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Cintica Enzimtica

Funciones de las Protenas


Las funciones de las protenas son especficas de cada tipo de protena y permiten a las clulas defenderse de
agentes externos, mantener su integridad, controlar y regular funciones, reparar daos Todos los tipos de
protenas realizan su funcin de la misma forma: Por unin especfica de otra molcula o in (ligando o ligante)

De la unin se derivan:
Formacin de estructuras celulares (Protenas fibrosas)
Transporte y almacenamiento
Reactividad especfica (catlisis)
Cambios conformacionales (alosterismo, motores moleculares, transmisin y transduccin de seales)

Enzimas

Las enzimas son catalizadores biolgicos que disminuyen la energa de activacin de


las reacciones que catalizan, pero no modifican la constante de equilibrio.

Por tanto aceleran en igual proporcin la velocidad de la reaccin en las dos


direcciones.

Reacciones catalizadas por enzimas

Condiciones de velocidad inicial


[S]=100%
[P]=0%

Curva de Evolucin de los componentes de la reaccin

Maud Menten (izq)


Leonor Michaelis (der)

La ecuacin de Michaelis-Menten describe como vara la


velocidad de las reacciones catalizadas por enzimas de acuerdo
a la concentracin de sustrato:
La concentracin de sustrato ([S]) es mucho mayor que la
concentracin de enzima ([E]).
La reaccin esta en equilibrio: [ES] no cambia durante el tiempo (la
reaccin se asume en equilibrio de flujos), es decir, la velocidad de
formacin de ES es igual a la velocidad de su transformacin en E + S y
en E + P).
Velocidad Inicial: Deben usarse velocidades iniciales (vo). Esto significa
que la velocidad de la reaccin debe determinarse tan pronto como el
sustrato y la enzima son mezclados.

La concentracin de sustrato debe permanecer casi


constante durante el periodo de tiempo en que se mide
la reaccin

La Temperatura, la fuerza inica, el pH, y otras constantes fsicas


que puedan afectar la velocidad de la reaccin deben
permanecer constantes
Cada molcula de enzima debe actuar en una molcula de
sustrato en cada ocasin
La enzima debe permanecer sin ninguna modificacin, ni en su
estructura, ni en su concentracin, durante todo el tiempo que
dure la determinacin de la reaccin.

Variables de la ecuacin de velocidad

Variable dependiente: velocidad inicial


Variables independientes:
A) Concentracin de enzima
B) Concentracin sustrato

Representacin grfica de la ecuacin de MichaelisMenten

Transformacin de la ecuacin de Michaelis-Menten

Paramtros cinticos
Son las constantes que aparecen en la ecuaciones de
velocidad
Estn compuestos por las constantes de velocidad de
los pasos que constituyen la reaccin catalizada

Unidades

Velocidad mxima
Es la velocidad lmite a la que tiende la reaccin catalizada por
enzimas a concentraciones saturantes de sustrato, es decir cuando
toda la enzima est como ES

Vmax= kcat[E]total

Constante cataltica (kcat)


La constante cataltica solo se puede conocer cuando se tiente a la
enzima pura y por tanto se conoce su concentracin

kcat= Vmax/[E]total

o kcat= Vmax/[sitios activos]

A kcat tambin se le conoce como nmero de recambio,


porque indica el nmero de ciclos catalticos por sitio activo y
por unidad de tiempo

Constante de Michaelis-Menten (Km)

Constante de especificidad

La enzima betana aldehdo deshidrogenasa cataliza la oxidacin de betana aldehdo a glicina betana
usando NAD+ como coenzima. Se estudi la cintica de la reaccin catalizada por la enzima pura en
ensayos de velocidad inicial en los que la concentracin de NAD+ era variable y la de betana aldehdo
constante. La masa molecular de esta enzima es de 125 kDa. Los datos de velocidad inicial obtenidos
son los siguientes:
[NAD+] (M)
v (U/mg prot)
50
20.1
100
36.2
125
42.6
250
70.0
500
100.5
1000
132.4
2000
151.4
4000
166.5
10000
176.2
____________________________________

Hacer un anlisis grfico de los datos experimentales usando


las transformacin lineal a la ecuacin de Michaelis-Menten y
determinar la cat y kcat/Km

La caracterizacin cintica de una actividad enzimtica en una


preparacin parcialmente pura proporcion los siguientes datos de
velocidad inicial:
A) Determine por regresin no lineal las constantes cinticas de la
enzima. B) Podra calcular estas constantes por regresin lineal? C)
Qu conclusiones
preliminares podra derivar del anlisis de los resultados?

En ensayos de actividad realizados con 0.1 ml de una preparacin


enzimtica en un volumen final de 1 ml se obtuvieron las siguientes
velocidades iniciales a las concentraciones de sustrato indicadas. A)
Demuestre si esta reaccin sigue o no la cintica de Michaelis-Menten
por anlisis grfico y, si procede, determine Km para el sustrato y Vmax
y Vmax/Km para esta concentracin de enzima

B) Cules son las velocidades iniciales a [S]=1.010-6 M y a


[S]=1.010-3 M? C) Calcule la cantidad total de producto formado
durante los primeros 5 min a [S]=2.010-3 M y a [S]= 2.010-6 M. D
Suponga que la enzima en cada mezcla de reaccin se aumenta
por un factor de 4 cul sera el valor de Km y Vmax?

La Quimotripsina puede hidrolizar ademas de enlaces peptdicos,


enlaces amido y steres derivados de aminocidos. Las constantes
cinticas de la reaccin canalizada por esta enzima con diferentes
steres se incluye en la siguiente tabla:

Determinar el orden de preferencia con el que la quimiotripsina


catalizar la hidrlisis de estos sustratos si los tres se encuentran
presentes en la misma concentracin.

Cul sera la razn entre velocidades de produccin de la Nacetilvalina y N-acetiltirosina si en el medio de reaccin se encuentran
presentes estos dos sustratos a la misma concentracin?
Qu conclusin puede obtener acerca del sitio activo de esta enzima
a partir del anlisis de estos datos?

La enzima acetilcolinesterasa tiene una Km. para acetilcolina de


9.5X10-5 M y una kcat de 1.4x104 s-1, mientras que la enzima catalasa
tiene una Km para el H2O2 de 2.5x10-2 M y una kcat de 1.0x107 s-1.
Cul de las dos enzimas est ms prxima a la perfeccin cataltica?

En la siguiente tabla se incluyen las velocidades iniciales de


una reaccin catalizada por una enzima que sigue cintica de
Michaelis Menten, medidas en ausencia (1), y en la presencia
de dos diferentes inhibidores totales (1 y 2), ambos a una
concentracin de 10 mM. Se us la misma concentracin de
enzima en todas las determinaciones.

Determinar las constantes cinticas de la enzima en ausencia y


presencia de los inhibidores, realizar la curva de Michaelis. (B) Para
cada inhibidor determinar el tipo de inhibicin. (C) Qu
informacin adicional requerira para calcular el nmero de
recambio de la enzima?

En una reaccin enzimtica monosustrato se


determinaron las siguientes constantes de velocidad:
k1=5x10-7 M-1s-1, k-1= 2x102 s-1 y k2 (kcat) = 4x4
s-1.
(A) Calcular Ks y Km para esta reaccin.

Factores que afectan la velocidad


Concentracin de sustrato o sustratos (cofactores)
Concentracin de enzima
Inhibidores
Activadores
pH
Temperatura

Regulacin de la actividad enzimtica por union a la


enzima de ligandos que no son sustratos

Tipos de Inhibidores

Slo se afecta la Km

Afecta la Km y Vmax