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VIABILIDAD DE ESPERMATOZOIDES DE LLAMA (Lama glama) REFRIGERADOS DURANTE DIEZ DIAS EN CUATRO DILUTORES

Viability of llama (Lama glama) Spermatozoa refrigerated during ten days in four semen expanders

Delgado, P.A. *1 Santalla, I.S. 2

1 Profesor Investigador Reproducción Animal “Medicina Veterinaria y Zootecnia-Universidad Pública de El Alto”. Bolivia. 2 Investigador Independiente, trabajo de tesis en Reproducción Animal “INZ-T-UCB”.

RESUMEN

La poca concentración de espermatozoides en el semen de llamas hace de que se necesite de nuevos procedimientos de manipulación de este material genético sin afectar a sus características, para darle la mayor eficiencia posible a los eyaculados de animales de alta calidad genética que apenas llegan a preñar al 40 % de la población de hembras. Por esta razón se evaluó el efecto de cuatro dilutores (TYG, TGF, CYG y CYF) sobre el tiempo de sobrevivencia espermática y características microscópicas (motilidad y porcentaje de espermatozoides vivos) del semen de llama (Lama glama) conservado en fresco. El trabajo de investigación se realizó en los laboratorios de la carrera de Ingeniería Zootécnica de la UAC-T- UCB Se realizó la colección de 80 muestras de semen de 8 llamas. El dilutor TYG, transcurridas las 120 horas llego a mantener valores mayores al 50% de motilidad espermática y porcentaje de espermatozoides vivos con respecto a los dilutores TYF, CYG y CYF. El semen diluido y conservado en fresco con el dilutor TYG es capaz de mantener viables durante 120 horas para la inseminación artificial, con 51,16 % de motilidad y 59,33 % de vitalidad.

Palabras clave: semen refrigerado, llamas, Tris-yema, motilidad vitalidad espermática. ______ * 1 Responsable de la Investigación. E-mail address * 1 : pedro.delgado@fulbrightmail.org

1.

INTRODUCCIÓN

La manipulación de semen en camélidos sudamericanos tiene grandes inconvenientes, tales como la duración de la cópula (45 minutos en promedio), la posición de cópula (decúbito ventral), la cantidad de eyaculación (1,8 mL en promedio), su extrema viscosidad (característica medida por su filancia o capacidad de estirarse), su poca concentración de espermatozoides(entre 80 a 200 millones por mL). Todo esto hizo que durante varias décadas se investigue una técnica óptima para poder extraer este semen y poder manipular los espermatozoides sin que estos pierdan su capacidad fecundante (Delgado, 2010). Mediante esta investigación se pretende conservar los espermatozoides de la llama, refrigerado a 4º C para prolongar la capacidad fecundante para la inseminación artificial. Por esta razón se diseñó esta investigación con los siguientes objetivos: Evaluar el efecto de cuatro dilutores sobre el tiempo de sobrevivencia espermática y características microscópicas (motilidad y porcentaje de espermatozoides vivos) del semen de llama (Lama glama) conservado en fresco.

2.

MATERIALES Y MÉTODOS

La investigación se realizó en los previos de la Unidad Académica de Tiahuanacu UCB, (17° 35’ a 18° 17’ de Latitud Sur y 68° 20’ a 69° 08’ de Longitud Oeste) a una altura de 3854 msnm. Se utilizaron 8 llamas machos mayores a 3 a 4 años de edad de la raza Q`ara y 2 llamas hembras vacías. Los dilutores se prepararon mediante las siguientes fórmulas:

Tabla 1. Composición de insumos de los diferentes dilutores utilizados

2. MATERIALES Y MÉTODOS La investigación se realizó en los previos de la Unidad Académica de

El pH de los dilutores se ajustó a un pH ligeramente ácido de 6,5.

  • 2.1. Colecta de semen y Pre-dilución del semen con bromelina y conservación a 4 ºC

Para colectar semen se utilizó la técnica desarrollada por Quispe y Delgado (2011), en el cual se estimula por 5 minutos a los machos acercándolos a las hembras winculladas (sujetadas en decumbencia ventral), luego de lo cual se acomoda el maniquí en la parte posterior de la hembra. El tiempo de cópula se desarrolló en un promedio de 15 min. Luego rápidamente se llevó al laboratorio colocándolo en baño maria a 38º C para su posterior evaluación. Para la pre-dilución se utilizó la formulación (de extracto de piña más un dilutor específico) desarrollada por Delgado (2010), para romper la viscosidad del semen de llamas. En una relación de 1:0.75 (1 mL de semen más 750 μL de extracto de piña) todo a 38 ºC, para luego realizar la evaluación de las características microscópicas del semen. Inmediatamente se inició el enfriamiento a 4 ºC en un lapso de 2 hr.

Los tratamientos fueron denominados TYG (Dilutor TRIS-yema Glucosa), TGF (Dilutor TRIS- yema Fructosa), CYG (Dilutor Citrato-yema Glucosa) y CYF (Dilutor Citrato-yema Fuctosa). Las variables medidas fueron la Motilidad espermática (%), Vitalidad espermática (%). Para determinar las diferencias entre tratamientos, se empleó el Diseño Completamente al azar y la prueba de comparación de promedios de DUNCAN a un nivel de significancia del 5% (α=0.05).

  • 3. RESULTADOS Y DISCUSIONES

    • 3.1. Evaluación del efecto de cuatro dilutores sobre el porcentaje de motilidad de espermatozoides de llama (Lama glama) conservado en fresco.

El dilutor TYG mantiene 51,16% de motilidad espermática hasta 120 horas de conservarse en fresco a 4 ºC, mientras el dilutor CYG mantiene una motilidad espermática de 54,50% hasta los 72 horas de conservación en fresco a 4º C, el dilutor TYF llega a mantener 51,33% de motilidad espermática hasta las 72 horas y el dilutor CYF hasta 48 horas de conservado en fresco a 4 ºC llegó a mantener una motilidad 50,60%.

Figura 1. Porcentaje de motilidad de espermatozoides de llama conservados a 4 ºC, en cuatro dilutores (TYG, TYF, CYG y CYF), durante 240 horas.

Figura 1. Porcentaje de motilidad de espermatozoides de llama conservados a 4 ºC, en cuatro dilutores

A * , B * y C * representan la diferencia de promedios de % espermas motiles (Duncan) para cada hora de evaluación.

Martínez et al., (2007), conservó hasta 72 horas semen de caprino a 4 ºC, en los que se encontraron aún mas de 50% motilidad espermática, Raymundo et al., (2006) conservó semen de alpacas a 38 ºC y encontró a las 8 hrs mayor a 50% de motilidad espermática. La motilidad espermática de los espermatozoides de las diferentes especies conservados en fresco no logra superar a 72 horas de conservación más del 50% de motilidad espermática, interesantemente Limachi y Delgado (2013) conservaron espermatozoides de bovinos a 4 ºC durante 240 horas con una motilidad superior a 52,92% utilizando el dilutor Citrato ácido cítrico. Se puede inferir que los espermatozoides de llama tienen como estrategia metabólica para la generación de ATP, la utilización de la glucosa como uno de los sustratos energéticos, el cual sería metabolizado a través de la vía glucolítica y del ciclo de Krebs. Entonces los espermatozoides de llama son capaces de mantenerse durante 120 horas en el dilutor TYG (tris-yema-glucosa) a 4 ºC con una motilidad adecuada para realizar la inseminación artificial.

  • 3.2. Evaluación del efecto de cuatro dilutores sobre porcentaje de espermatozoides vivos de llama (Lama glama) conservado en fresco

El dilutor TYG llego a mantener 53 % de vitalidad espermática hasta 144 horas de refrigeración a 4 ºC, el dilutor TYF mantuvo 54,33% de espermatozoides vivos hasta las 96 horas de conservado.

Figura 2. Porcentaje de vitalidad de espermatozoides de llama conservados a 4 ºC, en cuatro dilutores (TYG, TYF, CYG y CYF), durante 240 horas.

Figura 1. Porcentaje de motilidad de espermatozoides de llama conservados a 4 ºC, en cuatro dilutores

A * , B * y C * representan diferencia de promedios de % de espermas vivos (Duncan) para cada hora de evaluación.

La vitalidad espermática encontrada en otras especies, en base de la motilidad apta para la inseminación artificial, pasada las 72 horas de conservación presenta mayor a 55% de vitalidad en caprinos (Martínez, et al., 2007). Limachi y Delgado (2013), transcurrido las 240 horas de conservación a 4 ºC encontraron 57,34% de espermatozoides vivos de toros, además mencionan que el factor que influye en el descenso de la vitalidad espermática se debe al estrés oxídativo que sufren las membranas celulares de los espermatozoides, con el tiempo aumenta la cantidad de radicales libres de oxígeno en los dilutores de conservación que afectan negativamente a la supervivencia de los espermatozides. Algunos autores como Maxwell y Johnson (1999); Janauskauskas et al., (1996) y Limachi y Delgado (2013) indican que el porcentaje de vitalidad debería ser de 72%. Preponderantemente el % de espermatozoides vivos para la inseminación artificial va juntamente relacionado con el % de espermatozoides motiles, donde deberían estar por encima del 50% de motilidad y mayor al 60% vitalidad, para obtener una eficiente fertilidad.

Los espermatozoides conservados a 4 ºC se mantienen inmóviles debido a que la bicapa lipídica de la membrana celular se solidifica pero siguen su actividad metabólica produciendo ATP en la mitocondria gracias al ciclo de Krebs, a partir de ácido cítrico, fructosa y glucosa. Mediante la oxido-reducción, se forma radicales libres que son responsables de los cambios estructurales y funcionales de los espermatozoides llevándolos a la muerte al final (Sanock y Kurpisz 2004).

  • 4. CONCLUSIONES

El dilutor que mantiene mayor porcentaje de motilidad y vitalidad espermática en refrigeración a 4 ºC, hasta 120 horas, es el TYG (tris-yema-glucosa).

  • 5. BIBLIOGRAFÍA

Delgado, P., 2010. Manual de Procedimientos de laboratorio para colección procesamiento y cultivo in vitro de gametos. 1ra ed La Paz: INZ-T-UCB. Januskauskas, AL; Söderquist, MG; Haard, MC; Haard, N; Rodriguez HV. 1996. Influence of Sperm Number Per Straw on the Post-Thaw Sperm Viability and Fertility of Swedish Red and White A.I. bulls. Vet Scand 14(5):2-27. Limachi, P., Delgado, P. 2013. Viabilidad Espermática del Semen Bovino (Bos taurus L.) Conservado en Fresco con Diferentes Dilutores. Tesis de grado Unidad Académica Campesina de Tiahuanacu, UCB. La Paz Bolivia. Maxwell, W. M., Johnson, L. A. 1999. Physiology of spermatozoa at high dilution rates:

influence of seminal plasma. Theriogenology 52:1353-1362. Martínez, J.L. Hernández, Namibia Díaz, Yiliany Molina, L. Interian, y Dianelys González- Peña. 2007. Un nuevo diluyente para la conservación del semen caprino en estado fresco refrigerado. Centro de Investigación para el Mejoramiento Animal de la Ganadería. Tropical. (CIMAGT). Ave 101 No.6214. Reparto Loma de Tierra, Cotorro, Ciudad Habana.

Quispe, C., Delgado, P., (2011). Rev Inv Zoot. Bolivia. Desarrollo de tres protocolos de colección de semen en llamas (lama glama) en el departamento de la paz -Tesis de grado Universidad Católica Boliviana “San Pablo” UAC – Tiahuanacu. Raymundo Fernando T.1, Wilfredo Huanca L.2, Teodosio Huanca, 2006. Efecto de tres dilutores en la conservación del semen de alpacas rev inv vet perú; 17 (2): 125-130. Sanock, D. y Kurpisz, M., 2004. Reactive oxygen species and sperm cells Reproductive Biology and Endocrinology. 2: 12 - 18.