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UNIVERSIDAD DE CHILE

FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICAS Y FARMACEUTICAS


DEPARTAMENTO DE CIENCIA DE LOS ALIMENTOS Y TECNOLOGIA QUIMICA

EFECTO DE LA ADICIN DE HIDROLIZADOS DE LEVADURA


Saccharomyces cerevisiae EN LA OBTENCIN DE LECHES
ACIDIFICADAS

Profesor Patrocinante:
Jos Mario Romero Reyes
Departamento de Ciencia de los
Alimentos y Tecnologa Qumica
Universidad de Chile

Directores de Memoria:
Pedro Carriles Cobos
rea Manager Lallemand Chile
Jos Mario Romero Reyes
Departamento de Ciencia de los
Alimentos y Tecnologa Qumica
Universidad de Chile

MARIA JOSE CASTAON GONZALEZ


MEMORIA PARA OPTAR AL TTULO DE INGENIERO EN ALIMENTOS
SANTIAGO, 2009

DEDICATORIA

A Dios y familia con mucho cario

AGRADECIMIENTOS

Al profesor Jos Mario Romero, por su apoyo, conocimientos,

carisma

disposicin durante todo el desarrollo de esta memoria.


Al profesor Luis Lpez, por su apoyo y conocimientos.
A la profesora Andrea Bunger, por su excelente disposicin.
A mis amigas por su compaa, en especial Annie, Anjela, Jos Novoa y otras
muy importantes durante toda la carrera.
A mi mam y familia por su amor, paciencia y apoyo incondicional.
A Dios por estar junto a m en cada paso.

NDICE GENERAL

DEDICATORIA ... II
AGRADECIMIENTOSIII
NDICE GENERAL IV
RESUMEN ..VI
SUMMARY.VII
CAPTULO I: INTRODUCCIN....1
1.1. Antecedentes generales...4
1.1.1. Descripcin general de la levadura.4
1.1.1.1. Hidrolizados ....7
1.1.1.1.1. Proceso de autolisis celular en la levadura.........9
1.1.1.1.2. Componentes liberados durante la autolisis.10
1.1.2. Fermentacin lctica....11
1.1.2.1. Leches fermentadas....13
1.1.2.1.1. Leches fermentadas como alimentos funcionales14
1.2.

Objetivos.16
1.2.1. Objetivo general.16
1.2.2.

Objetivos especficos...16

CAPTULO II: MATERIALES Y MTODOS.....17


2.1. Lugar de Trabajo..17
2.2. Materiales...17
2.2.1. Materias primas17
2.2.2. Reactivos17
2.2.3. Insumos y utensilios.18
2.2.4. Equipos e instrumentos...18
2.3. Mtodos...19
2.3.1. Proceso de autolisis para la obtencin de hidrolizados de levadura19
2.3.1.1. Levadura seca....20
2.3.1.2. Rehidratacin levadura.20
2.3.1.3. Autolisis...20

2.3.1.4. Pasteurizacin...20
2.3.1.5. Centrifugacin20
2.3.1.6. Determinacin del porcentaje de hidrlisis...20
2.3.1.7. Determinacin de nitrgeno total...21
2.3.1.8. Determinacin de amino nitrgeno ......21
2.3.2. Proceso de fermentacin lctica con adicin de hidrolizados..22
2.3.2.1. Leche entera...23
2.3.2.2. Adicin de inculo..23
2.3.2.3. Adicin de hidrolizados.....23
2.3.2.4. Fermentacin......24
2.3.2.5. Refrigerado.....24
2.3.2.6. Determinacin de lactosa.....25
2.3.2.7. Determinacin de pH.....25
2.3.2.8. Determinacin de cido lctico....25
2.3.2.9. Rendimiento terico de la fermentacin lctica...........................26
2.3.3. Determinacin de vitaminas.27
2.3.4. Evaluacin sensorial del yogurt...27
CAPTULO III: RESULTADOS Y DISCUSIONES...29
3.1. Determinacin de nitrgeno total.29
3.2. Determinacin de amino nitrgeno.29
3.3. Determinacin del porcentaje de hidrlisis30
3.4. Determinacin de la cintica de la fermentacin lctica.....32
3.4.1. Rendimiento de los procesos de fermentacin......36
3.5. Determinacin de protena total en el yogurt37
3.6. Determinacin de vitaminas........38
3.7. Evaluacin sensorial.....39
CAPTULO IV: CONCLUSIONES.42
CAPTULO V: BIBLIOGRAFA..43

RESUMEN

El objetivo de este trabajo fue obtener autolizados o hidrolizados de levadura


Saccharomyces cerevisiae para su adicin durante el proceso de obtencin de leches
acidificadas.
Los hidrolizados se hicieron a travs de un proceso de autolisis celular, donde
las enzimas endgenas degradan la pared celular de la levadura y liberan el contenido
citoplasmtico al medio extracelular. El proceso de autolisis se realiz a diferentes
condiciones de temperatura, 30, 35, 40, 45 y 50C por 72 horas y se control,
determinando el contenido de N total en la levadura seca y el N asimilable en el
extracto lquido del hidrolizado, obteniendo as, el porcentaje de hidrlisis total. El
mayor porcentaje de hidrlisis total fue de 18 % y se obtuvo a 45 C. El hidrolizado
obtenido en estas condiciones, se separ en extracto lquido, slido y extracto
completo (mezcla de extracto lquido y slido), y se adicion a la fermentacin lctica.
Todos los procesos de fermentacin se realizaron en las mismas condiciones
(45 C x 6 h). Se determin la cintica de fermentacin lctica en los procesos con la
adicin de los extractos en distintas etapas (al inicio y a mitad del proceso) y en
relacin, 3,5 ml y 7 ml por 100 ml de medio de fermentacin. Los rendimientos (Y p/s)
ms altos se obtuvieron en los procesos con adicin de 7 % de extracto lquido y con 7
% del extracto completo, ambos, al inicio de la fermentacin, logrando un aumento de 7
% en la conversin de lactosa en acido lctico, al compararse con el control. Adems
el producto obtenido con adicin de 7 % del extracto lquido al inicio del proceso,
present un 6 % ms de protena total que el control y contenidos normales de
vitamina B1 y B2, con un aumento de tiamina.
Se realiz evaluacin sensorial a los productos obtenidos en la fermentacin
con adicin de extractos al inicio del proceso y con las dos concentraciones utilizadas,
aplicando el test de diferencias contra control. Los datos se evaluaron mediante
anlisis de ANOVA y test de Tukey (DSH), donde, no existieron diferencias
estadsticamente significativas entre jueces, pero s, entre muestras con adicin de
extractos y el control. Adems los jueces destacaron la presencia de sabor salado en
las muestras, y lo calificaron como desagradable.

SUMMARY

Effect of the addition of hydrolyzed yeast (Saccharomyces cerevisiae)


during the acidified milks

The aim of this study was to obtain autolyzed or hydrolyzed Saccharomyces


cerevisiae in orden to be incorporated uring the process of acidified milk production.
The hydrolysates were obtained through a cellular autolysis process, where the
endogenous enzymes degrade the yeast cell wall and release the cytoplasmitic
contents into the extracellular medium. The autolysis process was done at different
temperature conditions; 30, 35, 40, 45 and 50 Celsius degrees for 72 hours and
monitored by determining the N total content in the dry yeast and the N assimilated in
the liquid extract of the hydrolyzed, obtaining so, the percentage of total hydrolysis.
The highest percentage of total hydrolysis was 18% at 45C. The hydrolyzed
obtained under these conditions was divided in liquid, solid and complete extract, the
last was

an extract mixture of liquid and solid, and was added to the lactic

fermentation.
All fermentation processes were conducted under the same conditions (45C for
6 hours). The kinetics of the lactic fermentation in the processes with the addition of the
extract in different stages (at the beginning and at the middle of the process) and in
relation, 3.5 ml and 7 ml per 100ml of fermentation medium. Was determinated the
highest yields (Yp/s) were obtained in the process with addition of 7% of the liquid
extract and with 7% of the complete extract, both, at the beginning of the fermentation,
achieving a 7% increase in the conversion of the lactose in lactic acid, when compared
with the control. Additionally, the product obtained with addition of 7% of the liquid
extract at the beginning of the process; show a 6% more protein than the control, and
normal content of vitamin B1 and B2, with an increase of thiamine.
Sensory evaluation was performed on products obtained from fermentation with
the addition of extracts at the beginning of the process and with the two used
concentrations, applying the test of differences against control. The data was evaluated

using ANOVA analysis and Turkey test (DSH), where no statistically significant
differences were found among judges, but, they were found between samples
containing extracts addition and control. Besides, the judges highlighted the presence
of salty taste in samples, and described it as unpleasant.

Captulo I
INTRODUCCIN

La biotecnologa alimentara tradicional utiliza las actividades de los


microorganismos para producir diferentes tipos de alimentos. Productos lcteos como
el queso y leches acidificadas, encurtidos, vinagre, vino y cerveza involucran en su
obtencin un proceso de fermentacin. Actualmente es creciente la preocupacin de la
poblacin por ingerir alimentos naturales y disminuir el consumo de productos ricos en
azcar, sal y grasa. As tambin, es cada vez mayor el inters por alimentos con
propiedades funcionales, como forma de prevenir enfermedades. Entre los diferentes
tipos de alimentos con estas caractersticas se destacan los productos lcteos, como
las leches fermentadas, que contienen microorganismos probiticos liberadores de
cido lctico el cual que tiene la capacidad de facilitar la digestin de los alimentos y la
absorcin de los nutrientes (Dragone ,2007).
La mayora de los autores coinciden en definir probiticos como aditivos
alimentarios constituidos por microorganismos vivos, que tienen un efecto beneficioso
en la fisiologa y la salud del hospedero (Marteau y cols., 2001). Adems son capaces
de estimular la produccin de anticuerpos y producir enzimas que destruyen sustancias
txicas o cancergenas y presentar accin antibacteriana (Teo y Tan, 2005). Los
prebiticos son aquellos componentes no digeribles que afectan de manera positiva al
husped porque estimulan

en forma selectiva el crecimiento y/o la actividad

metablica de una cepa, o de un nmero limitado de cepas de bacterias del colon


(Roberfroid, 2001).
Las leches fermentadas se consumen desde la antigedad encontrndose
referencias a estos productos en proverbios, leyendas y textos antiguos. Los productos
lcteos acidificados proceden del Oriente y se hicieron muy populares en la Europa
central y oriental. El primer ejemplo de leche acidificada fue presumiblemente
producido de forma accidental por nmadas. Leche acidificada es el nombre genrico
que incluye productos tales como el yogur, kfir, mazada acidificada, nata acidificada y
koumiss. Este nombre genrico deriva del hecho de ser la leche la materia prima que

se inocula con un cultivo de fermentos que convierte parte de la lactosa en acido


lctico (Manual de industrias lcteas, 2003).
En Espaa, Isaac Carasso empieza a producir yogur industrialmente en
Barcelona para ser vendido en farmacias en 1917 (Aranceta y Serra, 2004). A este
mbito sanitario y excepcional se limita su consumo hasta que, a partir de la dcada de
los 60, su popularidad empieza a extenderse, convirtindose en la actualidad en un
alimento habitual de consumo diario (Tamime, 1991).
El yogurt y las leches fermentadas presentan una serie de propiedades
beneficiosas para la salud que les hace considerarse como alimentos funcionales, a la
vez que contienen multitud de ingredientes funcionales para la formulacin de otros
alimentos. Adems, estos productos lcteos son un vehculo excelente para la
inclusin de otros ingredientes funcionales de origen lcteo o no lcteo, bacterias
probiticas, carbohidratos prebiticos, fibra alimentaria, compuestos antioxidantes, etc.
(Recio y Lpez-Fandio, 2005). Por estas razones, hoy en da han salido al mercado
distintos productos como yogurt congelado en forma de paletas o helados, yogurt
lquido y yogurt seco para usarse como ingrediente en sopas, aderezos para ensaladas
y productos de confitera (Lpez y cols., [s.a.]).
El valor nutricional de la levadura por su parte es conocido y antiguo. Pero el
que la levadura constituya tambin un valioso complemento para el hombre y los
animales es un hecho relativamente reciente, y su introduccin como tal se remonta
slo a los ltimos decenios. Las guerras desencadenadas en Europa dieron impulso a
los estudios en este sentido, porque al fallar las importaciones de ultramar, muchos
pases se encontraban ante un grave dficit de protenas. La investigacin intensiva y
la experiencia prctica revelaron que el valor de la levadura no se limitaba en modo
alguno a su elevado contenido proteico, 50 % aproximadamente, sino que las
vitaminas que contiene y otros factores activos son, por lo menos, igualmente
importantes. Los experimentos sobre la alimentacin revelan que la levadura, debido
especialmente a su elevado contenido de lisina y valina, es un excelente suplemento
de la protena de los cereales, y que aumenta en grado considerable el valor nutritivo
de los alimentos a base de cereales, tales como el pan (Schmidt, 1953).

Por otra parte los hidrolizados o autolizados de levadura son el producto de la


accin autoltica de las proteasas intracelulares de la misma levadura en la fase
estacionaria del crecimiento provocando la salida

del contenido citoplasmtico al

medio de cultivo en el cual se encuentra la levadura (Prez y cols., 2001).


Los hidrolizados tambin llamados extractos de levadura que son producidos a
partir de una cepa especialmente seleccionada de Saccharomyces cerevisiae tienen la
notable propiedad de conferir e intensificar naturalmente el aroma original de los
diversos productos finales, adems de conferir cuerpo a alimentos como: sopas,
caldos, condimentos, salsas, bocados, embutidos, derivados de tomate y platos
preparados. Hoy en da existen adems extractos de levadura ricos en aminocidos
libres, minerales y vitaminas, siendo un complejo de nutrientes eficiente para ser
utilizado en procesos de fermentacin industrial y medios de cultivo con la ventaja de
ser naturales o no-genticamente modificados.
Los hidrolizados se utilizan ampliamente en la tecnologa alimentaria por sus
propiedades nutricionales o funcionales, solubilidad, poder emulsificante, capacidad
espumante, etc. (Bentez y cols., 2008)
La evaluacin sensorial de todos los productos, resulta hoy imprescindible para
evaluar y analizar la calidad sensorial de los alimentos, como comentan CostellDuran,
los inconvenientes y los riesgos que conllevan son, en la mayora de los casos,
menores que las ventajas que aporta si se utiliza correctamente (Mori, 1989).
La adicin de estos hidrolizados de levadura se presenta como una alternativa
interesante para la mejora o enriquecimiento de productos como leches fermentadas.

1.1.

Antecedentes Generales

1.1.1. Descripcin general de la levadura:


Las levaduras son organismos unicelulares de los cuales existen cerca de 600
especies. Estos se encuentran ampliamente distribuidos en la naturaleza, pero el
gnero Saccharomyces es el que ofrece mayor inters industria y aunque consta de
41 especies, Saccharomyces cerevisiae es la levadura que ms se emplea en
numerosos procesos fermentativos. Resultan fciles de cultivar tanto en laboratorio
como a escala industrial, con un medio de cultivo que contenga azcares, sales
minerales y una pequea cantidad de extracto de levaduras o peptonas. Las clulas
de levadura tienen una composicin qumica aproximada de 40% de protenas, 15%
de cidos nucleicos, 25% de polisacridos, 15% de lpidos y 5% de compuestos
hidrosolubles como nucletidos, aminocidos, azucares, factores de rendimiento y
enzimas entre otras (Prez, 2000).

Figura 1.1. Imagen


microscpica de la levadura.

Una caracterstica destacada de la levadura es la gran proporcin de las


sustancias nitrogenadas que contiene. La cantidad vara mucho, al parecer de acuerdo
a las condiciones de nutricin en las que la levadura se ha crecido, pero en general

ms de la mitad de la materia seca se compone de protenas y de otros rganos


nitrogenados. Los distintos componentes compuestos de nitrgeno son glucgeno,
goma, muclago, la grasa, materia resinosa, de celulosa y, junto con una buena
proporcin de los ingredientes minerales (Simmonds, [s.a.]).
Las levaduras contienen todos los aminocidos considerados esenciales por la
OMS y la FAO (Informe 522 de 1973).

Energa [kcal]
Protena [g]
Hidratos carbono [g]

164
27,8
11,8

Calcio [mg]
Hierro [mg]
Yodo [g]

86
3,7
___

Vit. B1 Tiamina [mg]


Vit. B2 Riboflavina [mg]
Eq. niacina [mg]

Fibra [g]

Magnesio [mg]

180

Vit. B6 Piridoxina [mg]

Grasa total [g]


AGS [g]

0
0

Zinc [mg]
Selenio [g]

2,1
18

Ac. Flico [g]


Vit. B12 Cianocobalamina [g]

AGM [g]

Sodio [mg]

3600

Vit. C Ac. ascrbico [mg]

AGP [g]
AGP/AGS
(AGP + AGM)/AGS
Colesterol [mg]
Alcohol [g]
Agua [g]

Potasio [mg]
Fsforo [mg]

2600
104

Retinol [g]
Carotenoides (Eq. carotenos) [g]
Vit. A Eq. Retinol [g]
Vit. D [g]
Vit. E Tocoferoles [g]

0
0
34

9,7
14,3
97
1,3
1010
0,5
0
0
0
0
___
0

Tabla 1.1. Composicin nutricional de la levadura. Aporte por 100 g de porcin


comestible Porcin comestible % = 100. Fuente: Sociedad Chilena de
Nutricin, Bromatologa y Toxicologa.

Las levaduras contienen una importante cantidad de vitaminas hidrosolubles


del complejo B, fuente indispensable para el hombre pues muchas veces deben ser
incorporadas para lograr el normal desarrollo de las funciones celulares durante el
crecimiento y la reproduccin. El complejo B incluye a las vitaminas B1-B2-B6, niacina
y cido flico, biotina-pantotenato; sus funciones son las de participar en reacciones
enzimticas como co-enzimas (B1, B6, niacina, biotina, cido flico y pantotenato); en
la sntesis de cidos nucleicos (biotina y cido flico) y como activadores de funciones
de la respiracin celular (B2 y niacina).
Los principales componentes de la pared celular de Saccharomyces cerevisiae
son mano-protenas y -glucanos en proporciones ms o menos iguales y pequeas

cantidades de N-acetilglucosamina. (Conzelmann y cols. 1988; Ballou, 1990; Rinsum y


cols., 1991). La capa de glucano tiene la funcin de soportar y mantener la rigidez de
la pared, mientras que la de mano-protenas determina su permeabilidad (Zlotnik y
cols., 1984; Blagoeva y cols., 1991).
A continuacin se presenta una tabla comparativa de composicin aminocidos
y vitaminas de algunos alimentos y la levadura.

Huevo
entero

Carne Leche Levadura Guisantes Trigo

Aminocidos esenciales
Arginina

100

+ 13

- 33

- 27

+ 39

- 30

Histidina

100

- 10

+ 20

+ 13

- 43

-5

Isoleucina

100

- 21

- 22

-7

- 49

- 55

Leucina

100

- 13

+ 23

- 17

- 30

- 26

Lisina

100

+6

+4

- 14

- 30

- 65

Metionina

100

- 22

- 20

- 71

- 76

- 76

Fenilalanina

100

- 27

-16

- 36

- 24

- 40

Treonina

100

+9

-6

+2

- 20

- 39

Triptofano

100

- 20

+7

-9

- 53

-9

Valina

100

- 21

- 10

-9

- 45

- 44

B1, tiamina

100

+ 36

- 73

+1540

+ 446

+ 58

B2, riboflavina

100

+3

- 39

+1680

- 21

- 25

Niacina

100

462

- 62

+1720

+ 75 + 588

B6, pirodoxina

100

- 30

- 90

+ 60

- 93

- 72

Acido
pantotnico

100

- 46

- 89

+ 36

- 75

- 64

H, biotina

100

- 96

- 97

+ 100

Vitaminas

- 97 - 100

Tabla 1.2. Contenido de aminocidos y vitaminas en 5 alimentos.


Fuente: Revista de Silvicultura y Productos Forestales, 1953.

1.1.1.1.

Hidrolizados:

El grado de hidrlisis es la propiedad fundamental de un hidrolizado y va a


determinar en gran medida las caractersticas del mismo y por lo tanto su posible uso.
El grado de hidrlisis final est determinado por las condiciones utilizadas, siendo
estas, concentracin, tiempo de incubacin y las condiciones fisicoqumicas tales
como el pH y la temperatura. Debido a la hidrlisis, las propiedades moleculares de las
protenas cambian, producindose la disminucin del peso molecular, el aumento de la
carga y la liberacin de grupos hidrofbicos, entre otros fenmenos (Caessens y cols.,
1999). Estos cambios moleculares pueden ser detectados con varios mtodos
analticos. Existen diferentes mtodos para realizar la hidrlisis de las levaduras
pudiendo agruparse estos en mtodos qumicos (hidrlisis cida y qumica) mtodos
fsicos (hidrlisis trmica) y mtodos biolgicos (autolisis con o sin control, hidrlisis
enzimtica) (Rodrguez y cols., 2008).
Los hidrolizados que se producen para su uso en alimentacin se pueden
agrupar en: hidrolizados con bajo grado de hidrlisis, entre el 1% y el 10%, para la
mejora de las propiedades funcionales; hidrolizados con grado de hidrlisis variable
para su uso como saborizantes y por ltimo, hidrolizados extensivos, con grado de
hidrlisis superior al 10%, para su uso en alimentacin especializada (Bentez y cols.,

2008).
El material de partida para la obtencin de hidrolizados puede ser de origen
animal, vegetal o microbiano. Entre los vegetales los ms usados son soja, trigo arroz,
principalmente en pases desarrollados. De los sustratos de origen animal se utiliza el
pescado, principalmente en pases orientales, como Japn y Corea.
Para la eleccin de la fuente adecuada a utilizar, debe tenerse en cuenta el uso
que vaya a tener el hidrolizado, as como el valor agregado del producto final con
respecto al sustrato inicial. Por ejemplo, para la obtencin de hidrolizados con
propiedades gelificantes y emulsificantes se suele emplear colgeno y gelatina por su
capacidad de formar geles transparentes (Adler-Nissen y Olsen, 1979). Como fuente
de fermentacin para el crecimiento de microorganismos se emplean hidrolizados de

levadura o casena. Cuando la finalidad del hidrolizado es su uso como fuente de


nitrgeno, se usan protenas de pescado y protenas microbianas en alimentacin
animal y protenas de soja y lcteas en alimentacin humana, siendo estas ltimas, la
materia prima ideal para la preparacin de alimentos infantiles y dietas (Kong y cols.,

2007).
Tambin dependiendo de las materias primas utilizadas suelen denominarse
segn la tabla 1.3:
Fuente de materias primas de naturaleza
proteica

Productos elaborado

Levadura panadera

Extracto de levadura, hidrolizado enzimtico de


lavadura

Kluyveromyces marxianus

Autolizado de levadura

Levadura cervecera

Extracto de levadura, hidrolizado enzimtico de


lavadura

Levadura forrajera

Extracto de levadura, hidrolizado enzimtico de


lavadura

Levaduras

Extracto

Otras levaduras

Autolizado de levadura

Algas

Hidrolizados de algas verdes-azules

Tabla 1.3. Sustratos de origen microbiano empleados en la obtencin de hidrolizados


proteicos, peptonas y extractos.
En forma generalizada, la preparacin de estos productos se desarrolla a
travs de los siguientes procesos tradicionales (Cabrera y Rolz, 1977).
Autlisis: Incubacin de las clulas en medio acuoso a pH 6,5 y 45 50 C,
donde las enzimas endgenas degradan la pared celular, liberando la porcin
intracelular.
Plasmlisis: autlisis en presencia de altas concentraciones de NaCl (hasta
25%), la cual acelera el proceso.

Hidrlisis cida: la suspensin de levaduras se trata con HCl concentrado y


se calienta hasta 100C; luego se neutraliza con NaOH. En este caso, el producto final
contiene altas concentraciones de NaCl y el proceso destruye el triptfano presente.

1.1.1.1.1.

Proceso de autlisis celular en la levadura:

La autlisis ha sido estudiada por diversos autores, es un proceso que consiste


en la ruptura y degradacin de las estructuras celulares por su propia dotacin
enzimtica. Charpentier y Freyssinet 1989, plantean cuatro etapas diferenciadas a lo
largo del proceso:

Inicialmente las actividades de las enzimas endo y exo--(1,3) glucanasas

liberan una mezcla de polisacridos y de cadenas cortas oligosacaridas. Una fraccin


de estos polisacridos corresponden a las mano-protenas unidas covalentemente al
glucano de la pared intacta.

Posteriormente, la hidrlisis parcial del glucano provoca una desestabilizacin

de la estructura de la pared, que supone una liberacin de mano-protenas de elevado


peso molecular con bajos contenidos de glucosa y que proviene mayoritariamente de
la zona periplasmtica.

En una etapa ms tarda contina la degradacin de los glucanos de la pared

por las -(1,3)-glucanasas en los restos de pared y en el medio extracelular.

Finalmente las exo--(1,3)-glucanasas, solubilizadas en el medio, degradan el

glucano unido a las mano-protenas y estas a su vez pueden ser hidrolizadas por manosidasas y por otras proteasas que liberan peptidomananos de menor tamao.

Figura 1.2. Proceso de autlisis celular de la levadura. Fuente: Biorigin, 2009.


1.1.1.1.2.

Componentes liberados durante la autlisis:

Consecuencia de esta ruptura y fragmentacin del material celular son


liberadas molculas de distinta naturaleza. Estas molculas se pueden clasificar como
procedentes del interior celular o bien de las paredes (Guilloux-Benatier y cols., 1995)
figura 1.3:

Contenido celular: nucletidos o nucleosidos (se comportan como agentes de

flavor), aminocidos y pptidos (actan como precursores de aromas y pueden


presentar sabores dulces o amargos).

Pared celular: glucanos y mano-protenas (activadores del crecimiento de

bacterias lcticas, presentan interacciones con voltiles aromticos).


El grado de autlisis se puede variar controlando las condiciones de tiempo y
temperatura del proceso (Carriles, 2008).

Figura 1.3. Componentes liberados durante la autolisis de la levadura. Fuente:


Morata y cols. 2005).

1.1.2. Fermentacin lctica:


La fermentacin lctica consiste en la transformacin de la lactosa en cido
lctico por la accin de bacterias acidfilas del tipo homofermentativas
heterofermentativas. Las homofermentativas como Lactobacilos y Estreptococos
metabolizan la

lactosa produciendo

un 95%

de cido lctico

y el resto

principalmente acetaldehdo que influye en el aroma y sabor del producto lcteo, en


tanto que las heterofermentativas producen el 50% de cido lctico adems de etanol
y

anhdrido

carbnico

como

es

el

caso

de

las

bacterias

del

tipo

Leuconostoc (Capraispana, 2008).


La accin de estas bacterias desencadena un proceso microbiano por el cual la
lactosa (azcar de la leche) se transforma en cido lctico. La conversin de lactosa en

cido lctico tiene un efecto conservador sobre la leche. El bajo pH de la leche


acidificada inhibe el crecimiento de las bacterias de la putrefaccin y de otros
organismos perjudiciales. De esta forma se prolonga la vida til del producto (Manual
de industrias lcteas, 2003).
A medida que el cido lctico se acumula la estructura de las protenas de la
leche va modificndose (van cuajando), y lo mismo ocurre con la textura del producto.
Existen otras variables, como la temperatura y la composicin de la leche, que influyen
en las cualidades particulares de los distintos productos resultantes (Manual de
industrias lcteas, 2003).
Durante la primera etapa de la fermentacin, las bacterias se desarrollan a igual
tiempo, mientras hay pptidos y aminocidos libres. Cuando estos se acaban, los
Streptococcus thermophilus mueren porque no producen proteasas, pero el
Lactobacillus bulgaricus si las produce por lo que sigue creciendo, luego, por accin de
estas proteasas vuelve a crecer el Streptococus thermophilus. Este proceso produce
una relacin simbitica entre ambas bacterias (Frazier, 1978).
Aunque el producto final es el cido lctico principalmente, tambin se producen
metabolitos como acetaldehdo (aroma tpico del yogurt), siendo esta una de las
capacidades en las que se basa la seleccin de cepas (Frazier, 1978).
Las necesidades nutritivas de los lactobacilos son complejas, y la mayor parte
de las cepas no puede cultivarse en los medios nutritivos ordinarios, a menos que se
enriquezcan con glucosa y suero. Las necesidades individuales de aminocidos son
variables, adems, en general se requiere piridoxina, tiamina, riboflavina, biotina, cido
flico y cido nicotnico, variando las necesidades en cada caso. Estos requerimientos
nutritivos

variados

tienen

aplicacin

prctica

en

tcnicas

de

dosificacin

microbiolgicas de vitaminas y de algunos aminocidos, para los cuales son ms


sensibles que los mtodos qumicos disponibles. En concentracin adecuada, hay
cierta relacin definida, incluso lineal entre la concentracin de vitamina en un medio
de cultivo adecuado, pero exento de vitamina, y el desarrollo o la cantidad de cido
producidos (Spreer y Sutherland, 1991).

1.1.2.1.

Leches fermentadas:

Las leches fermentadas en general, resultan del desarrollo de microorganismos


benficos que modifican los componentes de la leche; la lactosa que se transforma
parcialmente en cido lctico en otros casos en alcohol etlico, y los prtidos que son
parcialmente peptonizados mejorando su digestibilidad (Veisseyre, 1986).
Las leches fermentadas son productos preparados con leche a la que, tras
tratarla trmicamente, se le inoculan bacterias lcticas que actan como cultivo
iniciador de la fermentacin. Las bacterias cido lcticas tienen la capacidad de
obtener energa de la lactosa y de hidrolizar las protenas lcteas liberando pptidos y
aminocidos al medio.
Su capacidad proteoltica ha sido tradicionalmente explotada porque los
aminocidos y pptidos que se forman durante la fermentacin contribuyen o son
precursores de otras sustancias que influyen en el aroma, el sabor y la textura de estos
productos (Visser, 1993).
Adems de un buen sabor y un buen aroma, la leche acidificada debe tener una
apariencia y consistencia adecuadas. Estas caractersticas son determinadas por
medio de una adecuada eleccin de los parmetros de proceso (Manual de industrias
lcteas, 2003).
Las leches fermentadas son productos de gran valor nutricional. Su
composicin, similar en general a la de la leche de partida, difiere de sta debido a la
adicin de distintos ingredientes y al proceso fermentativo. El valor nutritivo de la
fraccin proteica as como la asimilacin de la lactosa mejoran debido a la
fermentacin, que aumenta su digestibilidad, y la materia grasa, aunque muy influida
por la leche de partida, tambin vara en funcin de las especies bacterianas
fermentativas (Rota y Herrara, 2001). El contenido vitamnico es difcil de establecer
debido a la influencia que ejercen tanto los microorganismos (que sintetizan y asimilan
distintas vitaminas) como los tratamientos (trmico o desnatado) a los que se somete la

leche (Tamime, 1991). El calcio destaca como mineral tanto por su riqueza como por
su fcil absorcin gracias al cido lctico presente en estos alimentos.
La leche fermentada ms conocida es el yogur, obtenido por fermentacin
lctica mediante la accin de Lactobacillus bulgaricus y Streptococcus thermophilus.
Existen diferentes tipos de yogur en funcin de los ingredientes que contiene, la
aplicacin o del tratamiento trmico tras la fermentacin, su consistencia o su origen
(Montero y cols., 2006).
Se puede clasificar al yogurt segn las siguientes caractersticas: Por el mtodo
de elaboracin, por el sabor y por el contenido graso (Spreer y Sutherland, 1991):

El yogurt aflanado (cuajado o coagulado), es el producto en que la leche

pasteurizada, es envasada inmediatamente despus de la inoculacin, producindose


la coagulacin en el envase.

El yogurt batido, es el producto en el que la inoculacin de la leche

pasteurizada, se realiza en tanques de incubacin producindose en ellos la


coagulacin, luego se bate y posteriormente se envasa.

El yogurt natural, es aquel sin adicin alguna de saborizantes, azcares y

colorantes, permitindose solo la adicin de estabilizantes y conservantes. El yogurt


frutado, es aquel al que se le ha agregado frutas procesadas.
1.1.2.2.

Leches fermentadas como alimentos funcionales

Las propiedades beneficiosas de las leches fermentadas se pueden atribuir a


los microorganismos que se emplean en su elaboracin, y a los diferentes productos
liberados durante el proceso de fermentacin, tales como metabolitos, iones y
molculas biolgicamente activas. Los microorganismos contribuyen a la seguridad
bacteriolgica del producto y le confieren una serie de caractersticas desde el punto
de

vista

organolptico,

tecnolgico

nutricional.

Adems

de

aumentar

la

biodisponibilidad de la lactosa y de las protenas y producir un enriquecimiento de


ciertas vitaminas del grupo B, determinados microorganismos, en particular algunas

bacterias cido lcticas, como lactobacilos, bifidobacterias y los estreptococos,


presentan efectos probiticos en el organismo (Leroy y cols., 2004).
Los probiticos, se definen como microorganismos vivos, principalmente
bacterias y levaduras, que pueden ser agregados como suplemento en la dieta y que
afectan de forma beneficiosa al desarrollo de la flora microbiana del intestino. Sus
efectos beneficiosos han sido descritos en algunas patologas, especialmente en las
diarreas, ciertos tumores y alrgias (Fuller, 1989).

1.2.

Objetivos

1.2.1. Objetivo General:

Estudio del efecto de la adicin de hidrolizados de levadura en la cintica de


fermentacin lctica para la obtencin de leches acidificada.
1.2.2. Objetivos Especficos:

Obtencin de hidrolizados de levadura en distintas condiciones del proceso


controlando variables de tiempo y temperatura.

Controlar el proceso de hidrlisis mediante la determinacin de nitrgeno total y


amino nitrgeno en los hidrolizados.

Determinar la cintica de fermentacin lctica

Determinar la cintica de fermentacin lctica en presencia de hidrolizados

Probar el efecto de la adicin de los hidrolizados de levadura en diferentes


etapas durante el proceso fermentativo.

Evaluacin sensorial de los productos obtenidos con adicin de los hidrolizados


de levadura.

Captulo II

MATERIALES Y MTODOS
2.1. Lugar de Trabajo
El estudio se realiz en el Laboratorio de Microbiologa Aplicada de la Facultad
de Ciencias Qumicas y Farmacuticas de la Universidad de Chile, ubicado en Vicua
Mackenna 20.
2.2. Materiales
2.2.1. Materias primas

Levadura Lallemand, cepa Saccharomyces cerevisiae

Leche entera UHT

Yogurt comercial

2.2.2. Reactivos

NaOH p.a. Merck

HCl p.a. Merck

Sulfato de Cobre (CuSO4)

Sulfato de Potasio (K2SO4)

Tartrato de Sodio y Potasio (KNaCH4O64H2O)

Formalina 40%

cido Sulfrico Concentrado (H2SO4)

Buffer pH 4,0, pH 7,0 y 10,0 Cicarelli

Fenolftalena 1%

Acido lctico (CH 3 CHOHCOOH)

Azul bromotimol

Lactosa Merck

Rojo metilo

H2O destilada y esterilizada

2.2.3. Insumos y utensilios

Frascos de 250 ml Schott

Frascos de 500 ml Schott

Matraces de diferente volumen Pyrex

Tubos de ensayo

Tubos centrfuga

Pipetas

Mechero Bunsen

Gradilla

Termmetros

Gotario

Algodn

Cinta adhesiva

2.2.4. Equipos e instrumentos

Termmetro de varilla, marca Brand

Balanza analtica Adam PW 124

Autoclave KSG 112

Estufa con Control de Temperatura Kottermann

Sistema de refrigeracin

pH metro digital Hanna Instruments HI 111

Bao Termoregulado Arquimed YCW-03S

Mechero, trpode y malla alambre

Digestor BUCHI.

Unidad de destilacin BUCHI.

2.3. Mtodos

2.3.1. Proceso de autlisis para la obtencin de hidrolizados de levadura.

Figura 2.1. Diagrama de bloques del proceso de autlisis celular de la levadura.


2.3.1.1. Levadura seca

A la levadura Saccharomyces cerevisiae se le determin el contenido de


nitrgeno total por el mtodo de Kjeldahl. Luego de esto se pes.
2.3.1.2. Rehidratacin levadura
Se realiz a 30 C por 15 minutos en vasos de precipitado de 250 ml, a razn
de 1:7 (levadura:rehidratante), en bao termorregulado, usando como rehidratante
agua destilada y esterilizada en autoclave por 15 minutos a 121 C.
2.3.1.3. Autlisis
La autlisis se realiz por mtodo fsico (hidrlisis trmica). La levadura
rehidratada se coloc en estufa a distintas temperaturas, 30, 35, 40, 45 y 50 C.
Las muestras se mantuvieron en estufa hasta lograr un porcentaje constante de
hidrlisis.
2.3.1.4. Pasteurizacin
Las muestras se pasteurizaron a 70C durante 10 minutos, en bao
termorregulado.
2.3.1.5. Centrifugacin
El autolizado ya pasteurizado se someti a centrifugacin a 4000 rpm durante
10 minutos, para la separacin del material soluble (sobrenadante extracto lquido) e
insoluble (extracto slido biomasa decantada) (anexo 1).
2.3.1.6. Determinacin del porcentaje de hidrlisis
Esta determinacin es el parmetro clave para el seguimiento y control de la
reaccin de autlisis a travs de la hidrlisis de protenas. Representa la proporcin de
enlaces peptdicos hidrolizados sobre el nmero total de enlaces (Bentez y cols.,
2008). El porcentaje de hidrlisis por lo tanto, se determin a partir del nitrgeno total

presente en la levadura seca y el amino nitrgeno presente en el extracto lquido. El


porcentaje de hidrlisis viene expresado segn:
% Hidrlisis = A x 100
7,857 x 10
Donde:
A = animo nitrgeno en extracto lquido de hidrolizado (g /ml).
7,857 x 10 = N total en cepa de levadura utilizada (g/ml).
2.3.1.7. Determinacin de nitrgeno total
La determinacin de nitrgeno total se realiz por del mtodo de Kjeldahl, este
es un mtodo clsico para determinar la cantidad de protenas de un producto a partir
de su contenido en nitrgeno, donde la materia orgnica es digerida con cido sulfrico
y el nitrgeno obtenido en forma de una sal estable (sulfato de amonio) es valorada,
previa destilacin en medio alcalino para descomponer la sal y convertirla en
amonaco, contra una solucin cida valorada (HCl) (Schmidt-Hebbel, 1981) (anexo 2).
2.3.1.8. Determinacin de amino nitrgeno
La determinacin de amino nitrgeno indica la cantidad de grupos amino libres
totales liberados al medio lquido debido a la hidrlisis celular de la levadura, y se
realiz por el mtodo de Srensen (Association of Official Analytical, 1980) que
consiste en bloquear la funcin amina por adicin de un exceso de metanol mediante la
titulacin con formol. Se calcul mediante la siguiente frmula:
Amino nitrgeno (mg/L) = G x 56
Donde:
G = es el gasto en mL de NaOH 0,1N obtenido en la valoracin.

2.3.2. Proceso de fermentacin lctica con adicin de hidrolizados

Figura 2.2. Diagrama de bloques del proceso de fermentacin lctica con adicin de
hidrolizados.

2.3.2.1. Leche entera


Para el proceso se utiliz leche entera UHT (comercial), lo que evita la dificultad
de encontrar leche cruda durante el estudio.
2.3.2.2. Adicin de inculo
Tambin llamada inoculacin, despus que la leche ha sido acondicionada a la
temperatura adecuada es inoculada y homogenizada, se utiliz como inculo yogurt
natural.
2.3.2.3. Adicin de hidrolizados
Los hidrolizados se adicionan a la mezcla y esta se agita para una correcta
homogenizacin (Figura 2.3.)
Los hidrolizados obtenidos se adicionaron a diferentes concentraciones y en
distintas etapas del proceso. Adems para poder tener una base de comparacin se
utiliz un control al cual no se le adicion ningn extracto de hidrolizado.

Xi
Adicin de extractos
Adicin de inculo (yogurt)

Leche

Fermentacin 45 C X 6 hrs.
Figura 2.3. Esquema adicin de extractos.

Las formulaciones para las fermentaciones se presentan en la tabla 2.1.

Formulacin I

Formulacin II

Control

Ingredientes

Ingredientes

Ingredientes

Inculo (yogurt)

20

Inculo (yogurt)

20

Inculo (yogurt)

20

Hidrolizado

Hidrolizado

3,5

Hidrolizado

Leche

73

Leche

76,5

Leche

80

Tabla 2.1. Formulaciones utilizadas en los procesos de fermentacin

2.3.2.4 Fermentacin
La temperatura se eligi prxima a la temperatura ptima de desarrollo del
Streptococcus thermophilus (42 a 45C) y del Lactobacillus bulgaricus (47 a 50 C),
de acuerdo a las bacterias probiticas presentes en el inoculo (yogurt). Adems, se
determin el tiempo de fermentacin total hasta un pH aproximado de 4,6 y 4,7 ya que
el pH 4,5 es el punto isoelctrico de las protenas lcteas (Guerrero, 2005).
Los parmetros de proceso fueron 45C por 6 horas aproximadamente para
todas las fermentaciones.
2.3.2.5. Refrigerado
Terminada la fermentacin, el yogurt se lleva a refrigeracin a no ms de 5 C
hasta la evaluacin sensorial.

2.3.2.6. Determinacin de lactosa


La lactosa en la fermentacin lctica es el sustrato del proceso, por lo cual se
midi a tiempo cero (luego de inocular la leche) y despus cada una hora para
determinar el rendimiento del proceso.
La determinacin de lactosa se realiz por el mtodo de Fehling el cual se basa
en que la glucosa y otros azcares como la lactosa son capaces de reducir a agentes
oxidantes por lo que son llamados azcares reductores. As, tenemos que en el
mtodo de Fehling se puede medir el volumen de la muestra necesario para reducir la
totalidad de los iones cpricos de una solucin

cuproalcalina titulada. En medio

alcalino y caliente, los azcares reducen al sulfato de cobre CuSO4 a Cu2O (precipitado
de color rojizo), con la desaparicin del color azul del ion Cu++2 que indica el trmino
de la reaccin (Bordeu y Scarpa, 2000).
2.3.2.7. Determinacin de pH
La determinacin de pH se realiz con tiras indicadoras especiales de pH, con
un rango de pH 4 7.
2.3.2.8. Determinacin de cido lctico
Al igual que la lactosa para poder obtener el rendimiento del proceso es
necesario obtener la cantidad de producto formado el cual es el acido lctico, por lo
tanto este se midi a tiempo cero (luego de inocular la leche) y despus cada una hora
del proceso.
Se realiz con el mtodo para la determinacin de la Acidez titulable segn la
NCh1738.Of98 debido a que esta norma establece el mtodo para determinar la acidez
titulable en la leche y se aplica a leche cruda, leche pasteurizada, esterilizada, crema y
productos lcteos fludos, sean o no fermentados.

2.3.2.9. Rendimiento terico de la fermentacin lctica


De forma general, en el rendimiento terico para un proceso homofermentativo,
se produce cido lctico principalmente y pequeas cantidades de productos
secundarios entre los que destacan: acetona, acetaldehdo (aroma tpico del yogurt),
acetona, diacetilo y glucanos.
C12H22O11 + H2O 4 C3H6O3

4
PM lactosa = 342 g/mol

PM ac. lctico = 90 g/mol

dS/dt = velocidad consumo sustrato (lactosa).

dP/dt = velocidad formacin producto (cido lctico).

Factor de rendimiento
Y p/s = - dP/dt
dS/dt

Sabiendo que 1 molcula de lactosa, genera 4 molculas de cido lctico, se


calcula el rendimiento terico (Romero, 2007):
Y p/s terico = (90 4) / 342 = 1,04 [g cido lctico / g lactosa]

2.3.3. Determinacin de vitaminas


La determinacin de vitaminas B1, B2, B3 fue realizada por el laboratorio
externo Analab con los siguientes mtodos (Association of Official Analytical, 2000):

Determinacin de vitamina B1 tiamina en alimentos por cromatografa lquida


con detector de fluorescencia.

Determinacin de riboflavina en alimentos por cromatografa lquida con


detector de fluorescencia.

Determinacin de niacina en no cereales por espectrofotometra.

2.3.4. Evaluacin sensorial del yogurt


Para este anlisis sensorial se utiliz un panel entrenado de 7 jueces,
seleccionados entre alumnos de la carrera de Ingeniera en Alimentos que ya cursaron
el ramo Evaluacin Sensorial y segn sus aptitudes sensoriales. Adems se realiz un
entrenamiento terico con el fin de unificar criterios en los posibles parmetros
sensoriales presentes en las leches fermentadas.
El test empleado fue un test de diferencias contra control (anexo 3) el cual se
utiliza para determinar si existen diferencias entre una muestra o ms muestras y un
control, adems tambin se puede estimar la magnitud de estas diferencias. (Bunger,
2007).
Las muestras se ordenaron designando un control o referencia, y las dems
muestras se evaluaron con respecto a la magnitud de la diferencia con el control. El
control se present identificado como control y las muestras se presentaron
codificadas con letras al azar. Entre las muestras codificadas se coloc un control
escondido (ciego) codificado igual que las muestras. Este, ayuda a medir el error por
expectacin, efecto placebo, o

efecto numrico que se presenta an cuando no

existen diferencias (Bunger, 2007).


Para la evaluacin, las muestras se presentaron en tres set distintos que se
clasificaron segn el tipo de hidrolizado adicionado.

Las caractersticas evaluadas fueron el color, intensidad del aroma,


consistencia, gusto salado, acidez e intensidad del sabor residual.
Los datos se evaluaron mediante de un anlisis de ANOVA y con el test de
Tukey (DSH) para determinar si existan diferencias estadsticamente significativas en
las caractersticas sensoriales del yogurt con adicin de hidrolizados de levadura y
entre jueces. El diseo se analiz con un nivel de confianza del 95% utilizando el
Software Statgraphics Plus 5.1.
La evaluacin sensorial se realiz en el laboratorio de Evaluacin Sensorial de
la Facultad de Ciencias Qumicas y Farmacuticas de la Universidad de Chile.

Captulo III.
RESULTADOS Y DISCUSIONES

3.1. Determinacin de nitrgeno total


En la tabla 3.1. se presentan los valores obtenidos para la determinacin de
nitrgeno total por el mtodo de Kjeldahl. El anlisis se realiz por triplicado con

muestras de aproximadamente un gramo de levadura seca.

Muestra (g)

% N total

% Protena

1,0231

5,5

34,4

1,0203

5,5

34,4

1,0073

5,6

35,0

5,5 0,058 34,6 0,35


Promedio
Tabla 3.1. Porcentaje total de Nitrgeno y
Protena en la levadura seca.

Para obtener el contenido de protena bruta a partir del N total se us el factor


de conversin 6,25, que representa el contenido promedio de nitrgeno en la molcula
de protena.
La levadura tiene una composicin qumica de protena total aproximada de 40
% (Prez, 2000), sin embargo la Sociedad Chilena de Nutricin, Bromatologa y
Toxicologa declara para esta un 27,8 % de protena. Se observa que el porcentaje
obtenido de N total en la levadura est dentro de los mrgenes esperados y la
cantidad de protena total, obtenida, es mayor que la que declara la Sociedad Chilena
de Nutricin, Bromatologa y Toxicologa.
3.2. Determinacin de amino nitrgeno

El resumen de datos obtenidos se encuentra la tabla 3.2.

Temperatura de hidrlisis (C)


mg amino N /L (72 h de proceso)
30
551,6
35
884,8
40
1069,6
45
1400
50
1321,6
Tabla 3.2. Temperatura de hidrlisis y cantidad de amino N al final del proceso.
Estos resultados revelan la cantidad de nitrgeno que ha sido solubilizado al
medio durante la autolisis celular. El amino N se midi cada 12 horas por el mtodo

de Srensen hasta las 72 horas de proceso. Luego de las 72 horas la cantidad de


amino N a los 45 C comienza a ser constante (anexo 4), por lo tanto, este es el
tiempo de proceso final. En la tabla 3.2 se observa que a mayor temperatura la
cantidad de nitrgeno solubilizado aumenta, por lo tanto, las temperaturas ms
adecuadas para el proceso de autolisis son 45 y 50 C.
3.3. Determinacin del porcentaje de hidrlisis

El proceso de autlisis para la obtencin de hidrolizados se presenta en la


siguiente figura (anexo 4):

Figura 3.1. Proceso de Hidrlisis

En la figura 3.1. se observa que a medida que aumenta la temperatura de


proceso, la autolisis celular se hace ms rpida. A temperaturas ms bajas como 30 y
35 C las curvas muestran procesos ms lentos. A diferencia de lo que ocurre a 40, 45
y 50C y donde las curvas indican una mayor velocidad en el proceso y porcentajes de
hidrlisis al final del proceso ms altos. Todas las curvas se asemejan solo en las
primeras 12 horas del proceso que es donde ocurre el aumento ms rpido en el
porcentaje de hidrlisis. Sin embargo pasado este tiempo la relacin porcentaje de
hidrlisis v/s tiempo, no aumenta a la misma razn.
Cabe destacar lo que ocurre a 45 y 50 C donde las curvas se entrecruzan a las
40 horas aproximadamente del proceso, en la primera etapa del proceso a 50C el
porcentaje de hidrlisis es mayor siguiendo la hiptesis que a mayor temperatura existe
un mayor porcentaje de hidrlisis, sin embargo, posterior a esto, la curva a 45C
muestra un mayor porcentaje que el proceso a 50C, lo que se pudo deber a una
saturacin del medio a 50C. A pesar de esto, la variacin en el porcentaje obtenido al
final del proceso a 45 y 50C solo vari en 1%.
Los porcentajes finales de hidrlisis a las diferentes temperaturas se muestran
en la tabla 3.3.
Temperatura de hidrlisis (C)

% hidrlisis

30

77

35

11,3 11

40

13,6 14

45

17,8 18

50

16,8 17

Tabla 3.3. Porcentajes finales de hidrlisis

Los mayores grados de hidrlisis se obtienen a temperaturas alrededor de 50C


(Peppler y Red, 1913; Perlman, 1979) o entre 45 a 50 C (Haehn, 1956), segn la
tabla 3.3 la temperatura donde se obtiene el mayor porcentaje de hidrlisis es a 45 C.

3.4. Determinacin de la cintica de la fermentacin lctica

Todos los procesos de fermentacin se realizaron bajo las mismas condiciones


de inculo (20%), temperatura (45 C) y tiempo (6 h). La adicin de los extractos se
hizo de acuerdo al siguiente esquema:

Figura 3.2. Esquema de adicin de extracto.

El extracto lquido se refiere al sobrenadante del hidrolizado y extracto slido se


refiere a la biomasa decantada despus de la autolisis.
La definicin extracto completo se refiere al extracto lquido y slido del
hidrolizado en conjunto. Las experiencias se compararon con un control al cual no se le
adicion ningn tipo de extracto
La cintica de fermentacin (anexo 5) para todos los procesos que a
continuacin se presentan tienen la siguiente codificacin:

A, a = curvas con adicin de 7% de extracto al inicio del proceso.


B, b = curvas con adicin de 7% de extracto a mitad del proceso.
C, c = curvas con adicin de 3,5% de extracto al inicio del proceso.
D, d = curvas con adicin de 3,5% de extracto a mitad del proceso.
E, e = curvas sin adicin de extractos (control)

** Las letras maysculas representan las curvas de consumo de lactosa y las


letras minsculas las de formacin de acido lctico.

La figura 3.3 muestra la cintica de fermentacin del proceso con adicin de


extracto lquido de hidrolizado:

Figura 3.3.

La figura 3.4 muestra la cintica de fermentacin del proceso con la adicin del
extracto completo de hidrolizado:

Figura 3.4.
La figura 3.5 muestra la cintica de fermentacin del proceso con la adicin de
extracto slido del hidrolizado:

Figura 3.5.
Al comparar las figuras de los procesos de fermentacion no se observan
importantes diferencias al adicionar cualquiera de los tres tipos de hidrolizados.

Por otra parte, se observa, que s existen diferencias cuando se adicionan los
extractos al inicio del proceso y a mitad del proceso de fermentacin.
Cuando se adiciona cualquiera de los extractos a ambas concentraciones (7%
y 3,5%) al inicio del proceso la velocidad de consumo de lactosa es ms rpido
durante la primera fase de la fermentacin. Luego, como consecuencia, la produccin
de cido lctico se muestra levemente mayor comparado con la curva del control a
partir de las 2 horas aproximadamente. Sin embargo no necesariamente la rapidez
en el proceso tiene relacin con la obtencin de un producto de calidad (Romero,
2007).
Adems, se observa que al adicionar los extractos a mitad del proceso de
fermentacin no hay diferencias al compararse con el control, presentando curvas muy
semejantes.
Estos resultados se pueden atribuir a que la actividad de las bacterias acido
lacticas puede ser estimulada por productos basados en levaduras que contienen
enzimas y nutrientes que estas necesitan. (Gunther, 1995).
La cintica acelerada, observada en los procesos, tambin se puede deber a
que los lactobacilos en general requieren de vitaminas como por ejemplo piridoxina,
tiamina, riboflavina, biotina, cido flico y cido nicotnico, y tambin aminocidos
(Spreer y Sutherland, 1991) presentes por ejemplo en gran cantidad principalmente en
el extracto lquido provenientes de la autlisis celular de la levadura.
Adems, segn Garret (1930) un buen suministro de nitrgeno debe estar
presente como alimento para las bacterias ya que este contribuye a que puedan
multiplicarse y acidificar a un ritmo rpido.

3.4.1. Rendimiento de los procesos de fermentacin

La tabla 3.4. muestra el resumen de los rendimientos obtenidos en todos los


procesos fermentativos.

Tipo de
hidrolizado
adicionado

Porcentaje de adicin

Factor de Rendimiento
Y p/s

0,3

30

0,26

26

0,29

29

0,23

23

0,3

30

0,26

26

0,29

29

0,25

25

0,26

26

0,26

26

0,26

26

0,26

26

0,23

23

7% al inicio del proceso


7% a mitad del proceso
Extracto lquido

3,5% al inicio del proceso


3,5% a mitad del proceso
7% al inicio del proceso
7% a mitad del proceso

Extracto completo

3,5% al inicio del proceso


3,5% a mitad del proceso
7% al inicio del proceso
7% a mitad del proceso

Extracto slido
3,5% al inicio del proceso
3,5% a mitad del proceso
Sin Hidrolizado

Control

Tabla 3.4. Rendimientos de la fermentacin lctica


Para obtener el rendimiento de los procesos de fermentacin, stos, se
consideraron como proceso homofermentativo. El cual, de forma general, indica que 1
molcula de lactosa produce 4 molculas de cido lctico:

Yp/s terico = 1,04 [g cido lctico / g lactosa]


Rendimiento terico =104%

El Yp/s terico supone que toda la lactosa es convertida en cido lctico. Al


comparar el Yp/s terico con los resultados obtenidos, el mayor porcentaje obtenido es
de un 30% de lactosa convertido en cido lctico. A diferencia del control, que fue de
un 23%. Por lo tanto, la adicin de extracto lquido y del extracto lquido y slido en
conjunto del hidrolizado aumenta un 7% aproximadamente la conversin de lactosa a
cido lctico al compararse con el control.
En la tabla 3.4 resumen se observa, que los mayores rendimientos se
presentan cuando se adiciona 7% de extracto lquido y 7% del extracto completo de
hidrolizado al inicio del proceso.
Adems, de acuerdo a la IDF (International Dairy Federation), el mnimo de
acidez al trmino de la incubacin debe ser de 0,7 g de cido ltico por 100 g de
yogurt (Rasic y Kurman,1983) y en todos los procesos con adicin de extractos se
obtuvo aproximadamente 1 g de cido ltico por 100 g de yogurt.
3.5. Determinacin de protena total en el yogurt
El porcentaje de protena total se determin en la muestra obtenida de la
fermentacin con un 7 % de extracto lquido de hidrolizado al inicio del proceso y en
una muestra control sin adicin de ningn extracto. El anlisis se realiz en triplicado y
los resultados se presentan en la siguiente tabla:
En este caso, para obtener el contenido de protena bruta a partir del N total se
us el factor de conversin 6,38, que representa el contenido promedio de nitrgeno
Control

Muestra
g de muestra

4,6101

4,6363

4,6181

4,6145

4,6241

4,6186

% N total

0,6

0,6

0,6

0,5

0,5

0,5

% Protena
3,83
3,83
3,83
3,19
3,19
Promedio %
3,83
3,19
Protena
Tabla 3.5. Porcentaje total de Nitrgeno y Protena en yogurt.
en la molcula de protena para alimentos como leche y sus derivados.

3,19

Los yogurt comerciales declaran entre un 3,5 y 4 % de protena total en su


etiquetado y los resultados obtenidos muestran una diferencia cercana al 6% entre la
muestra con adicin de extracto lquido del hidrolizado comparado con el control sin
extracto. Este aumento del porcentaje de protenas en la muestra se debe claramente
a la alta cantidad de protena total presente en el extracto adicionado.
3.6. Determinacin de vitaminas
La tabla 3.6 muestra los resultados obtenidos del anlisis de vitaminas en la
muestra obtenida de la fermentacin con un 7 % de extracto lquido de hidrolizado al
inicio del proceso y en una muestra control sin adicin de ningn extracto.

Vitamina

mg de vit./100 g muestra

B1 Tiamina
B2 Riboflavina
B3 Niacina

0,162
0,14
No detectado

mg de vit./100 g yogurt comercial


(Schmidt-Hebbel y cols., 1992)
0,04
0,23
-

Los resultados de la muestra, se encuentran dentro de los mrgenes


esperados si se comparan con la tabla de composicin qumica de alimentos chilenos,
a pesar, de existir un aumento de en el contenido de tiamina.

3.7 Evaluacin sensorial

En la tabla 3.6. se presentan los resultados promedios de los puntajes


obtenidos en la evaluacin sensorial con el test de diferencias contra control.
Set

Muestra

Color Aroma Consistencia Salado Acidez Residual

D (control escondido)

0,1 a

-0,6 a

0,7 a

-0,9 a

0,6 a

0,3 a

A (con 3,5% de
adicin extracto lquido)

1,3 d

1,9 d

-2,4 d

1,7 d

2,4 d

3,1 d

J (con 7% de adicin
extracto lquido)

1,3 d

2,6 d

-2,3 d

2,1 d

2,4 d

3,0 d

M (con 7% de adicin
todo el extracto)

0,1 c

2,4 u

-1,0 c

2,7 c

2,0 c

1,9 c

-0,1 c

-0,4 a

0,4 a

0,1 a

-0,4 a

0,1 a

-0,1 c

1,6 v

-1,6 c

2,6 c

-0,4 a

1,6 c

0,4 a

-0,3 a

-0,1 a

-0,1 a

0,3 a

-0,4 a

3,0 e

3,0 e

-3,4 e

3,4 e

2,3 e

3,1 e

2,6 e

2,4 e

-2,9 e

2,9 e

2,4 e

3,7 e

H (control escondido)
2
F (con 3,5% de
adicin todo el extracto)

B (control escondido)

L (con 7% de adicin
extracto slido)
X (con 3,5% de
adicin extracto slido)

Tabla 3.6. Subndices por set en la misma columna y con letra distinta, representan
diferencias estadsticamente significativas entre muestras (P<0.05)

En la tabla resumen de diferencias entre muestras y control se observa que:

El color en las muestras L y X representan la mayor de diferencia con el control


y se identificaron en el rango de algo ms oscuras que el control. En cambio, para las
dems muestras la calificacin fue igual y muy cercana al color del control. La
intensidad del aroma en todas las muestras fue identificada como algo ms intenso
que el control. La consistencia disminuy en las muestras ya que todas se identificaron
como algo ms liquidas que el control. La acidez se indic como algo ms acido que el
control.
El gusto a salado fue calificado como algo ms salado que el control. Esta
caracterstica a diferencia de las otras fue indicada como una nota de desagrado en la
mayora de los jueces, debido a que al final del test al responder que muestra
preferan siempre indicaron que el control, respondiendo que esta decisin se deba a
la nota salada existente de las dems muestras. Esta nota se puede deber al

llamado quinto sabor. Los humanos sienten cinco cualidades de gusto: dulce, salado,
amargo, cido y el sabroso, llamado tambin umami descubierto por investigadores

japoneses, y del cual se sabe que existe una sinergia entre este, dado por el
extracto de levadura principalmente y los nucletidos derivados del proceso de
autolisis celular y el sabor salado, dado por la sal cloruro de sodio (Biorigin, 2009).
Finalmente la intensidad del sabor residual se calific como algo ms intenso y
mucho ms intenso que el control. La diferencia e intensidad de esta caracterstica se
puede atribuir principalmente a la nota salada presente en las muestras proveniente
del extracto adicionado. La cual, en el caso del extracto slido, se puede eliminar al

tratar el extracto con lavados, previos, a la adicin a la fermentacin lctica.


El

anlisis

de

varianza

para

muestras

indica

que

las

diferencias

estadsticamente significativas para la mayora de las caractersticas se presentaron


principalmente entre las muestras con adicin de extractos y el control, pero no entre
las mismas nuestras.
El anlisis de varianza para jueces indic que en los sets solamente existi
diferencia estadsticamente significativa (p-value < 0,05)

en la

caracterstica de

acidez, por lo tanto, esta no es una caracterstica a considerar para conclusiones

finales, a diferencia, del color, intensidad del aroma, consistencia, gusto salado, e
intensidad del sabor residual que no presentaron diferencias estadsticamente
significativas entre jueces.

Captulo IV
CONCLUSIONES

El trabajo presentado permiti establecer que la obtencin de hidrolizados de

Saccharomyces cerevisiae aplicando temperatura por un tiempo definido y luego, su


adicin al proceso de fermentacin lctica para obtener yogurt, produce cambios
favorables en el proceso mismo y mejoras en el producto.

El proceso de autlisis celular para la obtencin de hidrolizados a 30, 35, 40

45 y 50 C mostr, que a mayor temperatura el N solubilizado al medio aumenta, por


lo tanto, el porcentaje de hidrlisis tambin. Obtenindose el porcentaje ms alto de
hidrlisis a 45 C por 72 horas.

No se presentaron diferencias entre la adicin de extracto lquido, el extracto

completo y el extracto slido del hidrolizado a la fermentacin lctica. Pero si existieron


diferencias al adicionar los extractos al inicio y a mitad del proceso de fermentacin.

Los mayores rendimientos (Yp/s), que da cuenta de la produccin de cido

lctico, se obtuvieron con la adicin de 7 % de extracto lquido y con la adicin de 7 %


del extracto completo al inicio de la fermentacin.

La adicin de estos extractos aumento un 7 % la conversin de lactosa en cido

lctico comparado con el control sin adicin de extractos.

El producto obtenido en la fermentacin con 7% de extracto lquido contiene un

6% ms de protena total que el control y un aumento en el contenido tiamina.

Finalmente, en todas las caractersticas evaluadas en test de diferencias contra

control, las muestras con adicin de extractos, mostraron diferencias estadsticamente


significativas comparadas con el control. Adems los jueces identificaron una nota
salada y desagradable en las muestras con adicin de extractos.

Captulo VI
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Anexo 1

Extracto
lquido

Extracto
slido

Hidrolizado
obtenido a 50 C

Hidrolizado
obtenido a 45 C

Hidrolizado
obtenido a 40 C

Anexo 2
Mtodo Kjeldahl

Pesar en balanza analtica una cantidad una cantidad adecuada de muestra

para la sensibilidad del mtodo.

Introducir la muestra en un tubo de mineralizacin.

Agregar bajo campana, un mezcla mineral constituida por 0,6 g de CuSO4 y 12

g K2SO4 y ml de H2SO4 conc. , con probeta.

Colocar e tubo en el equipo de digestin trmica con arrastre y eliminacin de

vapor de SO2 y dejar reaccionar hasta que la solucin se vuelva completamente


transparente.

Una vez terminada la digestin, enfriar el tubo y agregar 1 ml de fenolftalena y

llevar al equipo destilador Bchi.

Agregar cantidad suficiente de NaOH al 30%.

Durante la destilacin recolectar los vapores de NH3 a la salida del destilador,

en un matraz de 500 ml que contenga 50 ml H2SO4 de concentracin conocida (0,1N)


y al cual se le agregaron 2-5 gotas de indicador rojo de metilo.

Valorar el excedente de acido con NaOH 0,1 N (viraje de rosado a amarillo) y

determinar los mg de N reaccionantes y luego el % de protena como sigue:


Mg N = (V1 X N1 V2 X N2 ) X 14

Donde:
V1 y N1 : Volumen y normalidad del H2SO4
V2 y N2 : Volumen y normalidad del NaOH
14: peso atmico del N
f: factor de conversin 6,25 para levadura y 6,38 para lcteos
% Protena = (mg N x f x 100) / peso muestra
Anexo 2

Anexo 3

Test de diferencias contra control (Muestra leche fermentada)

Nombre: ______________________________ Fecha: ________

Set: _________

Instrucciones:

Debe evaluar las muestras de izquierda a derecha.


Debe evaluar el control antes de cada muestra.
Califique el grado y direccin de diferencia con el control en cada atributo.

Muestra x con respecto al control:


Color:
-5

-4

-3

Mucho
ms
claro

-2

-1

Algo
ms
claro

Igual al
control

Algo
ms
oscuro

5
Mucho
ms
oscuro

Intensidad de Aroma:
-5

-4

-3

Mucho
menos
intenso

-2

-1

Algo
menos
intenso

Igual al
control

Algo
ms
intenso

5
Mucho
ms
intenso

Tome la muestra con la cuchara


Consistencia:
-5
Mucho
ms
liquido

-4

-3

-2
Algo
ms
liquido

-1

0
Igual al
control

2
Algo
ms
firme

5
Mucho
ms
firme

Ahora por favor pruebe la muestra.


Gusto a salado:
-5

-4

-3

Mucho
menos
salado

-2

-1

Algo
menos
salado

Igual al
control

Algo
ms
salado

5
Mucho
ms
salado

Acidez:
-5

-4

-3

Mucho
menos
acido

-2

-1

Algo
menos
acido

Igual al
control

Algo
ms
acido

5
Mucho
ms
acido

Intensidad sabor residual:


-5

-4

-3

Mucho
menos
intenso

-2

-1

Algo
menos
intenso

0
Igual al
control

2
Algo
ms
intenso

5
Mucho
ms
intenso

Indique cual presenta mejor calidad:


Control____________
Muestra ___________
Justifique brevemente, por qu?
:_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________

Anexo 4
Autlisis a 30C
Tiempo h

mL de NaOH 0,1N

mg amino N /L

% hidrlisis

5,6

313,6

12

6,3

352,8

4,5

24

392

48

7,9

442,4

5,3

60

8,65

484,4

6,2

72

9,85

551,6

96

11,5

644,3

8,2

120

12,5

699,3

8,9

Autlisis a 35C
Tiempo h

mL de NaOH 0,1N

mg amino N /L

% hidrlisis

7,3

408,8

5,2

12

8,5

476

6,1

24

10,1

565,6

7,2

48

12,3

688,8

8,8

60

14,5

812

10,3

72

15,8

884,8

11,3

96

17,9

1005,7

12,8

120

18,9

1060,7

13,5

Autlisis a 40C
Tiempo h

mL de NaOH 0,1N

mg amino N /L

% hidrlisis

9,15

512,4

6,5

12

10

560

7,1

24

12,5

700

8,9

48

14

784

10

60

17,6

985,6

12,5

72

19,1

1069,6

13,6

96

21,5

1202

15,3

120

22,7

1273

16,2

Autlisis a 45C
Tiempo h

mL de NaOH 0,1N

mg amino N /L

% hidrolisis

9,8

548,8

12

12,7

711,2

24

17,8

996,8

12,7

48

22,1

1237,6

15,7

60

23

1288

16,4

72

25

1400

17,8

96

25

1400

17,8

120

25

1400

17,8

Autlisis a 50C
Tiempo h

mL de NaOH 0,1N

mg amino N /L

% hidrlisis

13,9

778,4

9,9

12

14,5

812

10,3

24

19

1064

13,5

48

20

1120

14,2

60

21,8

1220,8

15,5

72

23,6

1321,6

16,8

96

24,3

1359

17,3

120

24,3

1359

17,3

Anexo 5
Cintica de fermentacin con adicin de extracto lquido del hidrolizado.
g lactosa/ml de muestra
tiempo h

g cido lctico/ml de muestra


D

0,06

0,06

0,06

0,06

0,06 0,0046 0,0046 0,0046 0,0046 0,0046

0,053

0,058

0,054

0,058

0,058 0,0049 0,0047 0,0049 0,0048 0,0046

0,049

0,053

0,049

0,053

0,052 0,0056 0,0055 0,0054 0,0056 0,0055

0,044

0,046

0,045

0,045

0,046 0,0079 0,0069 0,0077 0,0069 0,0071

0,04

0,042

0,041

0,042

0,042

0,039

0,04

0,04

0,041

0,038

0,039

0,039

0,039

0,009 0,0086 0,0088 0,0088 0,0082

0,04 0,0093 0,0091 0,0091 0,0091 0,0089


0,039 0,0105 0,0099

0,01 0,0093 0,0093

Cintica de fermentacin con adicin de extracto completo del hidrolizado.


g lactosa/ml de muestra
tiempo h

g cido lctico/ml de muestra


D

0,06

0,06

0,06

0,06

0,06 0,0046 0,0046 0,0046 0,0046 0,0046

0,053

0,058

0,053

0,057

0,058 0,0048 0,0046 0,0047 0,0047 0,0046

0,048

0,053

0,049

0,053

0,052 0,0057 0,0056 0,0055 0,0056 0,0055

0,044

0,046

0,045

0,047

0,046 0,0079

0,041

0,042

0,041

0,042

0,042

0,04

0,041

0,04

0,04

0,038

0,039

0,039

0,038

0,007 0,0075 0,0069 0,0071

0,009 0,0088 0,0089 0,0089 0,0082

0,04 0,0095 0,0091 0,0095 0,0094 0,0089


0,039 0,0104 0,0098

0,01 0,0101 0,0093

Cintica de fermentacin con adicin de extracto slido del hidrolizado.


g lactosa/ml de muestra
tiempo h

g cido lctico/ml de muestra


D

0,06

0,06

0,06

0,06

0,06 0,0046 0,0046 0,0046 0,0046 0,0046

0,052

0,058

0,053

0,057

0,058 0,0053 0,0049 0,0051 0,0047 0,0046

0,049

0,053

0,05

0,054

0,052 0,0069 0,0056 0,0067 0,0054 0,0055

0,046

0,047

0,046

0,047

0,046 0,0078 0,0069 0,0076 0,0069 0,0071

0,041

0,042

0,042

0,042

0,042 0,0088 0,0087 0,0087 0,0087 0,0082

0,04

0,04

0,04

0,041

0,04 0,0093 0,0093 0,0092 0,0091 0,0089

0,038

0,039

0,039

0,039

0,039

0,01 0,0101 0,0099 0,0099 0,0093