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Sesin n 5
Electroforesis en gel de agarosa
M. Somma, M. Querci
ndice
Sesin n 5
Electroforesis en Gel de Agarosa
Introduccin
Prctica
Bibliografa
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Sesin n 5
Introduccin
La electroforesis en gel es un mtodo que se emplea para separar macromolculas
en funcin del tamao, la carga elctrica y otras propiedades fsicas. El trmino
electroforesis describe la migracin de las partculas cargadas bajo la influencia de
un campo elctrico. Electro se refiere a la electricidad y foresis, del griego
phoros, significa trasladar.
consistente en aplicar corriente elctrica a las molculas para que atraviesen una
placa de gel. La fuerza motriz de la electroforesis es la tensin elctrica aplicada a
los electrodos en ambos extremos del gel.
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tiempo que el otro electrodo las atrae. La fuerza de friccin del material de gel acta
como tamiz molecular, separando las molculas en funcin de su tamao.
Durante la electroforesis, las macromolculas son empujadas a travs de los poros,
dependiendo su tasa de migracin por el campo elctrico de los siguientes factores:
fuerza del campo
tamao y forma de las molculas
hidrofobicidad relativa de las muestras
fuerza inica y temperatura del tampn en que se desplazan las molculas.
Para tener una idea cabal del proceso de separacin de las partculas cargadas en
la electroforesis en gel, conviene tener presentes las simples ecuaciones referidas a
esta tcnica. Cuando se aplica tensin a los electrodos se genera un gradiente de
potencial (E), que puede expresarse con la siguiente ecuacin:
E = V/d
(1)
(2)
(3)
(4)
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(5)
Cuando se aplica una diferencia de potencial, las molculas que poseen distintas
cargas globales comenzarn a separarse debido a sus diferentes movilidades
electroforticas.
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Esta ecuacin muestra que, para una resistencia R dada, es posible acelerar la
separacin electrofortica aumentando la tensin V aplicada, lo cual dar lugar al
correspondiente incremento de la intensidad de la corriente I. La distancia migrada
ser proporcional a la intensidad y al tiempo. Con todo, el aumento de tensin (V) y
el incremento correspondiente de intensidad e (I) ocasionara uno de los principales
problemas que plantea la mayor parte de las formas de electroforesis, a saber, la
generacin de calor. Este fenmeno queda ilustrado con la siguiente ecuacin, en la
que la potencia (W, medida en vatios) generada durante la electroforesis equivale al
producto de la resistencia multiplicado por el cuadrado de la intensidad:
W = I2R
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inestabilidad trmica de las muestras, que son bastante sensibles al calor (por
ejemplo, desnaturalizacin del ADN)
Tampn de electroforesis
La movilidad electrofortica del ADN se ve afectada por la composicin y la fuerza
inica del tampn de electroforesis. En ausencia de iones, la conductancia elctrica
es mnima y el ADN migra lentamente o ni siquiera se desplaza. En un tampn de
elevada fuerza inica la conductancia elctrica es muy elevada y se genera una
importante cantidad de calor. En el peor de los casos, el gel se funde y el ADN se
desnaturaliza.
Se dispone de varios tipos de tampones para la electroforesis de ADN nativo
bicatenario. Contienen EDTA (pH 8,0) y tris-acetato (TAE), tris-borato (TBE) o trisfosfato (TPE) a una concentracin de aproximadamente 50 mM (pH 7,5 7,8). Los
tampones de electroforesis suelen prepararse en forma de soluciones concentradas
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Concentracin de agarosa
Un fragmento de ADN de un tamao determinado migra a diferentes velocidades a
travs de los geles segn la concentracin de agarosa.
En funcin de la
Gamas de tamaos de
ADN (pb)
0,75
10 000 15 000
1,0
500 10 000
1,25
300 5 000
1,5
200 4 000
2,0
100 2 500
2,5
50 1 000
ADN marcador
Para una tensin, un gel de agarosa y unas concentraciones de tampn
determinadas, la distancia de migracin depende del peso molecular del material
inicial.
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Tampn de carga
Las muestras de ADN que deben cargarse en el gel de agarosa se mezclan en
primer lugar con un tampn de carga que por lo general contiene agua, sacarosa y
un colorante (por ejemplo, cianol de xileno, azul de bromofenol, verde de
bromocresol, etc.). La cantidad mxima de ADN que puede cargarse depende del
nmero de fragmentos. La cantidad mnima de ADN que puede detectarse mediante
fotografa de los geles teidos con bromuro de etidio es de aproximadamente 2 ng
en una banda de 0,5 cm de ancho. Si una banda de este ancho contiene ms de
500 ng de ADN, la ranura estar sobrecargada y se producir emborronamiento. El
tampn de carga se emplea con tres fines:
aumentar la densidad de las muestras para que las gotas de ADN caigan
uniformemente en el pocillo
Prctica
Advertencia: El bromuro de etidio es una sustancia mutgena/carcingena potente y
moderadamente txica.
Micropipetas
Esptulas
Material de vidrio
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Reactivos
cido brico
Na2EDTA
CAS 6381-92-6
Bromuro de etidio
CAS 1239-45-8
Sacarosa
Cianol de xileno FF
ADN marcadores:
CAS 77-68-1
CAS 2650-17-1
54,0 g
cido brico
27,5 g
Na2EDTA
7,44 g
Mezclar el reactivo con agua desionizada para obtener una solucin de un litro con
un pH de 8,3.
Cianol de xileno FF
0,025 g
Sacarosa
4g
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Procedimiento
Sellar los bordes de un molde de plstico limpio y seco con cinta adhesiva o de
otro modo.
0,8 - 1%
1,5%
2,0%
genmico
GM4
ADN
GM3
GM08
GM07
CRYIA4
HA-nos118-r
CRYIA3
HA-nos118-f
p35S-cf3
p35S-cr4
ZEIN4
GMO4
ZEIN3
GMO3
X
X
X
X
Enfriar la mezcla a 50 - 60C y aadir bromuro de etidio (de una solucin madre
de 10 mg/ml) hasta lograr una concentracin final de 0,2 g/ml y mezclar bien.
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Marcador
3 l
2 l
5 l
10 l
Agua
Tampn de carga
ADN EcoR I / Hind III
6 l
2 l
2 l
10 l
Marcador
2 l
8 l
10 l
Cerrar la tapa de la cubeta del gel y conectar los cables elctricos para que el
ADN migre hacia el nodo y aplicar una tensin de 5 - 10 V/cm.
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Bibliografa
Sambrook, J., Fritsch, E.F. y Maniatis, T. (1989). Gel electroforesis of DNA en:
Sambrook, J., Fritsch, E.F. y Maniatis, T. (Eds.) Molecular Cloning: a Laboratory
Manual. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor,
NY, USA, captulo 6.
Westermeier, R. (1997). Electroforesis in Practice: a Guide to Methods and
Applications of DNA and Protein Separation, VCH, Weinheim.
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