Está en la página 1de 10

Efectos de la temperatura y el pH en el crecimiento de bacterias hetertrofas

en las lagunas de estabilizacin de residuos


INTRODUCCIN
La temperatura y el pH estn entre los parmetros ambientales importantes que
rigen las actividades y la tasa de crecimiento de algas y bacterias heterotrficas en
lagunas de estabilizacin. La temperatura influye en la composicin de la biomasa,
el requerimiento de nutrientes, el metabolismo y la naturaleza de la velocidad de
reaccin metablica. Los microorganismos no tienen la capacidad de regular su
temperatura interna, lo que puede afectar el crecimiento de los mismos y la tasa
de utilizacin de sustratos. Por otra parte, se sabe que el pH del medio en el
sistema de algas-bacterias influye en la regulacin de la biomasa, el sistema de
transporte de iones y la tasa metablica. La temperatura vara ampliamente en las
lagunas de estabilizacin de residuos en funcin de la ubicacin del estanque y la
estacin del ao. En las aguas residuales domsticas, el pH es la funcin de la
velocidad de carga orgnica y puede variar de 6.0 en el afluente hasta un mximo
de 11.5 en los estanques de maduracin. El pH en las lagunas de estabilizacin de
residuos ubicados en climas tropicales y subtropicales, se correlaciona con la
temperatura del agua.
El mtodo de verter en placa es ampliamente utilizado para la enumeracin de
bacterias heterotrficas en ambientes naturales por la tcnica del nmero ms
probable (MPN), la cual es adecuada cuando se desea precisin. Muchos
investigadores difieren significativamente en la eleccin de la temperatura de
incubacin para la enumeracin de bacterias heterotrficas. Hattori por ejemplo
utiliza tres temperaturas diferentes, 30, 27 y 20C. Los mtodos estndar
recomiendan temperatura de incubacin a 35C durante 48h para el extracto de
agar glucosa-triptona utilizando la tcnica de recuento en placa. Jen y Bell (1982)
y Brozel y Cloette (1992) recomiendan la temperatura de 30C durante 72h. El pH
del agar recomendado por los mtodos estndar es estrictamente 7.0 +/- 0.2,
aunque el pH del citoplasma de las bacterias vara ampliamente. El pH interno de
las bacterias oscila desde 6.5 hasta 7.0 en acidfilos, 7.5 hasta 8.0 en neutrfilos y
8.4 hasta 9.0 en alcalfilos. Esto significa que la enumeracin de las bacterias a
pH 7.0 +/- 0.2 segn lo recomendado por los mtodos estndar, no puede producir
necesariamente los mejores resultados en el sistema de algas-bacterias.
Varios estudios se han llevado a cabo en la enumeracin de bacterias
heterotrficas en entornos naturales. Las muestras para estos estudios se
obtuvieron de los suelos forestales y de arroz, el mar, las aguas lacustres y
fluviales, un colector de aguas pluviales que fluye continuamente y aguas de
refrigeracin. Estos ambientes naturales son diferentes de las lagunas de

estabilizacin donde los nutrientes, pH y otros factores fsico-qumicos que afectan


el crecimiento celular se diferencian. La aplicacin de condiciones de incubacin
derivadas de otras condiciones ambientales puede no ser adecuada en el sistema
de algas-bacterias. Los objetivos especficos de este estudio fueron:
* Estudiar el efecto simultneo de pH y la temperatura sobre el crecimiento de
bacterias hetertrofas y la eficiencia de consumo de glucosa.
* Determinar el procedimiento de enumeracin correcta para bacterias que crecen
en el sistema de algas- bacterias.
* Investigar la competencia por el sustrato entre algas y bacterias.
Reactores alimentados con quimiostato se utilizaron como estanques modelo para
los experimentos. La glucosa se suministr diariamente como la nica fuente de
carbono orgnico a la concentracin de 75 mg/l. Un estudio anterior indic que a
esta concentracin las condiciones anaerbicas no pueden prevalecer.
Mtodos y materiales
Microorganismos y la preparacin del inoculo.
El inculo de semilla bacteriana se obtuvo de la cuenca de sedimentacin final de
la ciudad Sendai, planta de tratamiento de aguas residuales de lodos activados y
se mantuvo en laboratorio en cultivo de siembra de glucosa discontinuo
alimentado. La composicin de nutrientes que se utiliz para mantener cultivo de
siembra bacteriana se muestra en la Tabla 1.
Tabla 1

Alrededor de 400 mg / l de glucosa se aliment diariamente y oxgeno fue


proporcionado por una bomba de aire. La semilla se transfiri una vez cada dos
semanas para mantener una buena viabilidad y estabilidad de la poblacin
bacteriana heterotrfica. El alga Chlorella vulgaris fue utilizado para los
experimentos y se cultiv a 6.000 lx en un matraz cnico 51 que contiene
aproximadamente 21 de medio lquido con la composicin mostrada en la Tabla 1.
El carbono fue suministrado por burbujeo en el aire en la parte inferior del matraz.
fig. 1

La operacin del medio y el reactor quimiostato


La composicin de nutrientes que se us para los experimentos se muestra en la
Tabla 1. El agua del grifo se utiliz en la preparacin del medio y se
complementaron con trazas de metales. Reactores de quimiostato hechos de
plstico acrlico se utilizaron como modelo de las lagunas de estabilizacin, y las
luces, la temperatura y el tiempo fueron controlados por modelo FLI-30 en la
incubadora. Cada reactor tena 61 volumen bruto con 51 de capacidad til y
estaba provisto de muestreo puerto cerca del extremo inferior y una cubierta con
puertos de liberacin de gas. Una intensidad de luz de 6000 lx fue proporcionada
por lmparas fluorescentes blancas fras, fijadas a los tres lados interiores de la
incubadora. Las luces se hicieron funcionar a 12 h fotoperiodos alternantes de luz
y la oscuridad controladas por un temporizador. Esta intensidad de la luz no puede
ser un factor limitante para el crecimiento de las algas porque la intensidad de luz
de saturacin es inferior a 5400 lux. Creciendo activamente clulas bacterianas a
partir de un cultivo de siembra recin preparada se aclimataron a una temperatura
similar a la de la cultura, en un matraz cnico de 500 ml que contiene 200 ml de
medio lquido. Despus de la aclimatacin durante aproximadamente 24-36 h,
semillas de algas y bacterias se mezclaron y se utilizaron para inocular cultivos
para los experimentos. El cultivo se realiz a las temperaturas de 10, 15, 20 y 30
C y se mezclan completamente a agitadores magnticos. Para cada temperatura,
varias corridas se realizaron a pH 3- 11.5. El pH del medio se controla ajustando
con IN HCl o IN soluciones de NaOH. Se aadi glucosa a diario en forma
granular para proporcionar una concentracin de entrada de 75 mg / l del volumen
restante del cultivo. Con esta concentracin de glucosa, condiciones anaerbicas
no puede ocurrir en el sistema algas-bacterias. Antes del muestreo, la biomasa
pegada a las paredes del reactor se volvi a suspender cuidadosamente haciendo
girar el contenido del cultivo, el muestreo se realiz a las 10:00 am, 3h despus
las luces se encendieron. Adiciones diarias de glucosa se realizaron
inmediatamente despus del muestreo o a las 10:00 am en los das en que no se
hizo el muestreo.
Experimentos sobre los efectos sobre el pH agar y la temperatura de
incubacin para la enumeracin de bacterias
Para determinar el procedimiento de enumeracin correcto para el nmero de
bacterias heterotrficas cultivadas en sistema de algas bacteriana, era necesario
estudiar los efectos del pH agar y la temperatura de incubacin sobre las clulas
capaces de formar colonias. Las bacterias hetertrofas utilizados para los
experimentos se hicieron crecer en cultivo mixto de bacterias hetertrofas de
Chlorella vulgaris de acuerdo con el procedimiento descrito anteriormente. Los
cultivos se mantuvieron a 20C ya un pH de 3.0, 5.0, 6.0, 7.0, 8.0, 9.0, 10.0 y 11.0

en una serie de reactores de quimiostato, hasta que se alcanzaron las densidades


de estado estacionario. La densidad en estado estacionario de bacterias
heterotrficas se evalu mediante el recuento de bacterias por Vertido en placa
como se describe en los mtodos estndar (1985). Dependiendo del pH del cultivo
las bacterias hetertrofas alcanzaron la densidad de estado estacionario en
aproximadamente 8-11 das. Muestras para el examen de los efectos del pH agar
y la temperatura de incubacin sobre las clulas capaces de colonias que forman
fueron confirmadas por un perodo suficientemente largo de tiempo.
El efecto del pH agar se investig a pH 6.0, 7.0, 8.0, 10.0, porque este rango es
tpico en los estanques de estabilizacin de residuos. El agar se ajust al pH
deseado por adicin de NaOH o HCl antes de la esterilizacin en autoclave. La
formacin de colonias se determin mediante dilucin en serie de las muestras, y
cada dilucin se extendi sobre 15 placas. Tres placas de cada dilucin se
extendieron con agar a un pH especificado. Para el estudio de la temperatura de
incubacin se sigui un procedimiento similar, pero el pH agar se ajust a pH 7.0
antes de la esterilizacin en autoclave. Cada dilucin se extendi sobre 6 placas.
Tres de cada dilucin fueron incubadas a 35C como se recomienda en los
mtodos estndar y a 20C, la temperatura similar a aquella en la que se
cultivaron las bacterias. La temperatura del medio ambiente en el que las bacterias
cultivadas fue elegido porque de acuerdo a jen y la campana mayores densidades
de bacterias se recuperan a la temperatura de incubacin similar a la temperatura
ambiente.
Anlisis de muestras
La poblacin de bacterias heterotrficas se determin por recuento de vertido en
placa de dilucin en serie de muestras mezcladas con agar extracto de triptonaglucosa. Incubacin a 35 C y se contaron las colonias despus de 72 h de
incubacin, por razones que se discutirn ms adelante en el texto. La
esterilizacin se hizo de acuerdo con los mtodos estndar.
La biomasa de algas se determin por un mtodo de clorofila en los mtodos
estndar clorofila A se extrajo con 90% de acetona y se midi por el mtodo
espectrofotomtrico.
La concentracin de glucosa se determin mediante el procedimiento propuesto
por Dubois. Concentracin de glucosa en las muestras se midi
espectrofotomtricamente a 490 nm. Entonces la concentracin de glucosa en las
muestras se determin mediante la comparacin de la lectura de densidad ptica
con las soluciones de glucosa curvas de calibracin estndar. Se comprob el pH
con un medidor de pH.

Resultados
La eleccin de las condiciones de incubacin para la enumeracin de
bacterias
bacterias heterotrficas se cultivaron primero en cultivo mixto de las algas y
bacterias a 20 C durante 20 das y en diferentes valores de pH. Las bacterias
fueron cultivadas en agar con diferentes valores de pH y temperatura de
incubacin, Jen y Bell informaron que al 95% de intervalo de confianza, la
exactitud se enumeraba dentro de 20%. Esto significa que el tiempo mnimo de
incubacin puede ser determinada como la duracin despus del recuento de
bacterias hetertrofas el cual supera el 80% del nmero de clulas capaces de
formar una colonia. Este tiempo mnimo de incubacin se determin
matemticamente mediante la ecuacin como se describe a continuacin. Donde
N0 es el nmero de clulas capaces de formar colonias, N es el nmero de clulas
en el tiempo, t es el tiempo desde las colonias comenzaron a formarse, lambda es
un parmetro probabilstico y se calcul a partir de la pendiente.
Se obtuvo una regresin lineal cuando se represent frente el tiempo de retraso, t
se define como el tiempo cuando las colonias comenzaron a formarse ya se
vertieron las placas. El tiempo de retardo se determin como se muestra en la
Figura 2. La ecuacin (2) se utiliz para estimar el tiempo total, T, necesario para
N clulas que se formaron, ya se vertieron las placas, tasa de formacin de los
mismos y de la temperatura de incubacin
Figura 3. Muestra que la formacin de colonias es considerablemente ms lenta a
20 C que a 35 C. Se observaron resultados similares a pH 9,0 y pH 3,0, pero en
colonia
La figura 4 muestra un buen ajuste de la ecuacin para el cultivo crecido a pH de
3.0, 5.0, 7.0 y 9.0 cuya placas se enumeraron en la temperatura de incubacin de
35 C. Cuando las bacterias se incubaron a 20 C, el retraso de al menos 24 h se
observ, a excepcin del cultivo heterotrfica a pH 3,0. Como se observa en la
Tabla 2, el nmero de clulas capaces de formar colonias en un cultivo para un pH
dado es independiente de los valores N, temperatura de incubacin a 20 C para
el cultivo de pH de 3.0, 5.0, 7.0 y 9,0 respectivamente. Excepto para el cultivo de
pH de 3,0, N, fueron superiores a 35 C que a 20 C, aunque las bacterias se
cultivaron a 20 C.

La Figura 5 muestra que ms colonias se formaron a pH 7.0, independientemente


de pH en el que las bacterias se cultivaron inicialmente. Esto sugiere que el pH
ptimo para el crecimiento bacteriano es probablemente cerca de pH neutro.
Las poblaciones bacterianas en estado estacionario en el cultivo en pH de 10.0
fueron 2,2 1.3x108, 72,0 27.5x108, 73.5-53.1x104 y 21.9 19.4x104 ufc / ml a
30, 20,15 y 10 C, respectivamente. A pH 7.0 las densidades bacterianas eran
hetertrofos 1.30.6x108, 14,7 3.2x106 y 20,1 5.5x108 ufc/ml a 30,10 y 10 C,
respectivamente. Anlisis estadsticos mediante distribucin t de Student a 95%
intervalo de confianza muestra que los valores de los cultivos crecido en 10,15 y
20 C fueron estadsticamente iguales pero aquellos a 30 C fueron
estadsticamente diferentes. La razn para el mismo nmero de bacterias
heterotrficas a 10-20 C no era claramente evidente. Es posible que la densidad
alcanzada sea el sistema algas-bacteriano para las condiciones experimentales
dadas en este trabajo.
Fig 5. Efecto del pH en el nmero de bacterias hetertrofas. Bacterias
heterotrficas se crecen inicialmente en el cultivo algas-bacteriana mezclado a
20C por 20 das
Tambin se observ que a medida que la temperatura del cultivo disminuy, tom
ms tiempo para que las bacterias alcanzaran la densidad mxima. Poblaciones
bacterianas bajas a los 30C podran haber sido influenciados por las altas
actividades de algas y bacterias a esta temperatura, esto ha causado que la
glucosa se convierta en un factor que limita el crecimiento. A 30 C, 6.000 lx y pH
7.0, por ejemplo, la eficiencia de consumo de glucosa era casi 100% y el
rendimiento de biomasa fue de 0.385 mg de partculas de carbono orgnico
(POC)/mg glucosa. Este rendimiento es equivalente al 96,3% porque
tericamente, 1 mg de glucosa tiene 0,4 mg C el rendimiento de biomasa
observada en los sistemas microbianos. Evidentemente, con la biomasa sirve a 30
C, la glucosa fue un factor limitante para el crecimiento bacteriano.
En contraste, el rendimiento de biomasa a los 20 y 15 C fueron
considerablemente inferiores a 0.245 y 0.218 mg POC / mg de glucosa,
respectivamente. Estos valores son equivalentes a 61,3 y 54,5% del rendimiento
de biomasa, respectivamente.
Tambin vale la pena mencionar que en el sistema de algas-bacterias alimentados
con glucosa, aparte de relacin simbitica (Oswald et al, 1953), algas y bacterias
compiten por glucosa, una sustancia bien asimilada por Chlorella (Kommor y
Tanner, 1974; Martnez et al , 1987; ......). Mayo y Noike (1994a, b) tambin
reportaron evidencia de bacterias hetertrofos y Chlorella vulgaris en competencia

para la glucosa, con Chlorella tiene una mayor capacidad para la absorcin de
bacterias.
Efecto del pH sobre la poblacin bacteriana en cultivos discontinuos
alimentados
La Figura 7 muestra el efecto del pH del cultivo en la densidad bacteriana
heterotrfica a 10 C. Las densidades bacterianas fueron 20,1 5,5 x 106 ufc / ml
a un pH de 6,0 y 4,5, respectivamente. En ph alcalino, densidades bacterianas
disminuy ligeramente a 10,9 1,7 x 106 ufc / ml a un pH de 9,0. A pH 10.0, las
poblaciones bacterianas fueron mayores que a pH 7,0. Resultados similares se
repitieron a los 30 y 20 C (fig 6). El anlisis estadstico en el intervalo de
confianza del 95% muestra que las diferencias en la poblacin bacteriana a pH 7.0
y 10.0 fueron insignificantes a 30 C, pero significativa a las 10, 15 y 20 C. Es
posible que las altas actividades de algas y bacterias cerca de pH neutro fueran
responsables de este comportamiento haciendo que la glucosa fuese un factor
que limita el crecimiento. A pH 10,0 fue asimilada slo alrededor del 64% de la
glucosa. Esto significa que las algas y las bacterias no tienen que competir por la
glucosa. La poblacin bacteriana en pH 11,0 disminuy a 1,1 0,8 x 104 ufc / ml.
Crecimiento de bacterias heterotrficas en presencia y ausencia de algas
Para determinar si el bajo nmero de bacterias hetertrofas a 30 C fue el
resultado de la temperatura, se llevaron a cabo ms estudios en ausencia de
algas. Bacterias hetertrofas primero se aislaron de las colonias que se han
formado en las placas. Activamente las clulas bacterianas en crecimiento se
prepararon en un matraz de 1000 ml que contiene 2000 mg de extracto de glucosa
triptona y se cultivaron a 30 C despus de 2 das, las clulas bacterianas
heterotrficas se transfirieron a reactores, ajustada a pH 7,0 y 10,0. Glucosa se
aaden a diario en forma granular para proporcionar una concentracin de entrada
de se proporcion 75 mg / L del volumen restante del cultivo y la composicin
nutricional que aparece en la tabla 1. De la figura 8, se puede observar que, en la
presencia de algas, el nmero de bacterias hetertrofas fue menor en
comparacin con un sistema similar en ausencia de algas. Esta evidencia sugiere
que algn factor inhibe el crecimiento de bacterias heterotrficas en presencia de
Chlorella vulgaris. Dos posibles causas para este comportamiento se considera
que la produccin de agentes bactericidas por algas o la competencia por el
sustrato.
Efectos de pH y la temperatura sobre la degradacin de la glucosa
Captacin de glucosa por el sistema de algas bacteriana se calcul como una
pendiente de glucosa consumida contra la glucosa aadida y los resultados

obtenidos se presentan en la figura 9. La temperatura no influy significativamente


en la eficiencia de consumo de glucosa a valores de pH bajos, pero una influencia
significativa se observ a pH por encima de 9,0. La captacin de glucosa es
dependiente de Ph , el con un amplio ph ptimo de 6,0 a 8,0, una fuerte cada por
encima de pH 9,0 y descensos leves por debajo de pH 6,0 . En un cultivo mixto de
Chlorella vulgaris con bacterias hetertrofas, la eficiencia de consumo de glucosa
se vio mas afectada en el rango de pH alcalino que en intervalo de pH cido. La
disminucin en la velocidad con el aumento de pH podra haber sido causado por
la disminucin de la afinidad de la glucosa del sistema de captacin por las algas.
La cintica del efecto del pH sobre la degradacin de la glucosa se estudi en un
cultivo discontinuo usando un experimento para cada pH investigado. La biomasa
de entrada utilizado para el cultivo discontinuo era aproximadamente 550 mg POC
/ 1 (rango de 546- 558 mg / l) y se recogi en la fase de crecimiento exponencial
de el cultivo de siembra. Los experimentos por lotes se llevaron a cabo a 30C en
una serie de cultivos mixtos discontinuos mantuvo a pH 5.0,7.0,8.0,9.0, 10.0 y
12.0. La intensidad de la luz proporcionada era 6000 lx operados en fotoperiodos
de 12 horas alternas de luz y oscuridad. La concentracin de glucosa de 2,000
mg / ml se aadi y una fraccin de composicin de nutrientes que figuran en la
tabla 1 se le proporcionaron. Mediante el uso de los datos obtenidos de cultivo
discontinuo, la tasa de degradacin especifica mxima de la glucosa, vmax, y los
coeficientes de saturacin de tasa media, Km, se determinaron de acuerdo con la
ley de velocidad de Michaelis- Menten [ecuacin 3] utilizando el enfoque analtico
desarrollado por halwach 1978 que se muestra por la ecuacin 4.
Donde U=`[S0- S) /S0], S0 es la concentracin inicial de sustrato , S es la
concentracin de Sustrato en el momento, t y X0 es la concentracin de biomasa
(mg / dl). Trazando (t / T) contra [(1 / T) * en [[1 / (1-T)]], km y Vmax se calcula a
partir de la pendiente,[Km /(vmaxX0)]
y la intercepcin vertical, [(S0+km)/
(vmax X0)]. En la tabla 4 se muestra el efecto del pH v max, y los coeficientes de
saturacin de tasa media, km. a partir de los datos que se muestran en la tabla 4,
la absorcin de alta afinidad se produce a pH casi neutro. Kommor y Tanner (1975
= han observado que la protonacin cambia la conformacin de la portadora y por
lo tanto aumenta la afinidad de Chlorella vulgaris para el azcar.
Discusin
Los resultados presentados en el cuadro 2 muestran que el nmero de bacterias
hetertrofas cultivadas en la temperatura de incubacin de 35C, no difiri
significativamente a las cultivadas a 20c, la temperatura inicial del cultivo. Estos
resultados difieren de la obra por Jen yBell (1982) quienes concluyeron que una
mayor recuperacin de bacterias heterotroficas en la temperatura de incubacin

de 30c que era similar a la temperatura de del entorno a partir del cual se
obtuvieron las bacterias (28-30c). Curiosamente a las temperaturas de incubacin
de 20, 25 y 35c, Jean y Bell (1982) no observaron ninguna diferencia significativa
en el nmero de bacterias en el tiempo de incubacin superior a 96 horas. Estos
resultados son similares a los resultados de la tabla 2.
Si la temperatura ambiente era el factor determinante para la seleccion de la
temperatura de incubacin, entonces el mayor nmero de bacterias debera haber
sido obtenido a 20c que a 35c. Esto significa que la temperatura ambiente del
medio ambiente no era el factor que regula una mayor recuperacin de las
bacterias hetertrofas.
Este trabajo ha demostrado que el metabolismo de la glucosa disminuye
significativamente a valores altos de pH particularmente por encima de pH 9,0.
Curiosamente aunque las densidades bacterianas heterotrficas fueron mayores a
pH 10.0 que el pH neutro 7.0 para todas las temperaturas investigadas, el
metabolismo de la glucosa disminuyo considerablemente. La fuerte disminucin de
la eficiencia de utilizacin de la glucosa a pH alcalino (Fig 9).corresponde tambin
a la fuerte reduccin de las tasas de crecimiento de Chlorella vulgaris Estos
resultados sugieren que tal vez Chlorella era ms responsable del metabolismo de
la glucosa que las bacterias hetertrofas, y est de acuerdo con otros hallazgos en
la literatura.
Abeliovich y Weisman reportaron un crecimiento insignificante y la actividad de las
bacterias hetertrofas en el estanque y lleg a la conclusin de que las bacterias
desempean un papel secundario en la degradacin de la materia orgnica en los
estanques de oxidacin. Mayo Anda Noike encontraron que la mitad de las
constantes de saturacin tasa, K, para el crecimiento de Chlorella vulgaris y de
bacterias heterotrficas fueron 181 y 27 mg / l, respectivamente. Wright y Hobbie
observaron la aparente K, valor de 7 microgramos por litro de poblaciones
naturales de cultivo bacteriano alimentado glucosa en el ambiente oligotrfico.
Esta baja constante de saturacin para las bacterias sugiere su papel de menor
importancia en la asimilacin de la glucosa.
Hubo una evidencia de que las bacterias hetertrofas crecieron menos
vigorosamente en la presencia de Chlorella vulgaris que en la ausencia de clulas
de Chlorella.
Conclusiones
Sobre la base de los resultados experimentales obtenidos se hacen las siguientes
conclusiones.

1. el pH superior a 10,0 fueron significativamente perjudicial para el nmero de


bacterias hetertrofas, pero la afinidad por la glucosa disminuy a pH por encima
de 8,0.
2. Las temperaturas entre 10 y 20C no influyeron en el nmero de bacterias
hetertrofas, a 30 grados, sin embargo, el nmero de bacterias hetertrofas
disminuy debido al aumento de la competencia por la glucosa por Chlollera
vulgaris.
3. no se encontr ninguna evidencia para apoyar la opinin de que la descarga de
sustancias bactericidas de Chlollera vulgaris fue responsable de la reduccin del
nmero de bacterias hetertrofas.

También podría gustarte