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Medicina Oral y Medicina Oral s Pathologygy Inhibicin de la inhibicin de la Candida

albicans Candida albicans adherencia adherencia


Efecto de alto peso molecular y del alginato de sodio sobre Candida albicans hidro- phobicity y
adherencia a las clulas
1 Ana Isabel Ascurra 1 1 , Silvina Ruth Barembaum, Mara Alejandra Bojanich 2 , Silvia Edith
Calamares 3 , Javier Aguilar, Luis
4 5 Jos Battellino, Susana Dorronsoro Tereza
(1) Jefe de Trabajos Valore Ctedra de Introduccin a la qumica y fsica Biolgicas de la
Facultad de Odontologa (2) Profesor Con Ctedra de Introduccin a la qumica y fsica
Biolgicas de la Facultad de Odontologa (3) Jefe de Trabajos valore, Instituto de Virologa
Varella, Facultad de Ciencias Mdicas (4) Profesor Titular Ctedra Otra de Qumica de la
Facultad de Odontologa (5) Profesor Titular Ctedra de Introduccin a la qumica y fsica
Biolgicas de la Facultad de Odontologa de la Universidad Nacional de Crdoba, Argentina
Correspondencia:
Dra. Ana Isabel Ascurra Departamento de Biologa Bucal de la Facultad de Odontologa de la
Universidad Nacional de Crdoba.
Haya de la Torre S/N. Ciudad Universitaria, Pabelln 4 postales, 5000-Crdoba, Argentina.
E-mail: azcurra@fcq.unc.edu.ar Ascurra AI, Barembaum SR, Bojanich MA, calamares, Aguilar J,
Battellino LJ, Dorronsoro ST. Efecto del peso molecular alto
Recibido: 6-05-2005 quitosano y alginato de sodio sobre Candida albicans hidrofobicidad y
Aceptado: 4-01-2006 adherencia a las clulas. Med Oral Patol Oral Cir Bucal 2006 ;11:E120-5.
Medicina Oral S. L. C. I. F. B 96689336 - ISSN 1698-6946
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RESUMEN
El objetivo del presente trabajo es evaluar el efecto de alto peso molecular (QAPM) y del
alginato de sodio (NaAL) sobre la hidrofobicidad de la superficie de Candida albicans y
adherencia de la levadura a las clulas epiteliales y fibroblastos de distinto origen.
Para este estudio, una cepa de coleccin y siete cepas de C. albicans de la saliva (pacientes con
estomatitis subprtesis) fueron cultivados en agar glucosado de Sabouraud suplementado con
QAPM o NaAL o en ausencia de los mismos (control). La hidrofobicidad se determin por odo
de adhesi a hidrocarburos utilizando dos medios orgnicos (xileno y cloroformo).
Experimentos de adherencia, las suspensiones acuosas de levaduras se pusieron en contacto
con soluciones de biopolmeros y diversas clulas (fibroblastos humanos y de rata y las clulas
epiteliales Hep-2). La cuantificacin de la adherencia se realiz por microscopa ptica.

Resultados: Se observa un descenso en la hidrofobicidad se observ en la presencia de QAPM


(44%) y de NaAL (82%) cuando chlo- roform fue empleado como medio orgnico, mientras
tanto los descensos fueron del 30% con QAPM y 19% con NaAL en presencia de xileno.
Adherencia de C. albicans a las clulas epiteliales y fibroblastos humanos disminuy
significativamente con ambos biopolmeros. En el caso de ratas los fibroblastos, se observ
una disminucin slo con NaAL. Ninguno de los experimentos mostraron diferencias
significativas asociadas a tipo fibroblasto.
Conclusiones: los biopolmeros mostr eficacia en la reducci de la hidrofobicidad y la
adherencia de C. albicans a las clulas, las cuales son importantes factores de virulencia
relacionados a la colonizacin de los tejidos blandos del host o acrlico superficies orales
presentes en el sistema.
Palabras clave: Candida albicans, el chitosn, alginato, la adherencia, hidrofobicidad.
RESUMEN
Objetivo: "evaluar" el efecto del quitosn de alto peso molecular (QAPM) y del alginato de
sodio (NaAL) sobre la hidrofobi- cidad superficial de Candida albicans y la adhesin de esta la
levadura un relato epiteliales y fibroblastos de distinto origen.
Diseo del estudio: Para el estudio de la hidrofobicidad, las levaduras (n= 7) se hicieron crecer
en agar glucosado de Sabouraud suplementado con QAPM o NaAL o en ausencia de los
mismos (controles). La determinacin de la hidrofo- bicidad se realiz por el mtodo de
adhesin a hidrocarburos utilizando dos solventes orgnicos (xileno y cloroformo).
En los estudios de adhesin, las levaduras se pusieron en contacto con soluciones de
biopolmeros y luego se enfrenE120
Medicina Oral S. L. Email: medicina@medicinaoral.com

Med Oral Patol Oral Cir Bucal 2006; Med Oral Patol Oral Cir Bucal 2006 ;11:E120-5. 11:E120-5.
Inhibicin de la inhibicin de Candida albicans Candida albicans adherencia adherencia

Medicina Bucal y Medicina Oral s Pathologygy Inhibicin de la inhibicin de Candida albicans


Candida albicans adherencia adherencia Med Oral Patol Oral Cir Bucal 2006; Med Oral Patol
Oral Cir Bucal 2006 ;11:E120-5. 11:E120-5. Inhibicin de la inhibicin de Candida albicans
Candida albicans adherencia adherencia
taron un relato diferentes (fibroblastos humanos y de rata y relato epiteliales Hep-2). La
cuantificacin se realiz por edificio ptica.

Resultados: Se observ una disminucin han colaborado del 44% de la hidrofobicidad en


presencia de QAPM y del 82 %, con NaAL, o del 30% con QAPM y 19% con NaAL, cuando los
solventes orgnicos empleados fueron cloroformo o xileno, positi- vamente. La adhesin de C.
albicans un relato epiteliales y fibroblastos humanos disminuy significativamente con ambos
biopolmeros. En el caso de los fibroblastos de enca de rata, slo se observ una disminucin
han colaborado con NaAL. En ninguno de los Institut Valenci d'se observaron diferencias
significativas en asociacin al tipo de fibroblasto empleado.
Conclusiones: Los biopolmeros resultaron efectivos" en la reduccin de la hidrofobicidad y la
adhesin de C. albicans un relato, las cuales son importantes factores de virulencia
relacionados con la finca de los tejidos blandos del hospedador o superficies acrlicas se
presenta en el sistema estomatogntico.
Palabras clave: Candida albicans, quitosn, alginato, adhesin, hidrofobicidad.
INTRODUCCIN terapia anti-inflamatoria por un perodo de 7 a 10 das antes de la aparicin de
nuevos materiales en odontologa, as como para el recuerdo de la muestra se incluy en el
juicio. Para la prevencin como para el tratamiento de las enfermedades bucales, cepa aislada
ha aumentado, en la saliva se sembraron en agar Sabouraud glucosa en los ltimos aos. Entre
ellos, alto molecular (SGA) suplementado con 1% realiz (Britania, (QAPM), polmeros
catinicos derivados de la quitina, se utiliza como Argentina). Todos los aislamientos se
identificaron bioqumicamente por un vehculo de entrega de medicamentos, con propiedades
osteoconducting pruebas (Candifast, internacionales y favoreciendo los fibroblastos
proliferacin (1-4). Alginato de Sodio Microbio, Francia) y fue completada por mi- (NaAL),
copolmero aninico, dental se emplea para im- cromorphological estudio sobre agar harina de
maz y sion germinativo (5,6 ). Adems, ambos materiales biocompatibles, produccin de
tubos se utilizan (15).
en aplicaciones biomdicas. Preparacin de la levadura de la hidrofobicidad de la superficie
celular de estomatitis subprtesis, causada principalmente por C. albicans, puede ser (CSH) en
un alto porcentaje de poblacin dental despus de la deteccin de las cepas, la levadura ha
sido cultivado en prtesis 24-48 h (7,8 ). El desarrollo de la infeccin depende 37 OC en SGA
sin polmero (control) y en los medios de comunicacin en muchos factores, como tipo
interaccin protena - protena suplementados con QAPM 0,05 g% (90% deacetilado, 280 entre
Candida y las clulas del husped, la morfologa de la levadura (blas de cps, MW 300 kDa,
Unifarma Argentina) y 0,2 g% NaAL toconidia o micelio) y el estado inmunolgico de la (420
cps, Kimitsu, Chile). Dichas concentraciones host (9). La posibilidad de adherencia a las
superficies de plstico y sub-inhibitorias de polmeros previamente determinados tejidos
blandos constituye un factor de virulencia que predomina en las condiciones descritas.
en C. albicans respecto a otras especies de Candida. Muchos estudios Determinacin de CSH
de hongos adherencia a los materiales plsticos empleados diferentes CSH se determin por
adherencia a las clulas epiteliales mtodo hidrocarburos (10,11 ). Diferentes interacciones
participar (13). En resumen, las suspensiones de levaduras en tampn fosfato salino en este
proceso, siendo la hidrofobicidad de la superficie celular (CSH) (PBS) se contact con
(absorbancia a 520 nm = 0,400 ) a uno de los ms importantes (12). Muchos han sido los
mtodos orgnicos diferentes fases, xileno o cloroformo, en un volumen que se utiliza para
determinar la HSC, pero la adhesin a los hidrocarburos relacin de 5:1 ; la mezcla se mezcla y
se deja 1 minutos a uno de los ms empleados por su sencillez (13,14 ). resto de 10 min. CSH
fue calculada por la absorbancia de factores como la temperatura, el tiempo de interaccin de

ambas fases, fase acuosa a pH 520 nm antes y despus de entrar en contacto con las
levaduras, fuerza inica de los medios de comunicacin, concentracin relativa de las
suspensiones a las fases orgnica (13).
especies interactuantes y carcter cido-base de las condiciones del crecimiento orgnico y la
preparacin de clulas disolvente empleado modificar CSH valores. a) Cultivo celular de
fibroblastos humanos y clulas epiteliales El propsito de este Trabajo fue evaluar el efecto de
fibroblastos humanos partiendo de beb prepucio (HF) y QAPM y NaAL de CSH y adhesi de
C. albicans una lnea celular epitelial (Hep-2, ATCC CCl 23) de faringe a las clulas epiteliales y
fibroblastos. carcinoma, donados por el Centro Mdico de Estudios e Investigaciones Clnicas
(CEMIC, Buenos Aires, Argentina,
MATERIAL Y MTODOS y el Instituto de Virolog , el Dr. Varella, UNC, respectivamente), el
aislamiento y la identificacin de Candida. De cultura medio MEM Eagle (Gibco, una cepa de
coleccin (C. albicans ATCC 10231) y asla USA) con 10% de suero fetal bovino y 50 g/ml de
gentamicina de saliva de los pacientes con estomatitis subprtesis. Las clulas de los cultivos
se lavaron dos veces con PBS y dis- (n = 7) ayudar III, facultad integrada con 0,05 % tripsina
EDTA; por ltimo, la suspensin de la Odontologa, Universidad Nacional de Crdoba,
Argentina 5 de 1 x 10 clulas/ml en medio de cultivo preparado. 100 l (UNC), consentimiento
informado la participacin en el de esta suspensin se dej de crecer en un 24 bien sala
estudio, fueron empleados en este trabajo. Ninguno de los pacientes que durante 24 h a 37 OC
de adherencia en condiciones de 5% de CO2 consumido, f macos xerostomizantes o y 100%
de humedad (16).
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b) cultivo primario de fibroblastos gingivales de rata adherencia a las clulas tres ratas Wistar
macho (de 3 a 5 semanas de vida, de 200 a 300 g) La Figura 2 muestra que las muestras de
control tienen un mayor nmero de donantes de fibroblastos gingivales (RF). Despus de la
adhesin las levaduras, independientemente del tipo de clulas (Figura 2: A-I, anestesia, tejido
conectivo de la enca superior e inferior fue B-I y C-I) de las clulas tratadas con NaAL (Figura 2:
A-II,B- extrado, segn criterios de Freshney (16). Las muestras fueron II,C-II) y QAPM (Figura
2: A-III, B-III, C-III). Adherencia lavadas tres veces con PBS estril y tejido conectivo de C.
albicans a HF y clulas Hep-2 disminuy significativamente, en muy pequeas porciones,
cultivada en MEM de Eagle con QAPM y NaAL respecto al control (p < 0.5 ). Cuando los
medios suplementados con 20% de suero fetal bovino, y comparando el nmero de C. albicans
adheridas a FR, slo mantenerse a una temperatura de 37 OC en las mismas condiciones que
se observaron diferencias significativas entre NaAL y fibroblastos. Era de 10 a 14 das o hasta
obtener el control, pero no entre los polmeros. No hay diferen- tes un cultivo confluente (17).

Los fibroblastos se cosecharon con ferencias en los resultados entre los dos tipos de
fibroblastos (figura 3).
tripsina al 0,05 % y se resuspendieron en medio de cultivo a una
concentracin de 5 x 10 1 cel/ml .
Preparacin de levaduras para ensayo de adherencia levadura cultivada en SGA durante 24-48
h a 37 OC fueron inoculadas en caldo glucosado de Sabouraud y culta 16-18 h a 37 C .
Se lavaron las clulas cosechadas por dos ciclos centrifugacin
7 (400 rpm, 5 min) con solucin PBS estril y una suspensin (1 x 10 clulas/ml en PBS). El
nmero de clulas fue ajustado por recuento hematolgico en cmara de Neubauer.
Ensayo de adherencia las clulas epiteliales y fibroblastos fueron lavadas con PBS y se contacta
con saliva inactivada (30 min a 60 OC) durante 1 h a 37 C . Libres de levaduras adheridas
despus de que el contacto con la saliva por observacin microscpica. Simul- tiempo,
suspensin de C. albicans y biopolmeros se agregaron (0.25 % P/V QAPM en 1% de cido
actico y 0,10 % P/V estril NaAL en H2O) (18,19 ); las muestras se incubaron 1 h a 37 C.
Despus de esto, las suspensiones fueron esparcidas en un cubreobjetos, secado al aire y
fijado con metanol y coloreadas con
Fig. 1. Efecto de los biopolmeros de superficie celular hidrophobicity de violeta cristal. Mismo
procedimiento sin inclusin de biopo- C. albicans en dos diferentes medios orgnicos. Media
error estndar. C:- lymers se hizo para las muestras de control. La cuantificacin de trol,
QAPM: alto peso molecular, NaAL: alginato de sodio.
C. albicans adheridas a las clulas se realiz por microscopa ptica (400 X) (n= 150) en al
menos tres campos. Las imgenes fueron analizadas por sistema analizador de imgenes
(Image Pro Plus 4.0 Media Cybernetics v. 2002, ESTADOS UNIDOS). Conglomerado de clulas
Campos DEBATE no han sido cuantificados (18). Los ensayos se realizaron por triplicado en la
adherencia de C. albicans a las superficies del hospedador es considerada la tres momentos
diferentes. fase inicial para la candidiasis. Se trata de un complejo anlisis estadstico proceso
que implica factores qumicos y biolgicos y de los resultados se procesaron estadsticamente
mediante MANOVA (CSH ces participar en adherencia; interacciones hidrfobas reproducir
resultados), ANOVA y test LSD-Fisher (adhesi un papel importante entre ellos. CSH, factor
de virulencia con el paquete estadstico SPSS 10.0 . Un valor de p 0,05 fue el proceso de
adhesi fngica, no debe analizarse pu- fijar para determinar diferencias significativas.
dependen de una termodinmica (12) debido a que diversas estructuras microbianas tambin
contribuyen a la misma, tales como las protenas de membrana, RESULTADOS las
lipoprotenas, fosfolpidos y lipopolisac (20). En la hidrofobicidad de la superficie celular
bibliografa, odo de adhesi a hidrocarburos empleando el efecto de los biopolmeros de
CSH de C. albicans se muestra en xileno como fase orgnica es el m utilizado (13,21 ). Esta
figura 1. Una disminucin significativa con respecto al control (p = 0,025 ) disolvente neutro las
levaduras se adhieren solamente a travs de tanto orgnicos hidrfobos se observ las fases
(44% con QAPM interacciones, mientras que con cloroformo, se puede evaluar tambin cidos
y 82% con NaAL en cloroformo, y 30% con QAPM y las interacciones de tipo base, debido a su
aceptor electrnico 19% con NaAL, en xileno). Valores de HSC levaduras cultivadas en carcter
electrnico superficie microbiana donante. Esta presencia de QAPM y NaAL no muestran
importantes determina valores mayores de HSC (14) en esta fase orgnica.

las diferencias de los disolventes orgnicos. CSH de levaduras control Nuestros resultados
concuerdan con dichas diferencias. Cuando las muestras fue significativamente mayor con
cloroformo que con xileno se pusieron en contacto con QAPM y NaAL, CSH disminuyeron (p =
0.001 ). Los valores obtenidos en la presencia de los biopolmeros respecto al control de los
disolventes orgnicos.
variando la fase orgnica no fueron significativamente diferentes.
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Candida albicans adherencia adherencia Med Oral Patol Oral Cir Bucal 2006; Med Oral Patol
Oral Cir Bucal 2006 ;11:E120-5. 11:E120-5. Inhibicin de la inhibicin de Candida albicans
Candida albicans adherencia adherencia
Fig. 2. Imgenes microscpicas de C. albicans adheridas a diferentes tipos de clulas (A: HF; B:
RF; C: Hep-2) en ausencia (I: control) y la presencia de Naal (II) y HMW (III). (Ampliacin: 400
X).
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Candida albicans adherencia adherencia
Fig. 3. Nmero de C. albicans adheridas por celda en la presencia y en la ausencia de los
biopolmeros. Media error estndar. C: control, QAPM: alta mo- lecular peso, NaAL: alginato
de sodio
RF HF Hep-2
puede ser a las condiciones de cultivo, que modifique los hongos tratamiento de la candidiasis
oral resulta ms sencillo en los pacientes estructura de la pared, y por lo tanto, la carga
superficial (21). Estos con una ligera inmunodeficiencias, tema en el que en general considera
que cido-base interacciones contribuyen frmacos antimicticos son eficientes. Estos
interfieren en ergosterol de accin antifngica de estos polmeros, sntesis de membrana

celular de Candida o en estudios de reglamentacin se refiere a la micosis adherencia a


superficies diferentes enzimas para cidos nucleicos sntesis, pero tambin interfieren en
mostrar que la Cndida tiene numerosas adhesinas; entre ellas, las vas metablicas de las
clulas humanas. Sin embargo, CR3 receptores, homloga a la integrina, manno de candidiasis
oral crnica hay que resistir tratamiento clnico o protenas que pueden interactuar con las
lectinas de molculas como efectos colaterales indeseables observados con el uso de estos de
clulas epiteliales, CR2 receptor, que promueve adherencia frmacos antimicticos (26). Una
alternativa en los protocolos de tratamiento de superficies acrlicas (22,23 ) y receptores en la
inmovilizacin es el uso de estos biopolmeros, solas o asociadas, las protenas salivales de
tegumento (24). La adherencia es la causa que se han utilizado para que el adhesivo
microcpsulas por traumatismos u oclusin de la mucosa, como ocurre en la preparacin de
liberacin controlada de medicamentos orales en estomatitis subprtesis (10). En este
documento, una mayor adhesin de mucosa; tambin un efecto inhibitorio sobre el
crecimiento del hongo y las clulas epiteliales de los fibroblastos, que adhesi de C. albicans
a las clulas epiteliales por s mismos se ha asociado a un mayor nmero de receptores en la
antigua literatura (27-29). La disminucin de la CSH y adherencia a. La disminucin en la
adhesin de Candida producida por superficies biolgicas en la presencia de estos productos,
los biopolmeros se interpretara como una consecuencia de ser producir una disminucin del
potencial patognico de C. albicans de hongos y carga en la superficie de las clulas (25) (21).
Propiedades bioadhesiva de quitosano y alginato, sus las caractersticas fsico-qumicas de los
polmeros. Tambin se pueden usar medicamentos como intraoral (27), as como de inhibicin
que considerar el posible bloqueo de estos polmeros adherencia a las clulas oral antifngico
especfico y no por efectos de la viscosidad de la levadura y receptor celular (19). Estos
resultados (29), nos permitira estudiar esos productos de acuerdo con los obtenidos de HSC,
reforzando la: - una alternativa de estomatitis subprtesis, con un mejor tratamiento que
existe entre estos factores de virulencia. Una mayor aceptacin de los pacientes y una
disminucin de los efectos colaterales efecto observado para NaAL de QAPM puede ser debido
a los protocolos de antimicticos convencionales.
las propiedades mecnicas del gel, sumadas a las modificaciones que se producen en las
superficies celulares.
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Oral Cir Bucal 2006 ;11:E120-5. 11:E120-5. Inhibicin de la inhibicin de Candida albicans
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