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Enzimologa

Ivn Paz Aliaga

CAPTULO V

CONTENIDO
Tipos de estrategias catalticas
Mecanismo cataltico de las proteasas
Mecanismo cataltico de anhidrasa carbnica
Mecanismo cataltico de endonucleasas de restriccin
Mecanismo cataltico de las nuclesido monofosfato quinasas
Mecanismo cataltico de lisozima

ESTRATEGIAS CATALTICAS
INTRODUCCIN
Cuando el sustrato se une a la enzima, debe existir una exquisita
especificidad de unin lo que solo se consigue a travs de un gran
nmero de interacciones, si una de ellas no concuerda, lo mas probable es
que no ocurra la catlisis; adems, el complemento perfecto para dichas
interacciones solamente se forma cuando el sustrato se encuentra en el
estado de transicin. De esta forma, las interacciones entre la enzima y el
sustrato no solo favorecen la unin del sustrato sino que estabilizan al
estado de transicin; disminuyendo as la Energa de activacin. La
Energa de unin (Energa libre liberada en la formacin de un gran
nmero de interacciones dbiles entre la enzima y el sustrato) puede
promover tambin cambios estructurales tanto en la enzima como en el
sustrato, que favorecen la catlisis (ajuste inducido).

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TIPOS DE ESTRATEGIAS CATALTICAS


Para catalizar reacciones especficas, las enzimas normalmente emplean
una o ms de las estrategias siguientes:
1. Catlisis covalente:
En este tipo, el centro activo contiene un grupo reactivo,
habitualmente un nuclefilo potente, que en el transcurso de la catlisis
llega a ser modificado covalentemente de forma temporal; la proteasa
quimotripsina es un ejemplo de este tipo.
2. Catlisis general cido-base:
Aqu, una molcula diferente al agua desempea el papel de donador
o aceptor de un protn. La quimotripsina utiliza un residuo de histidina
como un catalizador bsico (acepta un protn) para incrementar el poder
nucleoflico de la serina.
3. Catlisis por in metlico:
Los iones metlicos pueden funcionar catalticamente de varias
formas, por ejemplo puede ser un catalizador electroflico mediante la
estabilizacin de una carga sobre un intermediario de la reaccin. De
igual forma, un in metlico puede generar un nuclefilo cuando
aumenta la acidez de una molcula cercana, como el agua (esto ocurre en
anhidrasa carbnica). Finalmente un in metlico puede unirse al
sustrato, aumentando el nmero de interacciones con la enzima y as,
aumenta tambin la energa de unin; las nicletido monofosfato
quinasasutilizan esta estrategia.
4. Catlisis por aproximacin:
En muchas reacciones participan dos sustratos diferentes,
aumentando la reaccin si se atraen a los dos sustratos juntos sobre una
misma superficie de unin de la enzima. Las nuclesido monofosfato
quinasas atraen a dos nucletidos a la vez para facilitar la transferencia
de un grupo fosforilo desde un nucletido al otro.
Vamos a ver a continuacin la estrategia cataltica de cuatro enzimas, las
cuales nos van a ejemplificar los tipos de estrategias desarrollados:
algunas proteasas, anhidrasa carbnica, enzimas de restriccin y las
nuclesido monofosfato quinasas.

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MECANISMO CATALTICO DE LAS PROTEASAS


Las reacciones proteolticas se observan en algunos procesos metablicos
como la digestin, en el recambio de protenas, en la regulacin de la
actividad de ciertas enzimas y de algunas protenas. Las enzimas
encargadas del proceso, conocidas como proteasas, rompen a las
protenas en el enlace peptdico mediante una reaccin de hidrlisis. Este
proceso es muy lento, en ausencia del catalizador se calcula que demora
entre 10 a 1000 aos, sin embargo, en presencia de las enzimas se
realizan en milisegundos.
La resonancia que presenta el enlace peptdico, dotndolo de un carcter
parcial de doble enlace, es la responsable de su estabilidad cintica,
mostrando una fuerte resistencia a la hidrlisis. Asimismo, el enlace C-N
se fortalece por su carcter de doble enlace y el tomo de carbono
carbonlico es menos electroflico y por tanto menos susceptible al
ataque nucleoflico que los tomos de carbono carbonlicos de otro tipo
de compuestos. Consecuentemente, para promover la rotura del enlace
peptdico, la enzima debe facilitar el ataque nucleoflico sobre un grupo
carbonilo normalmente no reactivo.
Mecanismo cataltico de la quimotripsina:
Esta enzima proteoltica del tracto intestinal de los mamferos, rompe
enlaces peptdicos donde el grupo carboxilo de los mismos es aportado
por aminocidos voluminosos e hidrofbicos como el triptfano, la
tirosina, la fenilalanina y la metionina.
La enzima emplea un nuclefilo potente para atacar al grupo carbonilo no
reactivo del sustrato; este nuclefilo se une covalentemente al sustrato
por un tiempo en el transcurso de la catlisis. Este nuclefilo es la serina,
lo cual se determin tratando a la enzima con di isopropil fluoro fosfato,
el cual la inactivaba de forma irreversible (como sabemos este compuesto
se une a los residuos de serina). A pesar de que la enzima posee 28
residuos de serinas, solo uno, la serina 195, se modific y esto condujo a
la prdida total de la actividad enzimtica.
Para estudiar el mecanismo se utiliz un anlogo del sustrato el cual al
ser escindido, forma un producto coloreado; este es el ester pnitrofenlico de N-acetil-L-fenilalanina, este sustrato es un ster en lugar

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de una amida, uno de los productos formados por la hidrlisis de este


sustrato por la quimotripsina es el p-nitrofenolato de color amarillo. Ver
figura 5.1.

Figura 5.1.- Sustrato cromognico: El ester p-nitrofenlico de N-acetil-Lfenilalanina produce un producto amarillo, el p-nitrofenolato, despus de
ser atacado por quimotripsina.
Al monitorear la reaccin, al comienzo se observa una etapa explosiva de
produccin rpida de producto coloreado; despus, cuando la reaccin
alcanza el estado estacionario, el producto se generaba ms lentamente.
Estos resultados sugieren que la hidrlisis tiene lugar en dos pasos: en el
primero, reacciona el residuo nuclefilo de serina con el sustrato para
formar el intermediario enzima-sustrato enlazado covalentemente (ver
figura 5.2); el grupo hidroxilo de la serina 195 sumamente reactiva ataca
al grupo carbonilo del sustrato para formar el intermediario acil-enzima y
se libera el alcohol p-nitrofenol. En segundo lugar, el intermediario acilenzima se hidroliza para liberar el componente cido carboxlico del
sustrato y regenerar el enzima libre. As, al aadir sustrato, el pnitrofenolato se produce rpidamente cuando se forma el intermediario
acil-enzima, pero necesita mas tiempo para que la enzima pueda reiniciar
un nuevo ciclo cataltico, para lo cual requiere la hidrlisis del
intermediario acil-enzima.
Pero la serina no acta sola, forma parte de una triada cataltica que
incluye tambin a histidina y aspartato y actan de la siguiente manera:
La quimotripsina es aproximadamente esfrica y consta de tres cadenas
peptdicas enlazadas por puentes disulfuro; se sintetiza como un
polipptido nico y se activa por la ruptura proteoltica del polipptido
para proporcionar tres cadenas. El centro activo de la quimitripsina
sealado por la serina 195, se encuentra en una hendidura sobre la
superficie de la enzima.

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Figura 5.2.- Catlisis covalente: La hidrlisis por quimotripsina tiene


lugar en dos etapas: la acilacin para formar el intermediario acil-enzima
y la desacilacin para regenerar el enzima libre.
El anlisis estructural revel la reactividad de la serina 195; este
aminocido forma un puente de hidrgeno con el anillo imidazol de la
histidina 57. El grupo NH de este anillo imidazol se encuentra a su vez
formando un puente de hidrgeno con el grupo carboxilo del aspartato
102; a este trio se le llama triada cataltica.
Esta triada funciona de la siguiente manera, la histidina posiciona a la
cadena lateral de serina para polarizar a su grupo hidroxilo. Actuando as,
los residuos funcionan como un catalizador bsico general, aceptando un
in hidrgeno, porque el grupo hidroxilo polarizado del residuo de serina
se balancea para su desprotonacin. La retirada del protn del grupo
hidroxilo genera un in alcxido, que tiene mucho mayor mayor poder
nucleoflico que un alcohol. El residuo de aspartato ayuda a orientar a la
histidina y lo convierte, a travs de interacciones elctricas en un mejor
aceptor de protones. Ver figura 5.3.

Figura 5.3.- La triada cataltica: esta triada convierte a la serina 195 en


un potente nuclefilo, a travs de la formacin de un in alcxido.

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El mecanismo de accin de quimotripsina seria el mostrado en la figura


5.4; despus de la unin del sustrato (paso 1), la reaccin comienza con
el grupo hidroxilo de la serina 195 que lleva a cabo un ataque
nucleoflico al tomo de carbono carbonilo del sustrato (paso 2).

Figura 5.4.- Mecanismo de hidrlisis de quimotripsina sobre una


protena: el proceso permite observar dos tipos de estrategias, catlisis
cido base y covalente. La interaccin del aspartato sobre la histidina
hace que esta ltima se convierta en una base ms fuerte.
El ataque nucleoflico cambia la geometra alrededor de este tomo de
carbono, transformndolo de trigonal plano a tetradrico. La inestabilidad
inherente al intermediario tetradrico formado mantiene una carga
negativa formal sobre el tomo de oxgeno derivado del grupo carbonilo.
Esta carga se estabiliza mediante interacciones con grupos NH de la
protena en un centro denominado cavidad del oxianin (se forman 2
puentes de hidrgeno con el oxgeno del carbonilo, uno de la propia
serina 195 y otro con una glicina de posicin 193). Estas interacciones
ayudan tambin a estabilizar el estado de transicin que precede a la
formacin del intermediario tetradrico. Despus, este intermediario
tetradrico se colapsa para generar el acil-enzima (paso 3). Este paso se
facilita mediante la transferencia de un protn desde el residuo de

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histidina cargado positivamente al grupo amino formado por la ruptura


del enlace peptdico. El componente amino se encuentra ahora libre para
apartarse de la enzima (paso 4) y se sustituye por una molcula de agua
(paso 5).
El grupo ster del acil-enzima se hidroliza ahora mediante un proceso
que es esencialmente la repeticin de los pasos 2, 3 y 4. La molcula de
agua ataca al grupo carbonilo mientras que simultneamente, el residuo
de histidina separa un protn que acta como un catalizador cido
general formando un intermediario tetradrico (paso 6). Esta estructura se
descompone para formar el producto cido carboxlico (paso 7).
Finalmente la liberacin del producto cido carboxlico (paso 8) pone
nuevamente a la enzima lista para iniciar un nuevo ciclo cataltico.
Este mecanismo explica la forma de ruptura del enlace peptdico pero no
explica la especificidad de esta enzima por residuos de aminocidos
grandes e hidrofbicos.
El examen de la estructura tridimensional de la quimotripsina con
anlogos del sustrato e inhibidores enzimticos revel la presencia de un
profundo bolsillo hidrofbico, llamado bolsillo S1 en el cual pueden
acomodarse largas cadenas hidrofbicas de aminocidos; la unin de una
cadena lateral apropiada en el interior de este bolsillo coloca el enlace
peptdico adyacente en el centro activo para su ruptura; la especificidad
de quimotripsina depende de qu aminocido se coloca en este bolsillo
hidrofbico.
Otras proteasas tienen especificidades mas complejas y en ellas, la
ruptura no solamente depende de los aminocidos que aportan el enlace
peptdico sino de algunos mas dentro de la cadena del sustrato; es decir,
estas enzimas tienen bolsillos adicionales sobre su superficie para el
reconocimiento de otros residuos aminoacdicos del sustrato. Ver figura
5.5. Los residuos sobre el lado amino terminal del enlace escindible se
denominan P1, P2, P3 y as sucesivamente; los subndices indican su
posicin con respecto al enlace escindible. Igualmente, los residuos
vecinos al lado C terminal del enlace peptdico a romperse se denominan
P1, P2, P3 respectivamente. De modo anlogo, los centros
correspondientes en la enzima (bolsillos receptores) se nombran S1, S2 o
S1, S2; los subndices y as sucesivamente.

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Figura 5.5.- Nomenclatura para la especificidad de las interacciones


proteasa-sustrato: Los centros de interaccin de los sustratos con la
enzima se designan como P y los correspondientes centros de unin en la
enzima se designan como S.
Existen muchas proteasas que muestran estas triadas catalticas, como
tripsina y elastasa; estas tienen cerca de 40% de similitud en cuanto a su
contenido aminiacdico con quimotripsina pero tienen especificidades
diferentes para el sustrato. Recordemos que tripsina rompe enlaces
peptdicos donde el aminocido que aporta el grupo carboxilo para el
mismo es positivo y de gran tamao como lisina y arginina; en el caso de
elastasa, este aminocido debe ser pequeo, como alanina y serina. Si
comparamos los bolsillos S1 de las tres proteasas encontramos: en el
bolsillo de tripsina existe un aspartato 189 en lugar de la serina 195 que
hay en la quimotripsina, mientras que la elastasa, hay en el fondo del
bolsillo dos valinas, 216 y 190, las cuales disminuyen el tamao de S 1
permitiendo solo el ingreso de aminocidos pequeos. Esto es lo que
determina la especificidad de la enzima. Ver figura 5.6.

Val 190
Ser 195

Quimotripsina

Asp 189

O-

O-

Tripsina

Val 216

Elastasa

Figura 5.6.- Bolsillos S1 de quimotripsina, tripsina y elastasa.

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Las similitudes en cuanto al proceso cataltico de las proteasas ha


permitido catalogarlas en diferentes familias y asimismo, determinar
lneas de evolucin convergentes.
La triada cataltica de la subtilisina, una proteasa de bacterias, est
conformada por aspartato 32, histidina 64 y serina 221. Para saber sobre
el rol cataltico de estos aminocidos dentro de la enzima, se ha
convertido individualmente cada residuo de estos en alanina, a travs de
una mutagnesis dirigida y luego se ha examinado la actividad de cada
mutante para romper un sustrato modelo, ver figura 6.7. Como se
esperaba, la sustitucin de la serina 221 del centro activo por alanina
disminuy drsticamente el poder cataltico (cerca de un milln de veces
menos) respecto a la enzima salvaje; el valor de KM prcticamente no
vari, indicando que la unin del sustrato no est afectada.
La mutacin de histidina 64 por alanina, tuvo efectos muy similares
como puede verse en la figura 5.7; estas observaciones apoyan la idea de
que la pareja serina-histidina actan conjuntamente para generar un
nuclefilo de suficiente potencia para atacar al grupo carbonilo de un
enlace peptdico.
La conversin del aspartato 32 en alanina tuvo un efecto menor sobre la
actividad de la enzima (cerca de 50000 veces menos que la enzima
salvaje). Pero la conversin simultnea de los tres residuos en alanina, no
fue ms perjudicial que solo la serina o la histidina. La primera letra de
cada barra corresponde a la abreviacin de una letra de los aminocidos
mutados, el nmero identifica la posicin del residuo dentro de la enzima
y la ltima letra es la abreviatura de una sola letra del aminocido que
sustituye al original.
Es importante indicar que subtilisina tiene en la cavidad del oxianin una
asparragina 155, si esta la mutamos por una glicina, la actividad de la
enzima disminuye al 0,2% de su valor en el tipo salvaje, pero aument el
valor de KM en solo 2 veces; estas observaciones, demuestran que el
grupo NH de asparragina desempea un papel importante en la
estabilizacin del intermediario tetradrico y del estado de transicin que
se produce.

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Figura 5.7.- Mutagnesis dirigida en la subtilisina: Los residuos de la


triada cataltica se mutaron por alanina en forma independiente,
observando una drstica disminucin en la actividad cataltica de la
enzima; el eje y corresponde a una escala logartmica de la Kcat.
Existen otras proteasas que utilizan otro compuesto en lugar de serina
para su catlisis, estas son las cistenproteasas, las aspartilproteasas y las
metaloproteasas; en cada caso, la estrategia genera un nuclefilo que
ataca al grupo carbonilo del pptido, ver figura 5.8. Son cisteinproteasas
la papana, la catepsina y caspasas.
Las aspartilproteasas tienen una pareja de aspartatos en el centro activo
los cuales actan juntos; son representantes de este grupo la renina y la
pepsina; estas enzimas muestran simetra bilateral sugiriendo que dos
enzimas idnticas se unieron en algn momento de la evolucin y que
cada copia del gen contribuye con un residuo de aspartato en el centro
activo del gen. El VIH y otros retrovirus contienen una aspartil proteasa
dimrica no fusionada similar a la protena fusionada, pero las cadenas
individuales no estn unidas para hacer una nica cadena; esta
observacin concuerda con la idea de que la enzima existi al principio
como unidades separadas.
Las metaloproteasas constituyen la ltima clase de enzimas que rompen
pptidos, en el centro activo hay un in metlico unido, casi siempre
Zinc, que activa a una molcula de agua para actuar como nuclefilo; la
enzima bacteriana termolisina y la carboxipeptidasa A son representantes
de esta clase de enzimas.

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Figura 5.8.- Las estrategias de activacin por tres clases de proteasas:


todas atacan al grupo carbonilo del enlace peptdico por romper, las
cisteinproteasas actan directamente mientras que las aspartilproteasas y
las metaloproteasas requieren de una molcula de agua.
Existen muchos compuestos tanto naturales como artificiales que por su
parecido estructural a los sustratos proteicos de algunas proteasas, actan
como inhibidores de las mismas; as tenemos al captopril, inhibidor
artificial de la metaloproteasa convertidora de la angiotensina, que es
utilizado en la hipertensin. Asimismo el crixivan, inhibidor de la
proteasa del VIH, el cual se emplea en el tratamiento del SIDA (la
proteasa del VIH tiene la funcin de hidrolizar las protenas vricas
multidominio para hacerlas activas, el bloqueo de este proceso impide
que el virus sea infeccioso).
MECANISMO CATALTICO DE LA ANHIDRASA CARBNICA:
El CO2, producto del metabolismo aerbico, es liberado hacia la sangre y
transportado por esta hacia los pulmones. Mientras esta en la sangre,
reacciona con el agua formando cido carbnico el cual por tener un pK
de 3,5 se transforma luego en bicarbonato. Esta reaccin que es
reversible, a pesar de ser muy favorable desde un punto de vista
termodinmico (sucede espontneamente a velocidades razonables en
ausencia de catalizador), es catalizada por las enzimas anhidrasas
carbnicas, dada la necesidad de que el proceso se lleve a cabo a gran
velocidad. Estas enzimas son tan importantes en humanos (hay por lo
menos siete distintas), que las mutaciones en algunas causan
osteoporosis, anemia y retraso mental.

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En 1940 se determin que la anhidrasa carbnica contena Zinc en su


estructura (fue la primera vez que se encontr que este metal poda actuar
como cofactor, ahora se sabe que son cientos de enzimas las que lo
requieren). Los estudios cristalogrficos de rayos X mostraron el lugar de
unin del zinc con la enzima. Ver figura 5.9.

Figura 5.9.- Estructura de la anhidrasa carbnica II humana y su centro


de unin al zinc; en rojo se representan las histidinas y el Zinc en plomo.
El zinc en los seres vivos solo puede encontrase en el estado de oxidacin
+2, por lo tanto, un tomo de este metal puede estar unido a 4 o mas
ligandos; en la anhidrasa carbnica, tres centros de coordinacin estn
ocupados por anillos imidazol de tres residuos de histidina y un centro de
coordinacin adicional est ocupado por una molcula de agua (la carga
del complejo permanece como +2).
Al estudiar el efecto del pH sobre la actividad de anhidrasa carbnica se
encontr que a pH 8 la reaccin se encontraba cerca de su velocidad
mxima; al disminuir el pH, la velocidad de reaccin tambin cae,

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llegando a un nivel de cero, cerca del pH 6. El punto medio de esta


transicin est cerca del pH de 7 (ver figura 5.10); por lo cual, se asumi
que un grupo ionizable de pK cercano a 7 estaba involucrado en el
proceso (se pens inicialmente que se trataba de una histidina). Estudios
posteriores determinaron que era el agua unida al zinc la responsable de
este pK. Pero como imaginar esto si el pK del agua es de 15,7, la
explicacin fue que las cargas positivas del Zinc disminuyen el pK de
esa molcula de agua a un valor cercano a 7.

Figura 5.10.- Efecto del pH sobre la actividad de anhidrasa carbnica.


Con el pH neutro se genera un in oxidrilo unido al zinc el cual es lo
suficientemente nucleoflico para atacar al CO2, mucho ms rpidamente
de lo que lo hace el agua. Esto sugiere un mecanismo que se resume en
los siguientes pasos: (ver figura 5.11)
1. el zinc facilita la liberacin de un protn de la molcula de agua, lo
que genera un oxidrilo o hidroxilin.
2. el CO2 se une al centro activo de la enzima y se orienta para
reaccionar con el hidroxilin
3. el oxidrilo ataca al dixido de carbono convirtindolo en in
bicarbonato
4. el centro cataltico se regenera con la liberacin del in bicarbonato y
la unin de otra molcula de agua.

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Figura 5.11.- Mecanismo de la anhidrasa carbnica.


Medidas directas revelaron que la molcula de agua tiene un valor de pK
de 8,7. A pH de 9,2, el complejo acelera ms de 100 veces la hidratacin
del CO2 respecto a pH 8,7.
MECANISMO CATALTICO
RESTRICCIN

DE

LAS

ENZIMAS

DE

Las endonucleasas de restriccin son sintetizadas por las bacterias para


actuar sobre el DNA de los bacterifagos, como un mecanismo de
proteccin; estas reconocen secuencias concretas de bases llamadas
centros de reconocimiento e hidrolizan el DNA en posiciones definidas.
La clase de estas enzimas mejor estudiada comprende a aquellas
conocidas como enzimas de restriccin tipo II, que escinden el DNA
dentro de sus secuencias de reconocimiento, otras escinden al DNA en
posiciones algo distantes de su centro de reconocimiento.
Las enzimas de restriccin muestran una gran especificidad y solo
escinden los DNAs que tienen los centros de reconocimiento, pero estas
secuencias pueden estar presentes tambin en el DNA de la propia
bacteria; para evitar su accin sobre ellas, estas son metiladas. Por
ejemplo, la endonucleasa EcoRV de E. coli, corta las molculas de DNA
vrico de doble cadena que contienen la secuencia 5-GATATC-3, pero
dejan intacto al DNA del hospedador que tiene cientos de secuencias
semejantes; el DNA hospedador se protege mediante otras enzimas

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llamadas metilasas, las que metilan las bases de adenina dentro de las
secuencias de reconocimiento del hospedador.
Las endonucleasas rompen el enlace entre el oxgeno 3 y el tomo de
fsforo; los productos de esta hidrlisis son las cadenas de DNA con un
grupo hidroxilo libre en 3 y un grupo fosforilo en 5 (ver figura 5.12)

Figura 5.12.- Hidrlisis de un enlace fosfodister: todas las enzimas de


restriccin catalizan la hidrlisis de los enlaces fosfodister del DNA.
El proceso puede ocurrir de dos formas diferentes, a travs de un
intermediario covalente, empleando un nuclefilo potente, el cual se une
al tomo de fsforo y forma un estado de transicin pentacoordinado, el
cual termina liberando el grupo desplazado; o mediante hidrlisis directa.
En el primer mecanismo un nuclefilo de la enzima (anlogo a la serina
195 de la quimotripsina) ataca al grupo fosforilo para formar un
intermediario covalente que luego se hidroliza para producir los
productos finales; aqu la configuracin final del tomo de fsforo
queda retenida debido a que tienen lugar dos desplazamientos
consecutivos (la configuracin esteroqumica del tomo de fsforo se
invertir de nuevo). En el segundo tipo, anlogo a los llevados a cabo por
las aspartil proteasas y metalo proteasas, una molcula de agua activada
ataca directamente al tomo de fsforo; en este mecanismo, slo ocurre
una reaccin de desplazamiento, por lo que la configuracin
estereoqumica del fsforo tetradrico se invierte ( el monitoreo de estos
cambios puede servir para determinar el mecanismo de accin de las
endonucleasas). Ver figura 5.13.

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Figura 5.13.- Tipos de mecanismos para la accin de las endonucleasas


de restriccin. A) intermediario covalente. B) hidrlisis directa. Nu =
nuclefilo.
Las enzimas de restriccin necesitan magnesio, al igual que muchas
enzimas que actan sobre sustratos que contienen fosfato. En la EcoRV
se ha visto que el in magnesio se encuentra unido a seis ligandos, tres
son molculas de agua, dos son grupos carboxilatos de residuos de
aspartato de la enzima y el ltimo es el tomo de oxgeno del grupo
fosforilo en el centro de escisin. El in magnesio mantiene mantiene
una molcula de agua en una posicin tal que pueda atacar al grupo
fosforilo y con la ayuda de los aspartatos, polariza la molcula de agua
hacia su desprotonizacin. Estudios adicionales han demostrado que se
requiere de un segundo in magnesio presente en un centro adyacente
para poder cortar el sustrato.
Pero lo sorprendente de estas enzimas es su especificidad; las secuencias
de reconocimiento son repeticiones invertidas, este ordenamiento
proporciona una simetra rotacional binaria (figura 5.14) a la estructura
tridimensional del centro de reconocimiento. La enzima de restriccin
tiene una simetra conveniente para facilitar el reconocimiento, se trata de
un dmero cuyas dos subunidades estn tambin relacionadas mediante
una simetra rotacional binaria; la enzima rodea al DNA y forma
interacciones muy especficas: las bases G y A en el extremo 5 de cada
cadena, dentro de la secuencia
5-GATATC-3, y sus bases
complementarias, se ponen en contacto directamente con la enzima
mediante puentes de hidrgeno que se entablan entre glicina 182, glicina

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184 y asparagina 185 con el par CG; mientras que el par AT forma
puentes con treonina 186 y la misma asparagina 185 (ver figura 5.15).

Figura 5.14.- Estructura del centro de reconocimiento de la endonucleasa


EcoRV

Figura 5.15.- Interacciones por puentes de hidrgeno entre la


endonucleasaa EcoRV y su sustrato DNA.
La caracterstica ms importante de este complejo es la distorsin del
DNA en su parte central; los dos pares centrales de bases TA, producen
el quiebre (figura 5.16). Las secuencias 5-TA-3 son conocidas por
encontrarse en la mayor parte de pares de bases fcilmente deformables.
Esta distorsin tiene efectos importantes sobre la especificidad de la
accin enzimtica.

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Figura 5.16. Distorsin en el centro de reconocimiento del DNA. El


DNA debera ser recto
Los estudios de unin de la EcoRV a su sustrato, llevados a cabo en
ausencia de magnesio han demostrado que la enzima se une a todas las
secuencias, afines y no afines, con una afinidad aproximadamente
idntica. Sin embargo, las estructuras de los complejos formados con
DNA no afn son extraordinariamente diferentes de los formados con
DNA afn, es decir, la conformacin del DNA no afn no se distorsiona
sustancialmente (ver figura 5.17). Esta carencia de distorsin determina
que ningn fosfato se site lo suficientemente prximo a los residuos de
aspartato del centro activo para completar un centro de unin para el in
magnesio (fig. 5.18)

Figura 5.18. Centro de unin para el in magnesio en la endonucleasa


EcoRV. El magnesio favorece la activacin de una molcula de agua y la
coloca de tal forma que pueda atacar al fosfato.
Por lo tanto, los complejos inespecficos no enlazan al in magnesio y el
aparato cataltico completo nunca llega a formarse. La distorsin del

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sustrato y la unin posterior del in magnesio explican la especificidad


cataltica de ms de 106 veces que se observa para la endonucleasa
EcoRV, a pesar de que posee una preferencia muy pequea a nivel de su
unin al sustrato.

ENERGA LIBRE

El DNA se distorsiona de tal manera en la unin a la enzima, que se


realizan contactos adicionales entre la enzima y el sustrato, aumentando
la energa de unin. Sin embargo, este incremento se anula mediante el
coste energtico de la distorsin del DNA desde su conformacin relajada
(figuras 5.19 y 5.20)

ENZIMA
ENZIMA
+
+
DNA
DNA AFN
Figura 5.19. La ESPECFICO
endonucleasa EcoRV enlazada al DNA afn posee una

energa de unin mayor que la correspondiente al DNA inespecfico; ese


adicional sirve para impulsar la distorsin del DNA, DISTORCIN
necesaria para
formar el complejo cataltico.
DEL DNA

Figura 5.20. DNA afn e inespecfico en la endonucleasa EcoRV. El


DNA afn en claro y el DNA inespecfico en oscuro. Obsrvese que el
DNA inespecfico se encuentra lejos de los centros de unin con el in
magnesio.

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Este ejemplo ilustra como las enzimas pueden utilizar la energa de unin
disponible para deformar a los sustratos y predisponerlos para su
transformacin qumica; las interacciones que tienen lugar dentro del
complejo enzima-sustrato distorsionado, estabilizan al estado de
transicin que conduce a la hidrlisis del DNA.
Asimismo, la distorsin del DNA explica como la mutilacin bloquea la
catlisis y protege al DNA de la clula hospedadora. Cuando un grupo
metilo se aade al grupo amino del nucletido de adenina en el extremo
5 de la secuencia de reconocimiento, la presencia de este grupo metilo
excluye la formacin de un puente de hidrgeno entre el grupo amino y
el grupo carboxilo de la cadena lateral de la asparagina 185. Este residuo
de Asn se encuentra estrechamente enlazado a otros aminocidos que
forman los contactos especficos con el DNA. La ausencia del puente de
hidrgeno interrumpe otras interacciones entre la enzima y el sustrato
DNA y por lo tanto, no ocurrir la distorsin.
La comparacin de la secuencia de aminocidos de una serie de
endonucleasas de restriccin de tipo II revela semejanzas significativas;
se observa la presencia de un ncleo estructural conservado: cadenas de
tipo que incluyen a los residuos aspartato (o en algunos casos
glutamato), que conforman los centros de unin para el in magnesio.
Estas observaciones indican que muchas enzimas de restriccin del tipo
II estn relacionadas evolutivamente; un anlisis ms detallado de las
secuencias de aminocidos sugiere que las bacterias pueden haber
obtenido los genes de estas enzimas a partir de otras especies, mediante
transferencia horizontal de genes (plsmidos); esto debido a que
bacterias que no estn relacionadas evolutivamente muestran entre si
mucha concordancia de aminocidos (50%) para estas enzimas.
MECANISMO
CATALTICO
MONOFOSFATO QUINASAS

DE

NUCLESIDO

Estas enzimas catalizan la transferencia del grupo fosfato terminal desde


un nuclesido trifosfato (NTP), normalmente el ATP, al grupo fosforilo
de un nuclesido monofosfato (fig. 5.21). La accin enzimtica consiste
en transferir ese fosfato desde el NTP al NMP, evitando la transferencia
de este al agua. Para esto las enzimas usan el encaje inducido adems de
un metal el cual se une al sustrato inicialmente.

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Figura 5.21. Transferencia del grupo fosforilo por las nuclesido


monofosfato quinasas.
Por cristalografa de rayos X se obtuvo la estructura tridimensional de
algunas NMP quinasas, tanto libres como unidas a sus sustratos. Al
comparar estas estructuras se ve que estas enzimas forman una familia de
protenas homlogas (fig. 5.22), por la presencia en todas ellas de un
dominio de unin del NTP, el cual consiste en una hoja central, rodeada
por hlices por ambos lados; otro rasgo comn es un bucle entre la
primera cadena y la primera hlice . Este bucle, que tpicamente
posee la secuencia de aminocidos gli-X-X-X-X-gli-lis, suele
denominarse bucle P, porque interacciona con los grupos fosforilo del
nucletido enlazado.

Figura 5.22. Estructuras de la adenilato quinasa y de la guanilato quinasa

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Estudios con NMP quinasas, as como de otras enzimas que tienen como
sustrato al ATP u otros nuclesidos trifosfato, revelan que estas enzimas
son prcticamente inactivas en ausencia de iones metlicos divalentes
tales como el Mg2+ y el Mn2+, pero adquieren su actividad normal cuando
se adicionan estos iones. El metal aqu no es componente del centro
activo, mas bien, los nucletidos se unen a ellos y el complejo
nucletido-in metlico es el autntico sustrato para estas enzimas.
Podemos decir que prcticamente todos los nuclesidos trifosfato se
encuentran presentes como complejos NTP-Mg2+.
El in magnesio neutraliza algunas de las cargas negativas presentes en la
cadena polifosfato, lo que reduce las interacciones inicas inespecficas
entre la enzima y el grupo polifosfato del nucletido. Asimismo, las
interacciones entre el in magnesio y los tomos de oxgeno del grupo
fosforilo mantienen al nucletido en la conformacin apropiada para que
se una especficamente a la enzima (fig. 5.23). Los iones magnesio estn
normalmente coordinados a seis grupos qumicos (optando una forma
octadrica); dos tomos de oxgeno se encuentran coordinados
directamente, las posiciones restantes estn ocupadas por molculas de
agua. Los tomos de oxgeno de los grupos fosforilo y , y , o bien
y pueden contribuir en la coordinacin. Adems, se producen
diferentes estereoismeros en funcin de qu tomo de oxgeno concreto
se una al in metlico.

Figura 5.23. Estructuras de las dos formas isomricas del complejo ATPMg
El in magnesio tambin proporciona contactos adicionales de
interaccin entre el complejo ATP-Mg2+ y la enzima, de modo que se
incrementa la energa de unin (fig. 7.24)

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Figura 5.24. Complejo ATP-Mg2+ enlazado a la adenilato quinasa.


Al comparar la adenilato quinasa en presencia y en ausencia de un
anlogo del ATP, se observa que la unin del sustrato induce grandes
cambios estructurales en la quinasa (fig.5.25). El bucle P se cierra sobre
la cadena del polifosfato, interaccionando ms extensamente con el grupo
fosforilo . El movimiento del bucle P permite al dominio de la parte
superior de la enzima desplazarse hacia abajo para formar una especie de
tapa por encima del nucletido enlazado; este movimiento se favorece
por la interaccin entre residuos bsicos (conservados entre las NMP
quinasas), los grupos NH del esqueleto peptdico y el nucletido. Con el
nucletido ATP retenido en esta posicin, su grupo fosforilo se
encuentra prximo al centro de unin para el segundo sustrato, el NMP;
en resumen, las interacciones con el sustrato provocan el desplazamiento
del bucle P, lo cual permite que se produzcan cambios ms profundos
como el cierre del dominio principal. La unin del segundo sustrato,
NMP, induce a nuevos cambios conformacionales, cambios que junto a
los primeros aseguran que se cree una conformacin catalticamente
competente solo cuando ambos, el donador y el aceptor, se encuentran
unidos, impidiendo as la transferencia del fosforilo al agua.
La enzima mantiene as muy juntos a sus dos sustratos y en una
orientacin apropiada para estabilizar el estado de transicin que conduce
a la transferencia de un grupo fosforilo desde el ATP hasta el NMP. Este
es un ejemplo de catlisis por aproximacin.

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Figura 5.25. Cambios conformacionales en la adenilato quinasa.


MECANISMO CATALTICO DE LA LISOZIMA
La lisozima, enzima presente en fluidos humanos, fue descubierta en
1922 por Alexander Fleming, por un estornudo casual sobre un medio de
cultivo que contena bacterias. Fleming vio al da siguiente que las
bacterias de ese medio de cultivo haban muerto por obra de algn
componente de su fluido; muy convencido de haber encontrado el
antibitico universal, dedic mucho tiempo en averiguar de qu se trataba
y descubri que era una enzima la responsable del hecho a la cual bautiz
como lisozima (liso por su capacidad de lisar bacterias).

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Poco tiempo despus se vio que esta enzima era solo activa para un
nmero reducido de bacterias y no actuaba sobre las bacterias ms
patgenas. La enzima se encontr tambin en saliva, lgrimas,
posteriormente en clara de huevo y muy pronto fue purificada para
estudiar su mecanismo cataltico.
La lisozima rompe las paredes celulares de las bacterias; es decir, su
accin especficamente es sobre un polisacrido que tiene alternadamente
solo dos monosacridos: el N-acetilglucosamina (NAG) y el cido Nacetil murmico (NAM), unidos entre s a travs de enlaces (14). Ver
figura 5.26.

Figura 5.26.- Unin del NAG y del NAM en el polisacrido de la pared


celular bacteriana.
Ambos compuestos son derivados de la glucosamina en los que el grupo
amino est acetilado; el NAM adems tiene un cido lctico unido al
carbono 3 por un enlace ter.
La lisozima rompe el enlace glicosdico entre el carbono 1 del NAM y el
carbono 4 del NAG; si es el NAG el que aporta el carbono 1 y el NAM el
4, este no puede ser hidrolizado por la enzima.
Otro polisacrido que es sustrato para la enzima es la quitina,
homopolmero de NAG presente en el exoesqueleto de todos los
artrpodos (crustceos, arcnidos, insectos, etc) y en algunas estructuras
de hongos; en este la unin tambin es de tipo (14).

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Estructura de la lisozima
Es una enzima relativamente pequea, conformada por 129 aminocidos,
con un PM de 14,6 Kdal. Presenta 4 puentes disulfuro que le dan una
elevada estabilidad a esta exoenzima (ver figura 5.27)

Figura 5.27.- Secuencia de aminocidos de la lisozima de clara de


huevo; los aminocidos que forman parte del centro cataltico se
encuentran pintados.
En 1965 David Phillips determin la estructura tridimensional de la
lisozima a travs de su mapa de densidad electrnica de alta resolucin,
el cual mostr una molcula compacta de forma elipsoidal, con
dimensiones de 45 x 30 x 30 Angtrms y con un plegamiento complejo;
internamente la molcula casi est constituida en su totalidad por
aminocidos hidrofbicos.
Determinacin del centro activo:
Debido a que la lisozima no tiene cofactor, el mapa de densidad
electrnica no revel de inmediato el lugar de unin del sustrato, pero la
cristalografa de rayos X si fue una herramienta muy til, observando la
interaccin de la enzima con inhibidores. Estos experimentos son

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factibles porque los cristales proteicos son bastante porosos permitiendo


la fcil difusin de molculas, inclusive relativamente grandes, a travs
de ellos; la densidad electrnica correspondiente a la molcula aadida
puede calcularse directamente a partir de las intensidades de las
reflexiones de los rayos X si la estructura no queda muy alterada. A esta
tcnica se le conoce como mtodo diferencial de Fourier.
La idea es poder conseguir una imagen en el momento de la unin del
sustrato con la enzima, pero como esto es casi imposible debido a que el
proceso es muy rpido y la posterior transformacin en producto lo es
ms an, es que se puede usar tcnicas como la crioenzimologa, en
donde se enfra el proceso (por ejemplo a temperatura de -50C) con lo
cual se lo hace mas lento. Pero otra forma es empleando anlogos del
sustrato no reactivos o que reaccionen muy lentamente; en este sentido,
para lisozima es til el trmero de N-acetilglucosamina (tri-NAG), ver
figura 5.28. Los oligmeros de N-acetilglucosamina
que constan de menos de 5 residuos, se hidrolizan muy lentamente, sin
embargo se unen al centro activo de la enzima; de hecho el tri-NAG es un
potente inhibidor.

Figura 5.28.- Tri-N-acetilglucosamina, inhibidor competitivo de la


lisozima
Los rayos X mostraron la localizacin del sitio de unin y las
interacciones responsables de la especificidad de esta unin y dio lugar a
la propuesta siguiente: el tri-NAG se une a la lisozima en una hendidura
presente en la superficie que atraviesa la totalidad de la enzima, el
inhibidor solo ocupa la mitad de esta hendidura. El tri-NAG queda unido

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a la enzima a travs de puentes de hidrgeno e interacciones de Van der


Walls; no hay interacciones elctricas debido a que el tri-NAG carece de
grupos ionizables. Los puentes de hidrgeno formados se representan en
la figura 5.29 y podemos observar que participan el aspartato 101, el
triptofano 63, el triptofano 62, el grupo alfa amino del aminocido 59 y el
grupo alfa carboxilo del residuo 107; asimismo, es el anillo C (tercer
anillo del tri-NAG) el que entabla el mayor nmero de puentes de
hidrgeno, 4 en total, en tanto que los otros 2 anillos (A y B) solo un
puente de hidrgeno.

Figura 5.29.- Enlaces de hidrgeno entre el tri-NAG y la lisozima


Mecanismo enzimtico de la lisozima:
El hecho de que el tri-NAG solo llena la mitad de la hendidura de la
lisozima hizo pensar que exista espacio suficiente para un oligosacrido
de 6 unidades, esto era alentador pues se saba que el hexa-NAG era
rpidamente hidrolizado por la enzima, a la misma velocidad que
oligmeros de mayor nmero de unidades que 6 (ver tabla 5.1)

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Tabla 5.1:
Efectividad de los oligmeros de la N-acetilglucosamina como sustratos:
SUSTRATO
NAG2
NAG3
NAG4
NAG5
NAG6
NAG8

Velocidad de reaccin (comparativa)


0
1
8
4000
30000
30000

Mediante la construccin cuidadosa de un modelo molecular, se situaron


en la hendidura otros tres residuos de azcar llamados D, E y F. Los
anillos E y F se acoplaron fcilmente, estableciendo un buen nmero de
puentes de hidrgeno; sin embargo el anillo D no se acopla a menos que
sea distorsionado es decir de la forma de silla que tiene pase a media
silla.
Qued demostrado asimismo que el enlace que se rompe es el formado
entre los anillos D y E por las siguientes razones:

Entre A y B ni entre B y C puede ser porque el tri-NAG no es buen


sustrato para la enzima
Entre C y D tampoco porque el NAM por su tamao nunca podra
encajar en el lugar C, por lo tanto all solo puede haber un NAG,
luego en el lugar D habra un NAM (por la alternancia); la enzima
solo puede romper el enlace entablado entre el NAM y el NAG (que
el NAM aporte el carbono 1 y el NAG el 4).
La incapacidad del NAM de situarse en el anillo C excluye tambin
el enlace entre el anillo D y F pues por alternancia estos estaran
ocupados por NAG y NAM respectivamente.

Al determinar que era el enlace que una los anillos D y E el que se


rompa, se pudo establecer loa aminocidos involucrados en el proceso;
pero haba que definir exactamente cual era exactamente el lugar de la
ruptura, se era entre el oxgeno y el carbono 1 o entre el oxgeno y el
carbono 4. Para ello ingeniosamente se utiliz agua marcada con oxgeno
18 de tal manera que al ocurrir la hidrlisis, el carbono que se lleve el
oxgeno marcado ser el del enlace que se rompe pues el otro carbono
mantiene al oxgeno original. De esta forma se estableci que es el enlace
entre el carbono 1 y el oxgeno el que se trompe. Ver figura 5.30

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Figura 5.30. Hidrlisis con agua marcada con 18O mostrando que la
lisozima corta el enlace C1-O y no el O-C4.
Se investig sobre los posibles grupos catalticos contiguos al enlace que
se rompe, buscando dadores o aceptores de protones y se encontr que
los nicos residuos posibles eran el glutamato 35 y el aspartato 52, los
dos situados a ambos lados del enlace. Estos dos aminocidos a pesar de
estar muy cerca, tienen entornos marcadamente diferentes, el aspartato
est en un medio claramente polar (pH 5 es el ptimo de la lisozima) lo
que hace que se encuentre desprotonado, en tanto que el glutamato se
encuentra protonado (indicando que el medio circundante prximo a el,
est fuertemente influenciado por los aminocidos cercanos de la enzima
que hacen que no se ionice cuando debera estarlo a pH 5). Los oxgenos
ms prximos de ambos aminocidos se hallan a una distancia de 3
Angstrms del enlace a romperse.
El mecanismo de la catlisis fue propuesto por Phillips y colaboradores:
El grupo COOH del cido glutmico 35 cede un H + al enlace entre
el carbono C-1 del anillo D y el tomo de oxgeno glicosdico,
rompindolo.
Esto crea una carga positiva en el C-1 del anillo D, formndose un
in carbonio (ver figura 5.31)
El dmero del NAG conformado por los anillos E y F difunde fuera
de la enzima
El carbanin intermediario reacciona con un in OH - del agua (ver
figura 5.32). El tetra NAG con los residuos A,B,C y D difunde fuera
de la enzima.
El cido glutmico 35 queda protonado y listo para otro ciclo
cataltico.

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Figura 5.31.- Mecanismo cataltico de la lisozima, primera parte

Figura 5.32.- Mecanismo cataltico de la lisozima, segunda parte


Como puede verse, el proceso se realiza a travs de un esquema general
cido pues hay una transferencia de un protn desde el cido glutmico
hacia el oxgeno. La ruptura del enlace es la que promueve la formacin
de un in carbonio el cual es estabilizado por el aspartato 52.
El factor geomtrico es la distorsin del anillo D, ajustndose
perfectamente a la hendidura del centro cataltico (ver figura 5.33), en
donde ocurre un cambio de la conformacin de silla a la de media silla;
esto fuerza al sustrato a adquirir la geometra del estado de transicin que
es el in carbonio.

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Figura 5.33.- Distorsin del anillo D del sustrato de la lisozima hacia la


forma de media silla o bote; luego del arreglo los carbonos 1, 2 y 5 as
como el oxgeno quedan en el mismo plano.
Apoyo experimental para el mecanismo de lisozima:

La forma en que se rompe el hexa-NAG es en un di-NAG y un tetraNAG


La energa libre total de la unin del sustrato hexamrico,
determinada mediante medidas de equilibrio de enlace, no es ms que
la contribucin de cada uno de los seis residuos y se muestra en la
figura 7.20. El hallazgo sorprendente es que el residuo D realiza una
contribucin negativa a la afinidad de unin ( + 15 Kj/mol ), esto
significa que esto constituye el precio energtico que se tiene que
pagar para conseguir distorsionar el anillo D.
Utilizando anlogos del estado de transicin, es decir un hexa-NAG
que tiene el anillo D en forma de media silla (ya distorsionado), la
afinidad de unin a la enzima de este, es mucho mas fuerte
Dependencia del pH de la velocidad de catlisis: la velocidad de
hidrlisis presenta su mxima rapidez a pH 5, la actividad enzimtica
desciende rpidamente a cualquier lado de este pH ptimo; el
descenso en el lado alcalino se debe a la ionizacin del glutamato 35,
mientras que el descenso de la velocidad en el lado cido se debe a la
protonacin del aspartato 52.
La lisozima permanece activa cuando se esterifican todos sus grupos
carboxilo excepto los del glutamato 35 y el aspartato 52. El cido
glutmico 35 y el cido asprtico 52 quedan sin modificar si esta
reaccin se lleva a cabo en presencia de sustrato, lo que indica que la
interaccin de ellos con el sustrato los protege.

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Figura 5.34.- Contribuciones energticas hechas por cada uno de los seis
azcares del hexa-NAG a la energa libre estndar de unin del sustrato;
obsrvese que es el anillo C el que realiza la mayor contribucin
energtica, debido a que es al que se le facilita mas su unin.

EJERCICIOS DEL CAPTULO V


1. Qu otras proteasas tienen triada cataltica?
2. Cul sera el comportamiento del Zinc como cofactor?
3. Qu otros iones metlicos participan como cofactores?
4. En qu casos se emplea la crioenzimologa en la determinacin del
sitio de unin del sustrato?
5. A qu se refiere la forma de silla y de bote de la glucosa?