Está en la página 1de 7

SITUACIN DE LA VALIDACIN DE LOS ENSAYOS MICROBIOLGICOS EN LOS LABORATORIOS.

J. Laso Snchez1
1- Gabinete de Servicios para la Calidad (GSC). C/Cocheras, 4 Portal G Bajo 4 28007 Madrid. Tlfno.: 915519252. Fax:
915018898. E-mail: gscsal@gscsal.com
RESUMEN. El presente artculo, desea dar una
panormica de la situacin actual de los laboratorios
espaoles sobre la validacin interna de los mtodos
microbiolgicos, haciendo hincapi en los problemas ms
acuciantes presentados, as como las necesidades de
herramientas futuras requeridas.

1.- Introduccin
La validacin es La confirmacin mediante examen y la
aportacin de evidencias objetivas que demuestren el
cumplimiento de ciertos requisitos para el uso especfico
previsto.
En el campo microbiolgico y debido a las caractersticas
propias de los mtodos de ensayo, en general se haba
optado por la utilizacin de mtodos publicados, para evitar
el requisito de validacin. En algn caso esto produca
dificultades, ya que los mtodos no eran seguidos
estrictamente por ejemplo en cuanto a tolerancias de
temperaturas, composiciones de medios.
Por otro lado, la informacin existente sobre
caractersticas de los mtodos, era escasa, y en el periodo
1990-2000, se empieza a poner de manifiesto, a travs de
ejercicios de intercomparacin, que los resultados
obtenidos pueden ser dependientes del mtodo utilizado.
Con la publicacin de la norma ISO 17025 y la
interpretacin de la misma realizada por los organismos de
acreditacin, la validacin de los mtodos microbiolgicos,
cobra un papel fundamental, ya que se solicita que se
validen internamente tambin, aquellos mtodos que no
tienen parmetros definidos, de modo que una vez
obtenidos estos, puedan compararse con requisitos
preestablecidos que demuestren su aptitud para uso.
Esto hace que en los ltimos aos, proliferen
publicaciones, cursos y artculos sobre este tema.
De hecho en el ltimo periodo se procede a la publicacin
de un importante nmero de normas ISO: ISO 13843, ISO
16140, ISO 17994.
Sin embargo las normas publicadas adolecen de un
problema de cara a la validacin prctica. Su objeto no es
la validacin interna, sino la normalizacin de mtodos
alternativos, la introduccin de nuevos medios de cultivo,
por lo que los experimentos solicitados sobrepasan en
nmero y capacidad de organizacin los recursos
generalmente disponibles en un laboratorio independiente.
Por ello conviene realizar una reflexin sobre las
caractersticas de la medida microbiolgica, y como afectan
estas a la validacin.

2.- Caractersticas de la medida microbiolgica


La investigacin de la presencia/ausencia de
microorganismos, el recuento de las unidades formadoras
de colonias (ufc) en una cantidad determinada de muestra
se basan fundamentalmente en:
1) Utilizacin de una serie de pasos en las que se utilizan
medios de composicin qumica especfica y temperatura
de incubacin que permiten seleccionar en funcin de sus
caractersticas a unos microorganismos de otros, a travs de
favorecer dificultar su crecimiento.
ETAPAS DE SELECCIN

2) Observacin de las caractersticas morfolgicas y


fsicas (color forma) de los microorganismos en los
medios utilizados.
ETAPAS DE DETECCIN

3) Realizacin de pruebas bioqumicas complementarias,


que diferencian unos organismos de otros.
ETAPAS DE CONFIRMACIN

Todo este proceso que es el definido desde siempre para


las pruebas microbiolgicas presenta las siguientes
caractersticas diferenciadoras, con respecto a otros
procesos de medida.
2.1 Taxonomas imprecisas
En muchos casos no se ha realizado una separacin
precisa desde un punto de vista taxonmico, e incluso se
generan grupos de microorganismos que pueden no estar
taxonmicamente relacionados.
2.2 Dependencia del comportamiento
La adscripcin a un grupo especfico se produce por el
comportamiento del individuo, y no por su constitucin
interna.
Para ello, se ha valorado, como se comportan
generalmente individuos tpicos de ese grupo.
Esto supone que pueden existir individuos no tpicos que
se comporten de manera diferente que el
comportamiento, y por tanto el resultado, pueda depender
de la historia reciente (Ej.: cepas estresadas).

Tercer Congreso Virtual Iberoamericano sobre Gestin de Calidad en Laboratorios. (INTERNET 2005)

569

J. Laso. Situacin de la validacin de los ensayos microbiolgicos en los laboratorios.

2.3 Cuantificacin de seres vivos

3.1 Tipos de mtodos

Dado que el objetivo de la medida es un ser vivo, las


condiciones de conservacin de la muestra, son muy
importantes, y es difcil garantizar la estabilidad de un
valor de referencia (necesario para pruebas de exactitud)
por un largo periodo de tiempo (necesario para pruebas de
reproducibilidad), a no ser que se utilicen tcnicas
especiales. Ejemplo: liofilizacin.

En el anlisis microbiolgico existen diferentes tipos de


mtodos:
a) Mtodos cualitativos.
Su objetivo es detectar la presencia ausencia de un
microorganismo objetivo en una cantidad determinada de
muestra.
b) Mtodos cuantitativos.
Su objetivo es detectar un valor numrico (n ufc/unidades
de alimento), de un microorganismo objetivo. Dentro de
esta categora se pueden distinguir:
b1) Mtodos NMP. Que utilizan la estadstica para
realizar una estimacin del valor numrico.
Realmente se trata de mtodos semicuantitativos.
b2)
Mtodos de recuento. Se realiza un contaje real de
las unidades formadoras de colonias, existentes en el
cultivo final.

2.4 Influencia de otros microorganismos


La presencia ausencia de microorganismos
acompaantes, puede alterar los resultados esperados
debido a factores tales como:
-Competencia en el uso de los recursos requeridos para
crecimiento.
-Enmascaramiento de la reaccin del microorganismo
objetivo.
-Comportamiento similar al microorganismo objetivo.
2.5 Falta de referencias comunes internacionales
Dado que el nmero de microorganismos obtenido
depende de las condiciones: medio de cultivo, tiempo y
temperatura de incubacin, los valores de referencia son
dependientes de su mtodo de obtencin y solo se puede
hablar de recuperaciones relativas.
2.6 Pequeos nmeros y distribuciones
Los recuentos contajes en general se realizan sobre
placas que contienen un nmero pequeo de ufcs, menor
de 200, de otro modo existiran dificultades para
realizarlos.
Esto plantea problemas importantes sobre todo cuando
existe un nmero pequeo inferior a 15 ufcs, porque la
distribucin es discreta (15 14 ufcs) y no continua como
en el caso de la qumica. Por ello el modelo de distribucin
gaussiano, no es aplicable, y debe utilizarse otro tipo de
distribuciones como Poisson binomial negativa.
Esta caracterstica supone que en las zonas de bajos
recuentos no tendremos garanta cuantitativa de nuestros
resultados, pudiendo incluso obtener resultados de cero por
la propia libertad de las colonias, de situarse, en el mililitro
de la solucin contiguo al que tomamos para hacer las
diluciones.
3.- Parmetros de validacin
Los parmetros de validacin son aquellas caractersticas
del mtodo para las que:
a) Se definen requisitos.
b) Se realizan experimentos para conseguirlos.
c) Se valoran los resultados obtenidos frente a requisitos
para poder declarar vlido el mtodo.
Los parmetros dependern del tipo de mtodo utilizado y
definirn aquellas caractersticas que sean tiles para el uso
previsto.

570

3.2 Parmetros de mtodos cualitativos


Dados los objetivos de estos mtodos, estaremos
interesados en:
a) Estar seguros que detectamos pequeas cantidades de
microorganismos.
b) Estar seguros que la presencia de otros
microorganismos, la presencia de matrices diferentes no
produce resultados falsos (positivos negativos).
Por ello los parmetros requeridos para estos mtodos
pueden ser:
-Lmite de deteccin
-Falsos positivos
-Falsos negativos
-Sensibilidad
-Especificidad
-Eficiencia.
Que segn las definiciones de la ISO 13843 son:
1) Lmite de deteccin.
Nmero de partculas por porcin analtica cuya
probabilidad p0 de obtener un resultado negativo es igual
al 5%, o al asignado.
NOTA 1 Probabilidad de un resultado positivo p(+) = 1p0.
NOTA 2 - Clculo de x a travs de una distribucin de
POISSON
x = In

1
p

= In

1
= In(20) = 3,00 (1)
0,05

2) Falsos positivos.
Cuando el mtodo alternativo da un resultado positivo sin
confirmacin y el mtodo de referencia da un resultado
negativo. Cuando resultado verdadero es negativo.
3) Falsos negativos.
Cuando el mtodo alternativo da un resultado negativo sin
confirmacin y el mtodo de referencia da un resultado
positivo. Cuando resultado verdadero es positivo.
4) Sensibilidad: Fraccin del nmero total de colonias
positivas correctamente asignado en la inspeccin previa.

Tercer Congreso Virtual Iberoamericano sobre Gestin de Calidad en Laboratorios. (INTERNET 2005)

J. Laso. Situacin de la validacin de los ensayos microbiolgicos en los laboratorios.

5) Especificidad: Fraccin total del nmero de colonias


negativas asignado correctamente en la inspeccin previa.
6) Eficiencia: Fraccin del total de experimentos en los
que los resultados finales coinciden con los asignados en la
inspeccin previa.
3.2.1 Requisitos para parmetros cualitativos
3.2.1.1 Lmite de deteccin

Tabla 2.

Los requisitos suponen la definicin de un valor mnimo


de ufc detectado, con una probabilidad determinada.
Para fijar criterios hay que valorar:
a) La probabilidad de deteccin exigida no puede ser
mayor del 90%, para asegurar que no se exigen ms de 10
repeticiones por nivel.
b) Cuando el nmero de ufcs es pequeo la distribucin
de Poisson, supone que pueden encontrarse porciones, sin
microorganismo por lo que el nmero mnimo de ufcs para
detectar, debe ser razonable en torno a 10 5 ufcs.
3.2.1.2 Otros parmetros
Los requisitos para asegurar la correcta deteccin de casos
positivos y negativos depender del nmero de muestras
que razonablemente se puedan exigir.
Inicialmente se podran establecer los siguientes criterios:
-Sensibilidad, selectividad: 90%
-Falsos positivos y/o negativos: 90%
-Eficacia: 90%
3.2.2 Sistema de obtencin de parmetros
Para la obtencin de los parmetros deberemos disponer
de muestras con valor de referencia (Ver apartado 4).
En el caso de lmite de deteccin deberemos disponer de
muestras con valores de referencia iguales menores al n
de ufcs establecido como lmite en una cantidad adecuada
para cumplir el criterio de probabilidad establecido.
Un sistema es el dopaje de muestras estriles con
volmenes de una suspensin de cepas de coleccin de
cultivo de la que conocemos su valor de referencia
mediante su cultivo en condiciones normalizadas, y el
anlisis de dichas muestras para valorar presencia
ausencia.
Ejemplo: Si deseamos verificar que nuestro mtodo de
Salmonella tiene un lmite de deteccin inferior a 5 ufcs,
con una probabilidad de deteccin del 90%.
Prepararemos al menos 10 muestras de por ejemplo 3
niveles de concentracin (10, 5, 3 ufcs por 25 g) y las
analizaremos obteniendo:
Tabla 1.
Nivel
10
5
3

N presencia

Para el resto de los parmetros se dispondr de al menos


10 muestras positivas y 10 negativas, que incluyan otros
microorganismos acompaantes, que puedan interferir, por
ejemplo: Listeria innocua para Listeria monocytogenes,
etc Dichas muestras sern analizadas con el mtodo que
se pretende validar.
Los resultados obtenidos se clasificarn de acuerdo a lo
indicado en la norma ISO 13843 como:

N ausencias

10
0
9
1
7
3
Por tanto nuestro lmite es 5.

Probabilidad
deteccin
100%
90%
70%

Valor mtodo a
validar
Muestra
Muestra +
Valor
inicial

a+b

c+d

Se calcularn los parmetros requeridos como:


-Sensibilidad = a/(a+b) porcentaje positivos reales
correctamente asignados.
-Especificidad = d/(c +d) porcentaje de negativos reales
correctamente asignados.
-Falsos positivos = c/ (a + c) porcentaje de positivos
detectados incorrectamente asignados.
-Falsos negativos = b/ (b + d) porcentaje de negativos
detectados incorrectamente asignados.
-Eficiencia (e) E = (a + d) /n Aciertos respecto de casos
totales.
3.3 Parmetros cuantitativos
En el caso de anlisis cuantitativos, ya sean de recuento
directo NMP, los objetivos previstos inicialmente
deberan ser:
1) Que todos los laboratorios den resultados iguales para
muestras con cargas similares.
2) Que los resultados sean repetibles.
3) Que no hay errores en la asignacin de
microorganismos.
Por ellos los parmetros requeridos sern:
a) Exactitud, expresada como recuperacin, y que
depender siempre del sistema con el que se ha obtenido, el
valor de referencia.
b) Precisin expresada como coeficiente de variacin de
reproducibilidad.
-Definicin exactitud: Grado de concordancia entre el
resultado de la medicin y el valor de referencia aceptado
NOTA: El trmino exactitud cuando se aplica a un
conjunto de resultados de mediciones implica la
combinacin de los componentes aleatorios y de un error
sistemtico comn o de un componente del sesgo. (ISO
5725-1, 3.6:94) (ISO 3534-1, 3.11:93)
El resultado final se puede expresar como:
Re cuperacin=

Valor Obtenido
100 ( 2)
Valor Re ferencia

-Definicin precisin: "El grado de concordancia entre los


resultados obtenidos al aplicar el procedimiento

Tercer Congreso Virtual Iberoamericano sobre Gestin de Calidad en Laboratorios. (INTERNET 2005)

571

J. Laso. Situacin de la validacin de los ensayos microbiolgicos en los laboratorios.

experimental repetidas
establecidas".

veces

bajo

las

condiciones

3.3.1 Parmetros adicionales, que no son de aplicacin en


el campo microbiolgico.
3.3.1.1 Linealidad
Que en general se aplica a mtodos instrumentales, por lo
que no tiene sentido en microbiologa.
Se ha especulado con su uso para valorar el
mantenimiento de exactitud y reproducibilidad a partir de
diluciones.
3.3.1.2 Rango de medida
En cuanto a lmite superior, depende del nmero de ufcs
que pueden detectarse en una placa, sin problemas de
invasin dificultad de recuento. Puede estimarse a partir
de experimentos pero en muchos casos, y dado que los
mtodos microbiolgicos estn basados en normas pueden
tomarse los criterios establecidos en las mismas en torno a
150 200 ufcs, dependiendo del mtodo.
En cuanto a lmite inferior tambin llamado lmite de
cuantificacin con el seguimiento de la distribucin de
Poisson, para pequeo nmero de unidades formadoras de
colonias, ya las normas indican que tericamente podr
oscilar entre 15 y 20 ufcs dependiendo de los requisitos de
exactitud y precisin solicitados.
-Definicin lmite de cuantificacin aplicado a anlisis
microbiolgicos cuantitativos: Nmero mnimo de
microorganismos dentro de una variabilidad definida que
puede determinarse en las condiciones experimentales del
mtodo evaluado.
El autor considera que no es de utilidad mientras no puede
ser utilizado en la expresin de resultados (Ver apartado
5.2).
3.3.2 Requisitos para parmetros cuantitativos
3.3.2.1 Recuperacin relativa
El valor aceptable depender de:
a) El sistema de obtencin del valor de referencia.
b) El nmero de repeticiones realizadas.
c) El tipo de mtodo recuento NMP.
En el caso de mtodos de recuento, con valores de
referencia obtenidos de Materiales de referencia, mtodos
alternativos intercomparaciones, es aconsejable que se
obtengan resultados similares y por tanto la recuperacin
suponga al menos el 90%.
En el caso de mtodos de recuento cuyos rangos de
referencia provengan de dopaje de soluciones
estandarizadas puede existir una influencia de la
recuperacin del medio selectivo frente a un medio no
selectivo, lo que obligue a aceptar valores inferiores por
ejemplo 60%.
En el caso de mtodos NMP, la propia variabilidad del
mtodo (elevada), y el pequeo nmero de repeticiones que

572

es posible realizar ( 10 20) pueden requerir establecer


criterios de aceptacin en torno a 75%.
3.3.2.2 Precisin
Los criterios de precisin aceptable estarn basados, en el
modelo de distribucin que se asume siguen las
dispersiones de ufcs.
Por ello suponiendo que siguen una distribucin de
Poisson.

CV =

1
NU

100 ( 3)

Siendo NU el nmero de unidades formadoras de


colonias.
Teniendo en cuenta que este coeficiente de variacin, es
terico, se aconseja aumentar el intervalo de aceptacin,
admitiendo que el laboratorio realiza operaciones que
pueden aumentar la variabilidad terica.
El autor propone aceptar valores que suponen un aumento
del 20% de la variabilidad terica por lo que el coeficiente
aceptable sera:

CV

MXIMO

120
NU

(4)

Para el caso de mtodos NMP, la distribucin no sigue la


de Poisson.
Cochran realiz una aproximacin terica calculando la
desviacin estndar en logaritmos (Bibliografa 2).
Este valor da lugar a unos CVaproximados del 40%.
3.3.3 Obtencin de valores de las caractersticas
El problema fundamental para obtener valores, es debido
a la falta de estabilidad de las muestras microbiolgicas.
Por ello, en principio, es difcil conseguir valores de
precisin en reproducibilidad.
Sin embargo se han desarrollado tcnicas que permiten
valorar la precisin, mediante la comparacin de un
conjunto de pares de valores.
El sistema se basa en obtener un conjunto de pares en el
que:
-Valor 1, es el valor de referencia.
-Valor 2, es el del mtodo a validar.
A partir de este conjunto se realiza una transformacin,
sustituyendo los valores por sus logaritmos, y se calcula la
diferencia de cada pareja.
La diferencia media est relacionada con la recuperacin,
una vez invertida la transformacin.
La desviacin estndar de las diferencias est relacionada
con el valor del coeficiente de variacin de
reproducibilidad.
Una sistemtica ms completa se desarrolla en la
referencia bibliogrfica.

Tercer Congreso Virtual Iberoamericano sobre Gestin de Calidad en Laboratorios. (INTERNET 2005)

J. Laso. Situacin de la validacin de los ensayos microbiolgicos en los laboratorios.

4.- Tipos de muestras para obtencin de valores de


referencia
La validacin ya sea de mtodos cualitativos como de
cuantitativos requiere disponer de muestras con un valor de
referencia conocido (positivo/negativo valor de recuento)
que siempre ser relativo a la fuente de obtencin.
Por ello es necesario definir las caractersticas de dichas
muestras y las fuentes de donde deben ser obtenidas.
4.1 Caractersticas
a) Las muestras deberan contener matrz (alimento, agua,
etc) representativa de lo que se desea analizar, para
valorar el comportamiento fsico-qumico de nuestro
proceso, dificultad de homogenizacin, reacciones
inespecficas, etc
b) Las muestras deberan incluir en general
microorganismos acompaantes, que pueden ser naturales,
adicionadas artificialmente.
Las acompaantes deberan ser de dos tipos:
b1) Organismos similares al objetivo que demuestran la
selectividad del mtodo. Por ejemplo: coliformes no
fecales, para mtodo de coliforme fecal, Shigella spp para
Salmonella spp, Listeria innocua para mtodo Listeria
monocytogenes. Generalmente deben ser adicionadas.
b2)
Otra flora acompaante habitual. Ejemplo
Pseudomonas. Generalmente se obtiene de muestras
naturales. En algn caso es necesario adicionarla porque
debe partirse de muestra estril ante la dificultad
inseguridad de disponer de muestras en las que
conozcamos el valor del microorganismo objetivo su
ausencia.
c) Cuando se trate de muestras con valores de referencia
para validacin de mtodos cuantitativos es aconsejable
que los valores sean tales que los de recuentos superen las
30 ufcs en placa para evitar la influencia de las
distribuciones de POISSON binomial en los resultados de
los recuentos.
Probablemente no es necesario que superen el valor ms
alto de recuento en placa (por ejemplo 200), ya que en ese
caso estaramos validando, la capacidad del laboratorio de
realizar diluciones.
d) En el caso de lmites de deteccin de mtodos
cualitativos requerirn muestras de varios niveles
descendentes del microorganismo objetivo y sin flora
acompaante para valorar la capacidad del mtodo sin
interferencias.
En el caso de otros parmetros cualitativos los niveles del
microorganismo objetivo deben ser superiores a los de la
zona de deteccin y deben ir acompaados de
microorganismos naturales e interferentes para poder
valorar las caractersticas del mtodo.
4.2 Procedencia de las muestras
Las muestras con valor de referencia pueden provenir de
cuatro fuentes que se describen a continuacin.

4.2.1 Materiales de referencia certificados.


Existen en la actualidad materiales de referencia con
valores numricos de microorganismos.
Generalmente se presentan en cpsulas liofilizadas, por lo
que ser necesario aadirlas sobre matrices que no
contengan el microorganismo objetivo.
Se pueden obtener por ejemplo de IRRM (Referencia
bibliogrfica).
Es necesario que sus certificados contengan una mnima
informacin:
-Valor de referencia y especificacin del microorganismo
objetivo.
-Intervalo de confianza del valor requisitos
incertidumbre (debe ser adecuada a los requisitos de
validacin).
-Mtodos utilizados en la determinacin del valor de
referencia. (Deben ser compatibles con el mtodo a
validar).
-Nmero de laboratorios participantes.
-Sistema de uso y conservacin.
Existen dificultades para conseguir MRCS para algunos
de los microorganismos, como ventaja cabe indicar que
conserva su valor durante largos periodos de tiempo
permitiendo pruebas de reproducibilidad.
4.2.2 Muestra analizada con mtodo alternativo
Requiere que el mtodo alternativo est validado, y que se
tome su valor como referencia.
En general no se puede realizar una comparacin en un
largo periodo de tiempo a no ser que se comparen, pares de
muestras distintas.
4.2.3 Muestras
intercomparacin

procedentes

de

un

ensayo

de

Se toma como valor de referencia el valor indicado por el


organizador, pero requiere:
-Que se conozca la forma de estimacin de dicho valor.
Preferentemente media de los valores logartmicos.
-Que la variabilidad sea conocida, y suficientemente
pequea.
-Que las muestras incluyan matriz y no solo liofilo.
-Que el nmero de participantes para obtener el valor
medio sea suficiente, mayor de 30.
4.2.4 Muestras dopadas con cantidades conocidas de
suspensiones de cepas de referencia procedentes de
colecciones de cultivo internacionales
En general los laboratorios disponen de este tipo de cepas,
con objeto de controlar sus medios de cultivo y realizar
operaciones de control de calidad.
Estas cepas se caracterizan por una tipificacin clara del
microorganismo objetivo con trazabilidad internacional,
pero no disponen de un valor cuantitativo de recuento. Por
ello es necesaria una operacin previa simultnea de
estandarizacin, consistente en el cultivo en general en un

Tercer Congreso Virtual Iberoamericano sobre Gestin de Calidad en Laboratorios. (INTERNET 2005)

573

J. Laso. Situacin de la validacin de los ensayos microbiolgicos en los laboratorios.

medio no selectivo, y en condiciones de tiempo y


temperatura definidas, de una alcuota de la suspensin con
que se dopan las muestras para, calculada la concentracin
de dicha suspensin, y teniendo en cuenta el volumen
dopado y la cantidad de muestra sobre la que se produjo el
dopaje, disponer de un valor de referencia, con el que
comparar el obtenido por la aplicacin de nuestro mtodo,
sobre la muestra dopada.

5.- Problemas actuales en la validacin


5.1 Definicin de requisitos a los parmetros
En la actualidad no se dispone aun de suficiente
informacin para definir valores aplicables como criterios,
y no existen normativas al respecto, como han surgido en el
campo de la qumica, donde algunas legislaciones
nacionales europeas fijan criterios para exactitud
precisin.
Por otro lado el nmero mnimo de pruebas a realizar para
garantizar el cumplimiento de determinadas probabilidades
(por ejemplo: Lmite de Deteccin probabilidad del 95%),
ya que no se estima mediante una desviacin estndar, sino
con un nmero de casos positivos negativos, puede
resultar muy elevada.

N mnimo =

100
(5)
100 Pr ob

Esto supone la necesidad de aceptar como vlidas


probabilidades no muy elevadas (por ejemplo 90%) que
permiten la realizacin de un n de repeticiones costosa
(10), pero posible.
5.2 Rangos de validacin lmite cuantificacin
En los ltimos tiempos se ha creado un debate sobre la
necesidad no de realizar pruebas experimentales para
obtener un lmite de cuantificacin.
En opinin del autor la necesidad de estimar
experimentalmente un lmite de cuantificacin es dudosa
ya que:
1) Debido a la suposicin de las distribuciones que siguen
los valores de ufcs de las muestras (Poisson binomial
negativa) se espera que tericamente este lmite sea
superior a 16 ufcs (CV = 25% para Poisson y superior para
binomial).
2) Este hecho ya ha sido indicado por numerosas normas
de anlisis microbiolgicos que indican que a partir de 15 a
25 ufcs los recuentos son aproximados.
3) Sin embargo la importancia de detectar una nica ufc
puede ser importante para valorar posibles riesgos
patgenos.
Por ello la comunidad microbiolgica ha aceptado
expresar numricamente, e informar de los resultados que
proviniesen de la existencia de una sola ufc, aunque su
reproducibilidad fuese dudosa.

574

4) Por ello, an si se calculase el lmite de cuantificacin,


debera poderse continuar dando valores inferiores al
calculado, por lo que su determinacin no tiene una utilidad
excesiva en la expresin de resultados, como en otros
campos (qumica).
5) La realizacin de las pruebas experimentales en la zona
del lmite de cuantificacin conlleva la necesidad de
establecer requisitos de aceptacin muy amplios debido a la
variabilidad de las medidas.
Por ello determinadas normas por ejemplo ISO TR 13843
aconsejan que las pruebas de exactitud y precisin se
realicen en zonas de recuentos superiores (al menos 30 ufc
de recuento), para asegurar que se pueden establecer
criterios exigentes, e indican, que si se cumplen los
criterios en zonas superiores, tambin se cumplirn en
inferiores.
Todo ello indica que ser necesaria una reflexin general
para valorar la utilidad y necesidad de determinacin del
lmite de cuantificacin.
5.3 Tipos de muestras utilizadas
Otro de los debates existentes en la actualidad es la
posibilidad de utilizar muestras estriles dopadas con
microorganismos, muestras naturales dopadas.
Ambos sistemas tienen sus ventajas e inconvenientes.
5.3.1 Muestras estriles
Garantizan la falta de microorganismo objetivo por el
propio proceso.
Son el nico sistema posible para algn tipo de anlisis,
por ejemplo aerobios, sino disponemos de mtodo
alternativo intercomparacin.
Por el contrario los microorganismos acompaantes deben
ser dopados, y probablemente no presentan una riqueza de
flora natural como en el caso de muestras naturales.
5.3.2 Muestras naturales
La garanta de no existencia del microorganismo objetivo
se obtiene aplicando en muchos casos el mtodo que se
quiere validar, lo cual supone un riesgo.
En muchos casos es necesario un dopaje de
microorganismos acompaantes, debido a que pueden no
existir algunos interesantes para valorar las interferencias.
Tienen la ventaja de la existencia de flora natural por lo
que son representativos de situaciones reales.
5.4 Obtencin de valores de referencia
Uno de los sistemas de obtencin de los valores de
referencia, lo constituyen los valores procedentes de
circuitos de intercomparacin. Es imprescindible sin
embargo que los organizadores de los mismos tengan en
cuenta una serie de particularidades para que sus datos
puedan ser aprovechados por los laboratorios.

Tercer Congreso Virtual Iberoamericano sobre Gestin de Calidad en Laboratorios. (INTERNET 2005)

J. Laso. Situacin de la validacin de los ensayos microbiolgicos en los laboratorios.

a) Utilizacin de muestras reales con matriz para que los


datos sean vlidos.
b)Necesidad de microorganismos acompaantes.
c)Obtencin de valores de referencia bien definidos (poca
variabilidad) y descripcin del mtodo de determinacin
del valor de referencia.
d)Nmero de participantes suficiente.
Otro de los sistemas utilizados es la adicin de volmenes
de una suspensin con una concentracin de ufcs
determinada, mediante el cultivo en unas condiciones de
tiempo y temperatura de incubacin determinados, usando
un medio de cultivo no selectivo.
Es imprescindible establecer normas comunes que
permitan estandarizar el contenido de las suspensiones,
haciendo comparables los resultados de los diferentes
laboratorios, y generando una referencia comn que nos
permita valorar las caractersticas de los mtodos.

Bibliografa
Curso Validacin y Clculo de Incertidumbre en ensayos
microbiolgicos. J. Laso. Gabinete de Servicios para la Calidad (GSC).
Cochran W.G. Estimation of bacterial densities by means of the Most
probable Number. Biometrics 6, 1950 App 39-52.
ISO TR 13843 Water quality Guidance on validation of microbiological
methods.
ISO/DIS 17994 Water quality. Criteria for establishing de equivalency of
two microbiological methods.
ISO 16140 Microbiology of food and animal feeding stuffs. Protocol for
the validation of alternative methods.
Institute for reference materials and measurements

Tercer Congreso Virtual Iberoamericano sobre Gestin de Calidad en Laboratorios. (INTERNET 2005)

575

También podría gustarte