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INTRODUCCION

El VIH necesita replicarse continuamente para poder sobrevivir.


Para llevar a cabo esa replicacin con xito, el virus utiliza las
clulas humanas (preferentemente los denominados linfocitosT CD4) a las que infecta para manipularles el cdigo gentico, con
el fin de que modifiquen su funcin habitual y se dediquen a hacer
copias del virus. Cuantos ms CD4 consiga colonizar, ms copias
de s mismo podr realizar el VIH.
Aunque existen algunos casos excepcionales, en general cuanto
mayor es el nmero de copias (es decir, cuanto mayor es la carga
viral) mayor es la invasin y destruccin de CD4, y viceversa. Por
este motivo, la carga viral es un valor indicativo de la capacidad del
virus para destruir el sistema inmunolgico y, por tanto, advierte del
riesgo de aparicin de enfermedades oportunistas.
Se considera que una carga viral es baja si se encuentra por debajo
de 100.000 copias/mL y alta si se encuentra por encima de esta
cifra criterios frecuentemente utilizados en ensayos clnicos-. Por
ltimo, debido a la sensibilidad de las pruebas de deteccin
utilizadas rutinariamente, se considera carga viral indetectable toda
aquella por debajo de 50 copias/mL.

Qu es una prueba de carga viral


Una prueba de carga viral en plasma (que tambin se llama prueba
de PVL, por sus siglas en ingls) mide qu cantidad de virus de
inmunodeficiencia humana (VIH) est presente en la sangre. La
cantidad de VIH presente en la sangre se llama "carga viral".
Cuanto menor sea la carga viral, menor ser la cantidad del VIH.
Si su mdico sabe cul es su carga viral, puede brindarle ms
informacin sobre su riesgo de tener problemas de salud
provocados por la infeccin por el VIH. Una prueba de PVL ayuda a
su mdico a determinar si su mtodo actual de tratamiento est
funcionando o si es momento de cambiar a medicamentos
diferentes.

RESUMEN DE LAS CARACTERSTICAS TCNICAS.


Actualmente existen diversas tcnicas disponibles que permiten la
deteccin de la carga vrica plasmtica. Las diferencias
fundamentales radican en los formatos, tiempos y capacidad de
procesamiento. Todas las tcnicas detectan y cuantifican el subtipo
mayoritario B y algunos otros subtipos circulantes (A, C, D, F, G), y
solamente la tcnica de RT-PCR de Abbott cuantifica el grupo O.
Ninguna de las tcnicas detecta el VIH-2.
Hay diversos mtodos para poder medir en plasma la carga vrica
del VIH-1 y cada uno de ellos tiene un diseo diferente:
Tabla 1: Caractersticas principales de las tcnicas disponibles para
la deteccin de la CVP.
PARMET
ROS

Mtodo
aplicado

AMPLIC
OR HIV1
MONIT
OR

COBAS
TAQMAN
HIV-1

ABBOTT
REAL
TIME

NUCLISE
NS
EasyQ
HIV-1

VERSANT
HIV-1 RNA
3.0

RT-PCR

RT-PCR a
tiempo
real

RT-PCR a
tiempo
real

NASBA

bDNA

Rango
dinmico
del
mtodo
Deteccin
de los
subtipos
de VIH-1
del grupo
M
Deteccin
del VIH-2
Deteccin
VIH-1
grupo O
Mtodo
de
deteccin

400750.000
copias/m
l

48-107
copias/ml

40-107
copias/ml

253.000.00
0 UI/mL

75-500.000
copias/ml

A-G

A-H

A-G

A-G

No

No

No

No

No

No

No

Si*

No

No

Colorime
tra
(peroxid
asa)

Fluoresce
ncia

Fluoresce
ncia

Quimioluminis
cencia

(Sondas
de
hibridaci
n)

(Sondas
de
hibridaci
n)

Fluoresce
ncia
(molecul
ar
beacons)

(fosfatasa

RT-PCR (Amplicor Monitor, Roche)


PRINCIPIO DEL ENSAYO
Esta prueba se basa en cinco procesos fundamentales:
a) Extraccin de ARN.
b) Transcripcin del ARN diana para generar ADN complementario.
c) Amplificacin por PCR de ste ADNc con iniciadores especficos.
d) Hibridacin de los productos amplificados con sondas
oligonucleotdicas, especficas para las dianas.
e) Deteccin por colorimetra de los productos amplificados y unidos
a las sondas.

En la prueba AMPLICOR para HIV 1, la transcripcin inversa y


amplificacin de ARN del HIV-1 y del patrn de cuantificacin se
realizan de forma simultnea. La mezcla maestra contiene pares de
iniciadores biotinilados especficos para el cido nucleico diana y el
patrn de cuantificacin.
La cuantificacin de ARN del HIV-1 se determina con ayuda del
llamado patrn de cuantificacin, una transcripcin no infecciosa de
ARN obtenida in vitro, con regiones de fijacin a los iniciadores
idnticas a las de la secuencia diana del HIV-1 y una regin nica
de fijacin a las sondas que permiten diferenciar el amplicn
(producto de la amplificacin por PCR) del patrn de cuantificacin
y el amplicn de HIV-1 . El patrn de cuantificacin se incorpora a
cada muestra con una cantidad conocida y atraviesa junto con el
ARN diana del HIV-1 las fases de preparacin de las muestras,
transcripcin inversa, amplificacin por PCR, hibridacin y
deteccin. Los niveles de ARN del HIV-1 en las muestras analizadas
se determinan mediante comparacin entre la absorbancia obtenida
del patrn de cuantificacin y la absorbancia del VIH en cada
muestra. As pues el patrn de cuantificacin compensa cualquier
efecto inhibitorio y garantiza la precisin de la cuantificacin del
proceso de amplificacin para cada muestra.

.PREPARACIN DE LA MUESTRA.
El ARN del HIV-1 se asla a partir del plasma mediante lisis de las
partculas vricas con un agente caotrpico y precipitacin del ARN
con alcohol. Con el reactivo de lisis se introduce en cada muestra
un nmero conocido de molculas de ARN del patrn de
cuantificacin. Este patrn, que atraviesa las fases de preparacin,
amplificacin y deteccin, sirve para cuantificar el ARN del HIV-1 en
la muestra analizada.

Actualmente existen sistemas automticos de extraccin de cidos


nucleicos (Cobas AmpliPrep (Roche), NucliSens EasyMag
(Biomerieux), EZ1 Advanced (Qiagen)) que permiten una mejor
estandarizacin de este proceso.
TRANSCRIPCIN Y AMPLIFICACIN POR PCR.
Esta prueba amplifica y detecta un secuencia diana de 142 bases,
localizadas en una regin muy conservada del gen gag del HIV-1 y
definida por los iniciadores SK431 y SK462, que estn biotinilados
en el extremo 5. La regin gag codifica antgenos especficos de
grupo (protenas estructurales centrales del virin).
La reaccin de amplificacin se lleva a cabo por medio de la enzima
polimerasa rTth (ADN-polimerasa termoestable de Thermus
thermophilus, obtenida por ingeniera gentica). En presencia de
manganeso y en las condiciones de tampn adecuadas, esta
polimerasa posee una doble actividad como transcriptasa inversa y
ADN-polimerasa.
a) Transcripcin inversa.
Las muestras ya preparadas se aaden a la mezcla de
amplificacin en los tubos de reaccin, en los que tiene lugar la
transcripcin inversa y la amplificacin por PCR. La mezcla reactiva
se calienta para que el iniciador ascendente se hibride de forma
especfica con el ARN del HIV-1 y el patrn de cuantificacin. En
presencia de un exceso de nucletidos trifosfato (dNTP) la rTth
elonga el iniciador hibridado y sintetiza una hebra de DNA
complementario (DNAc).
b) Amplificacin por PCR.
En esta fase se calienta la mezcla reactiva para desnaturalizar el
hbrido ADNc/ARN y exponer las secuencias diana a los iniciadores.
Cuando se produce la hibridacin con el iniciador descendente, la
rTth cataliza la reaccin de elongacin y se sintetiza as una cadena
de ADN. Termina el primer ciclo de PCR, con la obtencin de una
copia bicatenaria de ADNc de la regin diana para cada ARN del

HIV-1 o el patrn de cuantificacin. Estos ciclos se repiten un


nmero determinado de veces, duplicndose cada vez la cantidad
de amplicn. No se amplifica todo el genoma del HIV-1, sino solo la
regin comprendida entre ambos iniciadores.
El empleo de AmpErase y dUTP permite conseguir una
amplificacin selectiva del cido nucleico diana a partir de la
muestra clnica. AmpErase contiene la enzima uracilo-N-glucosilasa
(UNG), que reconoce y cataliza la destruccin de las molculas de
ADN que contienen desoxiuridina, pero no las que contienen
timidina. El ADN natural carece de desoxiuridina, que sin embargo
est siempre presente en los amplicones, debido al empleo de
dUTP como uno de los dNTP en la mezcla maestra. La presencia
de AmpErase permite destruir al ADN contaminante antes de iniciar
la amplificacin del ADN diana. AmpErase es inactivo por encima de
55 C, esto es, durante los siguientes pasos del ciclo trmico, de
modo que no destruye los amplicones diana.
HIBRIDACIN.
Una vez efectuada la amplificacin por PCR, los amplicones de HIV1 y el patrn de cuantificacin se desnaturalizan qumicamente a
ADN monocatenariomediante adicin de la solucin de
desnaturalizacin; a continuacin se transfieren a los pocillos de
una microplaca, cubiertos con sondas oligonucleotdicas especficas
para el HIV-1 (SK102) y el patrn de cuantificacin (CP35). Los
amplicones del HIV-1 y el patrn de cuantificacin se unen a los
pocillos correspondientes mediante hibridacin con las sondas de la
microplaca. En la microplaca se analizan diluciones seriadas de los
amplicones desnaturalizados, con el fin de conseguir resultados
cuantitativos dentro de un amplio intervalo dinmico.
DETECCIN.
Despus de la reaccin de hibridacin, se lava la microplaca para
eliminar el material no fijado y se aade a cada pocillo un conjugado
de avidina y peroxidasa de rbano picante (conjugado Av-HRP). El
conjugado Av-HRP se une a los amplicones marcados con biotina y
capturados por las sondas oligonucleotdicas ligadas a la

microplaca. A continuacin, se lava de nuevo la microplaca para


eliminar el conjugado no ligado y se aade a cada pocillo una
solucin de sustrato que contiene perxido de hidrgeno y TMB,
catalizndose la oxidacin de TMB para formar un complejo
coloreado. Por ltimo, se aade un cido dbil para detener la
reaccin y se determina la densidad ptica a 450 nm en un lector
automtico de microplacas.
. CUANTIFICACIN DEL ARN DEL HIV-1.
Este kit permite cuantificar la cantidad de virus presente en la
muestra con ayuda de una segunda secuencia diana (el patrn de
cuantificacin) que se aade a la muestra en una cantidad
conocida. Este patrn de cuantificacin es una molcula no
infecciosa de ARN, transcrita in vitro, con 219 pb y regiones de
fijacin a los iniciadores idnticas a las de una secuencia diana del
HIV-1, generando un producto de idntica longitud y con la misma
composicin de base que HIV-1. Ahora bien, su regin de fijacin a
las sondas se ha modificado, con el fin de poder modificar el
amplicn especfico del patrn de cuantificacin y el amplicn diana
del HIV-1.
La densidad ptica (DO) en cada pocillo de la microplaca es
proporcional a la cantidad de amplicn de HIV-1 o el patrn de
cuantificacin (PC) presente en el pocillo; la densidad ptica total es
proporcional a la cantidad de ARN presente en cada reaccin de
transcripcin inversa y amplificacin por PCR. La cantidad de ARN
del HIV-1 en cada muestra se calcula a partir del cociente entre la
densidad ptica total para el HIV-1 y la densidad ptica total para el
patrn de cuantificacin, multiplicado por el nmero de molculas
de patrn de cuantificacin introducidas, de acuerdo con la
siguiente ecuacin:
Total HIV-1 DO
x Input QS copias/ml por reaccin PCR x 40 =
HIV-1 RNA copias/ml
Total QS DO