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Anlisis de la Presencia de Organismos

Genticamente Modificados en Muestras de


Alimentos

Sesin n 5
Electroforesis en gel de agarosa

M. Somma, M. Querci

WORLD HEALTH ORGANIZATION


REGIONAL OFFICE FOR EUROPE
WELTGESUNDHEITSORGANISATION
REGIONALBRO FR EUROPA

ORGANISATION MONDIALE DE LA SANTE


BUREAU REGIONAL DE L'EUROPE
ORGANIZACIN MUNDIAL DE LA SALUD
OFICINA REGIONAL PARA EUROPA

Electroforesis en Gel de Agarosa

ndice
Sesin n 5
Electroforesis en Gel de Agarosa

Introduccin

Principios fsicos de la electroforesis en gel de agarosa

Componentes de la electroforesis en gel de agarosa

Prctica

Bibliografa

Anlisis de la Presencia de Organismos Genticamente Modificados en Muestras de Alimentos

12

Sesin n 5

Electroforesis en Gel de Agarosa

Introduccin
La electroforesis en gel es un mtodo que se emplea para separar macromolculas
en funcin del tamao, la carga elctrica y otras propiedades fsicas. El trmino
electroforesis describe la migracin de las partculas cargadas bajo la influencia de
un campo elctrico. Electro se refiere a la electricidad y foresis, del griego
phoros, significa trasladar.

As pues, la electroforesis en gel es una tcnica

consistente en aplicar corriente elctrica a las molculas para que atraviesen una
placa de gel. La fuerza motriz de la electroforesis es la tensin elctrica aplicada a
los electrodos en ambos extremos del gel.

Las propiedades de una molcula

determinan la velocidad con que un campo elctrico puede desplazarla a travs de


un medio gelatinoso.
Muchas macromolculas biolgicas importantes (por ejemplo, los aminocidos, los
pptidos, las protenas, los nucletidos y los cidos nucleicos) poseen grupos
ionizables y, a un pH determinado, existen en solucin como especies cargadas
elctricamente, sean cationes (+) o aniones (-). Segn la naturaleza de la carga
neta, las partculas cargadas migrarn hacia el ctodo o hacia el nodo. As, por
ejemplo, cuando se aplica un campo elctrico a un gel con pH neutro, los grupos
fosfato del ADN cargados negativamente lo harn migrar hacia el nodo
(Westermeier, 1997).
La electroforesis en gel de agarosa es un mtodo normalizado que se utiliza para
separar, identificar y purificar fragmentos de ADN. Se trata de una tcnica sencilla y
rpida que permite diferenciar fragmentos de ADN que no pueden separarse
adecuadamente con otros procedimientos. Por otra parte, el ADN puede localizarse
en el gel tiendo con una concentracin baja de bromuro de etidio, que es un agente
intercalante fluorescente que se utiliza como colorante.
En las siguientes secciones se presentan los principios fsicos, los componentes
(matriz de gel, tampn, tampn de carga y marcador) y los procedimientos para
preparar la electroforesis en gel de agarosa (Sambrook et al., 1989).

Principios fsicos de la electroforesis en gel de agarosa


La electroforesis en gel es una tcnica que se emplea para separar los cidos
nucleicos y las protenas. La separacin de las macromolculas depende de dos
variables: carga y masa. Cuando una muestra biolgica, como por ejemplo el ADN,
se mezcla en una solucin tampn y se aplica a un gel, esas dos variables actan
conjuntamente.

La corriente elctrica de un electrodo repele las molculas, al

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tiempo que el otro electrodo las atrae. La fuerza de friccin del material de gel acta
como tamiz molecular, separando las molculas en funcin de su tamao.
Durante la electroforesis, las macromolculas son empujadas a travs de los poros,
dependiendo su tasa de migracin por el campo elctrico de los siguientes factores:
fuerza del campo
tamao y forma de las molculas
hidrofobicidad relativa de las muestras
fuerza inica y temperatura del tampn en que se desplazan las molculas.
Para tener una idea cabal del proceso de separacin de las partculas cargadas en
la electroforesis en gel, conviene tener presentes las simples ecuaciones referidas a
esta tcnica. Cuando se aplica tensin a los electrodos se genera un gradiente de
potencial (E), que puede expresarse con la siguiente ecuacin:
E = V/d

(1)

donde V, medida en voltios, es la tensin aplicada y d, la distancia en cm entre los


electrodos.
Al aplicarse el gradiente de potencial (E) se genera una fuerza (F) en una molcula
cargada, que puede expresarse con la siguiente ecuacin:
F = Eq

(2)

donde q corresponde a la carga en culombios que lleva la molcula. Esta es la


fuerza, medida en newtons, que empuja la molcula cargada hacia el electrodo.
Existe asimismo una resistencia de friccin que ralentiza el desplazamiento de las
molculas cargadas. Esta fuerza de friccin es funcin de los siguientes factores:
tamao hidrodinmico de la molcula
forma de la molcula
tamao de poro del medio en que tiene lugar la electroforesis
viscosidad del tampn.
La velocidad v de una molcula cargada en un campo elctrico depende del
gradiente de potencial, la carga y la fuerza de friccin de la molcula, y puede
expresarse con la siguiente ecuacin:
v = Eq / f

(3)

donde f es el coeficiente de friccin.


La movilidad electrofortica (M) de un in puede entonces determinarse dividiendo la
velocidad del in por el gradiente de potencial:
M=v/E

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Adems, de la ecuacin (3) se infiere que la movilidad electrofortica M puede


expresarse de modo equivalente como la carga de la molcula (q) dividida por el
coeficiente de friccin (f):
M=q/f

(5)

Cuando se aplica una diferencia de potencial, las molculas que poseen distintas
cargas globales comenzarn a separarse debido a sus diferentes movilidades
electroforticas.

La movilidad electrofortica es un parmetro significativo y

caracterstico de las molculas o partculas cargadas y depende del valor de pK del


grupo cargado y del tamao de la molcula o partcula. Incluso las molculas con
cargas semejantes empezarn a separarse si sus tamaos moleculares son distintos
por cuanto estarn sometidas a fuerzas de friccin diferentes. El ADN bicatenario
lineal migra por las matrices de gel a velocidades inversamente proporcionales al
log10 del nmero de pares de bases.

Las molculas ms grandes migran ms

despacio debido a la mayor resistencia de friccin y a la menor eficacia del


desplazamiento a travs de los poros del gel.
La corriente que atraviesa la solucin entre los electrodos es conducida
principalmente por los iones del tampn, si bien una pequea proporcin lo es por
los iones de la muestra. La relacin entre intensidad I, tensin V y resistencia R se
expresa segn la ley de Ohm:
R=V/I

(6)

Esta ecuacin muestra que, para una resistencia R dada, es posible acelerar la
separacin electrofortica aumentando la tensin V aplicada, lo cual dar lugar al
correspondiente incremento de la intensidad de la corriente I. La distancia migrada
ser proporcional a la intensidad y al tiempo. Con todo, el aumento de tensin (V) y
el incremento correspondiente de intensidad e (I) ocasionara uno de los principales
problemas que plantea la mayor parte de las formas de electroforesis, a saber, la
generacin de calor. Este fenmeno queda ilustrado con la siguiente ecuacin, en la
que la potencia (W, medida en vatios) generada durante la electroforesis equivale al
producto de la resistencia multiplicado por el cuadrado de la intensidad:
W = I2R

(7)

Dado que la mayor parte de la potencia producida en el proceso electrofortico se


disipa en forma de calor, pueden producirse los siguientes efectos perjudiciales:

aumento de la tasa de difusin de los iones de la muestra y del tampn, con el


consiguiente ensanchamiento de las muestras separadas

formacin de corrientes de conveccin, con la consiguiente mezcla de las


muestras separadas

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inestabilidad trmica de las muestras, que son bastante sensibles al calor (por
ejemplo, desnaturalizacin del ADN)

disminucin de la viscosidad del tampn y, por ende, reduccin de la resistencia


del medio.

Componentes de la electroforesis en gel de agarosa


Agarosa
La agarosa, coloide natural que se extrae de las algas, es un polisacrido lineal (con
un peso molecular medio de ~12 000 Da) formado por la repeticin de la unidad
bsica, la agarobiosa, que comprende unidades alternadas de galactosa y 3,6anhidrogalactosa. La agarosa es muy frgil y las manipulaciones pueden destruirla
con facilidad.

Los geles de agarosa poseen grandes poros y se emplean

fundamentalmente para separar las molculas grandes con un peso molecular de


ms de 200 kDa.
Los geles de agarosa permiten una electroforesis rpida, pero con una resolucin
limitada por cuanto las bandas que se forman en los geles tienen tendencia a ser
difusas y a esparcirse. Ello obedece al tamao de los poros y no puede controlarse.
Los geles de agarosa se obtienen por suspensin de agarosa seca en polvo en un
tampn acuoso, tras lo cual se hace hervir la mezcla hasta que la agarosa se funde
y se convierte en una solucin transparente. A continuacin, se vierte esta solucin
en un molde para gel y se deja enfriar a temperatura ambiente hasta que se forma
un gel rgido. Al endurecerse, la agarosa forma una matriz cuya densidad viene
determinada por su concentracin.

Tampn de electroforesis
La movilidad electrofortica del ADN se ve afectada por la composicin y la fuerza
inica del tampn de electroforesis. En ausencia de iones, la conductancia elctrica
es mnima y el ADN migra lentamente o ni siquiera se desplaza. En un tampn de
elevada fuerza inica la conductancia elctrica es muy elevada y se genera una
importante cantidad de calor. En el peor de los casos, el gel se funde y el ADN se
desnaturaliza.
Se dispone de varios tipos de tampones para la electroforesis de ADN nativo
bicatenario. Contienen EDTA (pH 8,0) y tris-acetato (TAE), tris-borato (TBE) o trisfosfato (TPE) a una concentracin de aproximadamente 50 mM (pH 7,5 7,8). Los
tampones de electroforesis suelen prepararse en forma de soluciones concentradas

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y se conservan a temperatura ambiente. El TBE se utilizaba inicialmente a una


concentracin de trabajo de 1x en el caso de la electroforesis en gel de agarosa. No
obstante, una solucin de trabajo de 0,5x proporciona un poder ms que suficiente y
en la actualidad prcticamente todas las electroforesis en gel de agarosa se
practican utilizando esta concentracin.

Concentracin de agarosa
Un fragmento de ADN de un tamao determinado migra a diferentes velocidades a
travs de los geles segn la concentracin de agarosa.

En funcin de la

concentracin de agarosa o tampn, se pueden separar segmentos de ADN que


contengan de 20 a 50 000 pb. En los geles horizontales, la agarosa se emplea por
lo general en concentraciones comprendidas entre un 0,7 % y un 3 % (vase el
cuadro 1).
Cuadro 1. Concentracin recomendada de gel de agarosa para separar molculas de
ADN lineales.
% de agarosa

Gamas de tamaos de
ADN (pb)

0,75

10 000 15 000

1,0

500 10 000

1,25

300 5 000

1,5

200 4 000

2,0

100 2 500

2,5

50 1 000

ADN marcador
Para una tensin, un gel de agarosa y unas concentraciones de tampn
determinadas, la distancia de migracin depende del peso molecular del material
inicial.

As pues, debe cargarse un ADN marcador de tamao conocido en las

ranuras situadas en los extremos derecho e izquierdo del gel. Generalmente un


marcador contiene un nmero determinado de segmentos de ADN conocidos, lo cual
facilita la labor de determinar el tamao de los ADN desconocidos en caso de que se
produjese alguna distorsin sistemtica del gel durante la electroforesis.

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Tampn de carga
Las muestras de ADN que deben cargarse en el gel de agarosa se mezclan en
primer lugar con un tampn de carga que por lo general contiene agua, sacarosa y
un colorante (por ejemplo, cianol de xileno, azul de bromofenol, verde de
bromocresol, etc.). La cantidad mxima de ADN que puede cargarse depende del
nmero de fragmentos. La cantidad mnima de ADN que puede detectarse mediante
fotografa de los geles teidos con bromuro de etidio es de aproximadamente 2 ng
en una banda de 0,5 cm de ancho. Si una banda de este ancho contiene ms de
500 ng de ADN, la ranura estar sobrecargada y se producir emborronamiento. El
tampn de carga se emplea con tres fines:

aumentar la densidad de las muestras para que las gotas de ADN caigan
uniformemente en el pocillo

aadir color a la muestra, simplificando de este modo el proceso de carga

incorporar un colorante a la muestra que, en un campo elctrico, se desplace


hacia el nodo a una velocidad previsible.

Prctica
Advertencia: El bromuro de etidio es una sustancia mutgena/carcingena potente y
moderadamente txica.

Se debern llevar siempre guantes cuando se manipulen

soluciones y geles que contengan bromuro de etidio.


Instrumental

Unidad de electroforesis horizontal con alimentacin elctrica

Horno microondas o incubador-agitador

Micropipetas

Tubos de reaccin de 1,5 ml

Balanza que pueda pesar 0,01 g

Esptulas

Soporte para tubos de reaccin

Material de vidrio

Transiluminador (radiacin UV, 312 nm)

Instrumentos para documentacin (por ejemplo, cmara Polaroid o magnetoscopio).

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Reactivos

Agarosa adecuada para electroforesis de ADN

Tris[hidroximetil] aminometano (Tris)

cido brico

Na2EDTA

CAS 6381-92-6

Bromuro de etidio

CAS 1239-45-8

Sacarosa

Cianol de xileno FF

ADN marcadores:

CAS 77-68-1

CAS 2650-17-1

Lambda ADN EcoRI/HindIII digerido (u otros marcadores adecuados


similares)

Escalera de ADN de 100 pb.

Tampn de TBE 10x (1 litro)

Tris [hidroximetil] aminometano (Tris)

54,0 g

cido brico

27,5 g

Na2EDTA

7,44 g

Mezclar el reactivo con agua desionizada para obtener una solucin de un litro con
un pH de 8,3.

Conservar a temperatura ambiente.

Tampn de carga 6x (10 ml)

Cianol de xileno FF

0,025 g

Sacarosa

4g

Aadir sacarosa y cianol de xileno FF al agua desionizada para obtener 10 ml de


solucin.

Mezclar la solucin, pasar por autoclave y conservar a 4C.

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Procedimiento

Sellar los bordes de un molde de plstico limpio y seco con cinta adhesiva o de
otro modo.

Colocar el peine adecuado de modo que se formen pocillos

completos al aadir la solucin de agarosa.

Diluir tampn de TBE 10x y preparar la cantidad adecuada de tampn de TBE


0,5x para llenar la cubeta de electroforesis y preparar el gel.

Pesar la agarosa en polvo segn lo indicado en el cuadro 2 y aadirla a una


cantidad apropiada de tampn de TBE 0,5x en un matraz de Erlenmeyer con
tapa suelta (normalmente 150 ml de solucin de gel para un molde de 15 x 15
cm y 100 ml de gel para un molde de 15 x 10 cm).

0,8 - 1%
1,5%
2,0%

genmico

GM4
ADN

GM3

GM08

GM07

CRYIA4

HA-nos118-r
CRYIA3

HA-nos118-f

p35S-cf3

p35S-cr4

ZEIN4

GMO4
ZEIN3

GMO3

Cuadro 2. Concentraciones de gel de agarosa empleadas durante el curso.

X
X

X
X

Calentar la mezcla en un horno microondas o al bao mara hasta que se


disuelva la agarosa (comprobar el volumen de la solucin tras haberla
calentado).

Enfriar la mezcla a 50 - 60C y aadir bromuro de etidio (de una solucin madre
de 10 mg/ml) hasta lograr una concentracin final de 0,2 g/ml y mezclar bien.

Verter la solucin en el molde y dejar que se forme el gel. La cantidad de gel


empleado debe corresponder a un grosor de aproximadamente 3 - 5 mm.

Una vez completamente formado el gel, retirar cuidadosamente el peine y la


cinta adhesiva y colocar el gel en la cubeta de electroforesis.

Aadir tampn de TBE 0,5x a la unidad de electroforesis de modo que el gel


quede cubierto por una capa de aproximadamente 2 - 5 mm.

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Preparar muestras y marcador para ADN genmico del siguiente modo:


Muestra
Agua
Tampn de carga
Muestra

Marcador
3 l
2 l
5 l
10 l

Agua
Tampn de carga
ADN EcoR I / Hind III

6 l
2 l
2 l
10 l

Preparar muestras y marcador para productos de PCR del siguiente modo:


Muestra
Tampn de carga
Muestra

Marcador
2 l
8 l
10 l

Escalera de ADN de 100 pb15 l

Cargar 10 l de cada muestra en pocillos consecutivos y el ADN marcador


adecuado en las calles primera y ltima.

Cerrar la tapa de la cubeta del gel y conectar los cables elctricos para que el
ADN migre hacia el nodo y aplicar una tensin de 5 - 10 V/cm.

Hacer la electroforesis hasta que el cianol de xileno haya recorrido la distancia


adecuada a travs del gel (~ 40 - 60 minutos).

Desconectar la corriente y retirar los cables y la tapa de la cubeta. Introducir el


gel en un transiluminador UV y fotografiarlo.

Tirar el gel en el recipiente para residuos slidos destinado al bromuro de etidio


previsto a tal fin.

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Bibliografa
Sambrook, J., Fritsch, E.F. y Maniatis, T. (1989). Gel electroforesis of DNA en:
Sambrook, J., Fritsch, E.F. y Maniatis, T. (Eds.) Molecular Cloning: a Laboratory
Manual. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor,
NY, USA, captulo 6.
Westermeier, R. (1997). Electroforesis in Practice: a Guide to Methods and
Applications of DNA and Protein Separation, VCH, Weinheim.

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