2.

Materiales y mtodos
2.1. Cultivo de clulas de la leucemia lneas celulares K562, HEL, HL-60, KG-1a,
NB-4, OCI-AML3 y murino lnea celular estromal MS-5 fueron todos obtiene a
partir de la coleccin alemana de microorga-ismos y Cultivos Celulares (DSZM,
Braunschweig , Alemania). Lneas de clulas estromales murinas EL08-1D2 y
EL28-1B3 [18] fueron amablemente proporcionados por Robert O ostendorp,
Techni-cal Universidad de Munich. Las lneas celulares se mantuvieron a una
densidad de 2,5 105 / ml cada uno en RPMI 1640 que contiene 10% de FCS
(Biochrom, Berln, Alemania), 2 mM Glu-tamine y 1% de penicilina-estreptomicina
(Life Technologies, Darmstadt, Alemania) .Standard de laboratorio las condiciones
de normoxia (21%) compuesto O2, 5% de CO2, y 37C. Para los experimentos en
un ambiente de oxgeno reducido, se utiliz la estacin de trabajo INVIVO2400
hipxica de Tecnologa Ruskinn (Bridgend, Reino Unido). Las clulas se incubaron
en 1% de O2, 5% de CO2, y 37C durante 48 h. El nmero de clulas vivas se
evalua-ado por tincin con azul de tripano (Life Technologies, Darmstadt,
Alemania). Las clulas primarias AML fueron obtenidas de la mdula sea o
sangre perifrica de consecutivepatients con LMA de acuerdo a criterios de la
OMS despus de obtener el consentimiento informado. Clulas mononucleares de
sangre perifrica (PBMC) se obtuvieron a partir fue dado consentimiento donantes
sanos afterinformed. Por las caractersticas de las muestras de AML y los
donantes, por favor consulte la Tabla 1
2.3. De clulas activadas por fluorescencia (FACS)

PBMC aisladas se tieron durante 15 minutos a 4C en la oscuridad con

anticuerpos FITC etiquetados (Tabla 1, todos de Beckman Coulter, Brea, CA). Las
clulas fueron lavadas con tampn FACS (D-PBS que contena 0,1% de BSA y
EDTA 2 mM) y el flujo de datos de citometra fue adquirido usando un citmetro
FACS Calibur (BD Biosciences, San Jose, CA). Anlisis de la expresin se realiz
utilizando software CellQuest Pro BD.

2.4. Los ensayos para la deteccin de la lisis celular mediada por PBMC

3 105target clulas (blastos AML o clulas K-562) en 10 ml de RPMI fueron

teidas con 2 l de un ml de solucin de 1 mg / Calcena AM Probe (Life
Technologies, Darmstadt, Alemania). Despus de 3 min de incubacin a RT, las
clulas se lavaron dos veces y efec-tor: clula diana (E: T) se generaron

proporciones que van desde 2,5: 1 a 80: 1 en una placa de 12 pocillos. Despus
de 4 h de incubacin a la condicin respectiva, las suspensiones celulares fuerontrans preferidos en tubos de FACS. Las clulas se lavaron y se resuspendieron en
500 l de tampn FACS y se tieron con 10 l de un / ml de solucin de yoduro de
propidio 50 g (Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Alemania). Las clulas lisadas se
midieron usando FACS como se describe anteriormente. Para los experimentos de
co-cultivo con clulas estromales mesenquimales (MSC), clulas de 3 104stromal de lneas celulares murinas MS-5, EL08-1D2 y EL28-1B3 se sembraron en 12
bien y permiten llegar a ser adherente por incubacin durante la noche. Los
sobrenadantes se dis-cardada y 1 104 calcena AM marcada, los blastos de AML
primarias fueron co-cultivadas con MSC 1 h antes de se aadieron PBMCs en los
respectivos ratios. Despus de 4 h de incubacin, las clulas se transfirieron a
tubos FACS y desprendimiento de MSC se realiz mediante tripsinizacin.
Despus de MSCs se combinaron con medios de comunicacin en el respectivo
tubo de FACS, las clulas se lavaron y se tieron durante 10 minutos con 2 l de
anticuerpo CD45-APC (Tecnologa para la Vida-Gies, Darmstadt, Alemania) a 4C
en la oscuridad. Las clulas se lavaron, se tieron con PI y se analizaron como se
ha descrito anteriormente.
3.3. Medicin de la lisis mediada por clulas en un sistema de co-cultivo ByFlow
citometra

Para investigar la lisis mediada por clulas con un mtodo no radiactivo que
permite que un sistema de co-cultivo de tres celdas, un ensayo basado en FACS
fue desarrollado. En una primera etapa, las clulas efectoras (es decir, PBMCs) y
clulas diana (es decir, blastos AML) se midieron individualmente por FACS y una
puerta especfica que separa las dos poblaciones por su positividad para calcena
fue definida (Fig. 2A izquierda y medio, puerta R3) . La cantidad de clulas lisadas
se defini como clulas PI positivas en la puerta de destino R3 (Fig. 2C) y se
analiz a travs de histogramas. Adems, este mtodo permite el clculo preciso
de la relacin de efector a clula diana mediante el clculo del nmero de clulas
diana en la puerta R3 en comparacin con el nmero de clulas totales. Mediante
la adicin de un marcador adicional, este sistema podra ampliarse para analizar
un sistema triple de clulas co-cultivo. Como las clulas estromales
mesenquimales tincin negativa para CD45, se us este marcador para definir
puerta R2 que incluye slo las clulas CD45 positivas (es decir, leucocitos),
incluyendo clulas diana (Fig. 2B, izquierda) y la combinacin de las clulas diana
y efectoras (Fig. 2B , medio). MSC quedan fuera de esta puerta y por tanto no se
analizan ms de lisis (Fig. 2B, derecha). A continuacin, se analiz la puerta R2

(incluyendo las clulas diana y efectoras) para la positividad PI como se ha

mencionado antes.
3.4 . MSC proteger blastos AML contra de clulas NK mediada por lisis

A continuacin, se aplic este sistema para investigar los efectos de las clulas del
estroma mesenquimales (MSC) como otro componente pertinentes del
microambiente cuando se co- cultivaron con clulas diana. Las clulas primarias
AML fueron elegidos como clulas diana (n = 5 , para la caracterizacin de los
pacientes con LMA favor consulte la Tabla 1 ) . La viabilidad de las muestras de
AML no se alter significativamente cuando co -cultivadas con MSC ( 25 103
PERASSAY ) durante 48 h (viabilidad 90,0 % frente a 90,6 % , no significativo ) .
Curiosamente, hemos observado que la co- cultura de explosiones primarias AML
con MSC durante 48 h protegidas significativamente blastos AML desde mediada
por clulas NK lisis ( E : T ratio de 20 : . 1 , la reduccin de la lisis 50,7 % ; p <
0,05 , Fig 3A , E : relacin de T 10 : 1 de reduccin de la lisis 50,8 %, p < 0,05 %)
3.5. Mecanismos de proteccin de explosiones ALD por el MSC

A continuacin, hemos tratado de aclarar an ms los medios de proteccin de los

blastos AML por el MSC en el sistema de co-cultivo. Sobre todo lo que queramos
saber si es el contacto directo clula-clula de blastos leucmicos a MSC que es
de proteccin (por ejemplo, cambiando la proporcin E: T u ocultar las clulas
diana) o si MSC factores protectores secretos. No tanto, hemos utilizado las lneas
celulares estroma EL08-1D2 y EL28-1B3 murinos que son ya sea "partidarios"
(EL08-1D2) o "no-partidarios" (EL28-1B3) para el mantenimiento de las clulas
progenitoras hematopoyticas [18]. Curiosamente, slo la lnea celular MSC EL081D2 como una lnea celular partidario protegida significativamente blastos AML de
lisis mediada por clulas, mientras que no hubo efecto de las clulas "no
partidario" (68,1% de lisis sin MSC, el 67,5% de lisis para EL28-1B3 y 36,4% de
lisis para EL08-1D2, p <0,01, Fig. 3B). En consecuencia, estos resultados tambin
se pudo confirmar en el modelo K562, aunque con menor lisis celular (34,5% de
lisis sin MSC, el 31,5% de lisis para EL28-1B3 y el 17,6% de lisis para EL08-1D2,
p = 0,01, Fig. 3C). Tomados en conjunto, estos datos sugieren un efecto
relacionado especfico de apoyo MSC en lugar de un mero efecto inespecfico,
fsica.

4. Discusin

Las razones de los resultados decepcionantes para muchos enfoques

inmunoteraputicos en la LMA son en gran parte desconocido , pero en general
reflejan nuestra pobre comprensin de los complejos mecanismos involucrados.
Mientras una gran incertidumbre radica en el conocimiento imperfecto de los
antgenos diana pertinentes sobre los blastos leucmicos , puede haber otros
factores involucrados , que pueden no ser evidentes al observar las explosiones o
clulas efectoras solas .
El rea de aplicacin putativo para terapias dirigidas inmunes en AML ser la
terapia de mantenimiento y / o el tratamiento de la enfermedad residual mnima .
Aqu, las clulas diana ( es decir, clulas madre leucmicas ) residen en la mdula
sea , donde sobrevivieron el tratamiento inicial y, finalmente, se iniciar la
proliferacin de nuevo para causar la recada clnica . Por lo tanto , podra ser til
para investigar los efectos de la mdula sea en la respuesta inmune de clulas
efectoras contra explosin AML. La mdula sea , o mejor el ( clulas madre )
espacio pequeo , ofrece un santuario especfico o microambiente que consta de
ciertos componentes. El componente mejor identificados y caracterizados son las
clulas estromales mesenquimales y recientemente, la presin parcial de oxgeno
ha sido identificado como un jugador crtico en el compartimiento de clulas
madre.
En primer lugar, se encontr que la hipoxia de 1% de O2 activa las clulas NK,
pero no las clulas T, lo que sugiere un tipo muy especfico de la respuesta de
estas clulas inmunocompetente hacia la hipoxia. Consistente con este hallazgo,
las clulas NK eran significativamente ms activo y la lisis de las clulas diana se
aument durante condiciones de hipoxia cuando se aplica una lnea celular
modelo. Curiosamente, para las clulas T se ha descrito un efecto diferente de la
hipoxia, hipoxia con la inhibicin de la respuesta inmune hacia tumores slidos
[17]. Sin embargo, las clulas NK han demostrado ser las clulas efectoras en
AML tanto in vitro como in vivo; por ejemplo se demostr que en los pacientes con
LMA con clulas NK activos supervivencia libre de recada fue significativamente
mayor que en los pacientes con clulas NK inactivos [19]. Por lo tanto, nos
centramos en las clulas NK y no investigar ms a fondo los efectos de la hipoxia
en las clulas T. Sin embargo, estuvimos incapaz de observar cualquier lisis
significativa de los blastos de AML primarias por las clulas NK en nuestro
sistema, pero en nuestro modelo de estimulacin de las clulas NK con IL-2, que
se conoce para activar las clulas NK de una manera significativa, DID tambin no
mejora celular lisis. Una limitacin significativa sin embargo es que los datos no
eran obtenido en un entorno autlogo con clulas PBMC y AML del mismo
paciente . De hecho , la hipoxia podra influir innata mediata de clulas NK pero
deja inmunidad de clulas T mediada por MHC ms especfica afectada. Sin

embargo , la observacin de que las clulas NK lisis mediada disminuye cuando

se utilizan muestras primarias AML est en lnea con los hallazgos previos de los
llamados " clulas mieloides ", que son presentas clulas espectadoras en
muestras primarias AML , inactivar las clulas NK [ 5 ] , posiblemente a travs de
generacin de especies de oxgeno radicales [ 20 ] . En segundo lugar, hemos
sido capaces de identificar en este contexto otra poblacin -cin de clulas
mieloides " " ( que se derivan de la mdula sea ) que protegen las clulas de AML
cuando se co- cultivadas con clulas efectoras : clulas estromales
mesenquimales ( MSC ) , que tena una fuerte efecto protector sobre blastos
leucmicos.
MSC han cosechado un gran inters en los ltimos aos , debido principalmente a
sus efectos conocidos de quimioproteccin en blastocitos de la AML . Diversos
mecanismos se han descrito , pero ninguno de ellos puede ser realmente aplicada
a la proteccin contra la lisis mediada por clulas , ya que eran principalmente
relacionado con una disminucin de la capacidad para la apoptosis en blastos de
AML por ejemplo, misbalancing de protenas o metabolicchanges [12,13] antiapoptticos. Ya sea a corto plazo, la lisis celular mediada est relacionada con la
induccin de la apoptosis puede ser cuestionado , en cambio, los mecanismos
cito- txicos directos estn involucrados. Por lo tanto , la proteccin de los blastos
AML por la disminucin de su capacidad para someterse a la apoptosis parece
poco probable en nuestro contexto.
En cambio , el MSC podra proteger blastos AML por la inhibicin de las clulas T
NK o . Este mecanismo podra ser ms relevante en el contexto de la proteccin
microambiente mediada , ya que el contacto directo clula a clula no era
necesario para la proteccin. Por lo tanto , los factores solubles secretadas por el
MSC podran ser pertinentes que sin embargo an no se han definido.
Curiosamente, MSC se sabe que tienen capacidades de moduladores inmunes
tanto in vitro como in vivo. Ellos han demostrado que influyen positivamente injerto
agudo y crnico frente al anfitrin de enfermedad ( GvH - D ) , anautoimmune
como el trastorno despus de un trasplante alognico de clulas madre , donde
alorreactivas clulas T del donante ataque del anfitrin , dando lugar a daos
orgnicos graves como en el hgado, el intestino o la piel. En este contexto , el
MSC clnicamente podra mejorar GvH - D [ 21 ] , y los mecanismos propuestos
incluyen la supresin de la proliferacin de clulas T , la alteracin de los perfiles
de citoquinas de las clulas T y NK o la induccin de clulas T reguladoras [ 2225 ].