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Materiales y mtodos
2.1. Cultivo de clulas de la leucemia lneas celulares K562, HEL, HL-60, KG-1a,
NB-4, OCI-AML3 y murino lnea celular estromal MS-5 fueron todos obtiene a
partir de la coleccin alemana de microorga-ismos y Cultivos Celulares (DSZM,
Braunschweig , Alemania). Lneas de clulas estromales murinas EL08-1D2 y
EL28-1B3 [18] fueron amablemente proporcionados por Robert O ostendorp,
Techni-cal Universidad de Munich. Las lneas celulares se mantuvieron a una
densidad de 2,5 105 / ml cada uno en RPMI 1640 que contiene 10% de FCS
(Biochrom, Berln, Alemania), 2 mM Glu-tamine y 1% de penicilina-estreptomicina
(Life Technologies, Darmstadt, Alemania) .Standard de laboratorio las condiciones
de normoxia (21%) compuesto O2, 5% de CO2, y 37C. Para los experimentos en
un ambiente de oxgeno reducido, se utiliz la estacin de trabajo INVIVO2400
hipxica de Tecnologa Ruskinn (Bridgend, Reino Unido). Las clulas se incubaron
en 1% de O2, 5% de CO2, y 37C durante 48 h. El nmero de clulas vivas se
evalua-ado por tincin con azul de tripano (Life Technologies, Darmstadt,
Alemania). Las clulas primarias AML fueron obtenidas de la mdula sea o
sangre perifrica de consecutivepatients con LMA de acuerdo a criterios de la
OMS despus de obtener el consentimiento informado. Clulas mononucleares de
sangre perifrica (PBMC) se obtuvieron a partir fue dado consentimiento donantes
sanos afterinformed. Por las caractersticas de las muestras de AML y los
donantes, por favor consulte la Tabla 1
2.3. De clulas activadas por fluorescencia (FACS)
2.4. Los ensayos para la deteccin de la lisis celular mediada por PBMC
proporciones que van desde 2,5: 1 a 80: 1 en una placa de 12 pocillos. Despus
de 4 h de incubacin a la condicin respectiva, las suspensiones celulares fuerontrans preferidos en tubos de FACS. Las clulas se lavaron y se resuspendieron en
500 l de tampn FACS y se tieron con 10 l de un / ml de solucin de yoduro de
propidio 50 g (Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Alemania). Las clulas lisadas se
midieron usando FACS como se describe anteriormente. Para los experimentos de
co-cultivo con clulas estromales mesenquimales (MSC), clulas de 3 104stromal de lneas celulares murinas MS-5, EL08-1D2 y EL28-1B3 se sembraron en 12
bien y permiten llegar a ser adherente por incubacin durante la noche. Los
sobrenadantes se dis-cardada y 1 104 calcena AM marcada, los blastos de AML
primarias fueron co-cultivadas con MSC 1 h antes de se aadieron PBMCs en los
respectivos ratios. Despus de 4 h de incubacin, las clulas se transfirieron a
tubos FACS y desprendimiento de MSC se realiz mediante tripsinizacin.
Despus de MSCs se combinaron con medios de comunicacin en el respectivo
tubo de FACS, las clulas se lavaron y se tieron durante 10 minutos con 2 l de
anticuerpo CD45-APC (Tecnologa para la Vida-Gies, Darmstadt, Alemania) a 4C
en la oscuridad. Las clulas se lavaron, se tieron con PI y se analizaron como se
ha descrito anteriormente.
3.3. Medicin de la lisis mediada por clulas en un sistema de co-cultivo ByFlow
citometra
Para investigar la lisis mediada por clulas con un mtodo no radiactivo que
permite que un sistema de co-cultivo de tres celdas, un ensayo basado en FACS
fue desarrollado. En una primera etapa, las clulas efectoras (es decir, PBMCs) y
clulas diana (es decir, blastos AML) se midieron individualmente por FACS y una
puerta especfica que separa las dos poblaciones por su positividad para calcena
fue definida (Fig. 2A izquierda y medio, puerta R3) . La cantidad de clulas lisadas
se defini como clulas PI positivas en la puerta de destino R3 (Fig. 2C) y se
analiz a travs de histogramas. Adems, este mtodo permite el clculo preciso
de la relacin de efector a clula diana mediante el clculo del nmero de clulas
diana en la puerta R3 en comparacin con el nmero de clulas totales. Mediante
la adicin de un marcador adicional, este sistema podra ampliarse para analizar
un sistema triple de clulas co-cultivo. Como las clulas estromales
mesenquimales tincin negativa para CD45, se us este marcador para definir
puerta R2 que incluye slo las clulas CD45 positivas (es decir, leucocitos),
incluyendo clulas diana (Fig. 2B, izquierda) y la combinacin de las clulas diana
y efectoras (Fig. 2B , medio). MSC quedan fuera de esta puerta y por tanto no se
analizan ms de lisis (Fig. 2B, derecha). A continuacin, se analiz la puerta R2
A continuacin, se aplic este sistema para investigar los efectos de las clulas del
estroma mesenquimales (MSC) como otro componente pertinentes del
microambiente cuando se co- cultivaron con clulas diana. Las clulas primarias
AML fueron elegidos como clulas diana (n = 5 , para la caracterizacin de los
pacientes con LMA favor consulte la Tabla 1 ) . La viabilidad de las muestras de
AML no se alter significativamente cuando co -cultivadas con MSC ( 25 103
PERASSAY ) durante 48 h (viabilidad 90,0 % frente a 90,6 % , no significativo ) .
Curiosamente, hemos observado que la co- cultura de explosiones primarias AML
con MSC durante 48 h protegidas significativamente blastos AML desde mediada
por clulas NK lisis ( E : T ratio de 20 : . 1 , la reduccin de la lisis 50,7 % ; p <
0,05 , Fig 3A , E : relacin de T 10 : 1 de reduccin de la lisis 50,8 %, p < 0,05 %)
3.5. Mecanismos de proteccin de explosiones ALD por el MSC
4. Discusin