Está en la página 1de 3

Funcin de la solucin Tris buffer en la extraccin de ADN

La solucin Tris, o tri (hidroximetil) aminometano, es una solucin buffer biolgica comn
que se utiliza en todo el proceso de extraccin de ADN, ya que este es sensible al pH de
cualquier tipo de fuente durante dicho proceso. La solucin Tris se utiliza durante la lisis
celular, la eliminacin y la precipitacin de componentes celulares no deseados para
mantener un pH estable. Adems, desempea un papel particularmente importante en la
lisis celular.
La solucin Tris como buffer
Como el pH puede influir y ser influido por un nmero de factores celulares, mantener un
pH estable es esencial para la ciencia experimental. Los buffers biolgicos, como la
solucin Tris, son importantes porque pueden mantener un pH estable a pesar de las
influencias que podran modificar el pH. El Tri (hidroximetil) aminometano, con un pKa de
8,1, es una solucin buffer eficaz con un pH de entre 7 y 9.
Debido a su rango neutro, la solucin Tris es una solucin buffer comnmente utilizada en
los laboratorios biolgicos. Sin embargo, la solucin reguladora Tris es sensible a la
temperatura y debe ser utilizada en la temperatura a la cual se logr el pH original para
evitar inexactitudes.
Lisis de la clula
La lisis, o ruptura de las clulas, es el primer paso para la extraccin del ADN. Esto se
logra mediante el uso de una solucin buffer que contenga solucin Tris y EDTA (cido
Etilendiaminotetraactico). El EDTA se une a cationes divalentes tales como el calcio y el
magnesio. Dado que estos iones ayudan a mantener la integridad de la membrana celular,
la eliminacin de estos con EDTA desestabiliza la membrana. La solucin Tris es el
principal componente buffer su funcin principal es la de mantener el pH del buffer en un
punto estable, por lo general 8,0. Adems, la solucin Tris interacta con el LPS
(lipopolisacrido) de la membrana, lo cual sirve para desestabilizar la membrana an ms.
La solucin Tris protege al ADN de los cambios en el pH
Cuando las clulas se rompen, su ADN y contenido se vierten en el buffer. A menudo se
incluyen adems, la ARNasa (destruye el ARN), las proteasas (destruye las protenas), y
el SDS (dodecilsulfato sdico, solubiliza los fragmentos de membrana). En conjunto, este
caldo de contenido celular y fragmentos de ARN y protenas puede tener un gran impacto
en el pH de la solucin. Debido a que el ADN es sensible al pH, es importante que la
solucin Tris regule el caldo y mantenga el pH en un valor fijo.
Precipitacin del ADN
En la etapa final de la extraccin de ADN, se extrae el propio ADN de la solucin. En este
punto, el ADN es soluble en el buffer. Para extraer el ADN de la solucin, este se hace
insoluble mediante la adicin de etanol o isopropanol (alcohol isoproplico). Al hacer esto,
el ADN se hace visible en la solucin como una sustancia blanca filiforme. A pesar de que
cuando el ADN es insoluble se lo puede aislar de los componentes celulares restantes, no
es "utilizable". Despus de aislarlo, se elimina el alcohol, y el ADN debe ser devuelto a
una solucin buffer biolgica, tal como la solucin Tris, para ser utilizado.

FUNDAMENTO TERICO
El proceso de extraccin del DNA geonmico sigue ciertas pautas para su correcta
purificacin que son muy diferentes a los empleados en la purificacin de protenas, lo
que refleja las diferencias bsicas en la estructura de estos dos tipos de macromolculas.
El primer paso en la purificacin del DNA consiste en homogeneizar las clulas y distar los
ncleos de los cuales se extrae el DNA. El medio de extraccin de ordinario contiene un
detergente, como el SDS, que sirve para lisar los ncleos y liberar el DNA, hecho que
aumenta notablemente la viscosidad de la solucin. El detergente inhibe tambin
cualquier actividad nucleasa en la preparacin.
El objetivo de los pasos de purificacin es separar el DNA de materiales contaminantes,
como RNA y protenas. La desproteinizacin se logra en general agitando la mezcla con
un volumen de fenol. El fenol (o alternativamente cloroformo) es un desnaturalizador
activo de protenas que suprime la solubilidad de las protenas en la preparacin y las
precipita. Puesto que el fenol y la solucin salina amortiguadora no se mezclan, solo se
requiere centrifugar la suspensin para separar las bases, permaneciendo el DNA (y el
RNA) en la solucin dentro de la fase acuosa de arriba y la protena presente como un
precipitado concentrado en la interface.
La fase acuosa se retira y se somete a ciclos repetidos de agitacin con fenol y
centrifugacin hasta agotar toda la protena de la solucin. Aadiendo etanol fro. El etanol
fro forma una capa arriba de la solucin acuosa del DNA, el cual, se asla de las dems
molculas conforme sale de la solucin.
En la interface el RNA sale de la solucin salina.
En contraste, el RNA sale de la solucin como precipitados. Luego de este primer paso de
purificacin, se disuelve el DNA y se trata con ribonucleasa mediante tratamiento con una
proteasa.
Enseguida sale la proteasa por desproteinizacin con fenol y se vuelve a precipitar el
DNA.
La electroforesis es una de las tcnicas ms empleada en bioqumica y biologa
molecular, usada para separar y a veces purificar macromolculas, especialmente
protenas y cidos nucleicos, que difieren en tamao, carga o conformacin.
Cuando las molculas cargadas son sometidas a un campo elctrico, migran hacia el polo
positivo (nodo) como es el caso de los cidos nucleicos o negativo (ctodo) de acuerdo a
sus cargas.
Los fragmentos de DNA lineal migran a travs del gel de agarosa con una movilidad
inversamente proporcional al log10 de su masa molecular, situndose los ms pequeos
ms cerca del polo positivo, adoptando una apariencia similar a un cdigo de barras.
Cada barra contiene un fragmento de ADN de un tamao determinado ms o menos cada
23 pares de bases.
Entre los diferentes factores que afectan la movilidad de los fragmentos de ADN en el gel
de agarosa que pueden optimizarse para la separacin de los fragmentos est la
concentracin de agarosa.