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SERVICIO NACIONAL DE APRENDIZAJE

CENTRO NACIONAL DE HOTELERA, TURISMO Y ALIMENTOS


LABORATORIO DE MICROBIOLOGA
PREPARACIN DE MEDIOS DE CULTIVOS

1. OBJETIVO
Establecer los lineamientos para la preparacin, esterilizacin, conservacin y
control de calidad de medios de cultivos, homogeneizados y reactivos en el
laboratorio de microbiologa.
2. GENERALIDADES Y DEFINICIONES
ASPECTOS A TENER EN CUENTA PARA LA PREPARACIN DE MEDIOS DE
CULTIVOS.
Utilizar preferiblemente, los medios de cultivo deshidratados que ofrecen las
firmas comerciales, pero se pueden preparar en el laboratorio a partir de los
componentes especificados en la formulacin.
Los componentes que estn en pequeas concentraciones o son poco
solubles, es mejor aadirlos en forma de soluciones acuosas filtradas,
soluciones alcohlicas o alcalinas.
Los componentes como: hidratos de carbono, yema de huevo y sulfito sdico
deben prepararse a parte de los dems componentes del medio, y ser
aadidos al medio de cultivo base en condiciones aspticas.
Disolver los medios por calentamiento hasta ebullicin en constante agitacin.
Dejar enfriar los caldos a temperatura ambiente y los medios de cultivos a
50C, antes de utilizarlos.
Ajustar el pH del medio agregando solucin NaOH o HCl 0.1N segn el caso.
Si el pH obtenido es cido, agregar solucin NaOH hasta ajustar. Si el pH es
alcalino agregar solucin HCl hasta ajustar.
Dejar secar las placas con medios de cultivo, al lado del mechero con las cajas
de petri destapadas.
Cerrar muy bien los tubos y recipientes con soluciones o caldos de cultivo, para
evitar derramamiento por el efecto de la ebullicin.
Conservar los medios y reactivos en sus envases originales, a temperatura no
mayor a 30 C fuera de la exposicin a la luz y la humedad.
Conservar los medios y caldos de cultivos preparados, en la nevera entre 2 y 6
C de temperatura.
No utilizar los medios de cultivo deshidratados que presenten alteraciones de
color, que se observen apelmazados o que superen la vigencia establecida por
la casa comercial.
Seguir las indicaciones del fabricante para la rehidratacin y esterilizacin de
los medios de cultivo.
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CONTROL NEGATIVO: Una cepa cuyo crecimiento y comportamiento no puede


evidenciarse, debido a sus caractersticas fisiolgicas y bioqumicas, en el medio
de cultivo utilizado para el analito en cuestin.
CONTROL POSITIVO: Una cepa cuyo crecimiento es favorable, en el medio de
cultivo utilizado para el analito en cuestin.
CULTIVO: Es un mtodo utilizado para la multiplicacin de microorganismos, tales
como bacterias y hongos, en el que se prepara unas condiciones ptimas para
favorecer el proceso deseado. Pueden ser de dos tipos:
Caldos de cultivo: Son cultivos de crecimiento lquidos y generalmente se
preparan en tubos de ensayos.
Medios de cultivos: Son cultivos de crecimiento slidos y generalmente se
preparan en cajas de petri grande y pequeas, se solidifican a una
temperatura menor de 45 C.
DILUYENTE: Es una solucin preparada a partir de unos componentes bsicos,
cuya funcin radica en disminuir las concentraciones microbianas de una
poblacin, para poder ser examinadas en el laboratorio. Ejemplo: Solucin
peptona 0,1 %, solucin salina 0,85 %.
FUNDIR: Accin en la que se transforman los medios de cultivos slidos y
semislidos, a el estado lquido para permitir su manipulacin en las actividades
de realizacin de ensayos.
SOLUCIN: Es una mezcla homognea a nivel molecular o inico de dos o ms
sustancias, que no reaccionan entre s.
3. NORMAS DE SEGURIDAD

Lavarse las manos antes y despus de realizar las labores de limpieza.


Usar bata blanca, guantes, mascarilla, gorro y lentes de proteccin.
No comer, beber, fumar, aplicarse maquillaje o cremas en el rea de trabajo.
No almacenar alimentos y bebidas en refrigeradores donde se encuentren los
elementos y productos de limpieza y desinfeccin.

4. MATERIALES Y EQUIPOS
Frascos de vidrio con tapa rosca
Agar SPC (Standard Plate Count)
Agar EMB (Eosin Metilen Blue)
Agar Bismuto Sulfito
Peptona Buferada
Caldo Brilla
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Vidrios de reloj
Autoclaves
Bao Serolgico
Mechero
Trpode
Plancha calentadora
Cajas Petri
Tubos de ensayo
Campanas de Durham
5. METODOLOGA
5.1.

Preparacin de medios de cultivos.


Indicaciones generales: La preparacin de los medios de cultivos consiste
bsicamente en seguir las indicaciones del fabricante, las cuales se encuentran en
el inserto de cada medio de cultivo o reactivo. A continuacin se describes las
instrucciones generales para preparar los medios de cultivos y reactivos utilizados
en el laboratorio de microbiologa:
Leer cuidadosamente las indicaciones descritas en el inserto del frasco.
Pesar en la balanza la cantidad necesaria del polvo.
Cerrar inmediatamente los frascos con medios de cultivos, para evitar que
la humedad altere sus caractersticas.
Disolver el polvo deshidratado en agua destilada o desionizada.
Agitar la mezcla, hasta disolver completamente el polvo (En los casos de
caldos de cultivo). En los casos donde los medios de cultivos contienen
agar, disolver en bao de vapor y en constante agitacin hasta no observar
grumos.
Medir el pH de la mezcla utilizando un pH-metro; si no est disponible,
utilizar tirillas indicadoras de pH.
Si es necesario (Observar en el inserto el requerimiento de pH), ajustar el
pH con una solucin de Hidrxido de Sodio (NaOH) 0,1N solucin de
cido Clorhdrico (HCl) 0,1N.
Generalmente para los medios lquidos, servir 10 mL en tubos de ensayos
taparrosca, posteriormente incluir en ellos, campanas de Durham y cerrar.
Esterilizar en autoclave 121 C, 15 PSI durante 15 minutos segn
indicaciones del fabricante.
Distribuir 20 a 25 ml de medio de cultivo por caja de Petri.
Esperar que solidifiquen.
Rotular el material, describiendo el nombre del medio de cultivo (Para
placas de cultivo) y la fecha de preparacin.

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5.2.

Esterilizacin.
Seguir las instrucciones del proveedor; generalmente, la esterilizacin de un
medio de cultivo se realiza a 121C, 15 PSI durante 15 minutos, pero
existen medios que requieren condiciones especiales de esterilizacin.
Verificar el cumplimiento de los tiempos para alcanzar la temperatura de
esterilizacin, con el fin de evitar la degradacin de ciertos componentes del
medio.
Cuando se esterilizan volmenes grandes de medio de cultivo, la duracin
del calentamiento es ms elevada, y podra ocasionar degradacin de
algunos componentes.
Despus de culminado el proceso de esterilizacin, reducir la presin del
equipo paulatinamente para evitar que la ebullicin espontnea del medio
levante las tapas del recipiente y se genere derramamiento.

5.3.

Conservacin de los medios de cultivo preparados.

5.4.

Conservar los medios en la nevera entre 2 y 6C,


Almacenar los medios de cultivos durante mximo tres meses.
No utilizar los medios de cultivo que presenten signos de deshidratacin.
Los caldos de cultivo almacenados en tubos de ensayos deben ser
conservados por una semana como mximo.

Licuefaccin de los medios de cultivos.


Fundir los medios de cultivos en un bao-mara hirviente. Evitar calentar
durante un periodo de tiempo prolongado.
Antes de servir; conservar los medios de cultivo disueltos en bao-mara a
45 - 50C.
Servir los medios de cultivos cuando estos se encuentren a una
temperatura entre 45 50 C.
No mantener licuado un medio durante ms de 4 horas y no fundir un medio
de cultivo ms de una vez.
Verter de 20 a 25 ml de medio en las cajas de Petri grandes y verter de 5 a
10 ml de medio en cajas Petri pequeas.
Cuando se realiza siembra en profundidad; agregar de 20 a 25 ml de medio
de cultivo por caja de Petri.

5.5.

Preparacin de homogenizados
Utilizar puntas o pipetas estriles, para tomar las alcuotas de muestras y
realizar las diluciones.
Utilizar para cada dilucin una punta o pipeta estril.
No preparar diluciones o placas fluidas bajo la luz solar directa.
Proteger los extremos de las pipetas, del contacto con la superficie de los
mesones, guantes, recipientes de muestras y de otros materiales, para
evitar contaminacin cruzada.
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Introducir las puntas o las pipetas a una profundidad no mayor de 2.5 cm,
en las muestras o en los tubos con diluyente.
Depositar las porciones de muestra ubicando la pipeta en un ngulo
aproximado de 45, con el extremo tocando el fondo de la caja de Petri.
Levantar la tapa de la caja Petri cuidadosamente para evitar el contacto de
los bordes con la pipeta.
Drenar la alcuota contenida en la pipeta durante unos segundos, afincando
la punta de la pipeta sobre un punto seco de la caja de Petri.
5.6.

Preparacin de diluyentes.

5.6.1. Agua Peptonada al 0.1%.


Pesar en la balanza un (1) gramo de peptona.
Agregar en un recipiente de vidrio la cantidad pesada y completar con agua
destilada un volumen de 1000 mL.
Agregar 9, 99 225 mL de solucin peptona 0,1% en tubos de ensayos
taparrosca o frascos segn el caso, y cerrar correctamente.
Esterilizar en autoclave a 121 C, 15 PSI durante 15 minutos.
5.6.2. Solucin salina isotnica.
Pesar en la balanza 8,5 gramos de Cloruro de Sodio (NaCl).
Agregar en un recipiente de vidrio la cantidad pesada y completar con agua
destilada un volumen de 1000 mL.
Agregar 9, 99 225 mL de solucin salina en tubos de ensayos taparrosca
o frascos segn el caso, y cerrar correctamente.
Esterilizar en autoclave a 121 C, 15 PSI durante 15 minutos.
5.6.3. Preparacin de diluciones.
Agitar cuidadosamente las muestras 25 veces, para homogeneizar.
Preparar diluciones consecutivas de la muestra, (10 -1, 10-2, 10-3,10-n etc.)
segn el criterio establecido para cada una de ellas.
Preparar la dilucin 10-1 de muestras, midiendo10 ml de la muestra en un
frasco de dilucin que contenga 90 ml del agua peptonada 0.1% o sea el
caso su proporcin equivalente 1/9 (1 ml de muestra en 9 ml de diluyente).
Transferir 10 ml de la muestra, en un frasco de dilucin con 90 ml de agua
de peptona 0.1%, para obtener una dilucin 10-1.
Agitar vigorosamente el frasco, dejar en reposo.
Preparar la dilucin 10-2, transfiriendo 1ml de la dilucin 10-1, a un tubo de
dilucin que contenga 9ml de agua peptonada 0.1%, agitar
cuidadosamente.
Preparar la dilucin 10-3, transfiriendo 1ml de la dilucin 10-2, a un tubo de
dilucin que contenga 9 ml de agua peptonada 0.1%, agitar
cuidadosamente.
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Repetir estos pasos hasta obtener el nmero de diluciones necesarias.


Cada dilucin sucesiva disminuir 10 veces la concentracin.
El rango de diluciones preparadas puede modificarse en funcin a la cifra de
microorganismos esperada. Se deben analizar siempre tres diluciones
consecutivas.
6. CONSULTA
1. Por qu el medio EMB (Eosin Metilen Blue), puede ser considerado un
medio selectivo y diferencial? Para el aislamiento de qu tipo de bacterias
se lo emplea? Anote la composicin y diga qu funcin cumple cada uno.
2. En qu momento se esteriliza un medio de cultivo y por qu?
3. Cul es el medio de cultivo elegido para el aislamiento de Staphylococcus
aureus? Diga la composicin y clasifquelo de acuerdo a su origen,
composicin y consistencia.
4. Cul es el medio de cultivo que se emplea para el aislamiento de hongos y
levaduras?
7. BIBLIOGRAFA
ISO/IEC 17025:2005 Requisitos generales para la competencia de los
laboratorios de ensayo y calibracin.
Manual de tcnicas de anlisis microbiolgico de alimentos INVIMA 1998.
ISO 9001:2008 Requisitos de un sistema de gestin de calidad.
Universidad Nacional de Nordeste. 2006. Microbiologa General Medios
de cultivos. Disponible en: http://www.biologia.edu.ar/microgeneral/tp4.pdf

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