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Importancia de las inmunoglobulinas aviares y


sus aplicaciones en inmunoensayos
Importance of avian immunoglobulins and their immunoassay
applications
Hansen Wilber Murcia Gutierrez

Resumen
Las inmunoglobulinas son herramientas muy utilizadas en la deteccin de molculas de inters
en diferentes tipos de ensayos. Debido a lo dispendioso de algunos modelos utilizados para
la obtencin de este tipo de protenas, las IgY de aves como gallina son una interesante
alternativa gracias al fcil manejo, mantenimiento, gran produccin de anticuerpos y el no
maltrato o sacrificio del animal del cual se obtienen. Estudios han demostrado que las IgY
pueden presentar ttulos muy altos con gran especificidad frente al antgeno de inters.
Varios protocolos se han propuesto para extraer las IgY del huevo, donde el principal
inconveniente son los lpidos de la yema. Dentro de estos mtodos la cromatografa tioflica
ha demostrado ser el mejor para purificar y delipidar estos anticuerpos.
Palabras clave: IgY, inmunoglobulina, inmunoensayoss, purificacin, produccin.
Abstract
Immunoglobulins are useful important tools for laboratory research in the detection of a
variety of target molecules. Due to problems in manipulating some model animals used in
antibody production, IgYs from poultry become a real interesting alternative for research due
to easy handling, maintenance, high immunoglobulin production and a humane treatment
without harm of experimental animal used. Some studies have demonstrated that IgY could
be present at high titer with high antigen specificity. Different methods have been proposed
to extract immunoglobulins from egg yolk by removing lipids. Among the extraction methods,
the thiophilic chromatography has proved to be superior to purify and remove the lipids.
Key words: IgY, immunoglobulin, immunoassays, purification, production.

Magster en Microbiologa.Universidad Nacional de Colombia. Docente investigador.


Centro de investigacion y desarrollo Fundacin Universitaria del Area Andina. Bogot.
hmurcia@areandina.edu.co

Revista TEORA Y PRAXIS INVESTIGATIVA, Volumen 4 - No. 2, Julio - Diciembre 2009


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Hansen Wilber Murcia Gutierrez

INTRODUCCIN
Al igual que los mamferos, las gallinas producen
anticuerpos en respuesta a un antgeno, los cuales
son transferidos a su descendencia (Patterson et al.,
1962). Se ha encontrado que los anticuerpos con
mayor proporcin en el plasma sanguneo, las IgY,
son transferidos a la yema del huevo a travs del epitelio folicular del ovario durante la oognesis y se van
acumulando, proceso similar a la transferencia de
los anticuerpos a travs de la placenta en mamferos
(Rose & Orlans, 1981). Existen tres grandes isotipos
de anticuerpos en gallinas: una molcula de alto peso
molecular tipo IgM, dos subclases (7-8) del tipo IgG
que constituyen la mayor cantidad de inmunoglobulinas en el plasma y una del tipo IgA que se encuentra
en las secreciones externas como la vescula biliar y el
oviducto (Lebacq-Verheyden, Vaerman, Heremans,
1972). El trmino IgY es comnmente usado para
denotar el tipo de inmunoglobulina G7 de las aves.
Esta nomenclatura fue propuesta por Leslie & Clem
(1969) para reflejar algunas caractersticas particulares que hacen diferentes las IgG de mamferos y
las IgY de aves, en especial su peso molecular. La
cadena pesada de las IgY tiene un peso molecular de
aproximadamente 67 kDa, valor que se encuentra
por debajo del peso de la cadena de las IgM (70
kDa) o la cadena de las IgE (80 kDa). Es muy grande
para homologarla con la cadena de las IgG (50 kDa)
o la de las IgA (60 kDa). Como no se ha encontrado
evidencia sobre la presencia de IgM o IgA en la yema,
las IgY son el anticuerpo presente en mayor proporcin (Rose, Orlans, Buttres, 1974). Las IgA se pre-

sentan en mayor proporcin en secreciones y en el


plasma sanguneo que en el huevo (Leslie & Martn,
1973). Tanto IgM como IgA se han encontrado en
cantidades muy pequeas en la clara del huevo (Sunwoo, Li, Lee, Kim & Sim, 2000).
A excepcin de los anticuerpos monoclonales, la
produccin de anticuerpos policlonales en mamferos
contra protenas altamente conservadas dentro del
grupo de los mamferos ha presentado dificultades.
Mientras protenas como la RNA polimerasas no producen ningn tipo de respuesta en conejos o cerdos,
estas enzimas son inmunognicas en gallinas (Carroll
& Stollar, 1983). Esto hace de las gallinas excelentes
blancos de inmunizacin contra diferentes clases de
protenas no inmunognicas entre mamferos (Carroll & Stollar, 1983; Gassmann, Thmmes, Weiser
& Hbscher, 1990). Esta diferencia en la respuesta
inmune se atribuye al tiempo de divergencia entre
la aparicin de las IgY en los primeros anfibios y la
aparicin de los primeros mamferos (Jensenius, Andersen, Hau, Crone & Koch, 1981; Hdge & Ambrosius, 1984; Warr, Magor & Higgins, 1995) que se
estima en 300 millones de aos aproximadamente
(Jensenius & Koch, 1997).
La produccin de anticuerpos especficos en gallinas
vara mucho dependiendo de la respuesta generada
por el antgeno en el animal, partiendo desde 15
hasta 120 equivalentes de IgY por ao respecto a
la produccin en conejos (Fassina, Ruvo, Palombo,
Verdoliva, Marino, 2001). En la Tabla 1 se presentan
algunas caractersticas de la produccin de anticuerpos en mamferos (conejo) y en aves (gallina).

Tabla 1. Tabla comparativa sobre la produccin de anticuerpos policlonales entre mamferos


y aves (Tomado de Narat, 2003).
Conejo

Gallina

Numero de animales

Toma de muestra

6DQJUDGR P/VHPDQD

&ROHFFLyQGLDULDKXHYRV

Volumen muestra (en 2 semanas)

P/GHVDQJUH

KXHYRV P/
\HPDD

Anticuerpos totales

PJ

PJE

 PJ

 PJ





,J0,J$,J(

1LQJXQR

Anticuerpos especficos
F

Conejo / gallina - total

Conejo / galina - especficos


Presencia de otras Ig

a. Volumen promedio por yema igual a 15 mL.


b. Cantidad promedio de IgY igual a 80 mg por yema.
c. Nmero de conejos que producen igual cantidad de anticuerpos por gallina en 2 semanas.
d. Nmero de conejos que producen igual cantidad de anticuerpos especficos por gallina en 2 semanas.

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Inmunoglobulinas G de gallina (IgY)


La cadena pesada de las IgY (Cadena H o ypsilon
() posee un dominio variable (V) y cuatro dominios
constantes a diferencia de la cadena pesada de las
IgG que consta de slo 3 dominios constantes. Los
anticuerpos de gallina, al igual que las inmunoglobulinas de mamferos presentan una forma incompleta
de aproximadamente 120 kDa (5.7 s). Esta molcula
es el equivalente estructural de los fragmentos F(ab)
y se ha sugerido llamarlos IgY(Fc), mientras que
los homlogos de los fragmentos F(ab)2 se conocen como IgY(Fc). Las inmunoglobulinas Y pueden
coexistir en su forma completa y en la forma trunca dentro de un mismo individuo, como en algunos
grupos de tortugas (Pseudamys spp.) (Leslie & Clem,
1972) y algunos anseriformes o puede presentarse
solo un tipo de forma, como las gallinas que generan
la forma completa y algunos grupos de anfibios, reptiles y tortugas que producen exclusivamente la forma
reducida (Warr et al., 1995).
Estudios comparativos entre las IgG de mamferos
y las IgY han encontrado que los dominios G2 y
G3 de las IgG se encuentran cercanamente rela-

cionadas con los dominios C3 y C4 mientras que


el equivalente del dominio C2 est ausente, lo que
hace pensar que probablemente se transform en lo
que ahora es la regin de bisagra de las IgG (Fig. 1)
(Magor, Higgins, Middleton & Warr, 1994). Esta regin de bisagra es exclusiva de las IgG y les confiere
su flexibilidad, mientras que en las IgY al no poseer
esta regin su flexibilidad se ve bastante reducida. En
el caso de las IgY se encuentran entre los dominios
C1-C2 y C3-C4 residuos de glicina y prolina que
tienen la potencialidad de conferir flexibilidad aunque
muy limitada, lo cual trae implicaciones relevantes en
sus propiedades funcionales. Tanto las IgY como los
IgY(Fc) poseen dos sitios de unin a antgeno y en
principio son capaces de aglutinar o precipitar antgenos multivalentes, pero bajo condiciones especiales
como altas concentraciones de sales (hasta 10 veces
la concentracin de sales del suero sanguneo). Estas
condiciones favorecen los efectos de aglutinacin y
precipitacin que a fuerza inica baja no ocurren, tal
vez por la cercana y poca flexibilidad de las sitios
de unin del anticuerpo, generando un impedimento
que imposibilita la interaccin con dos eptopes en
molculas diferentes (Warr et al., 1995).

+LQJH

,J*

&1
9+

&2

&3

3RWHQWLDOVZLWFKUHJLRQV

&/
9/

,J< )F

9+

&1

3RWHQWLDOVZLWFKUHJLRQV

&2
9/

,J<

9+

&1
&2

9/

&/

&3

& 4

&/

Figura 1. Estructura de una IgG representativa de mamferos y una IgY en su forma completa
y truncada (Tomado de Warr et al., 1995).

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Las aves han sido un modelo til en investigacin bsica en inmunologa. De hecho, el trmino linfocitos
B se gener al conocerse que el sitio donde maduran
estas clulas es la Bursa de Fabricius, presente nicamente en las aves. Adems, el sistema inmune de los
mamferos y de las aves tiene muchas similitudes funcionales (Vainio & Imhof, 1995; Funk & Thompson,
1996). Las aves tienen un buen desarrollo del sistema
inmune tanto humoral como celular y normalmente
tienen grandes concentraciones de anticuerpos en el
suero y an ms en la yema del huevo (Farrely, Branton & Wanke, 1992; Schmidt et al., 1993).
Propiedades de las IgY
Las IgY de gallina tienen algunas caractersticas fisicoqumicas que las diferencian de las IgG de mamfero. No se unen a la protena A de Staphylococcus
aureus (Kronvall, Seal, Finstad & Williams, 1970),
no se unen a la protena G de Streptococcus spp.
ni tampoco a receptores Fc de mamferos (Larsson,
Balw, Lindahl & Forsberg, 1993). Slo se ha encontrado en Streptococcus suis el caso de un tipo de
protena capaz de reconocer IgG de distintos tipos de
animales, incluyendo las IgY de gallinas (Benkirane,
Gottschalk, Jacques & Dubreuil, 1998). En el caso
de IgY de pato se ha encontrado que son capaces
de unirse a la protena A de S. aureus y dbilmente
a la protena G de Streptococcus spp., por lo que
han sido empleadas columnas de Sepharosa-A CL4B para su purificacin (Higgins, Cromie, Liu, Magor
& Warr, 1995).
Tampoco interactan con factores reumatoideos
(RF). El factor reumatoideo es un auto-anticuerpo que
reacciona con la regin constante (Fc) de las inmunoglobulinas G, A o M de mamferos. La enfermedad
usualmente asociada en humanos al RF es la artritis
reumatoidea (RA), aunque este anticuerpo tambin
se encuentra presente en el plasma de pacientes con
diferentes tipos de enfermedades. Los ensayos ms
usados para detectar el RF son las pruebas de aglutinacin en el que el RF reacciona con dos (o ms en el
caso de RF anti-IgM) diferentes anticuerpos causando
aglutinacin. Este mismo tipo de reaccin puede ocurrir en ensayos de ELISA tipo sndwich, en el que el
anticuerpo de captura que reconoce el antgeno de
inters responde positivamente con el anticuerpo de
deteccin en ausencia del antgeno dando como resultado un falso positivo, debido a la interaccin que
ocurre entre anticuerpo de captura RF - anticuerpo
de deteccin al momento de aplicar la muestra de
suero en la que se encuentra el antgeno que se est

estudiando. Para evitar este tipo de interferencias se


han empleado fragmentos Fab (anticuerpos que no
poseen la regin constante) de anticuerpos de mamfero y anticuerpos de gallina ya que estos ltimos no
presentan reactividad cruzada con el RF debido a las
diferencias estructurales entre las IgG de mamferos y
las IgY de gallina (Larsson, Karlsson-Parra & Sjquist,
1991). Este tipo de interferencia por consiguiente es
capaz de afectar otros tipos de inmunoensayos (Larsson & Sjquist, 1988).
Otro problema que se tiene en inmunoensayos al emplear IgG de mamferos es la activacin del sistema
de complemento. Cuando se toma plasma humano
normal y se adiciona en un ensayo de ELISA en el
que se han fijado IgG de humano, el sistema de complemento de las muestras es activado y los componentes del complemento se unen a los anticuerpos,
principalmente hacia la regin variable del anticuerpo (Fab) lo que puede afectar la regin de unin al
antgeno. Se ha propuesto entonces que la unin de
protenas del sistema de complemento en la regin
Fab del anticuerpo conduce a una reduccin en la
valencia efectiva de ste, por lo que la activacin del
complemento puede inhibir la unin del anticuerpo
con el antgeno. Esta activacin vara entre especies
de mamferos pero no ocurre cuando se emplean inmunoglobulinas de gallina (Larsson, Wejker, Forsberg & Lindahl, 1992).
Las IgY tienden a asociarse en soluciones de NaCl
1.5 M para dar agregados con coeficientes de sedimentacin 14 S que al parecer corresponden a trmeros. Este tipo de agregacin se debe al parecer
por cambios estructurales que afectan su grado de
hidrofobicidad (Hersh & Benedict, 1966). El peso
molecular del anticuerpo sin reducir tiene un valor de
180 kDa, con pesos para la cadena pesada y liviana
de 67.5 kDa y 22.0 kDa respectivamente, determinado por equilibrio de sedimentacin. El contenido de carbohidratos es de aproximadamente 2.2%
(Leslie & Clem, 1969) un tanto mayor al porcentaje
de glicosilacin en las IgG (1.1%). Estos valores de
peso molecular han sido determinados tambin por
espectrometra de masas (MALDI-TOFMS) con valores para el anticuerpo, la cadena pesada y la cadena
liviana de 167.2 kDa, 65.1 kDa, y 18.6 kDa respectivamente (Sun, Mo, Ji & Liu, 2001). Adems de las
diferencias en peso molecular y contenido de carbohidratos, se ha reportado que las IgY presentan un
carcter ms hidrofbico que las IgG de mamferos
y un rango de pH para el punto isoelctrico (pI) ms
cido (6.7 0.9) que el reportado para las IgG (7.3

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1.2) (Dvalos-Pantoja, Ortega-Vinuesa, Bastos-Gonzles & Hidalgo-lvarez, 2000, 2001). Los rangos
de pI para los fragmentos IgY(Fc) y Fc son 7.0-9.5 y
5.5-6.0 respectivamente (Cheung, Thomas & Rylatt,
2003). En otros trabajos se han encontrado rangos
de pI para las IgY de 6.0-8.5 (Cheung et al., 2003)
y 6.5-7.5 (Gee, Bate, Thomas & Rylatt, 2003). Los
anticuerpos de gallina son poco estables a pH bajos
(pH 2-3) por tiempos prolongados (ms de dos horas)
y su actividad puede verse afectada al ser liofilizados
(Li-Chan, 2000).
Zhang (2003) presenta un resumen general de las
propiedades de las inmunoglobulinas Y comparado
con la las inmunoglobulinas G de mamferos.
Aplicaciones de las IgY
Las IgY tienen aplicacin potencial en medicina preventiva (por ejemplo, contra infecciones gastrointestinales) lo cual puede incrementar su uso. Tambin
se han aplicado en estudios biolgicos, como suplemento alimenticio, etc. Tienen un gran campo en
la extraccin y purificacin de compuestos bioactivos o patgenos y en inmunoensayos, gracias a su
gran especificidad. Recientemente se han empleado
como una herramienta biolgica en terapias contra
el cncer y como una herramienta bioqumica para la
caracterizacin de protenas (Song, Yu, Bai, Hester
& Kim, 1985; Sunwoo et al., 2000) e inmunohisto-

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qumica (Schmidt et al., 1993). Adems, se han producido IgY contra diferentes tipos de antgenos en
mltiples aplicaciones. (Narat, 2003), entre ellos en
antgeno Tn presente en clulas cancergenas (Vega,
Murcia & Prez, 2009).
Extraccin y purificacin de IgY
Diferentes mtodos se han aplicado para la extraccin de las IgY de la yema, ya que aproximadamente el 50% del material de la yema no es acuoso y
puede interferir en ensayos posteriores (Jensenius &
Koch 1997). Dentro de los mtodos utilizados se encuentran delipidacin con PEG 6000 (Polson & Von
Wechmar, 1980; Carrol & Stollar, 1983; Gassmann
et al., 1990; Jensenius & Koch, 1997), sulfato de
dextrano (Jensenius et al., 1981), dilucin con agua
(Akita & Nakai, 1992, 1993; Almeida et al., 2003),
solventes orgnicos como cloroformo (Ntakarutimana, Demedts, Van Sande & Scharp, 1992; Shin,
Choi, Kim, Hur & Yoo, 2002), 2-propanol y acetona (Bade & Stegemann, 1984), alginato de sodio
(Hatta, Sim & Nakai, 1988) y el mtodo - carrageenan (Hatta, Kim & Yamamoto, 1990; Shin, Roe &
Kim, 2004) con cantidades de protena que varan
ampliamente (Tabla 2) debido a las diferentes metodologas empleadas tanto para la extraccin, purificacin y cuantificacin de protena (Sunwoo, Lee,
Menninen, Suresh & Sim 2002).

Tabla 2. Comparacin entre diferentes mtodos de extraccin de IgY presentando sus respectivos rendimientos.

Autor

1WDNDUXWLPDQDHWDO 

Fraccin

Cantidad
protena
(mg x yema)

([WUDFWRFUXGR



,J<HVSHFtILFRV



Mtodo

&ORURIRUPR

*DVVPDQQHWDO 

([WUDFWRFUXGR



3(*

-HQVHQLXVHWDO

([WUDFWRFUXGR

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6XOIDWRGHGH[WUDQR

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Adems de los mtodos cromatogrficos clsicos utilizados para la fragmentacin de extractos proteicos,
se ha evaluado un nuevo tipo de interaccin descubierto por Porath, Malsano y Belew (1985) conocido
como cromatografa de interaccin tioflica (TIC) en
el que se activan soportes con DVS (divinilsulfona).
Estos tipos de ligandos basados en la activacin del
soporte con DVS pueden variar ampliamente, pero
aquellos que contienen grupos con azufre parecen
presentar mayor especificidad por la retencin de
anticuerpos. Se ha encontrado igualmente que la retencin de anticuerpos por cromatografa tioflica es
aplicable en la purificacin de anticuerpos de diferentes especies como ratn, rata, cabra, bovinos y gallinas. Solo se encuentran diferencias en la afinidad de
las distintas clases de anticuerpos, como en el caso
del humano en que las IgG e IgA tienen una buena adsorcin mientras las IgM se retienen en menor
proporcin (Schwarz, Hohen & Wilcheck, 1995). Se
ha propuesto que el mecanismo de retencin de los
anticuerpos a este soporte se debe a un complejo
donor-aceptor de electrones entre regiones ricas y
deficientes de electrones en zonas hidrofbicas hacia el interior de la protena y el grupo tioter como
donor y el grupo sulfona como aceptor del ligando,
donde al parecer el ligando no cumple un papel tan
importante como el grupo sulfona de la DVS (Belew, Juntti, Larsson & Porath, 1987; Scoble & Scopes, 1997). Barroso, Murcia, Vega & Prez, (2005)
compararon algunos mtodos de purificacin donde
encontraron que la cromatografa tioflica era muy
efectiva respecto a otros mtodos.

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