AKT (PKB) que inhibe
a GSK3. Por otro lado, se produce la activacin de mTOR (diana de rapamicina en clulas de

204

mamfero) que induce la activacin de NFB lo que provoca la inactivacin de PTEN y por tanto
cesa la inhibicin del propio sistema.

Como vemos se trata de una ruta muy bien regulada que donde fallos en PTEN o PI3K pueden
desencadenar la aparicin de cncer.

2 Vas de sealizacin
A modo de resumen vamos a realizar una visin global de las vas de sealizacin estudiadas,
as como un estudio pormenorizado de algunas no tratadas hasta ahora.
Los receptores acoplados a protenas G que estimulan a adenilato ciclasa y la activacin de la
PKA con dos subunidades catalticas y dos reguladas por AMPc, producen la fosforilacin de
factores de transcripcin como Fos, Jun, Myc y CREB.
Los receptores de citoquinas como
el de EPO estn asociados a quinasas
como JAK que permiten la fosforilacin de otras en restos de tirosina,
como es el caso de STAT que muestra sus NLS al dimerizar y va al ncleo.
Los receptores con actividad Yquinasa directa en su dominio citoslico desencadenan cascadas
como la de Ras y las MAPKs que se
translocan al ncleo para fosforilar
factores de transcripcin.

205

Los receptores como los del factor de crecimiento transformante (TGF) son muy especiales
porque van a desarrollar, a diferencia de los anteriores, actividad S/T-quinasa activando a
factores de transcripcin como Smad que en funcin del caso van a reclutar co-activadores o
co-represores.
Estos cuatro tipos de receptores estn relacionados con la fosforilacin de protenas que lleva
a una modulacin de la expresin gnica, pero adems podemos encontrar otros tres tipos de
receptores que van a realizar esta modulacin a travs de la degradacin de complejos o protelisis de protenas.
Los receptores del tipo Hedgehog (Hh, erizo) son un complejo de dos protenas que se disponen en la membrana plasmtica, donde una acta como receptor del ligando y la otra como
colaboradora amordazada por la primera. Cuando el ligando impacta con la protena receptora, esta se disocia y la colaboradora comienza a
mandar seales que provocan la disociacin de
complejos proteicos cuyas unidades entran al
ncleo como factores de transcripcin.
Los receptores Wnt son receptores del tipo
7tm que al unirse al ligando actan sobre una
protena que impeda la liberacin de factores
de transcripcin acoplados a complejos multiproteicos. Precisan de una protena similar a
LDLR para unir el ligando.
Los receptores Notch (muesca) son receptores
que interaccionan con protenas delta de otras
clulas favorecindose la protelisis del dominio citoslico mediante presenilinas y convertasas, que marcha al ncleo donde acta como
un factor de transcripcin.

2.1 Receptores con actividad enzimtica intrnseca o asociada


Veamos algunas caractersticas concretas de estos receptores y las actividades en las que estn
implicados.
Los receptores para el factor de crecimiento transformante (TGF):
-

Tienen como ligandos la superfamilia de TGF y BMPs, activinas e inhibinas (mamferos) y Dpp (Drosophila).
Presentan actividad S/T-quinasa intrnseca en el dominio citoslico.
Estn implicados en la activacin de los factores de transcripcin Smad.

Los receptores de citoquinas:


-

Tienen como ligando los interferones, eritropoyetina, hormona de crecimiento, algunas interleucinas (IL-2 e IL-4) y otras citoquinas.

206

Estructuralmente estn formados por una hlice transmembrana con un dominio


multi- extracelular y asociada a las quinasas JAK en la regin intracelular.
Estn implicados en la activacin directa de los factores de transcripcin STAT, la ruta
de PI3K, la ruta de IP3/DAG y la ruta de Ras-MAPK.

Los receptores con actividad tirosina quinasa intrnseca:


-

Tienen como ligando insulna, el factor de crecimiento epidermal (EGF), el factor de


crecimiento fibroblstico (FGF), neurotropinas y otros factores de crecimiento.
El receptor est formado por una hlice transmembrana con un dominio de actividad Y-quinasa citoslico.
Participan en la activacin de la va Ras-MAPK, IP3/DAG y PI3K.

Los receptores con actividad guanilato ciclasa:


-

Tienen como ligando el factor natriurtico atrial y las hormonas peptdicas relacionadas.
Estructuralmente es una hlice transmembrana con actividad guanilato ciclasa intrnseca en el dominio citoslico.
Estn implicados en la generacin de GMPc.

Los receptores que desarrollan actividad fosfotirosina fosfatasa (Y-fosfatasa):


-

Tienen como ligandos las pleiotropinas y otras hormonas proticas que van a actuar
como seales no negativas (positivas para la divisin) inhibiendo al receptor.
Presentan actividad fosfotirosina fosfatasa en el dominio citoslico inhibida por la
unin de ligandos. Por lo tanto tienen actividad fosfatasa constitutiva garantizando
que no se producir divisin celular en ausencia de estmulos.
Participan en la hidrolisis de los residuos de Y-fosfato que activan varias rutas iniciadas
por Y-quinasas.

Los receptores de las clulas T:


-

Tienen como ligandos pequeos pptidos asociados a los complejos mayores de histocompatibilidad (MHC) en la membrana plasmtica de macrfagos y otras clulas presentadoras de antgenos.
Se trata de hlices transmembrana con un gran nmero de qunasas asociadas al
dominio citoslico y que solo se han localizado en linfocitos T.
Estn implicados en la activacin de Y-quinasas citoslicas y las rutas de PI3K, IP3/DAG
y Ras-MAPK.

2.2 Ruta de transduccin para TGF-Smad


En algunas clulas el factor de crecimiento transformante TGF (no crecimiento) es presentado
por un receptor monomrico (RIII) al receptor propiamente dicho (RII), mientras que en otras
la interaccin se produce directamente a travs de RII, que es un dmero en s mismo.
La unin del ligando provoca en cualquier caso el reclutamiento de RIII, RII y RI, formando un
heteroligmero que se autofosforila en residuos de S/T.
207

A continuacin el heteroligmero fosforila a las protenas Smad3 que van a formar un complejo trimrico compuesto de dos subunidades de Smad3 y una subunidad de Smad4 que al
interaccionar van a mostrar sus NLS para ser importadas al ncleo como factores de transcripcin.
Si a estos complejos se les unen co-activadores pues se producir la expresin de genes, pero
si se les unen co-represores como Ski, N-CoR y las histonas desacetilasas se producir el silenciamiento gnico.

2.3 Rutas de transduccin que involucran protelisis


2.3.1 Ruta de Wnt
La ruta medida por Wnt comienza con la participacin de dos protenas en la membrana. Por
un lado tenemos el receptor denominado Frizzled (Fz) que estructuralmente es del tipo 7tm y
por otro lado una protena relacionada con el receptor de LDL (LDLR) que se requiere para
poder interaccionar con el ligando.
Cuando el receptor no interacciona con la hormona Wnt, el complejo GSK3/APC12/Axina se
encuentra activo fosforilando a la -catenina, lo que la encamina a su degradacin va proteasoma. Al mismo tiempo una protena denominada TCF est actuando como represor de la
transcripcin en el ncleo.

12

APC= adenomatosis polyposis coli proten que es un importante represor de tumores en humanos

208

La interaccin de Wnt con Fz provoca que el complejo receptor inhiba la protelisis de la catenina activando a la protena Dishevelle que va a actuar como inhibidora del complejo de
GSK3.
La -catenina es una protena que al no ser degradada, entra al ncleo e interacciona con TCF,
pasando ahora a actuar como co-activador de la expresin gnica.

2.3.2 Ruta de Hh
Los receptores Hedgehog (Ptc) presentan 12 hlices transmembranales que va a regular la
presencia en la membrana de otra protena denominada Smo del tipo 7tm.
En ausencia de hedgehog los receptores Ptc impiden la externalizacin Smo mediante la actuacin
de otras protenas que las mantienen en vesculas intracelulares.
Esto impide la asociacin del complejo Ci155/Fu/Cos2 cuya fosforilacin produce la liberacin proteltica de Ci155 que va al ncleo y
acta como un represor (estado
off). Adems las vesculas con Smo
van a estar siendo degradadas de
manera constitutiva va lisosomal.

209

La unin de Hh a Ptc produce la inactivacin del receptor y permite la salida de los receptores
a la membrana abriendo tres vas de transduccin:
-

Por una parte, la interaccin de Smo en la membrana con el complejo Ci155/Fu/Cos2,


permite la liberacin de Ci que acta como un factor de transcripcin que estimula la
expresin de genes (estado on).
Por otro lado se abre un sistema similar al sistema de adeniliato ciclasa asocindose
una protena G trimrica a Cos2 que libera la subunidad y regula los niveles de
AMPc.
Finalmente la fosforilacin del Smo provoca el reconocimiento por -arrestina y la internalizacin.

El sistema se vuelve mucho ms complejo si consideramos que tambin va a intervenir PKA, y


otros factores.
2.3.3 Ruta de NFB
La ruta de NFB se activa mediante ligandos
como el factor de necrosis tumoral (TNF-),
interleucina 1 (mamferos) o la protena Sptzle
(Drosophila) y desencadena la degradacin
dependiente de fosforilacin de la protena
inhibidora IB que libera al factor de transcripcin propiamente dicho.
Cuando los receptores reciben al ligando se
produce la activacin de la quinasa TAK1, que
fosforila a la quinasa IK activandola. La activacin promueve la fosforilacin de IB que ahora
es reconocida por una E3-Ligasa y degradada
va UPS, liberando al factor de transcripcin
NFB (heterodmero de p65/p50) que va al
ncleo e induce la transcripcin de genes.

210

2.3.4 Ruta de Notch/Delta


Los receptores Notch en realidad son varios pptidos cuya subunidad extracelular no se encuentra asociada covalentemente al
resto. Cuando Notch interacciona
con la protena delta de una clula
emisora se produce un reclutamiento de protenas asociadas a la membrana con actividad proteoltica.
Se trata de convertasas que solo van
a expresar actividad cuando hay un
acoplamiento Notch/delta. Por un
lado la convertasa TACE realiza un
corte y posteriormente la presenilina otro. Los cortes proteolticos
liberan un fragmento que se va a
desplazar al ncleo donde actuar
como factor de transcripcin.
Este sistema es muy importante para la morfognesis, el guiado de axones, el desplazamiento
de neuronas y la asociacin de unas protenas con otras.
Este sistema es muy semejante al procesamiento de la protena APP que produce el pptido amiloide relacionado con la aparicin del Alzheimer. En condiciones normales la protena precursora APP es cortada por -secretasa (TACE) y -secretasa (presenilina) dejando en la membrana un pptido de 26 aminocidos no patognico.

Pero cuando el primer corte est mediado por la -secretasa y el segundo es con presenilina se
da lugar a un pptido de 42 aminocidos que es patognico. La terapia para combatir el Alzheimer se centra actualmente en la bsqueda de inhibidores selectivos contra la -secretasa
que no afecten a otras convertasas como la presenilina.

211

3 Anomalas que pueden producir diversas clases de cncer


La sobreproduccin de los factores de proliferacin que impulsan la sntesis de ciclinas
mitticas.
Las cantidades de factores de proliferacin estn sometidas a una fuerte regulacin, pero
la amplificacin gentica o cualquier va que produzca un aumento de la cantidad de protenas,
aumento de su actividad (variantes allicas) o que alteren las afinidades de los receptores
pueden desencadenar una sobreproduccin de ciclinas. Por ejemplo, la sobreproduccin de
receptores o las mutaciones que los activan constitutivamente (oncogen Her-B es una variante
truncada de EGFR activada constitutivamente). Tambin la inactivacin de las vas de degradacin de las protenas implicadas.
Sobreproduccin de algunos factores de transcripcin como C-Fos o C-Jun que median en
la produccin de cilcinas que permiten el paso de G0 a G1 (Ciclina D + CDK6/4).
Infeccin por virus portadores de oncogenes como el virus del papiloma humano que incorpora una E3 ligasa de p53.
La reordenacin cromosmica durante una divisin celular puede dejar la expresin de
ciertos genes regulada por potenciadores (enhancers) muy eficientes aumentando la cantidad
del producto.
Conversin de un proto-oncogn en oncogn por mutaciones puntuales como en el caso
de Ras que puede perder su capacidad GTPasa.
Perdida de protenas con actividad fosfatasa, que actan sobre proten-quinasas y fofoinositoles.
Anomalas que aumentan la supervivencia celular como las que detienen la apoptosis,
como PKB. Generalmente la protena Bad est relacionada con la apoptosis porque se une a un
inhibidor de este proceso. Si PKB fosforila a la protena Bad, esta libera al inhibidor de la apoptosis y por lo tanto se inhibe el proceso de muerte celular, lo que puede derivar en tumores.
Prdida de antioncogenes como p53, Rb, APC, Smad4 (p15), TGF-2
Expresin de telomerasa
Sobreproduccin de ciclinas mitticas.

212

Anexo I: Ruta de CREB


En un contexto sinptico el vertido de glutamato a la hendidura sinptica activa toda una serie
de receptores en la terminal post-sinptica que llevan a la expresin gnica mediada por los
elementos de respuesta CRE.
En la membrana plasmtica de la terminal vamos a encontrar GPCR (Receptores capri acoplados a protenas G), GluR metabotrpicos (grupo II y III) e ionotrpicos (iGluR canales de calcio).

La llegada del glutamato activa los receptores GPRC y GluR metabotrpicos que estn acoplados por protenas G al sistema adenilato clicasa que aumenta la concentracin de AMPc desencadenando la activacin de PKA.
La activacin de PKA tiene varios efectos, por un lado fosforila a los receptores ionotrpicos de
glutamato (iGluR), provocando un aumento de la concentracin de calcio induciendo la activacin de CamK-II (calcio-calmodulina quinasa II), y por otro lado las dos quinasas (PKA y CamK-II)
fosforilan al factor de transcripcin CREB en la S133 permitiendo la unin al elemento de respuesta CRE. Esto permite el reclutamiento de co-activadores (CBP, p300) y de la mquina de
transcripcin (TBP, TFIIB,) sobre la caja TATA.
Por otro lado, la llegada del glutamato a los GluR metabotrpicos del grupo D provoca la activacin de la PLC a travs de protenas G que desencadenan la produccin de DAG e IP 3 activando a PKC y abriendo los canales de calcio del retculo endoplasmtico. Esto activa ms cal213

modulina y por ende a calcio-calmodulina quinasas (II y IV) que van a tener el citado efecto
sobre CREB.
No podemos olvidar a los receptores de los factores de crecimiento que van a activar a PI3K
reclutado a GRB2, Sos, que va a facilitar la activacin de Ras, que fosforila a Raf, luego a las
MEKs y finalmente ERK que actuara como factor de transcripcin directo o fosforilado a otros
factores como p90RSK.

Anexo II: Rutas de transduccin de seales en la clula

214

Bloque IV: Regulacin Molecular De La


Neurotransmisin

TEMA 1 Canales Inicos Activados por Voltaje


Pruebas electrofisiolgicas. Procedimientos de purificacin de los canales inicos. Reconstitucin en liposomas. Estructura terciaria y caternaria, selectividad inica y funcionamiento de los canales de sodio, calcio y potasio. Patologas que originan los fallos genticos.
TEMA 2 Neurotransmisin Colinrgica
Transporte de colina. Sntesis y transporte vesicular de acetilcolina. Liberacin y degradacin
de acetilcolina: colinesterasas.
TEMA 3 Receptores Ionotrpicos
Aspectos estructurales y funcionales de los receptores ionotrpicos. Receptores excitatorios:
colinrgicos nicotnicos y de glutamato. Agonistas y antagonistas. Receptores inhibitorios: de
GABA y glicina. Integracin funcional de seales que despolarizan e hiperpolarizan la membrana.
TEMA 4 Neurotransmisin Adrenrgica y Receptores Metabotrpicos
Biosntesis de catecolaminas: etapas individuales. Liberacin, captura e inactivacin. Monoamino oxidasas. Receptores metabotrpicos. Ansiedad, depresin y trastorno bipolar. Estimulantes, ansiolticos, ansiognicos psicotrpicos.
TEMA 5 Neurotransmisin Peptidrgica
Neuropptidos: biosntesis, liberacin y degradacin. Acciones celulares y fisiolgicas. Morfina,
herona, cocana: adiccin, tolerancia y analgesia. Encefalinas y endorfinas. Receptores de
opiceos: clases y efectos. Cannabinoides, receptores y acciones fisiolgicas.

215

216

Tema 1: Canales ionicos qe responden al voltaje


Los iones, como el sodio, el potasio y el cloruro,
se encuentran distribuidos asimtricamente entre
el interior y el exterior celular. Las concentraciones de potasio son ms altas en el interior celular,
mientras que las de sodio, cloruro y magnesio
sern ms altas en el exterior. La concentracin
de calcio es muy baja en el interior.
Los canales inicos dependientes de voltaje pueden presentar tres estados conformacionales denominados estado cerrado, abierto e inactivo
que van alternndose por la accin de la polarizacin/despolarizacin de la membrana celular.

Estos canales inicos pueden presentar oligosacridos, ser monmeros o hetermeros, En


cualquier caso se han relacionado diversas mutaciones en la secuencia de nucletidos del gen
que codifica para un determinado canal con diversas enfermedades musculares y neurodegenerativas. Para realizar los estudios y establecer la implicacin de estos canales en una enfermedad es necesario aislarlos.
100 canales/2 axones no mielinizados; 20,000 canales/2 axones mielinizados
1 Extraccin y purificacin de canales
Selectividad: Na 1; NH3OH 0.9; Li 0.9; NH2NH3 0.6; NH4 0.1; K 0.1; Rb<0.01; CH3NH3< 0.01

Ligandos canal Na: tetrodotoxina, batracotoxina, veratridina, toxinas de escorpin and anmonas

K 1; Rb 0.9,
NH4
0.1, Li<0.01,homogeneizado
Na<0.01
La purificacin de canales se puede realizar a partir del cerebro
de
cordero
en
Na -RVVRVFRI GRI LRLI KAAKGI R--Hlice de respuesta al voltaje
una solucin con tritn X-100 (detergente) que seCa
centrifuga
para obtenerNRAKGLK--Hlice
una S1 en la que
-KI LRVLRVLRPLRAI
de ya
respuesta al voltaje
Ligandoscanal K: tetraetilamonio (TEA), dendrotoxina de serpiente mamba
tendremos toda la poblacin de canales.
Ligandoscanal Ca,:dantroleno, nifedipina, nitrendipina

Para poder separar unos canales de otros se utilizan


compuestos de alta afinidad por canales concretos
como son las toxinas para los canales de sodio:
-

La tetrodotoxina es una neurotoxina derivada de la guanidoina extraordinariamente potente extrada del pez globo que tiene gran
217

afinidad por los canales de sodio. Se trata de una molcula hidrosoluble que bloquea
los canales de sodio evitando la despolarizacin de la membrana.
La batracotoxina (sapo) y veratridina (planta) son toxinas liposolubles que se unen al
canal de sodio pero por sus dominios intermembrana, alterando el tiempo de transicin entre los estados del canal. No es lo mismo que un canal cambie en 1 s que tarde 10-20 min.
Toxinas de escorpin y anmona.

Para los canales de potasio se utilizan ligandos especficos o toxinas como:


-

Tetraetilamonio (TEA)
Dendrotoxina de serpiente mamba

Para los canales de calcio se utilizan derivados de piridinas sustituidas:


-

Dantroleno
Nifedipina
Nitredipina

Como ya hemos mencionado en el extracto S1 tendremos toda la poblacin de canales de sodio, calcio y potasio. En primer lugar, antes de realizar una purificacin especfica de los canales de sodio vamos a separar los canales en general del resto de protenas que producirn
unin inespecfica.
Puesto que los canales de sodio son glicoprotenas, porque estn en la membrana plasmtica y
podemos presumir que tienen estructura oligomrica, tal vez sean reconocidos por alguna
lectina como LCA (aglutinina de la lenteja). Por lo tanto mediante una matriz de sefarosa-LCA
que reconoce manosas separamos todas las glicoprotenas con manosa terminal y lavamos el
resto. Para liberar las glicoprotenas de la matriz realizamos un lavado con una disolucin de
manosa (1M) y se dializa lo obtenido para retirar el exceso de manosa.
A continuacin, para realizar un seguimiento a la capacidad de unin de la toxina se aade
tetrodotoxina radiactiva a la disolucin, se lava la no unida y se mide con un contador de centelleo la radiactividad total.
En una segunda fase se utiliza una placa de sefarosa-tetrodotoxina para que los canales de
sodio queden especficamente unidos. Finalmente lavamos la sefarosa con una disolucin de
tetrodotoxina, obtenindose una purificacin rica en protenas que ligan esta toxina.
Para comprobar la pureza podemos realizar una electroforesis o para posteriores experimentos inyectarla a un conejo con el fin de generar un antisuero que nos permitir realizar experimentos como el Western blot.
La purificacin de los canales permite la realizacin de estudios funcionales a travs de liposomas a los que se adicionan los canales purificados. Posteriormente mediante la adiccin de
sodio radiactivo en este caso, y de toxinas que provocan la despolarizacin de la membrana
(veratridina) porque pasan los canales del estado cerrado al abierto, pues tendremos que detectar seal en el interior de los liposomas.
218

Por el contrario, la adicin de tetrodotoxina retiene los canales de sodio en estado cerrado, lo
que nos permite establecer la cantidad de sodio presente en el liposoma que se considerar
como background inespecfico.

2 Trnsito de iones a travs de canales


Los estudios mediante liposomas han permitido el establecimiento de los iones capaces de
atravesar cada canal especficamente y la facilidad con la que lo hacen. Los canales inicos
dependientes de voltaje presen una estructura con alta homologa entre ellos ya que se trata
de una familia proteica diseada para actuar como canales inicos dependientes de voltaje.
La comparacin con otros canales dependientes de ligando (muscarnicos, GABA, Glutamato,) tambin revela cierta homologa, lo que es lgico considerando la similitud topolgica y
funcional.
El funcionamiento de estos canales depende de la polarizacin de la membrana. Cuando se
produce la despolarizacin los canales pasan del estado cerrado al abierto, permitiendo el
trnsito de iones y a continuacin pasan al estado inactivo de manera espontanea. Para que se
produzca la transicin del estado inactivo al estado cerrado es necesario que haya repolarizacin de la membrana.
Por ello es necesario que la protena presente dominios que respondan a la despolarizacin y
al trnsito de iones (ionforo) que es el canal en s, muy selectivo y restrictivo. Los canales
dependientes de ligandos presentan un cierto rango siendo unos muy selectivos y otros no,
pero estos canales dependientes de voltaje van a ser todos muy restrictivos.
El trnsito de iones a travs de los canales especficos se realiza considerando un 100% de libertad de trnsito para el in especfico.

Trnsito de iones
1,2
1

0,8
0,6
0,4
0,2
0
Canal de Na
Canal de K

Na

Li

NH3OH

NH4

0,9

0,9

0,1

0,01

0,01

0,1

NH2NH3 CH3NH3
0,6

0,01

Rb

0,1

0,01

0,9

219

A travs de los canales de sodio entra por tanto el sodio con un 100% de facilidad, pero tambin:
-

El sodio (100%) presenta un dimetro de 5 , pero que aumenta ya que pasa a travs
del canal solvatado.
El litio (90%) porque presenta un radio inico similar en solvatacin.
El hidrxilamonio (NH3OH, 90%) es capaz de atravesar el canal gracias a su capacidad
para formar puentes de hidrgeno con los aminocidos del canal, mientras que el
amonio NH4 (10%) no presenta electrones desapareados para formar estas interacciones y no pasa a pesar de presentar menor tamao.
La hidracina (NH2NH3, 60%) y el metilamonio (CH3NH3, <1%) a pesar del tener el
mismo tamao presentan esa gran diferencia de facilidad de paso debido a que la primera puede establecer puentes de hidrgeno.
El potasio (10%) y el rubidio (<1%) entran muy mal a travs del canal ya que presentan
mayor radio inico.

A travs de los canales de potasio pasa el potasio con un 100% de facilidad en solvatacin:
-

Rubidio (90%) por presentar un tamao similar.


El amonio (10%) en la misma medida que el anterior porque no puede establecer los
enlaces por puentes de hidrgeno.
El sodio (<1%) y el litio (<1%) no pueden pasar a travs del canal a pesar de presentar
un tamao menor y esto como veremos se debe a las interaciones que se van a establecer en el canal.

En los axones no mielinizados podemos encontrar una densidad de 100 canales de sodio/2,
mientras que en los axones mielinizados podemos encontrar hasta 20.000 canales/2.

3 Estructura de los canales dependientes de voltaje


En general los canales dependientes de voltaje, tanto si son tetrmeros como monmeros va a
estar constituidos por una serie de secuencias cuyo ndice de hidrofobicidad es muy alto por lo
que dan lugar a muchas hlices hidrofbicas que se insertan en la membrana.
Estos canales estn formados siempre por 6 hlices hidrofbicas en las que vamos a diferenciar 4 dominios altamente conservados. El hecho de encontrar esta homologa estructural y
secuencial hace pensar que los canales dependientes de voltaje se formaron a partir de un gel
ancestral cuya duplicacin ha dado lugar a diferentes variantes. La unin de genes duplicados
habra dado lugar a la formacin de los canales monomricos (tetrmeros de 24 hlices) en los
que la unidad bsica se repite.
De las 6 hlices que conforman la unidad de los canales tenemos:
-

La hlice 4 con cargas positivas que es el sensor de voltaje.


Las hlices 5 y 6 que forman el ionforo, es decir el canal que atraviesan los iones.
Entre las hlices 5 y 6 hay un segmento o asa que no es igual en todos los casos pero
que son las encargadas de permitir o no el paso de iones segn su conformacin.

220

Para los canales de potasio tetramricos tendremos por tanto 4 hlices sensoras de voltaje y 8
hlices formando parte del ionforo, junto con las 12 hlices restantes haciendo un total de 24
hlices, unindose los monmeros mediante interacciones no covalentes pero muy fuertes.
Cada monmero presenta un tamao de unos 70 kD (7000 aminocidos).

En este canal encontramos adems una bola en los extremos N-terminales de las cadenas polipeptdicas que se denomina bola de presidiario y que va a obturar el ionforo para impedir el
trnsito de iones en el estado inactivo.
Los canales de sodio y calcio son monomricos, es decir, las 24 hlices van a formar parte de
una misma cadena polipeptdica que presenta un tamao de unos 280 kD (2800 aminocidos),
y carece de bola de presidiario.

Presentan una zona hidrofbica (H) interna que se denomina unidad de inactivacin. Este
segmento, en funcin de su conformacin interfiere con el paso de iones pasando el canal al
estado inactivo.
Tal y como vemos en las secuencias de las hlices 4 para los canales de sodio y calcio, se trata
de una secuencia en la que se van alternando cada dos o tres posiciones aminocidos cargados

221

Ligandos canal Na: tetrodotoxina, batracotoxina, veratridina, toxinas de escorpin and anmonas
positivamente
a pH
fisiolgico.20,000
Esta hlices
son axones
anfipticas,
ya que presentan todas las cargas
100 canales/2
axones no
mielinizados;
canales/2
mielinizados
Selectividad:
Na
1;
NH3OH
0.9;
Li
0.9;
NH2NH3
0.6;
NH4
0.1;
K
0.1;
Rb<0.01;
CH3NH3< 0.01
en un lado actuando como sensor de los cambios de potencial
en la membrana.
K 1; Rb 0.9, NH4 0.1, Li<0.01, Na<0.01

Na -RVVRVFRI GRI LRLI KAAKGI R--Hlice de respuesta al voltaje


Ca -KI LRVLRVLRPLRAI NRAKGLK--Hlice de respuesta al voltaje
Ligandoscanal K: tetraetilamonio (TEA), dendrotoxina de serpiente mamba

Dentro del contexto


de los canales
identificados
cada uno de estos presenta unos requerimienLigandoscanal
Ca,:dantroleno,
nifedipina,
nitrendipina
tos especiales en funcin del tejido que van a estar mediados por la presencia o no de subunidades accesorias, pero la unidad bsica de 280 kD se mantiene.
Por ejemplo, muchos de los canales son dianas de protein-quinasas regulndose el tiempo de
permanencia en estado abierto en funcin de la fosforilacin.
A nivel gentico podemos observar como los canales de sodio y calcio se disponen como unidades repetidas del mismo gen. Adems se ha caracterizado la variante Shaker del canal de
potasio (mosca mutante).

En el caso de procariotas, los canales e potasio solo estn formados por las dos ltimas hlices
y el asa, por lo que es lo mnimo que se necesita para establecerlo y adems resulta muy til
para los estudios funcionales.
Podemos ver el funcionamiento de las hlices sensoras de voltaje representadas en el modelo
de bola de presidiario (aunque se ndice canal de sodio, no es correcto). La despolarizacin de
la membrana provoca el cambio de posicin relativa de las hlices en la protena lo que provoca la transicin desde unos estados a otros.

222

4 Dinmica temporal en la apertura de canales.


Atendiendo a la dinmica de funcionamiento de los canales de sodio y potasio, el registro de la
intensidad y de los cambios conformacionales ha revelado que ante una despolarizacin de la
membrana los canales de sodio se abren pero cambian muy rpidamente al estado inactivo,
mientras que los canales de calcio presentan una transicin ms lenta, generando un hueco
temporal entre ambos.

5 Paso de iones a travs de los canales


El modelo ms sencillo del canal de potasio es el de procariotas formado por cuatro subunidades que portan el par de hlices del ionforo y el asa que regula el paso de iones. La formacin
del tetrmero da lugar a un filtro selectivo para el paso de potasio en el que pueden encontrarse dos iones a distintos niveles del canal.

Este canal presenta una zona vestibular ms ancha


en la que vamos a encontrar el ion solvatado, pero
para entrar en el canal tendr que entrar sin agua.
La prdida de las molculas de agua es un proceso
muy desfavorable termodinmicamente hablando
porque el ion pierde mucha estabilidad, pero el entorno de tomos de oxgeno presentes en los restos
de los aminocidos del canal ofrece un balance negativo, por lo que la estabilidad que gana es mayor
que la que pierde.
Precisamente este es el motivo por el que el sodio,
a pesar de presentar menor radio inico no puede
223

atravesar el canal de potasio, ya que desolvatado no se acomoda adecuadamente a los restos de oxgeno expuestos y por lo tanto no gana estabilidad y el proceso no es favorable.

El canal de potasio tiene una longitud de poro de 34 presentando una salida de 12 de largo
con una luz til de 3 , por lo que el radio inico del potasio (1,33 ) junto con el de los oxgenos (1,4 ) hacen un total de 2,73 ,
suficiente para pasar por el poro estableciendo los puentes de hidrogeno.
Pero dado que el sodio tiene un radio
inico menor (0,95 ), no puede establecer los puentes necesarios para
ser estable.
El canal de potasio se ensancha en el
vestbulo del lado citoslico que tiene
un dimetro de 10 donde la molcula est a solvatada-

224

Los aminocidos con los que el potasio establece puentes de hidrgeno a travs del ionforo
son treonina, valina, glicina, tirosina y glicina (TVGYG, televisin gallega y gallega) a travs de
sus grupos carbonilo.
En un canal de potasio vamos a poder encontrar dos iones pasando a la misma vez. El potasio
tiene una elevada densidad de carga positiva cuando est desolvatado, por lo que al entrar en
el canal, va a generar una fuerte repulsin electrosttica sobre los iones que puedan estar ya
dentro, empujndolos hacia el exterior a favor de concentracin de los propios iones en el
canal.

Este es el funcionamiento base de todos los canales dependientes de voltaje, es la unidad bsica sobre la que vamos a encontrar toda una variedad de protenas accesorias y otros procesos
como el modelo de la bola de presidiario.

6 Experimentos electrofisiolgicos con el mutante Shaker


Cuando se estudiaba el modelo en procariotas del canal de potasio de Shaker, se vio que si se
permeabiliza la membrana con tripsina se cortan las protenas de la membrana, entre ellas
esta bola de presidiario, por lo que cuando se produce la despolarizacin de membrana, y no
estaba la bola el canal se quedaba abierto continuamente ya que se pierde la capacidad de
inactivacin del canal de potasio.
La secuencia de la bola son 40-50 aminocidos (1-20 bola y 21-40 cadena). Se hicieron experimentos aadiendo aminocidos poco a poco, variando la cadena de la cola (con la bola), y se
vio que cuanto ms larga era la cadena ms tardaba en cerrarse.
El pptido sinttico mimetizaba casi a
la perfeccin la situacin del canal
silvestre y por ello el modelo de la bola
y el modelo del cambio conformacional explican la especificidad de los
canales inicos.
Pero este experimento no ha podido
ser repetido con los canales de sodio y
calcio, por lo que se considera que no
presentan la bola de presidiario.

225

226

Tema 2: Transmision colinergica


1 Protenas implicadas en la transmisin colinrgica
Al hablar de la transmisin colinrgica se hace necesario realizar un recordatorio de las protenas implicadas en el operador colinrico lo que incluye a los transportadores de colina (ChTs),
la coln-acetil transferasa (ChAT) encargada de sintetizar acetilcolina.
Esta molcula, una vez sintetizada, va a ser transportada a las vesculas de la terminal sinptica
por los transportadores vesiculares de ACh (VAChT) para ser vertida al espacio sinptico al
producirse la despolarizacin de la membrana.
En el espacio sinptico tenemos dos tipos de receptores para ACh, los receptores Nicotnicos
(N-AChR) y los muscarnicos (m-AChR). Finalmente para limpiar el espacio tenemos las colinesterasas (AChE y BuChE).

1.1 Transportadores de colina (ChTs)


Los transportadores de colina estn presentes en todas las clulas ya que las colinas son necesarias para la formacin de las fosfatidilcolinas que componen las membranas celulares.
Estos transportadores y se van a clasificar en dos tipos en funcin de su afinidad:
-

Los transportadores de colina de baja afinidad se distribuyen en todos los tejidos perifricos.
Los transportadores de colina de alta afinidad se distribuyen a nivel del SNC junco con
los anteriores y se inhiben por hemicholinio-3
y van a depender de sodio para su funcionamiento ya que se trata de un co-transporte
tipo simporte, es decir, sodio y colina entran
al mismo tiempo. Estos transportadores pertenecen a la familia de transportadores de catecolaminas, siendo todos muy parecidos.

La colina que se encuentra en el torrente sanguneo, a una concentracin 10 mM, va a proceder de la dieta (1/2) y de la recaptacin que se produce tras la hidrolisis de acetilcolina (1/2).
La presencia de los transportadores de alta afinidad en el SNC asegura el suministro de colina
en momentos de ayuno.
Dado que la recaptacin de colina en el espacio sinptico depende de sodio, la inhibicin de las
bombas de sodio/potasio de la membrana plasmtica mediante ouabana impedir el proceso.

1.2 Sntesis de acetilcolina y transportador vesicular (VAChT)


Una vez que la colina est en el interior celular esta puede ser unida con acetil-CoA dando
lugar a la acetilcolina (ACh) mediante una reaccin bisustrato catalizada por la colina acetiltransferasa.
227

El gen que codifica la colina acetiltransferasa est compuesto por 18 exones y en uno de sus
intrones se encuentra el transportador vesicular de acetilcolina, por lo que la sntesis de ambas protenas va a estar completamente coordinada. La enzima colina acetiltransferasa es el
marcador de las rutas colinrgicas.
El acetato activo (Acetil-CoA) que proporciona la energa necesaria para garantizar que la reaccin sea termodinmicamente favorable, procede del ciclo de los cidos tricarboxlicos, concretamente del citrato mitocondrial que sale al citosol a travs de la lanzadera de citrato/aspartato.

La acetilcolina es una molcula con carga positiva que va a ser acumulada inmediatamente en
las vesculas sinpticas gracias a la accin de los transportadores vesiculares de acetilcolina
(VAChT) que van a realizar un antiporter con dos protones. Estos transportadores son inhibidos por el vesamicol (Bsame) y se parecen mucho a los transportadores vesiculares de dopamina, noradrenalina Las vesculas van a albergar hasta 10.000 molculas de acetilcolina
junto con protenas que van a equilibrar la osmolaridad.
El pH de estas vesculas es de en torno a 5-5.5 gracias a la accin de bombas proteicas que
funcionan a expensas de ATP, sin esta acidificacin el transporte no funcionara, por ello las
sustancias lisosomotrpicas (neutralizan el pH cido) afectan negativamente al acmulo de
catecolaminas en general (dopamina, AChe, noradrenalina, adrenaina,).
El transportador vesicular de acetilcolina est formado por 12 estructuras helicoidales, al igual
que los transportadores vesiculares de catecolaminas en genera, pero no los de membrana.

228

1.3 Liberacin de acetilcolina al espacio sinptico


La despolarizacin de la membrana provoca la liberacin de las vesculas cargadas con acetilcolina al espacio sinptico donde los receptores nicotnicos y muscarnicos van a activarse,
para que despus la molcula se metabolizada rpidamente.
La degradacin de acetilcolina se produce mediante la accin de las colinesterasas que la
rompen en colina y acetato. La colina es transportada de nuevo a la terminal nerviosa mediante los simportadores de alta afinidad dependientes de sodio.
Si ponemos el proceso de exocitosis en el contexto del citoesqueleto celular tenemos que
tener en cuenta la participacin de las V-SNAPs y T-SNAPs.

En primer lugar una vescula vaca sufre la acidificacin de su interior mediante la aportacin
de los protones a travs de una ATPasa que va a permitir la captacin de acetilcolina por el
transportador vesicular de acetilcolina. Una vez llena la vescula se desplaza hacia el entorno
de la membrana donde se produce el atraque mediado por las SNAPs.
Pero no va a ser hasta que se produzca una entrada de calcio medidada por los canales dependientes de voltaje hasta cuando se produzca la fusin de membranas y exocitosis de acetilcolina.
A continuacin se produce la recaptacin mediada por los canales de alta afinidad simportadores de colina/sodio, y las vesculas vuelven al interior celular gracias a la formacin de la cubierta de clatrina.

229

Cuando llega un potencial de accin a la terminal sinptica se abren los canales de calcio dependientes de voltaje que provocan la liberacin de acetilcolina al espacio sinptico donde los
receptores nicotnicos (ionotrpicos, canales) de acetilcolina que son pentmeros 2 (SNC
embrionario) o 2 (musculo embrionario y zonas no sinpticas).
Existen del orden de 11 genes para la subunidad , 3-4 genes para la subunidad y un gen
para las restantes. En funcin de la zona los receptores nicotnicos sern pentmeros homomricos o heteromricos presentando diferentes afinidades por agonistas y antagonistas.
La subunidad de estos canales es la
que liga agonistas como la acetilcolina
provocando un cambio conformacional
que pasa el canal al estado abierto presentando un dimetro de poro de 10
(es menos selectivo y tambin puede
pasar el calcio).
La entrada de sodio a travs de los receptores ionotrpicos desencadena la
despolarizacin local de la membrana
que genera un potencial de accin capaz de abrir los canales de sodio dependientes de voltaje y finalmente los tubulotransversos, donde los canales de sodio se acoplan a los receptores de rianodina de las cisternas terminales del retculo sarcoplasmtico y
provocan la liberacin de calcio y la contraccin del msculo.

1.4 Receptores muscarnicos (m-AChR)


Los receptores muscarnicos de acetilcolina presentan como agonistas la acetilcolina y la muscarina. Sus antagonistas son la atropina (belladona) y otros.
La localizacin de estos canales es en el sistema nervioso central, los ganglios del sistema nervioso perifrico, rganos efectores (corazn, pulmn e intestino) y glndulas endocrinas.
Se trata de receptores metabotrpicos, es decir, que todos presentan estructura de receptor
7tm asociado a protenas G entre los que vamos a distinguir dos grupos:
-

Los receptores M1, M3 y M5 (impares)


actan activando a fosfolipasa C generando IP3 y estimulando el sistema de
PKC (activadores).
Los receptores M2 y M4 (pares) actan
reduciendo el sistema de adenilato ciclasa y abren los canales de potasio
(inhibidores) favoreciendo la hiperpolarizacin de membranas.

230

2 Drogas que afectan a la sinapsis colinrgica


Existen muchas drogas que actan a nivel de la sinapsis colinrgica ya sea sobre los propios
receptores o aumentan la cantidad de acetilcolina.
La nicotina y la muscarina son agonistas de los receptores nicotnicos y muscarnicos respectivamente. La atropina y la escoplamina son antagonistas de estos receptores y por tanto inhiben la sinapsis.
Los organofosforados se consideran agonistas del sistema porque inhiben la actuacin de las
acetilcolinesterasas impidiendo la degradacin de acetilcolina y por tanto perpetuando el estmulo.
La toxina botulnica y la toxina del ttanos son antagonistas porque van a impedir la liberacin de las vesculas sinpticas, pero el veneno de la viuda negra va a provocar la liberacin
masiva de estas vesculas por lo que se considera un agonista.

3 Colinesterasas (AChE y BuChE)


Distribucin en tejidos, clulas y fluidos.
-

La acetilcolinesterasa (AChE) est distribuida en el sistema nervioso y en los glbulos


rojos.
La butirilcolinesterasa (BuChE) se encuentra distribuida por todos los tejidos humanos
salvo en los glbulos rojos.

Preferencia por substrato e inhibidores.


-

La AChE hidroliza especficamente acetilcolina liberando colina y acetato. Es fuertemente inhibida por BW284c51 y poco inhibida por Iso-OMPA.
La BuChE presenta un centro activo de mayor tamao que le permite hidrolizar otras
molculas y puede suplir la accin de AChE, pero su substrato ptimo es la butirilcolina. Es fuertemente inhibida por Iso-OMPA pero poco inhibida por BW284c51.

La e-serina es un inhibidor especfico de colinesterasas que permite diferenciar entre colinesterasas y esterasas cualesquiera.
Propiedades cinticas.
-

La AChE es inhibida por un exceso de sustrato.


La BuChE no se inhibe por exceso de sustrato y es ms rpida que AChE.

El centro cataltico de las colinesterasas presenta un resto de glutamato, histidina y serina


muy importantes. La reaccin transcurre en dos etapas, primero el glutamato cede electrones a la histidina y esta se los cede a la serina que ataca a la acetilcolina formando un
intermediario carbamil-serina. En segundo lugar una molcula de agua hidroliza el intermedio y libera el acetato y la colina.

231

Acciones colinrgicas y no colinrgicas.


-

Las acciones colinrgicas de las colinesterasas son aquellas implicadas con la neurotransmisin y la sinapsis colinrgica.
Las acciones no colinrgicas son la hidrlisis de neuropeptidos como la sustancia P, encefalinas y endorfinas. Control de la actividad motora por secrecin desde varias regiones cerebrales. Estn implicadas en la formacin de nudos neurofibrilares y placas
amilodes en los cerebros con Alzheimer. Diferenciacin y proliferacin en tejidos neuronales y no neuronales. Detoxifificacin (BuChE).

Toxicidad de los organofosforados.


La toxicidad de los compuestos organofosforados y de los carbamatos (insecticidas) se debe a
que reaccionan con la serina del centro cataltico y provocan la inutilizacin de las enzimas
disponibles.
Suxametonio y episodios de apnea.
La hipersensibilidad al suxametonio que acta como inhibidor competitivo de la BuChE en la
placa motora es la primera situacin en la que se ha podido demostrar una funcin biolgica
para esta enzima en la detoxificacin.
Este compuesto cuando llega a la placa motora de los msculos se une a los receptores de
acetilcolina durante mucho tiempo y provoca la relajacin muscular por una despolarizacin
de membrana continuada. Dado que es un mal sustrato de AChE, bloquea su accin y ralentiza
en gran medida a BuChE.
Por ello se ha utilizado clnicamente como un sedante, o relajante muscular general. Pero en
muchos casos que posteriormente se comprob que eran pacientes con deficiencias en BuChE,
por mutacin o intoxicacin de organofosforados, se produca una parlisis mayor de la esperada y apnea, establecindose que era BuChE la encargada de la detoxificacin.
Variedad de mRNAs para AChE
Todas las formas molculas de AChE estn
codificadas por un solo gen constituido
por 6 exones, donde en funcin del empalme alternativo del 5 o 6 exn se dar
lugar a las formas globulares o asimtricas
respectivamente.
Los mRNAs producidos y las formas a las
que dan lugar se muestran a la derecha.
Formas molculas de AChE y BuChE
Las formas globulares de AChE proceden del ensamblaje del exn 5 en el mensajero y dan
lugar a protenas homomricas cuya naturaleza puede ser hidroflica o anfiflica en funcin de
si son unidas a fosfolpidos de la membrana por el producto del gen prima.
232

Existen tres formas hidroflicas que son el monmero (3-4 S), el dmero (5-6 S) y el tetrmero
(10-11 S) globular, y dos formas anfiflicas, el monmero (3-4 S) y el dmero (5-6 S).
Si el gen prima que codifica la protena que produce la unin entre las formas globulares y la
membrana no es operativo, por mucho que se exprese el mensajero T para las formas globulares anfiflicas todas sern hidroflicas.
Por otro lado, el mensajero que empalma el exn 6 da lugar a las formas asimtricas de AChe
que forman protenas heteromricas en las que varias unidades se van a aunir a travs de de
una triple hlice de colgeno a la membrana. Esta hlice est codificada por el gen ColQ.

233

234

Tema 3: Receptores ionotropicos


Los canales ionotrpicos (canales de iones) pueden dividirse en dos clases generales en funcin del estmulo que los abre:
-

Los canales inicos dependientes de voltaje son los canales ya estudiados de sodio,
potasio y calcio que pasan al estado abierto mediante una despolarizacin de la membrana.
Los canales inicos dependientes de transmisores son los clsicos excitatorios de acetilcolina, glutamato y serotonina, o los inhibidores de GABA y glicina que aumentan la
carga negativa en el interior de la clula (hiperpolarizacin).

Dado que las neuronas presentan toda una poblacin de estos canales, en funcin de los estmulos que reciba se producir una hiperpolarizacin de la membrana o una despolarizacin,
aumento de calcio

1 Sistema glutamatrgico
El glutamato es un aminocido que puede actuar como neurotransmisor, pero no puede atravesar la barrera hematoenceflica por lo que debe ser sintetizado en las neuronas a partir de
precursores locales:
-

La fuente de glutamato en las neuronas es la glutamina procedente de las clulas gliales, convertida en glutamato por la glutaminasa.
Tambin puede ser sintetizado por transaminacin del 2-oxoglutarato, un intermediario del ciclo de los cidos tricarboxlicos que se transforma en -cetoglutarato. A continuacin el -cetoglutarato es descarboxilado por la glutamato descarboxilasa dando
lugar al glutamato. En este caso el glutamato se produce a partir de la glucosa metabolizada en las neuronas y representa uno de los motivos del consumo de este glcido
por el cerebro.

A continuacin el glutamato es acumulado en las vesculas sinpticas gracias a la accin del


transportador vesicular de glutamato (VGLUT) que est codificado por 3 genes diferentes.
A continuacin el glutamato es vertido al espacio sinptico donde va a activar a tres clases de
receptores y es recuperado del espacio sinptico a travs de los transportadores de aminocidos excitadores (EAATs) de los que hay cinco clases diferentes de alta afinidad que se distribuyen en las clulas de la gla y las terminales presinpticas.
235

El glutamato captado por las clulas de la gla es transformado en


glutamina gracias a la accin de la
glutamina sintetasa que precisa de
amoniaco y ATP para catalizar la
condensacin. Una vez generada la
glutamina esta es transportada a la
terminal nerviosa establecindose
una cooperacin entre ambas clulas.
Existen muchos tipos diferentes de receptores de glutamato (GluR) de los cuales 3 son ionotrpicos no selectivos (sodio, potasio, calcio) que siempre producen respuestas excitatorias
postsinpticas. Nombrados en funcin de sus agonistas:
-

Receptor NMDA (N-metil-D-aspartato) cinco clases R1, R2A, R2B, R2C, R2D.
Receptor AMPA (-amino-3-hidroxi-5-metil-4-isoxazolpropionato) cuatro clases R1-R4.
Receptor de kainato cinco clases GluR5-7 y KA1-2

Estos receptores ionotrpicos presentan en su estructura una subunidad de unin al ligando


repetida por lo que van a unir dos molculas
de glutamato. A travs de ellos puede pasar
el sodio, el potasio y pequeas cantidades de
calcio que van a poder actuar como un segundo mensajero activando seales de transduccin, como las de calcio-calmodulina kinasa, PKC para regular la plasticidad neuronal
y la ramificacin de dendritas. Esto desencadena la memoria y el aprendizaje, establecindose y fortalecindose los contactos dendrticos.
Otra de las propiedades que forma la base de la plasticidad sinptica es que los receptores de
glutamato NMDA van a ligar magnesio cuando la membrana se encuentre hiperpolarizada, bloqueado el paso de cationes. La despolarizacin de la membrana va a ser el nico
momento en el que el magnesio salga y pueda
producirse el trnsito de iones.
Otra de las propiedades del receptor NMDA es
que para que se produzca el estado abierto se
requiere de la presencia obligada de la glicina
como co-agonista en su sitio de unin.

236

Adems de estos tres receptores ionotrpicos tambin


vamos a encontrar receptores metabotrpicos de glutamato (mGluR1-R8) que estn asociados a protenas G que
al disociarse interaccionan directamente con canales inicos o con protenas efectoras que producen segundos mensajeros que abren o cierran los canales.
Los receptores metabotrpicos producen respuestas ms
lentas que los receptores ionotrpicos y sus acciones fisiolgicas son muy variadas.

2 Sistema GABArgico
El GABA es un metabolito que se puede obtener a partir de diferentes rutas tal y como se
muestra en la imagen, donde destaca la descarboxilacin del glutamato.

Los receptores de GABA y glicina, a diferencia de los de glutamato y AChE, son inhibitodios. El
receptor GABA-A est compuestos por 19 subunidades (1-6, 1-3, 1-3, , , , y 1-3)
cuya diversidad sigue aumentando por las variantes de Splicing alternativo que van apareciendo y que se localizan a nivel del SNC.
Esto da lugar a una variedad de receptores altsima, al menos 30, cada uno de ellos con propiedades farmacolgicas y fisiolgicas distintas, adems de un modelo caracterstico de expresin. Pero dado que todos favorecen la hiperpolarizacin de membranas se considera que son
inhibitorios y se han venido empleando agonistas para el tratamiento de crisis convulsivas.
Uno de los agonistas ms conocido es
el diazepan, una benzodiacepina. Tambin liga etanol y tiopental, un componente relacionado con el suero de la
verdad para provocar hipnosis. Dado
que este receptor tambin puede ligar
hormonas esteroideas, se considera
que est relacionado con los cambios
de humor femeninos.

237

3 Receptor de glicina
Los receptores de glicina abundan en la medula espinal y el antagonista ms conocido es la
estricnina (cicuta). Estos receptores que tambin presentan varias clases son todos pentamricos entre los que pueden encontrarse homoligomeros y heteroligmeros.
Se trata de canales de cloruro que provocan la hiperpolarizacin de membranas y por lo tanto son inhibitorios.
Tienen sitios de unin diversos para tropinas, alcoholes, anestsicos generales, esteroides neuroactivos, canabinoides, cationes divalentes y ciertos derivados del glutamato, por lo que su
capacidad de respuesta es tremenda.

238

Tema 4: Transmision adrenergica y receptores


metabotropicos
1 Ruta de biosntesis de catecolaminas
La ruta de sntesis de catecolaminas comienza con la oxidacin de la fenilalanina a tirosina
catalizada por la fenilalanina hidroxilasa
que introduce un tomo de oxgeno (-OH)
en el anillo aromtico. La fenilalainina hidroxilasa es una metalprotena que requiere hierro para catalizar la reaccin y su
deficiencia desencadena la fenilcetonuria.
A continuacin se produce la oxidacin de la tirosina a DOPA (3,4-dihidroxifenilalanina) catalizada por la tirosina hidroxilasa que introduce otro tomo de oxgeno (-OH) en el anillo aromtico. Esta enzima es el punto clave de la regulacin de la biosntesis de catecolaminas porque
la tirosina puede ser necesaria
para muchos otros procesos y
por lo tanto va a estar sometida
a una fuerte regulacin. La tirosina hidroxilasa tambin es una
metalprotena con hierro cuya actividad depende de
-

los niveles de tirosina (sustrato).


oxgeno.
un cofactor denominado tetrahidrodiocterina (reducida) o dihidrodiocterina (oxidada).
Es fuertemente inhibida por DOPA y altas concentraciones de catecolaminas en el torrente sanguneo.
En la regin N-terminal presenta un dominio de 150 aminocidos que activa fuertemente a la protena por fosforilacin en 4 restos de serina (S). Cuando se produce la
despolarizacin de la membrana y se vierten las catecolaminas, aumentan la cantidad
de calcio-calmoculina y la calcio-calmodulina kinasa que activa la produccin de estas
molculas.
Se trata de una enzima regulada transinapticamente por lo que cuando una clula recibe inervacin colinrgica continuada, aumenta la expresin del gen de la tirosinhidroxilasa para compensar la gran estimulacin y reponer el contenido vesicular.

A continuacin la DOPA es descarboxilada a dopamina mediante la DOPA descarboxilasa o


aminocido aromtico descarboxilasa, una enzima muy poco especfica que requiere de fosfato de piridoxal (vitamina B6) como cofactor. La deficiencia de esta enzima o cofactor supone
niveles bajos de dopamina asociados con estados depresivos.

239

En muchas neuronas la ruta de sntesis termina aqu, introducindose la dopamina en las vesculas sinpticas a travs del transportador tpico de 12 hlices. Pero en otras neuronas no dopaminrgicas como las adrenrgicas la dopamina va a continuar la ruta de sntesis hasta dar
lugar a noradrenalina y adrenalina.
A continuacin la dopamina es oxidada a noradrenalina (nor = sin grupo metilo) por la dopamina--hidroxilasa que introduce
oxgeno (-OH) en la posicin del
resto de etanol. La dopamina-hidroxilasa es una cuproprotena
que presenta cobre y precisa de
cido ascrbico para realizar su
funcin. La accin de acomplejantes
de cobre como los carbamatos tales
como el disulfiran suprmmimen su actividad aumentando los niveles de dopamina que desencadenan en nauseas, mareos y vmitos por ello el alcoholismo crnico se trata con estos agentes. Esta enzima se utiliza como marcador para el diagnstico de algunos tipos de cncer, como los feocromocitomas, es decir, tumores de la mdula adrenal afines a la tincin, y neuroblastomas del sistema nervioso.
Al igual que antes, para algunas neuronas la ruta de sntesis finaliza con la formacin de noradrenalina, pero finalmente otras van a utilizarla para generar adrenalina.
A continuacin la noradrenalina es metilada a adrenalina por la feniletanolamina
N-metiltransferasa (FNMT) que introduce
metilo en la posicin N. El donador de
grupos metilos es la S-adenosilmetionina
(SAM) y la adrenalina va a ser acumulada
en las vesculas sinpticas.

2 Rutas dopaminrgicas
Las rutas dopaminrgicas ms importantes
a nivel del sistema nervioso central son la
ruta mesolimbocortical y la mesoestriatal.
Se sabe que esta ltima ejerce un papel
funcional en la actividad motora y por ello,
los daos de estas neuronas producen tremores y parlisis en la enfermedad de Parkinson.
Adems de en la coordinacin se sabe que
la dopamina est implicada en la motivacin, recompensa y reforzamiento.

240

3 Inactivacin de catecolaminas
No existen sistemas enzimticos de degradacin de catecolaminas en el espacio sinptico,
como ocurra para ACh, por ello la dopamina, noradrenalina y adrenalina van a ser eliminadas
por difusin y captura desde el espacio sinptico.
Para la degradacin de catecolaminas van a intervenir dos sistemas enzimticos:
-

Monoamino oxidasa (MAO) es una flavoproteina con FAD que cataliza una desaminacin oxidativa. Se trata de una enzima marcadora de la membrana mitocondrial externa y la reaccin que cataliza
consiste en una desaminacin (prdida de N en forma
de amonio) seguida de la introduccin de oxgeno (oxidacin) dando siempre como
producto final un aldehdo.
Puesto que los aldehdos son
muy reactivos porque reaccionan con los grupos amino
libres, las oxidasas y reductasas de los tejidos los transforman en cidos o alcoholes como productos finales.
Catecol-O-metiltransferasa
(COMT) que introduce metilo en los oxgenos de la posicin 3 o 4, es una protena soluble.

Estas enzimas pueden actuar alternativamente sobre las catecolaminas dando lugar a diferentes productos finales que sern alcoholes o cidos.

4 Sistema dopaminrgico
Agonistas del sistema dopaminrgico como la cocacina y las anfetaminas inhiben a los transportadores de recuperacin del neurotransmisor provocando la activacin continuada de los
receptores.
Los antagonistas dopaminrgicos como la reserpina inhiben al transportador vesicular de
monoaminas y compuestos como el AMPT (-metil--tirosina) inhiben a la tirosin hidroxilasa
impidiendo la sntesis de DOPA.
Los inhibidores de MAO se utilizan para el tratamiento de la depresin, ya que se aumenta el
tiempo de permanencia del neurotransmisor en
el espacio o trminal sinptica, ya que el transportador funciona en ambas direcciones en
funcin de la concentracin. Pero MAO presen241

ta dos variantes:
-

MAO-A tiene como sustrato preferente la noradrenalina y la serotonina. Est distribuida a nivel del SNC, el intestino, el hgado y la placenta.
MAO-B presenta amplio espectro de actuacin y se distribuye en la sangre y las plaquetas, adems del en el SNC.

Por lo tanto compuestos como anfetaminas, cocana, morfina, nicotina, alcohol, crack y otros
prolongan las acciones de la dopamina aumentando el sentimiento de placer y recompensa,
por lo que se desarrolla adiccin.
Recordemos que los transportadores de alta afinidad de las terminales sinpticas son dependientes de sodio y por lo tanto la recuperacin de catecolaminas va a estar afectada por ouabaina y veratridina. Ante una despolarizacin permanente de la membrana generada por veratridina, las concentraciones de sodio se equilibran a ambos lados de la membrana y por lo
tanto deja de funcionar el transporte.
El Parkinson supone un dficit de dopamina que se trata con L-DOPA. La dopamina se siblera
en el ncleo accumens, amgdala y corteza anterior, reguladoras de las emociones (circuito de
recompensa y placer).
Tambin abunda en el lbulo estriado (aprendizaje), hipocampo (memoria) y corteza prefrontal (juicio y planificacin de actividades).
Todos los receptores de dopamina son metabotrpicos. Existen 5 genes (D1-D5) y parecen
estar acoplados a protenas G donde unas activan a adenilato ciclasa y otros a PLC.

5 Sistema adrenrgico
Los receptores del sistema adrenrgico son sensibles a noradrenalina y adrenalina, y vamos a
encontrar cuatro tipos que se localizan en
posiciones pre- y post-sinpticas. Se nombran como receptores adrenrgicos 1, 2,
1 y 2 y son todos metabotrpicos.
Muchas de las drogas que afectan a las sinapsis dopaminrgicas tambin afectan al
sistema adrenrgico como es el caso de la
reserpina. Adems el transportador que
recapta estos neurotransmisores del espacio
sinptico tambin se fe afectado por cocana y anfetaminas.

6 Sistema serotoninrgico
La indolamina serotonina es sintetizada a partir del aminocido triptfano mediante dos reacciones sucesivas. En primer lugar la triptfano hidroxilasa cataliza la oxidacin del triptfano

242

introduciendo oxgeno (-OH) para formar el 5-hidroxitriptfano. Esta enzima requiere oxgeno
y la tetrahidrobiopterina que se transforma en dihidrobiopterina.
En segundo lugar la descarboxilasa de aminocidos aromticos cataliza la descarboxilacin de
la molcula generando la 5-hidroxitriptamina, ms conocida como serotonina.
La serotonina es sintetizada en muchas regiones cerebrales inervadas por las fibras serotoninrgicas que estn implicadas en el control del sueo y la vigilia, el comportamiento y la ansiedad.
Se ha relacionado con la serotonina el hambre, sueo, actividad sexual, emociones, actividad
autonmica, motora, cognitiva y ritmos circadianos. Las drogas que afectan a la sntesis, liberacin o captura de la serotonina se utilizan en el tratamiento
de depresiones, ansiedad y
esquizofrenia.
Hoy en da se utiliza Fenfluramina (anortico) para combatir
la obesidad. El sumaptriptan es
muy eficaz contra migraas y
cefaleas. El prozac o pldora de
la felicidad, es un agonista del
sistema que facilita la liberacin
de serotonina y por ello se provoca un estado de bienestar.
La farmacologa de los receptores de serotonina es muy amplia y existen 5 clases diferentes,
entre los que encontramos ionotrpicos y metabotrpicos. A diferencia de los estudiados en
este tema que son todos metabotrpicos.

243

244

Tema 5: Transmision peptidergica


Desde los aos 50 y 60, los neurofisilogos se interesaron por responder al motivo de los efectos de la morfina y de los derivados opioides, ya que sus acciones analgsicas tenan que estar
mediadas por algn tipo de receptor.
La utilizacin de morfina marcada revel la existencia de un receptor de alta afinidad que deba de responder ante un compuesto interno, que ms tarde se clasificaran como encefalinas
y endorfinas.

1 Encefalinas
La leucinaencefalina y la metioninencefalina son
dos pentapptidos de 5 aminocidos cuyo primer
resto es el de tirosina y su ltimo aminocido es
leucina y metionina respectivamente. Estos dos
pptidos adoptan la misma conformacin espacial
y van a ser reconocidos por el mismo receptor.

2 Sntesis y acciones de los neuropptidos


A raz del descubrimiento de las encefalinas y endorfinas se vio que haba muchos neuropeptidos como los del hipotlamo e hipfisis, que adems de las acciones hormonales, ejercan su
efecto sobre el sistema nervioso directamente.
Precisamente la inyeccin de pequeas cantidades de estos pptidos, como la vasopresina o la
oxitocina, en determinadas regiones del cerebro provocaban cambios que podan involucrar al
comportamiento sexual e incluso a veces induca polimixia (necesidad de beber agua).
Los neuropptidos se sintetizan en el soma de las neuronas como protenas grandes que maduran durante el transporte de las vesculas a la terminal sinptica. Se liberan al espacio sinptico y se unen a los receptores para posteriormente ser degradadas por proteasas. No hay vas
de captura pero en muchas ocasiones los productos de hidrlisis son neuroactivos, llegando a
ser ms activos que los precursores. Pero en general no van a presentar actividad.
Entre los neuropeptidos podes encontrar:
-

La sustancia P implicada en la percepcin del dolor.


Encefalinas y endorfinas que son analgsicos porque inhiben la liberacin de sustancia
P entre otro pptidos.
Oxitocina
Vasopresina
Agiotensina I y II
Neurotensina
Gastrina
NPY, CCK, TRH, LHRH, VIP,
245

En cuanto a los opiceos (morfina, herona y cocana) y opioides (metilencefalina, leucinencefalina y endorfina), todos se unen a receptores acoplados a protenas Gi que reducen la actividad de adenilato ciclasa.
Un angonista de estos receptores es la metadona (opioide sinttico) y una antagonista la naloxona.
Los efectos que provocan son la analgesia, adiccin, tolerancia, placer, indiferencia a estmulos, inmunosupresin, depresin respiratoria, bradicardia,
Cuando a una persona se le administra un opiceo, esta se une al receptor y baja la actividad
de adenilato ciclasa, pero las clulas reaccionan aumentado la expresin de adenilato ciclasa
debido a la importancia de mantener el sistema de AMPc. Por ello cada vez se desarrolla ms
tolerancia a la droga.
Pero si se produce una supresin de la administracin, el estmulo que pone en marcha al sistema adenliato ciclasa dispara los niveles de AMPc (al igual que la toxina del clera) dando
lugar nuseas y diarreas, as como al desarrollo de tremores.
Para saber si una determinada percepcin de dolor est relacionada con los receptores de
neuropeptidos se administra el antagonista naloxona. La acupuntura en el tratamiento de dolores se basa en la liberacin de encefalinas y endorfinas porque las agujas se sitan en los
puntos de liberacin de estos neuropeptidos. Pero si primero administramos naloxona, que
ocupa a los receptores, se impide la atenuacin del sistema de adenilato ciclasa que producen
los neuropeptidos y por lo tanto la sensacin de dolor contina.

3 Estructura gnica de los neuropeptidos


El motivo por el que a los genes de los neuropeptidos se los denomina con el prefijo pre- se
debe a que el producto de los genes se va a obtener a travs de ribosomas asociados al retculo endoplasmtico, por lo que portan un pptido lder (pre).
Una vez cortado, el producto de los genes llega a las
vesculas sinpticas donde madura desde proencefalina hasta encefalina.
El gen de la preproencefalina est codifica para cuatro molculas de metioninencefalina, una para leucinencefalina y otros dos pptidos. La protena sintetizada es cortada por las convertasas o hidrolasas en
puntos flanqueados por arginina (R) o lisina (K).
El gen de la preproopiomelanocortina contiene informacin para la hormona adrenocorticorona, pero
se puede cortar para dar lugar a la una gran diversidad de neuropptidos, en funcin de las convertasas
presentes en cada tipo neuronal.

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4 Receptores de neuropeptidos
Todos los receptores de neuropeptidos son metabotrpicos y estn acoplados a protenas G inhibidoras. Su
topolota es del tipo 7tm con un alto
grado de polimorfismo.
En general se establece que hay tres
clases de receptores de opiceos
principales denominados , y .

La exposicin prolongada de los receptores de opioides a sus agonsitas estimula la va inhibidora de adenilato ciclasa activando a las protenas Gi. Precisamente la toxina pertusis se une a
estas subunidades G inhibidoras provocando su adenilacin e impidiendo que frenen a adenilato ciclasa.

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En cualquier caso la liberacin de protenas G asociadas a estos receptores inhibidores pueden


activar a quinasas del receptor y a la PKC produciendo la desensibilizacin.
La ocupacin de los receptores aumenta por otra parte la conductanacia de potasio y baja la
del calcio, producindose hiperpolarizaciones. Si el calcio baja entonces hay una disminucin
de la liberacin de neurotransmisores.

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