Universidad de Concepcin

Facultad de Ingeniera Agrcola

Departamento de Agroindustrias

Laboratorio N 1
Reconocimiento de
protenas y cuantificacin de
protenas por Bradford
Nombre: Elisa Monjes Villalobos
Vanesa Vsquez Contreras
Carrera: Ingeniera Ambiental.
Profesora: Cristina Loyola.
Fecha de la experiencia: 21/08/2015.
Fecha entrega del informe: 28/08/2015.

INTRODUCCIN
Las protenas, son los pilares fundamentales de la vida. El cuerpo necesita
protena para repararse y mantenerse a s mismo. Cada clula en el cuerpo
humano contiene protenas, las cuales son una parte muy importante de la piel, los
msculos, rganos y glndulas.
Los cambios ambientales o los tratamientos qumicos pueden causar una
desorganizacin en la conformacin nativa de una protena, con la prdida
concomitante

de

la

actividad

biolgica.

Esta

desorganizacin se

llama

desnaturalizacin. Como la informacin nativa slo es estable de manera

marginal, la energa necesaria para causar la desnaturalizacin es una frecuencia
pequea, quiz equivalente a la desorganizacin en tres o cuatro puentes de
hidrgeno. (Virginia Melo,2007).
La estructura fundamental de las protenas son los aminocidos, los cuales
cuando se juntan entre s, o bien, con otras sustancias, dan origen a las protenas
simples o conjugadas.
Dentro del amplio grupo de las protenas, podemos encontrar la ovoalbmina, que
se encuentra en la Casena que se encuentra en la leche, las cuales sern las que
estudiaremos su comportamiento ante la reaccin con diversos compuestos.
La determinacin de protenas, es un proceso mediante el cual se puede
cuantificar la cantidad de protenas presentes en diversas muestras. Por lo
general, las protenas ms importantes para los seres humanos son las que nos
aportan la leche la fuente principal e importante como lo es la carne.

OBJETIVO GENERAL

Reconocimiento de alteraciones de protena en leche.

Cuantificacin de protenas mediante metodologa de Bradford.

OBJETIVOS ESPECIFICOS

Desnaturalizacin de protenas en leche con HCl, NaCl al 4% p/v, NaOH al

20% p/v y en altas temperaturas.

Nitracin de anillos de fenol mediante la reaccin Xantoproteicas.
Reconocer enlaces peptdicos por medio de la reaccin de Biuret.
Reacciones de aminocidos azufrados para verificar la presencia de azufre

en leche.
Cuantificar protenas mediante un espectrofotmetro.

MATERIALES
Gradilla
Pinza de madera
Pipetas graduadas
Leche
Vaso precipitado
Micro-pipetas

Tubos de ensayo
Bao Mara
Pro-pipeta
Gotario
Espectrofotmetro
Tubos de vidrio

Agua destilada

Vortex

Reactivos
cido clorhdrico HCl (puro)
cido ntrico HNO3
cido actico(CH3CO2H)
Acetato de plomo Pb(CH3COO)2
Sulfato de cobre Cu2SO4 al 1%

Reactivo de Bradford
Muestras patrones de protenas
Cloruro de sodio NaCl al 4%
Hidrxido de sodio NaOH al 20%

PROCEDIMIENTO
Desnaturalizacin o coagulacin de protenas:

A cuatro tubos de ensayo se le adicionaron 2mlde leche y se enumeran.

Al tubo numero 1 se le agreg 2ml de HCl puro.
Al tubo numero 2 se le agreg 2ml de una disolucin concentrada de NaCl

al 4% p/v.
Al tubo numero 3 se le agreg 2ml de NaOH al 20%p/v.
El tubo numero 4 se le aplico calor mediante bao mara.

Reacciones Xantoproteicas:

A un tubo de ensayo se le agregaron 2ml de leche y 1ml de HNO 3

concentrado, se calent a bao mara durante un tiempo y luego se enfri
en agua helada y posteriormente se le aadieron unas gotas de disolucin
al 40% p/v.

Reaccin de Biuret:

A un tubo de ensayo se agregaron 2ml de leche y 2ml de Hidrxido de

sodio al 20% p/v, luego se aadieron unas gotas de solucin de Sulfato
Cprico diluido al 1% p/v.

Aminocidos azufrados:

A un tubo de ensayo s ele agregaron 2ml de leche, 2 ml solucin de

Hidrxido de sodio al 20% p/v y gotas de solucin de Acetato de Plomo al
5% p/v, posteriormente se calent a bao mara.

Cuantificacin de protenas por Bradford:

En un tubo de vidrio se colocaron 0,5ml de leche y 2,5ml reactivo de

Bradford.

En otros 9 tubos de vidrio se colocaron 0,5ml de patrn de protenas y

2,5ml de reactivo de Bradford.

DATOS EXPERIMENTALES
Desnaturalizacin o coagulacin de protenas
Tubo N1
Tubo N2
Tubo N3
Tubo N4

2mL de leche y 2mL de HCl puro

2mL de leche y 2mL de NaCl al 4% p/v
2mL de leche y 2mL de NaOH al 20% p/v
2mL de leche ms calor

Reacciones Xantoproteicas:
Tubo N5

2mL de leche ms 1mL de HNO3 , calor, golpe de fro y gotas de

sosa al 40%

Reaccin de Biuret:
Tubo N6

2mL de leche mas 2mL de hidrxido de sodio al 20% p/v mas

gotas de solucin de sulfato cprico al 1% p/v

Reaccin de Aminocidos Azufrados:

Tubo N7

2mL de leche ms hidrxido de sodio al 20% p/v mas gotas de

acetato de plomo al 5% ms calor

DATOS BIBLIOGRFICOS

Casena: Es una fosfoprotena presente en la leche y en algunos de sus derivados

en la leche se encuentra en la fase soluble asociada al calcio en un complejo que
se ha denominado casingeno.
Las protenas son filamentos largos de aminocidos unidos en una secuencia
especfica. Son creadas por los ribosomas que traducen los codones de los genes
y ensamblan la combinacin requerida de aminocidos por la instruccin gentica.
Si la protena es alterada por algn factor externo, no es capaz de cumplir su
funcin celular.
Desnaturalizacin de protenas: Es un cambio estructural de las protenas,
donde pierden su estructura nativa y de esta forma, su ptimo funcionamiento
adems de cambiar sus propiedades fsicas y qumicas.
En la desnaturalizacin de la estructura cuaternaria, las subunidades de protenas
se separan o su posicin espacial cambia.
La desnaturalizacin terciaria implica los siguientes cambios:

Enlaces covalentes entre cadenas laterales de los aminocidos.

Enlaces no covalentes dipolo-dipolo entre cadenas laterales polares de

aminocidos.
Enlaces dipolo inducidos por fuerzas de Van Der Waals entre cadenas
laterales no polares de aminocidos.

En la desnaturalizacin de la estructura secundaria las protenas pierden todos los

patrones de repeticin regulares como las hlices alfa y adoptan formas aleatorias.
La estructura primaria, la secuencia de aminocidos ligados por enlaces
peptdicos, no es interrumpida por la desnaturalizacin, ya que esta es la
estructura bsica de toda protena.
El Reactivo de Biuret es aquel que detecta la presencia de protenas, pptidos
cortos y otros compuestos con dos o ms enlaces peptdicos en sustancias de
composicin desconocida.
Mtodo de Bradford
El mtodo de Bradford, cuantifica la unin de un colorante a una protena
desconocida y la compara con diferentes cantidades de otra protena estndar,
usualmente albumina de bovino. El complejo colorante-protena presenta un
mximo de absorcin de 595 nm. El colorante, en disolucin acida, se presenta en
dos formas una azul y la otra naranja. Este mtodo est diseado para cuantificar
entre 1 10 ug de protena. Es un mtodo simple, barato, confiable, rpido y
pocas sustancias interfieren en su determinacin.

RESULTADOS
Desnaturalizacin de protenas en leche:
Tubo n1

Se produce una reaccin exotrmica,

precipitacin

adems

Tubo n2
Tubo n3

desnaturalizacin de la casena.
No ocurre ninguna reaccin.
Ocurre un cambio de color y la

Tubo n4

desnaturalizacin de la casena.
No ocurre ninguna reaccin.

de

la

Reaccin Xantoproteicas ( Tubo n5):

leche + HNO3 concentrado + calor
Cambio de color de blanco a amarillo.
leche + HNO3 concentrado + calor + Cambio de color de amarillo a
golpe de frio + CuSO4 1% p/v

anaranjado.

Reaccin de Biuret:
Tubo n6

Ocurre

la

desnaturalizacin

de

la

casena y la formacin de un denso

color violeta, el cual representa la
presencia del cobre en la muestra.

Reaccin de aminocidos azufrados:

Tubo n7

Al agregar solo el NaOH la muestra se

vuelve

lechosa

ocurre

la

desnaturalizacin de la casena y al
aplicar acetato de plomo + Calor, la
muestra se vuelve oscuro lo cual indica
la presencia de sulfuro de plomo.

Cuantificacin de protenas por Bradford:

Absorbancia
0,0
0,174
0,510
0,675
1,108
1,485
1.674
1,871
2,018
2,091

Concentracin (mg/L)
0
25
50
75
125
150
200
250
300
1:100

Curva de Calibracin
2.5
f(x) = 0.01x + 0.13
R = 0.95

1.87
1.67
1.49

1.5

ABSORBANCIA

2.02

1.11
1
0.51
0.5
0
0

0.68

0.17
50

100

150

200

CONCENTRACION (mg/L)

250

300

350

Y = 0,0071X + 0,1348
2,091 = 0,0071X + 0,1348
X = 275,52mg/L de protena
R2 = 0,9549
DISCUSIN DE RESULTADOS
En los tubos donde se produjo la desnaturalizacin de la protena debido a un
aumento del pH, ocurri un proceso irreversible, volvindose insoluble debido a
que la protena perdi sus propiedades fsicas y qumicas.
En las reacciones Xantoproteicas las protenas en presencia de HNO 3 se
desnaturalizan originando un anillo bencnico, que se forma con la entrada de un
NO3 y la salida de un OH. La nitracin se puede identificar mediante el cambio de
color a amarillo debido a la presencia de aminocidos aromticos.
Por otro lado en la reaccin de Biuret el grupo amino paso a ser un grupo
carboxlico, ya que est formado por una disolucin de sulfato de cobre en un
medio alcalino, este reconoce el enlace peptdico de las protenas mediante la
formacin de un complejo de coordinacin entre los iones Cu2+ y los pares de
electrones no compartidos del nitrgeno que forma parte de los enlaces
peptdicos, lo que produce una coloracin violeta.
Mientras que en las reacciones donde debemos identificar la presencia de
aminocidos azufrados el azufre que poseen algunos aminocidos se mezcla con
el plomo dado lugar al sulfato de plomo.

CONCLUSIN
Mediante los experimentos realizados en el laboratorio podemos decir que la leche
sufri grandes cambios en sus estructuras terciarias y cuaternarias, ya que en la
mayora de los tubos se produjo la desnaturalizacin de la casena, la que se
separ mediante la acidificacin formando precipitados blancos, provocando la
prdida de las propiedades fsicas y qumicas. El cambio de color detecta la
presencia de protenas.
Hay numerosos agentes desnaturalizantes, como el calor, pH, sales inorgnicas a
concentraciones elevadas, disolventes orgnicos, etc. La desnaturalizacin
conlleva cambios drsticos en las propiedades fsicas de las protenas:
solubilidad, grado de hidratacin, ndice de refraccin, etc. Son ejemplos de
desnaturalizacin de protenas: a) la albmina de la clara de huevo, transparente y
semilquida, se convierte por calentamiento en una masa blanca y slida (huevo
fresco y cocido);
b) La casena de la leche soluble origina, por acidificacin, un precipitado
gelatinoso (yogur) (Jos M. Macarulla Flix M. Goi, 1994)
Por el mtodo de Bradford, podemos decir que a mayor concentracin mayor ser
la

absorbancia

y que

las muestras deben

ser diluidas para

que

el

espectrofotmetro nos entregue el valor de absorbancia. El valor R2 fue cercano a

1, por lo tanto, las mediciones fueron correctas.
Este tipo de grfica es la ms apropiada para la calibracin espectrofotomtrica.
Existen muchas razones por las que este tipo de grficas se tornan curvas.
Cuando la pendiente tiende hacia el eje de la ordenada, se dice que la desviacin
es positiva, y cuando la pendiente se aproxima a la abscisa, la desviacin es
negativa. (Wilbert Villegas- Pablo Acereto, 2006)

BIBLIOGRAFA

Virginia Melo Ruiz, 2007, Bioqumica de los procesos metablicos, Revert,

Mxico, 99-100 pg.

Jos M. Macarulla Flix M. Goi, 1994, Bioqumica humana, Revert,

Espaa, 114-118 pg.

Wilbert Villegas- Pablo Acereto, 2006, Anlisis ultravioleta- visible,
Universidad Autnoma de Yucatn, Mxico, 4-11 pg.

ANEXOS
1. Cmo se manifiesta la desnaturalizacin de la clara de huevo?
Se produce cambio de color de la clara. Pasa de transparente a opaco o
blanco.
2. Cul

de

los

tres

agentes

utilizados

tiene

mayor

poder

de

desnaturalizacin?
Al agregarle NaCl a la leche se produjo un cambio brusco de color de
blanco a amarillo provocado por la desorganizacin de las protenas.
3. Cmo podramos saber que una sustancia desconocida es una protena?
Mediante la reaccin Biuret o Xantoproteica.
4. Qu coloracin da la reaccin del Biuret?
Da un color violeta.
5. Una protena coagulada podra dar la reaccin de Biuret?
S, porque el reactivo reacciona con cualquier lquido o slido.
6. Si se realiza la reaccin de Biuret sobre un aminocido como la Glicina es
positiva o negativa? Por qu?
La glicina no reaccin con el reactivo de Biuret porque esta se forma libre y
no presenta enlaces peptdicos con los que reacciona el reactivo, por lo
tanto, es negativa.
7. Mencione 3 aminocidos portadores de azufre, fosforo y grupos aromticos.
Aminocidos portadores de azufre: Metionina, Cisteina, Leucina.
Aminocidos portadores de grupos aromticos: Finilalanina, Tirosina,
Triptofano.