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EVALUACION DE LA CONTAMINACION EN MEDIOS DE MADURACION,

FERTILIZACION Y CRECIMIENTO EMBRIONARIO DE BOVINOS DE


ALTURA CULTIVADOS IN VITRO
Evaluation of the contamination in media for maturation, fertilization and growing
of high altitude bovine embryos cultured in vitro
Delgado, P. 1* Parisaca, V.2 Delgado, E.Jh.3
Profesor Investigador Reproduccin Animal Medicina Veterinaria y ZootecniaUniversidad Pblica de El Alto. Bolivia.
2
Investigador Independiente, trabajo de tesis en Reproduccin Animal MVZ-B-UCB.
3
Auxiliar Investigador en Reproduccin Animal IZIP - UPEA. El Alto, Bolivia.
1

RESUMEN
Para determinar la contaminacin en medios de maduracin, fertilizacin y crecimiento de
Oocitos y Embriones de bovinos de altura (OyEba), se cultiv In vitro 2000 OyEba, en 96
soluciones de maduracin, fertilizacin y crecimiento de OyEba preparadas para el periodo
experimental. Se determin la presencia, especies, cantidad de microorganismos (en UFCs
(utilizando medios de cultivo microbiano PCA y Saboraund)) y antimicrobianos para el control
de estos. La presencia de hongos y bacterias fue de 38% y 100% respectivamente en el total de
las soluciones preparadas. Los hongos identificados fueron Candida albicans y Aspergillus ssp.
Adems de la bacteria Enterobacter agglomerans. La cantidad UFCs a las 0h de unin de los
Oocitos con los medios de cultivo M-199 o IVF, suplementados con 0, 10, 15 y 20% de suero
sanguneo bovino (SSB) fueron de 3, 1.5, 2.5 y 12.7x103 UFCs para el medio M-199 y 1.5, 3.5,
23.65 y 18.35 x103 UFCs para el medio IVF. La cantidad de UFCs a las 28h Post-cultivo de los
OyEba con los medios de cultivo M-199 e IVF, suplementados con 0, 10, 15 y 20% de SSB, fue
de 628.5 x103 UFCs en promedio para 0, 10 y 15% de suplementacin de SSB y de 1895x103
para M-199 y 2460 x103 para IVF con 20% de suplementacin de SSB. La mayor contaminacin
fue con el medio IVF. La cefalexina y cloranfenicol en antibiograma demostr control de la
bacteria Enterobacter agglomerans que es resistente a la gentamicina. La limpieza deficiente de
los ovarios colectados en el matadero, parece ser el medio de contaminacin principal, para la
presencia alta de microorganismos a las 0h. Debera optarse por otros antimicrobianos para el
control ms eficiente de microorganismos. Finalmente, es necesaria una limpieza ms profunda
del ambiente de manipulacin y cultivo de OyEba.
Palabras clave: oocitos bovinos, M199, IVF, Contaminacin, microorganismos
______
Contacto oficial:
*Responsable de investigacin: Cel.: 591-75832062
E-mail addressa: pedro.delgado@fulbrightmail.org
Autor de la investigacin: Cel.: 591-76260674
E-mail addressb: cinthia_dpd@hotmail.com

Abstract
In order to determine the contamination of media for maturation, fertilization and growing of
oocytes and embryos of high altitude bovines (OaEab), it was in-vitro cultured 2000 OaEab,
preparing 96 media for maturation, fertilization and growing of OaEab prepared for all
experiment. It was determined the presence, species, quantity of microorganism (UFCs) and
antibiotics for control of found microorganisms. The presence of fungus and bacteria was 38% y
100% respectively in the total of prepared media. The indentified fungus were Candida albicans
and Aspergillus ssp. Also, the identified bacteria was Enterobacter agglomerans. The quantity
of UFCs at 0h of union between oocytes and M-199 or IVF media supplemented with 0, 10, 15
and 20% of bovine blood serum. (BBS) were 3, 1.5, 2.5 and 12.7x103 UFCs for M-199 y 1.5, 3.5,
23.65 and 18.35 x103 UFCs for IVF. The quantity of UFCs at 28h post-culture of OaEab and M199 or IVF media supplemented with 0, 10, 15 and 20% of BBS were 628.5 x103 UFCs in average
for 0, 10 and 15% of supplementation of BBS, and 1895x103 for M-199 and 2460 x103 for IVF
with 20% of supplementation of BBS. The most contaminated media was IVF. The cefalexin and
cloranfenicol showed control of Enterobacter agglomerans, but, this bacterium is resistant to
gentamicin. The poor cleaning of slaughterhouse collected ovaries seems to be the principal
source of contamination for the high presence of microorganisms at 0h. It should be better to use
another antibiotics in order to control microorganisms more efficiently. Finally, a deep cleaning
of manipulation and culture OaEab environment should be done.
Key words: Bovine oocytes, M199, IVF, Contamination, microorganism.
1.

Introduccin

La crianza de bovinos de carne y leche se ha incrementado en Bolivia estos ltimos aos, es as


que la ciencia ha desarrollado nuevas alternativas de mejora en la produccin animal de esta
especie, de la misma manera se ha tecnificado la reproduccin animal en diferentes mbitos como,
la sincronizacin de celo, inseminacin artificial, transferencia de embriones y produccin in vitro
de embriones.
La fertilizacin in vitro ha logrado un importante progreso en las tecnologas de fecundacin en
el ganado bovino pero a pesar de haber obtenido gestaciones, an es baja la tasa de desarrollo de
los oocitos madurados y fecundados in vitro. Por lo que se pretende determinar los factores que
afectan la produccin embrionaria in vitro en los laboratorios que se dedican a esta actividad
cientfica, sobre todo en el medio de cultivo en los cuales afecta de sobremanera la contaminacin
por microorganismos. Por tal razn se determinaron los siguientes objetivos especficos:
primeramente, Determinar la presencia de microorganismos en medios de cultivo in vitro para
oocitos y embriones de Bovinos de altura, segundo: Determinar la cantidad de unidades
formadoras de colonias (UFCs) en medios de cultivo in vitro para oocitos y embriones de Bovinos
de altura. Y por ltimo: Evaluar el efecto de diferentes antimicrobianos sobre el control de
microorganismos encontrados en medios de cultivo in vitro.
2.

Materiales y mtodos

El presente trabajo de investigacin se realiz en el laboratorio de Reproduccin animal de la


UAC-T-UCB donde se cultivaron los ovocitos y embriones y se prepararon medios de cultivo;
tanto para la maduracin de ovocitos (M199 e IVF) y para la fertilizacin de estos las cantidades
de insumos para el preparado de estos medios se muestra en el siguiente cuadro:
Cuadro 1. Cantidad de insumos para la preparacin de la Solucin de stock de M-199 para
medio de maduracin in vitro
Cantidad
1000ml
9.6g
20 ul/50ml de solucin

Descripcin
Agua tridestilada
M-199
Solucin de Gentamicina

Cuadro 2. Cantidad de insumos para la preparacin de la Solucin de stock de IVF para


medio de fertilizacin in vitro.
Cantidad
50ml
2ml
73ul
0.25ml
150ml
60ul
120ul
5ul

Descripcin
Solucin de sales para IVF
Solucin de 5.25% de bicarbonato de sodio
Lactato de sodio al 60%
Gentamicina
Albumina serica Bovina (BSA)
Solucin de 0.2mg de Heparina
Solucin de gonadotrofina corionica equina (eCG)
Estrgeno

Obtencin de oocitos Bovinos.


La obtencin de oocitos se realiz de ovarios provenientes de vacas sacrificadas en el Matadero
Municipal de El Alto, por los mtodos de aspiracin y slicing o corte seriado. La seleccin de
oocitos, la aspiracin del complejo ovulo cumular se realiz con la ayuda de un
estereomicrocopio, cajas petri de 12cm y micropipetas, posteriormente se procedi a contar los
oocitos obtenidos por los dos mtodos y fueron cultivados en medios de maduracin M-199 e
IVF adicionados con 0, 10, 15 20% de suero sanguneo bovino.
Evaluacin de maduracin nuclear de oocitos
Se realiz posterior a una tincin de orceina y con la ayuda de un estereomicroscopio se evalu
distinguiendo la fase de divisin meiotica como la observacin del cuerpo polar y el uso
acromtico correspondiente a la metafase II.
Fertilizacin in vitro
Para esto, se utiliz semen congelado de bovino, proveniente del centro CUNA-Tiahuanacu. El
semen fue agregado cuando los oocitos cumplieron 30hrs de maduracin en los medios de M-199
e IVF que estaban adicionados con 0, 10, 15, y 20% de suero sanguneo bovino.

Evaluacin de la contaminacin bacteriana


Se realiz una evaluacin de la contaminacin en el proceso de desarrollo de oocitos y embriones
cultivados, utilizando los diferentes medios (Agar para recuento en placas PCA y Saboraund),
mtodos y tcnicas de evaluacin bacteriolgica como frotis, tincin gram, cultivos de muestras
y colonias, y su correspondiente lectura macroscpica de colonias. Tambin se mand a realizar
un examen microbiolgico al laboratorio SELADIS-LA PAZ para confirmacin de la
identificacin de los microorganismos presentes en estos medios de cultivo. Adems, se pidi
tambin un antibiograma para determinar la sensibilidad y resistencia microbiana.
3 Resultados y Discusin
3.1 Determinacin de la presencia de microorganismos en medio de cultivo In vitro para
oocitos y embriones de bovinos de altura
Se encontr dos diferentes microorganismos como; hongos Aspergillus ssp y Candida albicans y
bacterias como la Enterobacter agglomerans.
La presencia de hongos y bacterias fue de 38% y 100% respectivamente en el total de las
soluciones preparadas. Los hongos identificados fueron Candida albicans y Aspergillus ssp.
Adems de la bacteria Enterobacter agglomerans.
Fotografia 1. Oocito maduro limpio

Fotografia 2. Oocito maduro contaminado

3.2 Determinacin la cantidad de unidades formadoras de colonias (UFCs) en medios de


cultivo in vitro para ooocitos y embriones de Bovinos de altura
Para una mejor evaluacin se tom la muestras del los cultivos para produccin embrionaria M199 e IVF adicionados con diferentes cantidades de suero sanguneo antes del cultivo de oocitos
al cual se denomino 0hrs. Adems de tomar muestras a las 28hrs del cultivo.
La cantidad UFCs a las 0h de unin de los Oocitos con los medios de cultivo M-199 o IVF,
suplementados con 0, 10, 15 y 20% de suero sanguneo bovino (SSB) fueron de 3, 1.5, 2.5 y
12.7x103 UFCs para el medio M-199 y 1.5, 3.5, 23.65 y 18.35 x103 UFCs para el medio IVF. La
cantidad de UFCs a las 28h Post-cultivo de los OyEba con los medios de cultivo M-199 e IVF,
suplementados con 0, 10, 15 y 20% de SSB, fue de 628.5 x103 UFCs en promedio para 0, 10 y

15% de suplementacin de SSB y de 1895x103 para M-199 y 2460 x103 para IVF con 20% de
suplementacin de SSB. La mayor contaminacin fue con el medio IVF.
Fotografia 3. Cultivo de microorganismos

Fotografia 4. Cultivo de Microorganismos


listo para evaluacin

3.3 Evaluar el efecto de diferentes antimicrobianos sobre el control de microorganismos


encontrados en medios de cultivo in vitro
Respuesta emitida a un examen de antibiograma (Lab. SELADIS)
Identificacin: Enterobacter agglomerans
Sensible
Cefalexina
Cloranfenicol

Resistente
Sulfa Trimetropin
Tetraciclina
Ampicilina/Sulbactam
Cefotaxima
Ciprifloxacina
Ampicilina
Gentamicina

Fotografia 5. Evaluacin de halo de sensibilidad por antibiograma, al cultivo de Enterobacter


agglomerans

4. Conclusiones
La limpieza deficiente de los ovarios colectados en el matadero, parece ser el medio de
contaminacin principal para la presencia alta de microorganismos a las 0h. El suero sanguneo
es una fuente de nutrientes ptima para el desarrollo de bacterias y hongos y ms an a altas

concentraciones, por lo que ayudan a la incrementacin de la cantidad de unidades formadoras de


colonias (UFCs).
El antibiograma realizado indica que la bacteria Enterobacter agglomerans es resistente a la
Gentamicina pero sensible al Cloranfenicol y cefalexina. Lo que indicara que los protocolos
estandarizados en otros pases utilizando Gentamicina no se adecuaran para medios de
produccin embrionaria por su baja capacidad de control de microorganismos adems de
encontrar en algunos reportes bibliogrficos que este antibitico posiblemente inhiba la actividad
con otras sustancias en cultivos In vitro. En sntesis, debera optarse por otros antimicrobianos
para el control ms eficiente de microorganismos. Finalmente, es necesaria una limpieza ms
profunda del ambiente de manipulacin y cultivo de OyEba.
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