Manual Practicas Microbiologia Predictiva

FUNDAMENTOS DE MICROBIOLOGA
PREDICTIVA: Aplicaciones tericas y

prcticas.
Logaritmo N
ymx
Tiempo (t)
= +
Editor
Enrique
Cabeza Herrera
UNIVERSIDAD DE PAMPLONA
PAMPLONA COLOMBIA
Ttulo original:
Autor:
Editorial:
Fundamentos de Microbiologa Predictiva: aplicaciones tericas y

prcticas, 1 edicin.
Enrique Alfonso Cabeza Herrera, Ph.D.
Universidad de Pamplona.
Copyright 2011 by Enrique Cabeza Herrera

All Righs Reserved Enrique Alfonso Cabeza Herrera
Campus Universitario, Km 1 va a Bucaramanga,
Complejo Cientfico y Tecnolgico Simn Bolvar, 2do
piso. Pamplona - Colombia
I.S.B.N.:
enalcahe@unipamplona.edu.co
http://sites.google.com/site/enalcahe
IMPRESO EN COLOMBIA
PRINTED IN COLOMBIA
Reservados todos los derechos. Este libro no podr ser reproducido en forma alguna,
total o parcialmente por cualquier medio, sin el permiso expreso del autor.
FUNDAMENTOS DE MICROBIOLOGA
PREDICTIVA: Aplicaciones tericas y prcticas
Queda prohibida su reproduccin total o parcial por

cualquier medio sin el consentimiento expreso del autor
ENRIQUE ALFONSO CABEZA HERRERA
Ph.D., D.E.A. Ciencia y Tecnologa de alimentos

Especialista en Proteccin de Alimentos
Microbilogo
FACULTAD DE CIENCIAS BSICAS

DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGA
PAMPLONA NORTE DE SANTANDER
COLOMBIA
2013
CONTENIDO
Pg.
Unidad 1. Introduccin a la Microbiologa Predictiva
Unidad 2. Matemticas del crecimiento bacteriano.
Unidad 3.
Unidad 4.
Unidad 5.
Unidad 6.
Unidad 7.
Unidad 8.
Unidad 9.
Unidad 10.
ACTIVIDADES PRACTICAS
Pg.
Actividad 1.
Actividad 2.
Actividad 3.
Actividad 4.
Actividad 5.
Actividad 6.
Actividad 7.
Actividad 8.
Actividad 9.
Actividad 10.
Fundamentos de Microbiologa Predictiva: aplicaciones

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UNIDAD 1. INTRODUCCIN A LA MICROBIOLOGA PREDICTIVA
1.1. INTRODUCCIN
El modelamiento Predictivo es un campo promisorio de la microbiologa, se trata de un rea

multidisciplinar emergente de la microbiologa de alimentos, que combina disciplinas como las
matemticas, microbiologa, ingeniera y la qumica para desarrollar y aplicar modelos
matemticos para predecir las respuestas de los microorganismos a variables ambientales
especficas (McDonald y Sun, 1999). La Microbiologa Predictiva (MP) se basa en la premisa de
que las respuestas de las poblaciones microbianas a los factores ambientales son
reproducibles, y que al considerar los ambientes en trminos de dominios identificables es
posible, a partir de las observaciones del pasado, predecir las respuestas de los
microorganismos. La microbiologa predictiva surge como una metodologa alternativa a los
mtodos convencionales microbiolgicos para asegurar la calidad y seguridad de los alimentos.
La microbiologa de alimentos ha utilizado herramientas y mtodos de diagnstico tradicionales
que resultan ser muy engorrosos en cuanto a tiempo y gasto econmico, ya que solo despus
de un tiempo relativamente largo se logran obtener resultados que indiquen la presencia, el tipo
y cantidad de microorganismos patgenos y alterantes en los alimentos, haciendo que los
resultados de laboratorio sean demorados. Posteriormente se ha recurrido a mtodos rpidos
que generan resultados cuantitativos en 15 horas aproximadamente, mediante el empleo de
reacciones especficas de enzima-sustrato en medios de cultivo que generan cambios de color
(medios cromgenos) o fluorescencia (medios fluorognicos).
Finalmente se est recurriendo a anlisis cualitativos de la calidad de alimentos mediante el

empleo de tcnicas moleculares, que permiten detectar en tiempo menores a 1 hora la
presencia o ausencia de un microorganismo, especialmente los patgenos, como ejemplo de
estos mtodos tenemos la Reaccin en Cadena de la Polimerasa PCR que permite detectar la
presencia de estos microorganismos mediante la amplificacin de un fragmento de su material
gentico, por otro lado tenemos las pruebas de aglutinacin en partculas de ltex, alginato u
otra forma de encapsular bien sea un anticuerpo o un antgeno que reacciona con una fraccin
especfica del microorganismo blanco, pudiendo detectarse la presencia o ausencia del mismo.
Los anteriores mtodos han permitido obtener resultados relativamente cortos en el tiempo pero
un tanto costosos y con el inconveniente de que no se conoce el nmero exacto de
microorganismos presentes.
La necesidad de tomar decisiones oportunas con respecto a la calidad microbiolgica de los

alimentos, ha hecho que se est dando un impulso al desarrollo de herramientas bioinformticas
que resultan ser mucho ms giles y econmicas. En este sentido, ha tomado una importancia
cada vez mayor la denominada Microbiologa Predictiva o Ecologa Microbiana Cuantitativa.
Con el desarrollo de la microbiologa predictiva se puede predecir cul ser el comportamiento
Universidad de Pamplona Facultad de Ciencias Bsicas Departamento de Microbiologa 2011

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microbiano partiendo como base de que: las respuestas de los microorganismos a los factores
medioambientales son reproducibles, por otra parte, el papel que juegan los microorganismos
en los alimentos es cada da ms relevante, no solo desde el punto de vista sanitario, por su
impacto en la salud pblica, sino tambin en el deterioro de los productos alimenticios que
generan prdidas econmicas. As mismo, la Microbiologa Predictiva a travs de interfaces con
muchas otras disciplinas se ha convertido en un paradigma de la microbiologa moderna de
alimentos. Proporciona una base cientfica para sustentar el concepto de HACCP y la
Evaluacin Cuantitativa de Riesgos Microbiolgicos.
As
mismo, el uso de modelos predictivos pueden permitir estimar de la vida til de

alimentos, la seguridad microbiolgica de los mismos, el aislamiento de puntos crticos y
optimizacin de las cadenas de produccin y distribucin, tambin pueden dar una idea de
cmo las variables medioambientales o condiciones qumicas o fsicas tales como la
temperatura, pH y actividad de agua afectan la supervivencia de bacterias patgenas y
alterantes.
1.2. HISTORIA DE LA MICROBIOLOGA PREDICTIVA
El uso de los modelos matemticos en microbiologa de alimentos no es nuevo, ya que

Baird-Parker y Kilsby en 1987 informaron que los modelos de destruccin trmica de
microorganismos por calor fueron establecidos en la literatura y la industria (Ross y McMeekin,
1994). De hecho, el origen de la microbiologa predictiva puede remontarse hacia los aos 20s,
cuando Esty y Meyer planearon en 1922 el modelo de la Coccin botulnica. Este modelo
define el proceso trmico suficiente para destruir 1012 esporas de C. botulinum tipo A. Quiz
debido al hecho de que el modelo tuvo aceptacin entre los industriales y se convirti en amplio
uso en la industria alimentaria, no se vio la verdadera potencialidad predictiva de este tipo de
modelos.
El desarrollo histrico de la microbiologa predictiva puede dividirse en tres etapas definidas:
(1) orgenes, (2) estancamiento, y (3) evolucin.
Figura 1.1. Etapas del desarrollo de la Microbiologa Predictiva

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Fuente: Autor
1.2.1. Orgenes de la Microbiologa Predictiva
Como
habamos comentado, los orgenes de la microbiologa predictiva de alimentos

pueden remontarse hacia los aos 20. Esty y Meyer plantearon en 1922 un modelo que
describe el tiempo mnimo de tratamiento trmico a 121C que debe recibir todo alimento
enlatado y con pH igual o mayor a 4.5, para reducir 12 veces la presencia de esporas de
Clostridium botulinum tipo A, es decir, desde 1012 hasta 100. Este modelo fue denominado
Coccin botulnica, y debido a su amplio uso en la industria de alimentos pudo perderse su
carcter predictivo (XXXX, 19XX).
Scott en 1937 sent las bases de los modelos cinticos al afirmar que el conocimiento de
las velocidades de crecimiento de ciertos microorganismos a diferentes temperaturas es
esencial para los estudios sobre el deterioro de la carne refrigerada. Con estos datos, debera
ser posible predecir la influencia relativa de la alteracin sobre el deterioro ejercida por los
diferentes organismos en cada temperatura de almacenamiento, adems, debera ser posible
predecir el potencial alcance de los cambios en las poblaciones que diversos organismos
pueden sufrir durante el perodo inicial de enfriamiento de las superficies de la carne en los
mataderos cuando la superficie es con frecuencia mantenida a temperaturas muy favorables
para la proliferacin microbiana (Ross y McMeekin, 1994).
Por otra parte, J. Monod (1949) sent las bases del crecimiento bacteriano aplicado a la
industria de la fermentacin (McMeekin y Ross, 2002). Monod plante que El crecimiento
bacteriano, a pesar de la inmensa complejidad de los fenmenos a los que se someten, en
general, obedece a unas leyes relativamente sencillas que permiten definir ciertas
caractersticas cuantitativas del ciclo de crecimiento, fundamentalmente las tres constantes de
crecimiento: el crecimiento total (G), la tasa de crecimiento exponencial (R) y la fase de latencia

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(L).
1.2.2. Estancamiento
Durante los aos 60s y 70s la literatura sobre el tema permaneci silenciosa y el uso de
modelos cinticos se aplicaron para resolver problemas de alteracin de alimentos, mientras
que los modelos probabilsticos fueron empleados en los problemas de contaminacin de
alimentos y ETAS: botulismo. En 1973, Olley y Ratkowsky proponen el modelo de Curva de
Alteracin Universal dependiente de la temperatura en la alteracin del pollo.
1.2.3. Evolucin

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1.3. MODELAMIENTO MATEMTICO
Un
modelo es un anlogo de la realidad fsica, tpicamente simple e idealizada. Los

modelos pueden ser fsicos o matemticos y son creados con el objetivo de obtener una idea de
la realidad de la forma ms conveniente. Un modelo fsico puede ser una miniatura, tal como
una versin preliminar de una pieza a escala de un equipo. Un modelo matemtico es un

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anlogo matemtico de la realidad fsica, que describe las propiedades y caractersticas de un

sistema real en trminos de variables y operaciones matemticas.
El
fenomenal crecimiento en el poder de la computacin y la facilidad de uso de estas

herramientas han permitido que los modelos puedan ser ms realistas y han experimentado un
rpido crecimiento en el uso de modelos en diseos y experimentacin de productos, procesos
y equipos. Entre las muchas ventajas de los modelos tenemos (1) reduccin en el nmero de
experimentos, as como del tiempo y gastos econmicos; (2) proveen grandes ideas de los
procesos (en caso de un modelo basado en la fsica) que regularmente no pueden ser posibles
con la experimentacin; (3) optimizacin de procesos; (4) capacidad predictiva, por ejemplo,
formas de interpretar escenarios qu si; y (5) proveen mejoramiento en la automatizacin de
procesos y capacidades de control (Datta y Sablani, 2006).
1.4. CLASIFICACIN DE LOS MODELOS PREDICTIVOS
Los
modelos predictivos microbiolgicos pueden ser clasificados desde diversas

dimensiones (Gershenfeld, 1999), sin embargo, un esquema de clasificacin absoluta an no ha
sido decidido (McDonald y Sun, 1999). El uso uniforme de terminologa y clasificacin de los
modelos en grupos que tienen funciones especficas pueden hacer de la microbiologa
predictiva una disciplina ms exacta y de ms fcil uso (Baranyi y Roberts, 1992). Sin embargo,
solo el sistema de clasificacin propuesto por Whiting y Buchanan (1993) puede agrupar la
mayora de modelos en primarios, secundarios y terciarios (McDonald y Sun, 1999).
Bibliografa
Datta, A.K., Sablani, S.S. (2006). Chapter 1: Mathematical Modeling Techniques in Food and
Bioprocesses: An Overview. In: Handbook of Food and Bioprocess Modeling Techniques /
Editors, Shyam S. Sablani, Mohammad S. Rahman, Ashim K. Datta and Arun S. Mujumdar.
Taylor and Francis Group, LLC. CRC Press. Boca Raton, FL, USA. Pages 1 11.
Gershenfeld, N. (1999). The Nature of Mathematical Modeling. Cambridge: Cambridge
University Press.
Van Boekel, M.A.J.S., Tijskens, L.M.M. (2001). Kinetic Modelling. In: Food Process Modelling /
Editors L.M.M. Tijskens, M.L.A.T.M. Hertog and B.M. Nicola. Woodhead Publishing
Limited. CRC Press. Boca Raton, FL, USA. Pages 35 59.
Baranyi, J., Pin, C. (2001). Modelling Microbial Safety. In: Food Process Modelling / Editors
L.M.M. Tijskens, M.L.A.T.M. Hertog and B.M. Nicola. Woodhead Publishing Limited. CRC
Press. Boca Raton, FL, USA. Pages 383 401.
Baranyi, J., Roberts, T.A. (1992). A terminology for models in predictive microbiology A reply to

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K.R. Davey. Food Microbiology, 9: 355.

Ross, T., McMeekin, T.A. (1994). Review Paper: Predictive Microbiology. International Journal of
Food Microbiology, 23: 241 264.
McDonald, K., Sun, D-W. (1999). Predictive food microbiology for the meat industry: a review.
International Journal of Food Microbiology, 52: 1 27.

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UNIDAD 2. MATEMTICAS DEL CRECIMIENTO BACTERIANO

2.1.
OBJETIVOS DE LA UNIDAD
Al finalizar la unidad el lector estar en capacidad de:
Comprender los fundamentos matemticos del crecimiento y muerte bacteriana.
Construir grficos tanto de crecimiento como muerte empleando hojas de clculo de
cualquier programa ofimtico (p.ej. Microsoft Office Excel, OpenOffice Cal, Star Office
Cal, IBM Cal, etc.).
Manejar las hojas de clculo como herramienta para estimar el comportamiento de una
poblacin bacteriana.
Estimar los diferentes parmetros cinticos tanto de crecimiento como muerte
bacteriana.
2.2.
CRECIMIENTO BACTERIANO
En este captulo abordaremos el estudio matemtico del crecimiento bacteriano desde una
perspectiva clsica, es decir, partiendo del principio que el crecimiento bacteriano obedece a un
crecimiento constante (crecimiento equilibrado). Los aspectos de fisiologa del crecimiento sern
vistos en forma general y se profundizar en algunos de ellos en captulos posteriores. Sin
embargo, si el lector desea estudiar a profundidad los aspectos fisiolgicos, podemos sugerirle
revisar tratados o libros de microbiologa como Brock Biology of Microorganisms de Madigan et
al. (2008) o Zinsser Microbiology de Joklik et al. (1997).
El crecimiento o desarrollo bacteriano puede definirse como el aumento ordenado de todos

los constituyentes qumicos de la clula, tratndose de un proceso que implica la replicacin de
todas las estructuras celulares, organoides y componentes protoplasmticos a partir de los
nutrientes presentes en el medio circundante. Por otra parte, podemos definir el crecimiento
bacteriano como el aumento del nmero de clulas en el tiempo. Cuando una clula bacteriana
se coloca en un medio nutricionalmente completo, aumenta de tamao y con el tiempo se divide
para formar dos clulas. A este proceso se le denomina fisin binaria (binario para expresar el
hecho de que de una clula surgen dos) adoptando una progresin geomtrica de 2n, donde n
representa el nmero de generaciones o divisiones que han tenido lugar en el tiempo. De tal
forma, que si partimos de una clula, al cabo de la primera generacin se formarn 2 clulas,
despus de la segunda generacin se formaran cuatro, posteriormente ocho y as
sucesivamente. El proceso anterior se muestra en la figura 2.1.
En el desarrollo de un cultivo bacteriano se produce un aumento tanto de la masa celular

como del nmero de microorganismos, pero no existe una relacin constante entre los dos

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parmetros (Willet, 1997; Madigan et al., 2008), ya que cada especie puede variar su tamao,
velocidad de crecimiento y densidad celular en funcin de las condiciones intrnsecas,
extrnsecas e implcitas del cultivo donde se encuentren. Por tanto, en estudios cuantitativos que
se ocupan del desarrollo celular es necesario diferenciar entre la concentracin celular, es decir,
el nmero de clulas por unidad de volumen de cultivo, y la densidad bacteriana, que se define
como el protoplasma total por unidad de volumen (Willet, 1997). En apartados posteriores
realizaremos una mayor distincin entre estos dos aspectos, la forma de determinarlos y la
relacin entre ellos.
Figura 2.1. Representacin del crecimiento bacteriano por fisin binaria.
Fuente: Adaptado de Madigan et al., 2008.

Como ya se ha mencionado, el crecimiento se define como un aumento en el nmero de
clulas microbianas en una poblacin, que tambin se puede medir como un aumento en la
masa microbiana. La tasa o velocidad de crecimiento es el cambio en la cantidad de clulas o
de masa por unidad de tiempo. Durante el ciclo de divisin celular, todos los componentes
estructurales de la clula se duplican. El intervalo para la formacin de dos clulas a partir de
una se llama generacin y el tiempo requerido para que esto ocurra se llama tiempo de
generacin. El tiempo de generacin es, as, el tiempo requerido para que se duplique el
nmero de clulas. Debido a esto, tambin al tiempo de generacin se le llama tiempo de
duplicacin.
2.3.
CRECIMIENTO ASINCRNICO
El
estudio del crecimiento bacteriano suele hacerse a nivel de laboratorio en cultivos

continuos (sistema abierto) o discontinuos (sistema cerrado). Segn seala Willet (1997), por lo
general las bacterias se desarrollan en laboratorio en cultivos discontinuos, y por tanto las
condiciones se aproximan a las de un sistema cerrado. Cuando un medio adecuado se inocula
con bacterias y se toman nuestras pequeas a intervalos regulares de tiempo, la representacin
grfica de los datos dar una curva de crecimiento caracterstica (Figura 2.2).

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Logaritmo del nmero de clulas
Figura 2.2. Representacin grfica de la curva de crecimiento bacteriano.

Fase
estacionaria
Fase de
declive
Fase
exponencial
Transicin 2
Fase de
latencia
Transicin 3
Transicin 1
Fuente: Autor.
Tiempo
En la curva anterior se muestra las cuatro fases del desarrollo bacteriano que se producen
cuando se representa el nmero de clulas viables en funcin del tiempo en un cultivo
discontinuo y asincrnico. Ntese la presencia de tres interfases con variaciones de pendiente
que indican la transicin de una a otra fase del desarrollo: transicin 1 entre las fases de latencia
exponencial, transicin 2 entre las fases exponencial estacionaria y la transicin 3 entre las
fases estacionaria declive. En cultivos sincrnicos las interfases tienden a desaparecer ya que
las clulas crecen de forma simtrica y por tanto la curva de crecimiento adopta una forma lineal
entre cada una de las cuatro fases de crecimiento.
2.4.
CRECIMIENTO EQUILIBRADO
En muchos tipos de trabajos de investigacin es conveniente emplear microorganismos que

estn creciendo en forma equilibrada o sincrnica. En la forma habitual de cultivo de bacterias la
divisin celular ocurre de manera aleatoria, y produce una mezcla de clulas que representan
todas las fases del ciclo de divisin. Los estudios con estos cultivos slo dan valores promedio.
Sin embargo, se dispone de tcnicas para sincronizar la divisin y para introducir a todas las
clulas en el cultivo para que se dividan de forma simultnea. El estudio de las matemticas del
crecimiento bacteriano se abordar desde este enfoque y las ecuaciones as obtenidas podrn
emplearse para el estudio del crecimiento bacteriano en condiciones sincrnicas y asincrnicas.
De igual forma, el estudio matemtico del crecimiento bacteriano puede abordarse de forma
individualizada en cada una de las fases del crecimiento (Curvas Lineales) o desde un enfoque

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continuo donde el crecimiento ocurre como una serie de fases sucesivas (Curva Sigmoidal).
Ecuaciones de crecimiento equilibrado: Como es sabido el crecimiento bacteriano sigue
una relacin exponencial de primer orden, esto es, que por cada clula que se divida se
originan dos nuevas (Figura 1). De esta forma se puede afirmar que el crecimiento
bacteriano se comporta de acuerdo a la siguiente relacin:
= 2 (Ecuacin 1)
donde N es el nmero de clulas y n el nmero de duplicaciones que han tenido lugar.
Si asumimos que N = Nf en determinado tiempo Nf(t), entonces Nf(t) es dependiente del
nmero inicial de clulas (N0) y del nmero de divisiones que haya tenido lugar en ese
intervalo de tiempo n(t), de esta forma si reordenamos la ecuacin 1, obtenemos la siguiente
expresin matemtica que rige el crecimiento bacteriano en funcin del tiempo:
= 0 2 (Ecuacin 2)
Velocidad relativa de crecimiento y velocidad especfica de crecimiento: Si x(t) es una
variable tiempo-dependiente que describe la variacin de cierta sustancia, como biomasa o
concentracin de la clula. La velocidad instantnea del proceso es la derivada de
x(t):dx(t)/dt. La velocidad especfica, (t), se define como:
() =
Ecc. 3
Si x(t) denota la concentracin celular entonces en un cultivo bacteriano la velocidad de

crecimiento es medida como el aumento absoluto en la concentracin celular por unidad de
tiempo de la unidad, mientras que la velocidad de crecimiento especfica es el incremento
en la concentracin celular por unidad de tiempo por clula. Una simple ecuacin muestra
que si x(t) es positivo entonces:
() =
( )
Ecc.
Por consiguiente, la velocidad de crecimiento especfica puede medirse como la inclinacin

de la curva de crecimiento cuando el logaritmo natural (ln) de x(t) se traza contra el tiempo.
Si el log10 es usado en lugar de ln, entonces la pendiente de log10 ser moderada = 2,3
veces menor que la velocidad de crecimiento especfico cuando empleamos el ln.
La velocidad de crecimiento especfica () puede calcularse a travs de la ecuacin 4.1.

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( 0 )
( 0 )
Ecc. 4.1
La velocidad de crecimiento relativo (k) puede calcularse a travs de la ecuacin 4.2.

= 2,303
( 0 )
( 0 )
Ecc. 4.2
Tiempo de duplicacin (Td) y tiempo de generacin (Tg): En un momento fijo (tfix), el

valor de (t) ser (tfix) = fix. La relacin para el tiempo de duplicacin, Td = ln2/ fix =
0.69/fix, de tal forma que si (t) permaneciera constante, al tiempo t fix + Td, la concentracin
celular sera el doble que cuando estaba a tfix. Es importante anotar que, en cultivos
asincrnicos, Td no es equivalente al tiempo medio de generacin. De hecho, el tiempo
medio de generacin puede estimarse por 1/ fix en lugar de la relacin 0.69/ fix, si la
divisin celular puede aproximarse por un proceso aleatorio, como el proceso de Poisson.
El tiempo de generacin puede calcularse a travs de la siguiente ecuacin:
=
Ecc. 5
donde t es el diferencial de tiempo y n el nmero de generaciones.

El nmero de generaciones puede estimarse a travs de la ecuacin 6:
= 3,3 ( 0 ) Ecc.6
Si reemplazamos la Ecc. 6 en Ecc. 5, el tiempo de generacin se puede calcular mediante
la ecuacin 7:
=
3,3 0
Ecc. 7
Curvas de crecimiento y muerte bacteriana: Como hemos comentado anteriormente, la

cintica de crecimiento bacteriana sigue una tendencia de primer orden, lo mismo puede
asumirse para la muerte bacteriana, esto es que al graficar el Log de la poblacin en funcin
del tiempo se obtiene una lnea que representa cmo evoluciona esta poblacin. Esta lnea
de crecimiento o muerte puede entonces ajustarse a nuevas lneas de tendencia que
comparan el crecimiento real frente a una funcin matemtica definida: funcin lineal o
funcin exponencial por mtodo grfico o estimacin lineal o estimacin logartmica por
medio de frmulas Excel, de las cuales pueden obtenerse la ecuacin que representa cada
una de estas funciones, su coeficiente de correlacin R 2 o los valores de las diferentes
constantes. En este caso puede asumirse que el crecimiento o muerte bacteriana sigue una

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tendencia lineal o exponencial dependiendo del valor de R 2, cuando R2 se aproxima a 1 el

comportamiento bacteriano sigue esa tendencia. A manera de ejemplo, si en un estudio de
crecimiento se ajusta la grfica de los datos a una funcin lineal con un R2 = 0,955 y a una
funcin exponencial con un R2 = 0,985, la tendencia de crecimiento de esa poblacin se
comporta ms como una funcin exponencial que una lineal.
En el caso de un comportamiento se dice que es lineal cuando la grfica de la poblacin final
a un tfix es una lnea recta; y por consecuencia tiene la forma:
y = f(x)= mx + b
Donde m representa la pendiente de la recta y b la ordenada al origen (es el punto de
interseccin de la recta al eje de las y. Tambin es importante mencionar que este tipo de
funciones crecen a tasas constantes; y en ellas puede calcularse tanto el tiempo (t) como
una densidad de poblacin (y) especfica.
Si el crecimiento se ajusta a un comportamiento exponencial, puede obtenerse la poblacin
final a un tfix o calcularse el tiempo a una densidad de poblacin y a travs de una ecuacin
exponencial que adopta la forma:
y = f(x) = ax
y = f(x) = cebx
Donde la base a es una constante positiva, c y b son constantes y e es la base del logaritmo
neperiano.
Por otro lado, si los datos de crecimiento se asemejan a una funcin logartmica, la
poblacin final a un tfix o el tiempo a una densidad de poblacin y puede calcularse por
medio de una ecuacin que adopta la forma:
y = f(x) = logax
y = f(x) = blnmx
Donde la base a es una constante positiva, b es una constante equivalente a c y lnm es la
constante equivalente a eb. Es importante aclarar que las funciones logartmicas son las
inversas a las exponenciales.
2.5.
MODELAMIENTO DEL CRECIMIENTO

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El desarrollo de los diversos modelos de prediccin empleados en microbiologa descansa

sobre bases matemticas preestablecidas con anterioridad, sin importar tanto si se trata de
modelos probabilsticos, cinticos, mecansticos, etc,. Como comentaba en la introduccin de
este manual, los orgenes del modelamiento microbiano se sita sobre los aos de 1922 cuando
Esty y Meyer desarrollan un modelo para estimar el tiempo necesario para reducir las esporas de
Clostridium botulinum tipo A de 1012 a 100 (Conocido como coccin botulnica). En 1949, J.L.
Monod desarroll un modelo matemtico para representar el crecimiento equilibrado de una
poblacin bacteriana, posteriormente este modelo fue aplicado a la industria de la fermentacin.
En aos posteriores diversos investigadores empezaron a explicar en forma de expresiones
matemticas la relacin existente entre el nmero de bacterias finales en funcin del tiempo y
como varan estas con respecto a la aplicacin de algn factor externo que influye sobre su
crecimiento/supervivencia.
Uno de los factores que ms ha influido en el desarrollo de la microbiologa predictiva ha

sido el empleo de las nuevas tecnologas informticas, y en especial la aparicin y desarrollo de
herramientas de clculo como Excel de Microsoft Office, Calc de OpenOffice.org (Software
Gratuito), Calc de StarOffice, etc. Estas nuevas opciones han facilitado por un lado comprometer
conceptualmente a todas aquellas personas poco familiarizadas con el lgebra en la ayuda de
visualizacin de las ecuaciones y sus soluciones de nuevas maneras y no de la forma tradicional,
es decir haciendo nfasis en la repeticin y las reglas del algoritmo. Con el empleo de estas
herramientas en concepto de Margaret Niess se logra que el foco del pensamiento del estudiante
se traslade del campo algortmico al de la verdadera comprensin del concepto.
El modelamiento microbiano tampoco ha escapado a esta nuevas herramientas, antao el

desarrollo de ecuaciones simples de prediccin (modelos primarios) requera del conocimiento
profundo de las matemticas y en especial del lgebra para poder llegar al fin absoluto del
trabajo: la obtencin de un modelo matemtico expresado como una ecuacin que permita
predecir en futuras ocasiones el comportamiento de los microorganismos, sin embargo, con el
desarrollo de estas herramientas tecnolgicas, esta labor se ha vuelto un tanto ms simple. Esto
no quiere decir que se abandone del todo el mtodo ms clsico, ya que todos los modelos no
son iguales ni funcionan de la misma forma, esto depende del fin con el cual fue hecho, por
ejemplo: si es aplicable para todos o solo algn grupo microbiano de inters, las condiciones
particulares de prueba y validacin con que fue hecho entre otros.
Los datos obteniendo grficos, ecuaciones y tendencias del comportamiento microbiano. As

mismo, se han desarrollado bases de datos y programas estadsticos grficos y software
especficos de modelamiento, que con solo digitar algunos datos permiten observar y predecir el
comportamiento microbiano. Dentro de las bases de datos ms conocidas est el ComBase
Predictor, y ejemplos de programas estadsticos grficos son el Prisma, Staph Graphic Plus,

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Statistica, SPSS, Microfit, DMFit, mientras ejemplos de software especficos son: Pathogen
Modeling Program (PMP), Seafood Spoilage and Safety Predictor (SSSP).
ACTIVIDAD PRCTICA 1: CONSTRUCCIN DE CURVAS DE CRECIMIENTO-MUERTE

BACTERIANA Y ESTIMACIN DE PARMETROS CINTICOS EMPLEANDO LA HOJA DE
CLCULO MICROSOFT OFFICE Y OPEN OFFICE.
En la presente actividad se explica cmo desarrollar las grficas de crecimiento bacteriano,

as como la estimacin de diversos parmetros cinticos por los mtodos grficos y
matemticos, empleando como herramienta las hojas de clculo de los programas Office 2007
y Open Office 3.1 . Las grficas de muerte sern vistas en una unidad posterior.
2.6.
MATERIALES, EQUIPOS E INSUMOS

Computador con paquete Microsoft Office 2003 o posterior o OpenOffice 3.1. Para esta
prctica emplearemos el software Office 2007 de Microsoft.
2.7.
REACTIVOS
No se requieren.
2.8.
PROCEDIMIENTO
Antes de abordar el procedimiento, debemos aclarar que en esta prctica se emplear un
ejemplo sencillo de crecimiento equilibrado con independencia de fases de la curva de
crecimiento, es decir, que los datos se manejaran teniendo en cuenta solo la fase de
crecimiento exponencial y no los datos de crecimiento de una curva completa, la cual se
abordar en una prctica posterior. Tambin se presentarn dos procedimientos (mtodo
grfico y mtodo de las funciones) en forma de ventanas.
Mtodo grfico
A travs de ventanas que representa la hoja de clculo Excel desarrollaremos un ejercicio
de construccin de curvas de crecimiento y estimacin del mismo, con los supuestos datos
de crecimiento de S. aureus (100 UFC/g) mostrados en la Tabla 1, donde el
microorganismos mantenido durante 25 horas a 37C.
Tabla 1: Resultados supuestos del crecimiento de S. aureus en caldo BHI incubado a 37C
durante 25 horas.

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Tiempo (horas)
Poblacin (UFC/g)
Tiempo (horas)
Poblacin (UFC/g)
0,0
100
13,0
61659500
1,1
105
14,1
141253754
2,2
230
15,1
251188643
3,3
1230
16,2
354813389
4,3
4266
17,3
426579519
5,4
15136
18,4
457088190
6,5
52481
19,5
478630092
7,6
186209
20,5
489778819
8,7
645654
21,6
489778819
9,7
2187762
23,4
489778819
10,8
7244360
25,2
489778819
11,9
22387211
-----
---------
PASO 1: Los datos de crecimiento se representan en una hoja de Excel, a la densidad de

poblacin (UFC/g) le calcularemos el log10 y Ln insertando en la casilla C2 la siguiente orden
=LOG10(B2) y en la casilla D2 =LN(B2), de esta forma calculamos los logaritmos para la
poblacin al tiempo 0, continuamos con el mismo procedimiento para las dems casillas o
simplemente arrastraremos la frmula. De igual forma procedemos a calcular la tasa de
crecimiento especfica () para el primer intervalo de tiempo en E2 =(D3-D2)/(A3-A2)
empleando la ecuacin 3 y velocidad de crecimiento relativo k =(C3-C2)/(0,301*(A3-A2)) en
F2 o =(D3-D2)/(0,693*(A3-A2)) en G2 (Fig 2).
Figura 2. Cuadro de datos de crecimiento de S. aureus.

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PASO 2: Para proceder a graficar los datos de crecimiento, seleccionamos en la columna B

las filas correspondientes desde B2 hasta B24 (B2:B24) que corresponde a los datos de
crecimiento de S. aureus expresado en UFC/g (Fig. 3). Si seleccionamos (C2:C24)
obtendremos la grfica del crecimiento de S. aureus expresado como log10UFC/g o
(D2:C24) para representar el crecimiento en lnUFC/g (Fig 4).
Figura 3. Representacin del crecimiento de S. aureus en notacin cientfica.

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Crecimiento de S. aureus (UFC/g)

600000000
500000000
400000000
300000000
200000000
100000000
0
0,0
5,0
10,0
15,0
20,0
25,0
30,0
Figura 4. Representacin del crecimiento de S. aureus en notacin logartmica.
Crecimiento de S. aureus (Ln o Log10) UFC/g

25,000
20,000
15,000
Ln UFC/g
10,000
Log10 UFC/g
5,000
0,000
0,0
5,0
10,0
15,0
20,0
25,0
30,0
En los siguientes pasos calcularemos los diversos parmetros del crecimiento tales como:
velocidad media especfica de crecimiento, duracin de la fase de latencia y duracin de la
fase exponencial. As mismo, con los datos anteriores, calcularemos el tiempo medio de
generacin.
PASO 3: De acuerdo con la figura anterior procedemos a graficar nuevamente los datos de
crecimiento exponencial, para tal fin seleccionaremos aquella porcin del crecimiento en el
cual la poblacin aumenta de forma lineal. Seleccionamos la pestaa Insertar y all
escogemos la opcin Dispersin y elegimos el grfico con lneas suavizadas y
marcadores.

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Figura 5. Seleccin del tipo de grfico de crecimiento de S. aureus.
Posteriormente, en la pestaa de Diseo escogemos la opcin Seleccionar datos, segn

muestra la Figura 6.
Figura 6. Seleccin del tipo de grfico de crecimiento de S. aureus.
PASO 4: Inmediatamente hemos escogido la opcin Seleccionar datos se despliega una

ventana como el que se muestra en la Figura 7a. En esta ventana deberemos seleccionar
Agregar y se despliega una nueva ventana donde escogeremos los valores tanto del eje X
(2) como del eje Y (3) a graficar, as como el nombre de la serie (1) (Figura 7b). Para tal fin
damos un click sobre las tablas que aparecen seleccionadas en la figura 7b.
Figura 7. a) Ventana principal Seleccionar origen de datos; b) Ventana secundaria
seleccionar datos.

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1
2
3
1) Nombre de la serie: escogemos el nombre que queremos para la curva, por ejemplo si
graficamos el logaritmo 10 de los datos de crecimiento, seleccionamos la casilla C1.
2) Valores de X: Para nuestro caso seleccionaremos los correspondientes al tiempo desde
A5 hasta A13.
3) Valores de Y: En nuestro ejemplo escogemos los correspondientes al crecimiento en
logaritmo 10, desde C5 hasta C13.
Una vez finalizada la opcin de cargar datos para la curva damos click en Aceptar segn
se muestra en la figura 8; posteriormente repetimos el procedimiento del PASO 4 para
cargar los datos de crecimiento en logaritmo natural (ln UFC/g).
Figura 8. Ventana Secundaria de datos diligenciada.
PASO 5: Al finalizar de cargar los datos de logaritmo natural obtendremos la grfica con los
crecimientos lineales de la fase exponencial. Posteriormente nos ubicamos con el cursor
sobre la lnea que representa el crecimiento y damos clic con el botn derecho del ratn, y
seleccionamos la opcin Agregar lnea de tendencia segn se muestra en la figura 9.
Figura 9. Ventana principal de Agregar lnea de tendencia..

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PASO 6: En la siguiente ventana (figura 10) escogemos la opcin de tendencia lineal en la

ventana tipo y en la ventana opciones marcamos presentar ecuacin en el grfico y
presentar R cuadrado; posteriormente damos click en aceptar. Repetimos esta operacin
para la otra lnea de crecimiento, y as obtendremos la grfica de la figura 11.
Figura 10. Ventana principal de Formato de lnea de tendencia.
Figura 11. Curva de crecimiento exponencial de S. aureus con sus respectivas ecuaciones
y coeficientes de determinacin.

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Logx UFC/g
Crecimiento exponencial de S. aureus

18,000
16,000
14,000
12,000
10,000
8,000
6,000
4,000
2,000
0,000
Ln UFC/g
y = 1,1437x + 3,4217
R = 0,9997
Log10 UFC/g
0,0
5,0
10,0
y = 0,4967x + 1,486
R = 0,9997
15,0
Tiempo (horas)
Al analizar la figura 11 podemos observar que los coeficientes de determinacin o regresin

(R2) son prximos a 1 (0,999). Por lo tanto, las ecuaciones obtenidas sern las que
emplearemos para el clculo de los parmetros cinticos.
Mtodo de las frmulas en Excel

En algunos casos puede ser que no contemos con una hoja de clculo Excel que permita
construir las grficas y agregar las lneas de tendencia, tal como ocurre con algunos
paquetes ofimticos como el IBM Lotus Symphony (el cual est basado en la tecnologa de
OpenOffice.org), o el mismo Open Office en versiones inferiores a la 3.0. En estos softwares
se pueden agregar grficos pero las ecuaciones de regresin no se pueden obtener tan
fciles como en Excel o en OpenOffice Cal V 3.0 o mayor. En estos casos podemos usar
una funcin que traen las hojas de clculo denominada Estimacin Lineal.
Esta funcin calcula las estadsticas de una lnea utilizando el mtodo de "mnimos
cuadrados" para calcular la lnea recta que mejor se ajuste a los datos y, a continuacin,
devuelve una matriz que describe la lnea. Debido a que esta funcin devuelve una matriz
de valores, debe ser especificada como una frmula de matrices. La ecuacin de la curva
es la ecuacin de la recta: = + = 11 + 22 + +
(si hay varios rangos de valores X), donde el valor Y dependiente es funcin de los valores
X independientes. Los valores m son coeficientes que corresponden a cada valor X, y b es
un valor constante. Observe que Y, X y m pueden ser vectores. La matriz que devuelve
ESTIMACION.LINEAL es {mn,mn-1,...,m1,b}. ESTIMACION.LINEAL tambin puede
devolver estadsticas de regresin adicionales. Para mayor conocimiento de esta funcin
puede consultar la ayuda de Excel.

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Conocido y: es el conjunto de valores de y que se conocen en la relacin y = mx+b.

Conocido x: es un conjunto opcional de valores x que se conocen en la relacin y =
mx+b.
Constante: es un valor lgico que especifica si se ha de hacer que la constante b sea
igual a 0, si el argumento constante es VERDADERO o se omite, b se calcula
normalmente; pero si constante es FALSO, b se establece como igual a 0 y los valores
m se ajustan para encajar en y = mx.
Estadstica: es un valor lgico que especifica si se deben devolver estadsticas de
regresin adicionales. Si estadstica es VERDADERO, ESTIMACION.LINEAL devuelve
las estadsticas de regresin adicionales (Tabla 2), si estadstica es FALSO o se omite,
ESTIMACION.LINEAL slo devuelve los coeficientes m y la constante b.
Tabla 2. Estadsticas de regresin adicionales si estadstica es VERDADERO.

Estadstica
se1,se2,...,sen
Descripcin
Los valores de error estndar para los coeficientes m1,m2,...,mn.
seb
El valor de error estndar para la constante b (seb = #N/A cuando constante es

FALSO).
r2
El coeficiente de determinacin. Compara los valores y calculados y reales, y los

rangos con valor de 0 a 1. Si es 1, hay una correlacin perfecta en la muestra, es
decir, no hay diferencia entre el valor y calculado y el valor y real. En el otro extremo,
si el coeficiente de determinacin es 0, la ecuacin de regresin no es til para
predecir un valor y.
sey
El error estndar para el clculo y.
La estadstica F o valor F observado. Utilice la estadstica F para determinar si la

relacin observada entre las variables dependientes e independientes se produce por
azar.
df
Grados de libertad. Utilice los grados de libertad para encontrar valores F crticos en
una tabla estadstica. Compare los valores que encuentre en la tabla con la
estadstica F devuelta por ESTIMACION.LINEAL para determinar un nivel de
confianza para el modelo.
ssreg
La suma de regresin de los cuadrados.
ssresid
La suma residual de los cuadrados.
Para el mtodo de las frmulas emplearemos el mismo ejemplo del caso anterior.
PASO 1: En la ventana principal de la hoja de clculo seleccionamos 5 casillas en blanco en
dos columnas seguidas, posteriormente en la pestaa Frmulas seleccionaremos Insertar
Funcin como se muestra en la figura 12.

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Figura 12. Ventana principal de la hoja de clculo Excel
PASO 2: En la ventana Insertar Funcin (Figura 13) seleccionamos en categora todas y

buscamos la opcin ESTIMACION.LINEAL, damos clic en aceptar. Tambin podemos
seleccionar la funcin ESTIMACIN.LOGARTMICA, para aquellos casos donde el
crecimiento se ajusta a una funcin exponencial.
Figura 13. Ventana de seleccin de funciones.
PASO 3: Posteriormente complementamos la informacin que se despliega en la ventana de

Argumentos de funcin mostrada en la figura 14.
Figura 14. Ventana de argumentos de la funcin Estimacin.Lineal.

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Los argumentos a escribir en esta ventana para completar la informacin son los siguientes
(figura 15).
En el cuadro Conocido_y escribimos D5:D13 que representa el logaritmo natural del
crecimiento de la poblacin (mismos valores seleccionados en el paso 4 del mtodo
grfico).
En el cuadro Conocido_x escribimos A5:A13 que representa el tiempo durante el
cual crece la poblacin (mismos valores del tiempo seleccionados en el paso 4 del
mtodo grfico).
En la casilla correspondiente a Constante y Estadstica escribimos la palabra
VERDADERO.
Figura 15. Ventana de argumentos de la funcin Estimacin.Lineal completa.
PASO 4: Una vez diligenciada esta informacin presionamos al tiempo las teclas: Ctrl + Shif
+ Alt + Aceptar de la ventana anterior. La tecla Shif corresponde a aquella que tiene la
flecha:
. Al final obtendremos los datos mostrados en la siguiente figura:

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Figura 16. Resultados finales de la estimacin lineal.
Estimacin lineal
1,14372017
3,42169901
0,00746925
0,06030027
0,99970154
0,06239195
23446,9196
7
91,2731138
0,02724929
En la ilustracin anterior los datos de estimacin lineal corresponden en su orden a las
siguientes estadsticas de regresin correspondientes a la funcin lineal:
H2: Pendiente m (1,14372017)

H3: Error estndar para el coeficiente m (0,00746925)
H4: Coeficiente de determinacin o regresin (0,99970154).
H5: Valor F observado (23446,9196).
H6: Suma de regresin de los cuadrados (91,2731138).

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I2: Constante b (3,42169901).

I3: Error estndar para la constante b (0,06030027).
I4: Error estndar para el clculo Y (0,06239195).
I5: Grados de libertad (7).
I6: Suma residual de los cuadrados 0,02724929).
Con los datos obtenidos puede entonces construirse la ecuacin lineal. Si = + ,

entonces al reemplazar los datos la ecuacin queda conformada as:
= 1,1437 + 3,4217
R2 = 0,9997
Como podemos ver, estos datos son los mismos obtenidos en la figura 11 (mtodo grfico).
Clculo de los parmetros cinticos

De acuerdo con Zwietering et al. (1992), a partir de los datos de crecimiento pueden estimarse
diversos parmetros cinticos, entre ellos la duracin de las fases de latencia () y exponencial
(), fin de la fase de crecimiento (), la velocidad especfica de crecimiento () y la mxima
velocidad especfica de crecimiento (mx).
La forma ms comn de calcular la duracin de la fase de latencia () es la extrapolacin de la
tangente en el punto de inflexin de la curva de crecimiento, hasta que corta con la recta
equivalente al nivel inicial de inoculacin (Ymin). Despus de esta fase de latencia se establece la
fase exponencial. El final de esta fase exponencial () se puede definir como el momento en el
que la extrapolacin de la tangente en el punto de inflexin corta con la recta de la mxima
densidad poblacional (Ymx). La duracin de la fase exponencial () surge entonces de restar el
tiempo final de la fase exponencial menos el tiempo de duracin de la fase de latencia. La
velocidad especfica de crecimiento () corresponde con el valor de la pendiente en la grfica del
Ln UFC/g vs tiempo, mientras que la mxima velocidad especfica de crecimiento ( mx)
corresponde a la mxima velocidad vista en todos los intervalos de tiempo.
De acuerdo con los datos del ejemplo que nos ocupa, identificamos los siguientes valores:
Ymin = 4,605 ln UFC/g
Ymx = 20,009 ln UFC/g
Ecuacin de la recta: y = 1,1437x + 3,4217
Duracin de la fase de latencia:
= (y 3,4217) / 1,1437
= (4,605 3,4217) / 1,1437
= 1,0346 horas.

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Final de la fase exponencial:

= (y 3,4217) / 1,1437
= (20,009 3,4217) / 1,1437
= 14,5932 horas.
Duracin de la fase exponencial:
= 14,5932 1,0346
= 13, 5586 oras.
Velocidad especfica de crecimiento:
=m
= 1,1473 ln UFC/g*hora
Mxima Velocidad de crecimiento especfico: este parmetro para nuestro ejemplo se obtiene de
la columna E (). En ella debemos escoger la casilla en la cual se observa la mayor velocidad y
que en nuestro caso corresponde a E4 (intervalo entre las 2,2 horas y 3,3 horas).
2.9.
mx = 1,5243 ln UFC/g*hora que corresponde al intervalo =(D5-D4)/(A5-A4).

NIVEL DE RIESGO
Para el desarrollo de la anterior prctica se ha definido un nivel de Riesgo Bajo o nivel 1; es decir
que se requiere del uso de Bata de Laboratorio Manga Larga, Zapato Cerrado Bajo, Pantaln
Largo.
2.10.
BIBLIOGRAFA
Labuza, T. (2004). Predictive Microbiology Principles. Department of Food Science and
Nutrition. University of Minnesota. USA. Pp. 12.
Nies, M.L. (2006). Using Computer Spreadsheets to Solve Equations. Learning & Leading
with Technology, 3(23).
Monod, J. (1949). The growth of bacterial cultures. Annual Review of Microbiology 3: 371
394.
Microsoft Office Excel 2007 de Microsoft Corporation Inc. Marca registrada.
Zwietering, M.H., Rombouts, F.M., vant Riet, K. (1992). Comparison of definitions of the lag
phase and the exponential phase in bacterial growth. J. Appl. Bacteriol., 72: 139145.
Madigan, M.T., Martinko, J.M., Dunlap, P.V., Clark, D.P., Brock, T. (2008). Chapter 6:
Microbial Growth - Unit 1: Principles of Microbiology. In: Brock Biology of Microorganisms:
International Edition. 20th ed. Prentice Hall Edit.
Willett, H.P. (1997). Captulo 5 Fisiologa del crecimiento bacteriano. En: Zinsser
Microbiologa. 20 edicin. Joklik, W.K., Willett, H.P., Amos, B., Wilfert, C.M., Editores.
Editorial Mdica Panamericana S.A. Buenos Aires, Argentina. Pgs. 78 109.

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ACTIVIDAD 2
ESTANDARIZACIN DE UNA CURVA PATRON DE CRECIMIENTO BACTERIANO POR
MTODO TURBIDIMTRICO (PATRN McFARLAND) Y RECUENTO EN PLACA.
2.11.
OBJETIVOS
Los objetivos que se buscan con esta prctica son:

Diferenciar entre los distintos tipos de mtodos de recuento bacteriano y discernir cual
de ellos emplear bajo diversas situaciones.
Comprender los fundamentos que rigen los diversos mtodos instrumentales de
recuento microbiano.
Construir una curva patrn para la medida indirecta del crecimiento diversas bacterias
(E. coli, S. aureus, etc.) para futuras prcticas.
Ahorrar material de laboratorio, tiempo de trabajo, etc., en el desarrollo de las futuras
actividades relacionadas a la asignatura de Microbiologa predictiva.
Obtener ecuaciones de primer orden para la prediccin del crecimiento de estas
bacterias dependiente de la poblacin inicial a temperatura constante.
2.12.
MARCO TERICO
El crecimiento de una poblacin bacteriana puede ser entendido desde perspectivas

diferentes y de acuerdo a stas se puede llegar a determinar la medida del crecimiento
mediante diversas metodologas. Para algunos, el crecimiento es la capacidad que tienen las
clulas individuales para multiplicarse, esto es iniciar y completar una divisin celular. De
esta forma, se considera a los microorganismos como partculas discretas y el crecimiento
es entendido como un aumento en el nmero total de partculas bacterianas. Existen varias
formas de determinar el nmero total de microorganismos en una muestra: Determinacin
del nmero de microorganismos, Determinacin de la masa celular, y Determinacin de la
actividad celular.
Independientemente de los mtodos empleados para el conteo bacteriano estos se pueden
agrupar en dos modalidades claramente definidas, as pues tendramos los mtodos de
recuento directo o cuantitativos (como su nombre lo indica nos permite contar directamente
el nmero de clulas) y aquellos indirectos o cualitativos, que a travs de la determinacin
de diversos factores nos permite correlacionar la medida de los mismos con un nmero de
bacterias. En la prctica habitual del laboratorio, los ensayos se realizan siempre con
poblaciones bacterianas, a menudo tomando muestras en diversos momentos de su
crecimiento en un medio de cultivo. En el resto del manual nos vamos a referir al crecimiento
microbiano a escala de poblaciones. Comenzaremos con describir algunos mtodos
habituales de medir ese crecimiento poblacional, algunos de los cuales sern reforzados por
el alumno en las siguientes prcticas de laboratorio.

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El crecimiento de una poblacin o cultivo bacteriano se puede expresar en funcin de:

Aumento del nmero de clulas (microorganismos).
Aumento de masa del cultivo (masa celular).
Aumento de la actividad celular.
Estos tipos de expresiones son equivalentes entre s en cultivos que estn en crecimiento
balanceado o equilibrado (en el que todos los componentes aumentan una misma proporcin
por unidad de tiempo). En cultivos cerrados (discontinuos o no equilibrados) estas
expresiones de crecimiento son coincidentes durante algn periodo pero transcurrido el
tiempo, dejan de ser equivalentes, por ejemplo la masa celular y la actividad celular.
La medida del crecimiento bacteriano puede medirse tambin mediante dos tipos de
mtodos: directos (los cuales requieren preparaciones limpias, sin partculas extraas) e
indirectos.
Ahora bien, hagamos una descripcin de cada uno de ellos:
2.2.1 DETERMINACIN DEL NMERO DE MICROORGANISMOS: Estos mtodos pueden
ser indirectos como el Recuento en placa ya sea en superficie o incorporado, Mtodo de las
diluciones mltiples o del Nmero Ms Probable, Filtracin por membrana e incubacin de
sta sobre medio de cultivo slido, o mtodos directos como Recuento microscpico directo
de los microorganismos, ya sea en frotis o en cmaras, Conteo al microscopio de
membranas, Conteo electrnico de partculas (tipo Coulter), Recuento proporcional de
Wright.
2.2.2 DETERMINACIN DE LA MASA CELULAR: El crecimiento de una poblacin
bacteriana pueden determinarse por medio de mtodos directos de conteo de la poblacin:
medida del peso seco, medida del peso hmedo, medida del volumen, determinacin del
contenido de N, etc., o bien por mtodos indirectos como turbidimetra (escala de McFarland
y espectrofotometra) y Nefelometra.
2.2.3 DETERMINACIN DE LA ACTIVIDAD CELULAR: Este tipo de conteo nos permite
entre otros la determinacin de una actividad enzimtica, determinacin de un metabolito,
medida del consumo de oxigeno, medida de ATP, calorimetra, medida de impedancia,
radiometra (de C02).
A los efectos de llevar a cabo cualquier tcnica de recuento, hay que tener en cuenta el tipo
de muestra sobre la que se va a trabajar, por cuanto es posible que algunos de los mtodos
no sean aplicables. Cuando es necesario llevar a cabo diluciones, la toma y preparacin de
la muestra se realiza de la manera comn. En las descripciones que siguen se denominar
homogeneizado a la muestra preparada para su anlisis microbiolgico.

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Los primeros incluyen normalmente el recuento en placa (mucho trabajo, costos, tiempo) o
conteo directo al microscopio (cmara de Neubauer), mientras los segundos cuantifican
indirectamente la poblacin a travs de diferentes mtodos:
Mtodos elctricos: impedancia, conductancia.
Mtodos turbidimtricos pticos: Escala de McFarland.
Mtodos turbidimtricos instrumentales: Absorbancia, Tramitancia.
Citometra de flujo
Otros.
2.2.4 MTODOS TURBIDIMTRICOS INSTRUMENTALES: La medicin del crecimiento
por mtodos turbidimtricos resulta ser ms rpido y til, para obtener una estimacin del
nmero de clulas o biomasa. Una suspensin celular aparece turbia porque las clulas
dispersan la luz que atraviesa la suspensin. Cuantas ms clulas haya ms luz se dispersa
y ms turbia aparece la suspensin. La turbidez puede medirse con un fotmetro o un
espectrofotmetro, aparatos que hacen pasar la luz a travs de una suspensin celular y
detectan la cantidad de luz no dispersada. La mayor diferencia entre estos dos instrumentos
es que el fotmetro emplea un filtro simple (normalmente rojo, verde o azul) para generar
luz incidente de una amplitud de onda relativamente ancha, mientras que el
espectrofotmetro emplea un prisma o red de difraccin para generar luz incidente de banda
estrecha. Sin embargo, ambos aparatos miden solamente luz no dispersada expresando los
resultados en unidades fotomtricas (por ejemplo, Unidades Klett) o unidades de densidad
ptica (DO) para espectrofotmetro.
Para organismos unicelulares, las unidades fotomtricas DO son proporcionales (dentro de
ciertos lmites) a la masa celular y tambin al nmero de clulas. Por tanto las medidas de
turbidez pueden utilizarse como un sustituto para otros mtodos de contaje. Sin embargo y
antes de utilizar la turbidez como mtodo de contaje, hay que realizar una curva estndar
que relacione medidas directas (microscpicas o por recuento en placa) con las unidades
indirectas de turbidez (DO) (Francois et al., 2007). Tales curvas contienen datos para
nmero de clulas y masa celular, permitiendo la estimacin de ambos parmetros a partir
de una sola medida de la turbidez.
A elevadas concentraciones de clulas, la luz dispersada de la unidad detectora puede ser
rescatada por otra (apareciendo a la fotoclula como si nunca se hubiese dispersado).
Cuando esto ocurre, la correspondencia uno a uno entre nmero de clulas y turbidez pierde
linealidad. Sin embargo, dentro de ciertos lmites, las medidas de turbidez pueden ser
razonablemente precisas y adems tienen la virtud de ser rpidas y fciles de tomar.
Adicionalmente, las medidas de turbidez pueden tomarse sin distorsionar mucho las
muestras. Por estas razones, las medidas de turbidez se emplean ampliamente para seguir
el crecimiento de los cultivos microbianos; se puede medir repetidamente la misma muestra
y construir grficos semilogartmicos para calcular tiempos de generacin. La poblacin

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bacteriana puede determinarse midiendo la turbidez del cultivo a diferentes intervalos de

tiempo y confrontando estos resultados con medidas directas de la poblacin a los mismos
intervalos de tiempo por ejemplo mediante recuento directo en placa.
El cambio de luz se registra en el espectrofotmetro como porcentaje de transmisin
(cantidad de luz transmitida) y absorbancia o densidad ptica (D.O.), valor derivado del
porcentaje de transmisin, correspondiente al log del cociente entre la intensidad de luz
incidente sobre la suspensin (Io) y la de la luz transmitida por la suspensin (I). A = log Io/I.
Cuando se inocula una pequea poblacin bacteriana en un medio de cultivo lquido
adecuado, generalmente el crecimiento no comienza inmediatamente, sino que hay un
perodo de latencia. Una vez que empieza el crecimiento, se observa un incremento
exponencial en la densidad celular, que corresponde a la fase exponencial de crecimiento.
Esta fase es la ms significativa en el ciclo de crecimiento de los microorganismos y se
caracteriza porque los parmetros cinticos del crecimiento (, k) se mantienen constantes.
A medida que el crecimiento avanza, la concentracin de los nutrientes esenciales
disminuye, y se acumulan los productos finales del metabolismo, hasta que el crecimiento
llega a detenerse, de modo que el cultivo entra en fase estacionaria. Despus las clulas
lentamente se mueren, lisndose en algunos casos, en una ltima fase de muerte celular
(Figura 2.1).
Figura 2.1. Representacin grfica de las fases de crecimiento bacteriano
(Tomado de Labuza, 1994).
Tomado de Schlessinger et al., 1994.
2.13.

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2 frascos Erlenmeyer con 99 mL de caldo BHI.

48 tubos de ensayo con 9 mL de agua peptona.
64 Pipetas estriles de 1 mL.
16 Pipetas estriles de 10 mL.
96 cajas de petri estriles con agar BHI.
12 tubos de ensayo estriles.
Incubadora de 35C +/- 2C
Espectrofotmetro calibrado a 600 nm.
Celdas plsticas para espectrofotometra.
2.14.
REACTIVOS
Patrn de McFarland 5 (0,5 ml de BaCl2 al 1,175% + 9,5 ml de H2SO4 al 1%) (Ver anexo 2.1 y
2.2, preparacin y control de calidad del estndar de McFarland).
2.15.
PROCEDIMIENTO
2.5.1 Cultivos
Se usaran cultivo puros en fase exponencial de diversas bacterias (por ejemplo E. coli
ATCC25922 o S. aureus ATCC29213). Estos cultivos sern mantenidos a 37C durante 24 horas
en caldo Infusin-Cerebro-Corazn (Brain Heart Infusin - BHI) (Oxoid Ltd., Basingstoke, UK)
para ser usadas en la estandarizacin de las curvas de crecimiento de estas bacterias, las
cuales se usarn como referencia para el desarrollo de las dems actividades prcticas de la
asignatura.
2.5.2 Preparacin del inoculo, mantenimiento del cultivo y medida directa del crecimiento:
1.
A partir de un cultivo bacteriano (en fase exponencial) preparar una suspensin inicial
(Patrn 1 P1) de la cepa seleccionada y ajustarla a una turbidez correspondiente al
patrn McFarland 0,5, el cual equivale aproximadamente a 1,5x108 bacterias/ml
(ICONTEC, 2000). De este cultivo preparar una dilucin 1:10 (Patrn 2 P2) inoculando 1
ml de P1 en un tubo conteniendo 9 ml de caldo BHI (poblacin final equivalente a 1,5x107
bacterias/ml).
2.
A partir de P2 preparar cinco diluciones 1:10 para obtener los patrones P3, P4, P5, P6 y
P7 con unas poblaciones aproximadas a 1,5x106 bacterias/ml; 1,5x105 bacterias/ml;
1,5x104 bacterias/ml; 1,5x103 bacterias/ml y 1,5x102 bacterias/ml, respectivamente.
3.
A partir de cada patrn preparar diluciones decimales (1:10) consecutivas en agua
peptona estril de tal forma que la poblacin terica final sea de 1,5x102 bacterias/ml,
segn el esquema anexo al final de la gua (ver anexo 2.3). De la ltima dilucin sembrar

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en profundidad y por duplicado 0,1 ml para cada patrn. De la dilucin anterior sembrar en
profundidad y por duplicado 1 ml de cada patrn. Adicionar 15 mL de agar BHI y
homogenizar las cajas, llevando a incubar la totalidad de las cajas a una temperatura de
35C 2C por 24 48 horas.
Al finalizar el tiempo de incubacin, realizar los clculos de la poblacin as:
4.
De esta forma se calcula la poblacin en ufc/mL equivalentes al patrn 1, la cual ser

correlacionada con el valor inicial de la curva obtenida por espectrofotometra.
A partir de cada patrn (P1, P2, P3, P4, P5, P6 y P7) determine el valor de la absorbancia
a 600 nm, de esta forma obtendremos el equivalente en Ab para cada patrn, la cual ser
correlacionada con el recuento en placa profunda para cada patrn.
Con ayuda de Excel obtener una grfica de dispersin donde ubicaremos en el eje X el
valor de la absorbancia y en el eje Y el Log10 de la poblacin. Posteriormente usando
regresin lineal, agregar la lnea de tendencia que mejor ajuste tenga segn el coeficiente
de regresin (R2) y obtener el valor de la ecuacin.
Esta ecuacin es la que usaremos para futuros clculos de poblacin. Solo basta con
preparar el inoculo inicial del microorganismo (en nuestro caso Escherichia coli
ATCC25922 y Staphylococcus aureus ATCC29213) medir la absorbancia y reemplazar
este valor en la X de ecuacin. De esta forma obtendremos el valor aproximado de la
poblacin en ufc/ml.
5.
6.
7.
2.16.
RESULTADOS
Construir la curva experimental de absorbancia vs LnN empleando los datos recogidos en la

siguiente tabla 2.1:
Tabla 2.1. Tabla de resultados de la actividad prctica 2.
Patrn
(dilucin del
patrn)
Poblacin terica
(cel/ml)
1 (100)
1,5x108
2 (10-1)
1,5x107
3 (10-2)
1,5x106
4 (10-3)
1,5x105
5 (10-4)
1,5x104
Absorbancia
media (600 nm)
Media
Poblacin
(ufc/ml)
Poblacin real
(Ln ufc/ml)

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6 (10-5)
1,5x103
7 (10-6)
1,5x102
Ajustar la curva a la funcin ms adecuada (lineal, exponencial o logartmica). Calcular la

ecuacin de prediccin y corregir hasta obtener un R 2 > 0,98. Trabajar con un mnimo de 4
valores de referencia. La ecuacin as obtenida ser la que se emplear para los clculos de la
poblacin final a diferentes intervalos de tiempo en las prcticas siguientes.
2.17.
NIVEL DE RIESGO
Para el desarrollo de la presente prctica se ha definido un Nivel de Riesgo Medio o Nivel 2, ya

que se manejaran microorganismos considerados oportunistas y que en algn momento por
malas prcticas de laboratorio pueden conllevar algn peligro para los manipuladores. Por tanto,
todo estudiante, auxiliar y docente que oriente e intervenga en el desarrollo de la misma deber
usar los siguientes equipamientos:
Bata de Laboratorio manga larga, Guantes, Cofia, Tapabocas, Zapato Cerrado Bajo,
Pantaln Largo.
2.18.
BIBLIOGRAFA
Schlessinger, D., Schaechter, M., Eisenstein, B.I. (1994). Biologa de los agentes infecciosos,
captulo 3. En: Microbiologa. Mecanismos de las enfermedades infecciosas, enfoque
mediante la resolucin de problemas. 2da edicin. Editores: Schaechter, M., Medoff, G.,
Eisenstein, B.I., Guerra, H. Editorial Mdica Panamericana, S.A. Buenos aires. Argentina.
Pgs. 47 76.
http://www.cdc.gov/ncidod/dbmd/diseaseinfo/cholera/ch9.pdf.
Fernndez, C.M., Gonzlez, M., Illnait, M.T., Martnez, G. (1998). Determinacin de la
concentracin mnima inhibitoria de Anfotericina B en levaduras de inters mdico. Rev
Cubana Med Trop., 50(1): 48-53.
Francois, A., Valero, A., Geeraerd, A.H., Van Impe, J.F., Debevere, J., Garca-Gimeno, R.M.,
Zurera, G., Devlieghere, F. (2007). Effect of preincubation temperature and pH on the
individual cell lag phase of Listeria monocytogenes, cultured at refrigeration temperatures.
Food Microbiol., 24: 32 43.
ICONTEC. Instituto Colombiano de Normas Tcnicas y Certificacin. (2000). NTC 2455.
Desinfectantes. Limpiadores lquidos. Desinfectantes para uso domstico. Tercera
actualizacin. 25-10-2000.
Madigan, M.T., Martinko, J.M., Parker, J. (2001). Crecimiento microbiano, Captulo 5. En: Brock
Biologa de los Microorganismos. 8 edicin revisada. Editorial Prentice Hall Iberia, Madrid,
Espaa. ISBN: 84-89660-36-0. 4 reimpresin. Pgs. 155 157.

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Willett, H.P. (1997). Fisiologa del Crecimiento Bacteriano, Captulo 5. En: Zinsser, Microbiologa.
20 edicin. Editores: Joklik, W.K., Willett, H.P., Amos, D.B., Wilfert, C.M. Editorial Mdica
Panamericana, S.A. Buenos Aires. Argentina. Pgs. 78 109.
ANEXOS
ANEXO 2.1. Escala de McFarland
Fundamento: El patrn o la escala de McFarland consiste en una serie de tubos
hermticamente cerrados, previamente calibrados y con una densidad ptica diferente originada
por la aparicin de un precipitado de sulfato de bario (SO4Ba) resultante de la reaccin entre el
cloruro de bario (Cl2Ba) al 1,175% (0,048 M) y el cido sulfrico (H 2SO4) al 1% (0,36N). Esta
turbidez puede interpretarse pticamente o por mtodos espectrofotomtricos y cada una de
ellas se corresponde a una concentracin conocida de bacterias/ml. Para cada cepa bacteriana
hay que establecer la equivalencia entre la turbidez de cada tubo y la masa o la concentracin de
bacterias (cel/ml) que genera una turbidez similar.
Inconveniente: Es un mtodo poco preciso, que solo se emplea cuando no hace falta exactitud,
ha sido desplazado por los mtodos espectrofotomtricos.
Conservacin: El estndar de McFarland puede ser almacenado hasta por 6 meses en la
oscuridad y a temperatura ambiente entre 22 a 25C. Sin embargo, se recomienda almacenarse
a ser posibles en refrigeracin.
Cuidados: Descartar despus de 6 meses o antes si su volumen es menor. Antes de cada uso,
debe agitarse muy bien usando un shaker, hasta que el precipitado blanco de sulfato de bario se
haya disuelto en todo el medio. Para asegurar la densidad del estndar de McFarland as
preparado puede ser chequeado usando un espectrofotmetro con una celda de cuarzo de 1-cm;
para el estndar 0,5 de McFarland, la absorbancia a una longitud de onda de 625 nm puede
estar entre 0,08 a 0,1. Alternativamente, el aseguramiento del estndar de McFarland puede ser
verificado por ajuste de una suspensin de una cepa control (por ejemplo, E. coli ATCC 25922) a
la misma turbidez, preparando diluciones seriadas 1:10, y realizando el respectivo recuento en
placa. La suspensin as ajustada puede tener un conteo de 1,5x10 8 ufc/ml.
Para levaduras el estndar 0,5 de McFarland es equivalente a una suspensin de 106 ufc/ml
(Andreu et al., 1998).
Preparacin: Se adicionan cantidades crecientes (o decrecientes segn corresponda) de
BaCl2*2H2O al 1,175% (p/v) en H2SO4 al 1% (v/v) de acuerdo a la siguiente tabla (Tabla 2.2.)
para obtener la equivalencia deseada:

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Tabla 2.2. Preparacin del estndar de McFarland.

Escala de
BaCl2*2H2O (0.048M)
H2SO4 (0.36N)
McFarland
ml final
[ ] celular
0,1
9,9
10,0
3 x 108
0,2
9,8
10,0
6 x 108
0,3
9,7
10,0
9 x 108
0,4
9,6
10,0
12 x 108
0,5
9,5
10,0
15 x 108
0,6
9,4
10,0
18 x 108
0,7
9,3
10,0
21 x 108
0,8
9,2
10,0
24 x 108
0,9
9,1
10,0
27 x 108
10
1,0
9,0
10,0
30 x 108
Fuente: ICONTEC, 2000.

Los estndares de turbidez se preparan en tubos similares a los que se emplearan para preparar
la suspensin del inoculo. Despus, el tubo debe ser bien tapado usando una tapa rosca con
tefln, Parafilm, o algn otro medio que evite la evaporacin del mismo. Esta escala de 3x10 8 a
3x109 bacterias por ml es de gran utilidad en cuanto que, en la mayora de los experimentos, los
conteos quedarn dentro de estos lmites, excepto en los casos de muy bajo crecimiento.

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ANEXO 2.2. Procedimiento para la preparacin y control de calidad del estndar 0,5 de
McFarland (Equivalente a 1,5x108 bact/ml)
Fuente: Fernndez et al., 1998.

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ANEXO 2.3. Esquema de trabajo curva de calibracin de poblacin por mtodo

turbidimtrico y recuento en placa.
LECTURA TURBIDIMTRICA
P1
PT = 108
RECUENTO EN PLACA
Cultivo madre de E. coli / o S. aureus
fluorescens
1 ml
PT =102
P2
PT = 107
1 ml
1 ml
1 ml
1 ml
1 ml
1 ml
0,1 ml
PT =101
1 ml
Medir Absorbancia a 600 nm
PT =102
P3
PT = 106
1 ml
1 ml
1 ml
1 ml
1 ml
0,1 ml
PT =101
1 ml
PT =102
P4
PT = 105
1 ml
1 ml
1 ml
1 ml
0,1 ml
PT =101
1 ml
PT =102
P5
PT = 104
1 ml
1 ml
0,1 ml
PT =101
1 ml
P6
PT = 103
1 ml
1 ml
PT =102
1 ml
0,1 ml
1 ml
P7
PT = 102
1 ml
0,1 ml
PT =101
PT =102
PT =101

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ACTIVIDAD 3
INFLUENCIA DE LA TEMPERATURA SOBRE EL CRECIMIENTO BACTERIANO
3.1 OBJETIVO
Al finalizar la prctica el estudiante estar en capacidad de:
Comprender el efecto que la temperatura ejerce sobre la cintica de crecimiento
bacteriano.
Evidenciar la relacin existente entre la temperatura de incubacin y la velocidad de
crecimiento bacteriano.
Conocer el mecanismo bsico de accin de la temperatura en el crecimiento y
metabolismo a nivel de bacterias.
3.2 MARCO TERICO
As como los humanos estamos adaptados a vivir y trabajar en diversas condiciones de
temperatura, los microorganismos no escapan a esta regla. Por ejemplo cuando una
persona est acostumbrada a vivir y trabajar en un clima fro, el hecho de desplazarse y
realizar sus labores en clima clido causa una afectacin sobre su estado anmico y nivel de
actividad, reduciendo el rendimiento que cabra esperarse de la misma que cuando se
encuentra en su entorno natural. De esta forma podramos decir que la temperatura afecta
nuestras actividades, lo mismo ocurre con los microorganismos. Probablemente dentro de
los factores fsicos que influyen en el crecimiento, la temperatura es el principal factor que
afecta la viabilidad y el desarrollo microbiano, es decir, determina la velocidad de
crecimiento bacteriano (Adair et al., 1989; McDonald y Sun, 1999; Olson y Nottingham,
2000). Para entender mejor el efecto de este y otros factores medioambientales
(extrnsecos e intrnsecos) diversos modelos matemticos han sido desarrollados, con el
objeto de predecir el comportamiento de las poblaciones bacterianas cuando crecen en
condiciones controladas de laboratorio y muchos de ellos han logrado ser validados en
condiciones de produccin, transporte y almacenamiento de alimentos, esto es posible
incluso tomando en cuenta variaciones en factores de crecimiento extrnsecos como la
temperatura y en otros intrnsecos como la concentracin de sal, actividad de agua, entre
otros (Wijtzes et al., 1995; Zwitering et al., 1990).
Las bacterias suelen presentar diferentes exigencias en relacin a la temperatura de
crecimiento. Entre la mxima temperatura, por encima de la cual esta no puede crecer y una
temperatura mnima, por debajo de la cual un cultivo no se desarrolla, se ubican los lmites
en los que pueda haber crecimiento. Al rango de temperaturas sobre la cual pueden crecer
los microorganismos se le conoce como temperatura cardinal, as esta temperatura esta
constituida por una temperatura mnima, una mxima y una ptima, situndose esta ltima

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por lo general en valores muy cercanos o prximos a la mxima que a la mnima

temperatura de crecimiento. Las mejores condiciones de crecimiento de un organismo tienen
lugar dentro de unos lmites bastante reducidos que es lo que se conoce como temperatura
ptima de crecimiento. La temperatura ptima para el crecimiento de una especie microbiana
determinada, est relacionada con la temperatura del hbitat normal del organismo. La
influencia de la temperatura sobre el crecimiento, es realmente, una medida de la influencia
de la temperatura sobre la actividad enzimtica de la clula.
3.2.1 Comportamiento de los microorganismos respecto a la temperatura. El efecto de la
temperatura sobre el crecimiento es complejo. Por un lado cada reaccin qumica individual,
de todas las que conforman el metabolismo, es afectada por la temperatura, por lo que un
incremento de sta resulta en una mayor velocidad de reaccin. Esto se traduce en un
aumento de mx con la temperatura (ver Fig. 2). Por otra parte, aumentos posteriores de
temperatura inactivan las enzimas que catalizan las reacciones, con lo que el valor de mx
decrece rpidamente.
2.
Fuente: Wijtzes y col., 1995
Como se ha mencionado, cada microorganismo tiene una temperatura de crecimiento
adecuada. Si consideramos la variacin de la velocidad de crecimiento (y, por lo tanto al
tiempo de generacin, g) en funcin de la temperatura de cultivo (y suponiendo que el resto
de condiciones ambientales se mantienen constantes), podemos distinguir tres puntos
caractersticos llamados temperaturas cardinales: una temperatura mnima por debajo de la
cual no hay crecimiento; a temperaturas mayores se produce un incremento lineal de la
velocidad de crecimiento con la temperatura de cultivo hasta que se alcanza la temperatura
ptima a la que la velocidad es mxima (o sea, g mnimo). Por encima de esta temperatura

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ptima, se encuentra la mxima de crecimiento donde la velocidad de crecimiento decae

bruscamente y finalmente se produce la muerte celular. El margen entre la temperatura
mnima y la mxima se suele llamar margen de crecimiento o temperatura cardinal, y en
muchas bacterias suele comprender unos 40 grados. Hay varios tipos de microorganismos
en funcin de sus temperaturas de crecimiento mnima, mxima y ptima (ver tabla 1).
Tabla 1. Temperaturas cardinales para los microorganismos procariticos.
Temperatura (C)
Grupo
mnima
ptima
mxima
Mesfilo
5 a 15
30 a 45
35 a 47
Psicrfilo
5a5
12 a 15
15 a 20
Psicrtrofoa
5a5
25 a 30
30 a 35
Termfilob
40 a 45
55 a 75
60 a 90
Termtrofoc
15 a 20
45 a 55
65 a 75
Fuente: ICMSF, 2000.

aLos
microorganismos psicrtrofos son mesfilos que pueden crecer a temperaturas bajas.

Por tanto, se les puede considerar como psicrfilos facultativos. Esto es importante desde el
punto de vista aplicado porque cuando se encuentran contaminando alimentos, son capaces
de crecer en condiciones de refrigeracin (4 8C) y de producir infecciones en los
consumidores del alimento (30 35C).
bDe acuerdo con Enrique Iaez las bacterias denominadas termfilas pueden presentan
mnimos a 25oC, ptimos a 50 75oC y mximos entre 80 y 105oC. Dentro de esta categora
se suele distinguir las termfilas extremas (=hipertermfilas), que pueden llegar a presentar
ptimos cercanos a los 100oC, y que taxonmicamente pertenecen al dominio de las
Archaea. Las termfilas estrictas (o estenotermfilas), con ptimos por encima de los 80C
son de hecho incapaces de crecer a menos de 37oC, como las citadas arqueas (ej.,
Thermoproteus, Pyrococcus, Pyrodictium). La arquea Pyrolobus fumarii, habitante de los
humeros termales submarinos tiene su ptimo nada menos que a 105C y puede llegar a
aguantar 113C, y parece detiene su metabolismo (por "fro") a la "agradable" temperatura
de 90C. Las termfilas facultativas (o euritermfilas) pueden crecer a menos de 37 oC, como
p. ej. Thermus aquaticus.
cDe acuerdo con Mescle y Zucca (1994), los termtrofos son mesfilos capaces de crecer a
temperaturas relativamente elevadas, como ocurre con algunas bacterias lcticas
(Streptococcus thermophilus, Lactobacillus bulgaricus) o enterococos de origen fecal (E.
faecalis).

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Por encima de la temperatura mnima la tasa de crecimiento va aumentando

proporcionalmente hasta alcanzar la temperatura ptima, esto se debe al incremento
generalizado de la velocidad de las reacciones metablicas catalizadas por enzimas se van
aproximando a su ptimo. En dicha temperatura ptima las enzimas y reacciones se dan a
su mxima tasa posible. Se denomina coeficiente de temperatura a la relacin entre el
incremento de la velocidad de reaccin y el de temperatura. En trminos generales, la
velocidad de las reacciones bioqumicas suele aumentar entre 1,5 y 2,5 veces al aumentar
10C la temperatura a la que tienen lugar.
A partir de la temperatura ptima, si seguimos subiendo la temperatura se produce un
descenso acusado de la tasa de crecimiento hasta alcanzar la temperatura mxima. Dicha
temperatura refleja:
Desnaturalizacin e inactivacin de protenas enzimticas esenciales,
Colapsamiento de la membrana citoplasmtica,
Lisis trmica de la bacteria.
Lo anterior conduce inevitablemente a la muerte celular.
Es importante tener en cuenta que a temperaturas bajas, el metabolismo celular es lento y
las clulas paran de crecer; aunque suelen morir en algunos casos, no siempre es as. Sin
embargo, cuando la temperatura es superior a la ptima, se produce la muerte celular
rpidamente y las clulas no pueden recuperar su capacidad de divisin si baja
posteriormente la temperatura. Esto permite esterilizar por calor y no por fro. Para concluir,
veamos las principales adaptaciones bioqumicas a bajas y altas temperaturas seguidas por
las bacterias en general.
1.1.1.
Principales adaptaciones bioqumicas a medios fros (exhibidas por los
psicrtrofos):
- Enzimas ms resistentes al fro,
- Sistemas de transporte adaptados a bajas temperaturas,
- Los fosfolpidos de la membrana celular aumentan la proporcin de cidos insaturados
(y en algunas bacterias, poliinsaturados), ello supone que la membrana sigue en su
estado semifluido evitndose su congelacin.
1.1.2.
Principales adaptaciones bioqumicas a altas temperaturas (en clulas
vegetativas bacterianas)
- Enzimas termorresistentes. Algunas de ellas tienen un interior molecular muy hidrfobo,
- Ribosomas termorresistentes,
- Membranas ricas en cidos grasos saturados, que permiten enlaces hidrofbicos ms
fuertes,
- En Arqueas hipertermfilas los lpidos son muy especiales: en vez de basarse en steres
de cidos grasos con el glicerol, se trata de teres de hidrocarburos unidos al glicerol (el
enlace ter es ms resistente). Algunas, adems, en vez de la tpica bicapa lpdica,
exhiben una monocapa bioqumica de C40-bifitanil-tetrateres (resultado de unirse
"cola con cola" dos C20-fitanil-diteres), que condicionan una extrema resistencia a

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agentes ambientales.
1.1.3.
Modelamiento del efecto de la temperatura sobre el crecimiento.
Las aproximaciones modernas de la Microbiologa Predictiva de Alimentos han tratado de
entender y establecer un vnculo entre el crecimiento de microorganismos y los factores que
regulan el crecimiento tales como la temperatura, pH, actividad de agua, potencial redox,
etc. La gran mayora de los modelos secundarios son modelos de tipo cintico (Labuza y
Fu, 1993; McDonald y Sun, 1999), tales como el modelo de Arrhenius, modelo modificado
de Arrhenius, modelo de Schoolfield, modelo de la raz cuadrada de Ratkowsky y algunos
modelos polinmicos, de los cuales el ms comnmente usado ha sido el modelo de
Arrhenius. Los modelos cinticos para la determinacin de la vida til en alimentos son
generalmente basados en la ocurrencia de fenmenos y estos no han sido desarrollados
para un alimento en particular. Sin embargo, los parmetros experimentales y ambientales
de un modelo pueden aplicarse para un producto en especial. De estos, la temperatura es
normalmente considerada como el factor ms importante en las reacciones de deterioro de
los alimentos, especialmente, para la alteracin microbiana donde la velocidad de
crecimiento especfico y la fase de latencia son altamente dependientes de la temperatura
(Giannuzzi y col., 1998).
Diversos modelos predictivos han sido usados a travs del tiempo para evaluar la relacin
entre la temperatura y la velocidad de crecimiento bacteriano (Adair et al., 1989). La
ecuacin original del modelo lineal de Arrhenius se ha aplicado tanto al crecimiento
microbiano como a las reacciones qumicas, es decir, este modelo est basado en
consideraciones termodinmicas empricas (McDonald y Sun, 1999), pero se reconoce
ampliamente que la relacin entre el logaritmo de los parmetros de la curva de crecimiento
y el inverso de la temperatura absoluta es no-lineal o por lo menos lineal slo por encima de
una fraccin del rango de temperatura (Adair et al, 1989).
.
1.1.3.1. Modelo de la Raz Cuadrada
El modelo de la raz cuadrada es probablemente la ecuacin ms estudiada y el modelo

ms ampliamente usado para analizar el efecto de la temperatura sobre la velocidad
especfica de crecimiento (Giannuzzi et al., 1998). Ratkowsky et al., (1983) propusieron la
siguiente relacin:
= 0
Donde es la velocidad especfica de crecimiento, b es un coeficiente de regresin [(log
(ufc/cm2) das-1)1/2C-1], T es la temperatura de incubacin absoluta (K)y T0 es una
temperatura conceptual sin significancia metablica para psicrfilos, psicrtrofos y
mesfilos, es decir, la menor temperatura en la cual la velocidad de crecimiento es cero o la

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fase de latencia es infinita (Ratkowsky et al., 1983; Adair et al., 1989; Giannuzzi et al.,
1998).
La ecuacin anterior fue modificada como sigue (Giannuzzi et al., 1998):
= +
Donde T es la temperatura de incubacin (C), q es la pendiente de la lnea de regresin
[(log (ufc/cm2) das-1)1/2C-1] y p [(log (ufc/cm2) das-1)1/2] es el intercepto a 0C.
1.1.3.2. Modelo de Arrhenius
La ecuacin de Arrhenius fue derivada empricamente basada en consideraciones

termodinmicas (Labuza y Riboh, 1982), y describe la velocidad con que una reaccin
cambia cuando se emplean diferentes temperaturas conocidas (Ross y McMeekin, 1994).
La forma ms simple de esta ecuacin es:
k = A
o
ln = ln
Donde, k es la velocidad de reaccin; A (ufc/ml*tiempo) es un factor pre-exponencial que

corresponde al intercepto de y en una grfica de Lnk vs 1/T, R es la constante universal
de los gases (8,314 KJ/KgK o 1,987 cal/Kmol), T es la temperatura absoluta (K), y Ea
(KJ/Kg) es denominada como la energa de activacin de la reaccin lmite de velocidadcrecimiento (Ross y McMeekin, 1994). Si en la ecuacin anterior los valores de k son
calculados a diferentes temperaturas y si el lnk es graficado contra 1/T, puede obtenerse
una lnea recta en la cual la pendiente (m) es igual Ea/R (Labuza y Riboh, 1982; Labuza y
col., 1992; McDonald y Sun, 1999). As el modelo de Arrhenius puede catalogarse en la
clasificacin de Whiting y Buchanan (1993) como un modelo de tipo secundario.
Cuando el modelo de Arrhenius es empleado para evaluar el efecto de la temperatura sobre
el crecimiento microbiano, entonces k se transforma en la velocidad de crecimiento
especfico (Ross y McMeekin, 1994; Giannuzzi y col., 1998), y la ecuacin de Arrhenius
puede escribirse como:
= A
Sin embargo, el crecimiento bacteriano es complejo y las extrapolaciones de las grficas

pueden no mostrar linealidad, por lo tanto, la ecuacin anterior no puede encajar muy bien

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por debajo de los datos ptimos o por encima de las temperaturas mnimas para el
crecimiento. Entonces, las grficas obtenidas solo sirven para predecir el crecimiento
microbiano en un limitado rango de temperatura (Labuza y Fu, 1993; McDonald y Sun,
1999). As la ecuacin que ha sido utilizada mayoritariamente para describir el efecto de la
temperatura sobre el crecimiento microbiano es el modelo de la raz cuadrara propuesto por
Ratkowsky y col., en 1982 (Adair y col., 1989; Willocx y col., 1993; Neumeyer y col., 1997;
Giannuzzi y col., 1998).
Cultivo madre de E. coli o S. aureus en fase exponencial (mantenido en caldo BHI) y

ajustado a un McFarland 0,5.
Pipetas de 10 ml y 1 ml estriles.
Espectrofotmetro.
Celdas para espectrofotometra.
Incubadoras a distintas temperaturas (25C, 30C, 35C, 40C y 45C.
Frascos erlenmeyer con 99 ml de caldo BHI.
20 mL de caldo BHI estril (Solucin Blanco).
REACTIVOS
No aplica
PROCEDIMIENTO
A partir del cultivo madre inocular 1 ml en un frasco erlenmeyer conteniendo 99 ml de
caldo BHI.
De esta suspensin determine la absorbancia a 600 nm y confronte con la curva patrn
de Ab vs. LnN obtenida en la prctica 1, y prediga la poblacin inicial. Esta poblacin
ser la equivalente a la poblacin inicial a tiempo 0.
Colocar a incubar la suspensin a diferentes temperaturas durante una hora. Pasado
este tiempo en condiciones aspticas tome un inculo y determine la absorbancia.
Posteriormente cada media hora haga lecturas espectrofotomtricas hasta obtener por lo
menos 8 datos de incrementos en este valor. Confrontar estos resultados con la curva
patrn y calcular la poblacin a los diferentes intervalos de tiempo.
Realizar la grfica de crecimiento a cada temperatura, para tal fin, tome los datos de
lectura obtenidos por los otros grupos. Una vez construida la grfica y con los valores
obtenidos determine en cada una de ellas la duracin de la fase de latencia, la velocidad
de crecimiento especfico y el tiempo de duplicacin. Discuta adems el comportamiento
del crecimiento a cada una de las diferentes temperaturas.

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Tiempo (min)
60
90
120
150
180
210
240
270
300
Ab (600 nm)
LnN clulas/ml
NIVEL DE RIESGO
Pantaln Largo.
BIBLIOGRAFA
Adair, C., Kilsby, D.C., Whittall, P.T. (1989). Comparison of the Schoolfield (non-linear
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ACTIVIDAD 4
INFLUENCIA DEL PH Y ACIDEZ SOBRE EL CRECIMIENTO BACTERIANO
OBJETIVO
Comprender el efecto que el pH tiene sobre la viabilidad y crecimiento bacteriano.
Conocer el mecanismo bsico de accin del pH sobre el medio, sobre la membrana
celular y sobre las reacciones metablicas de las bacterias.
MARCO TERICO
En estado natural, la mayora de los alimentos (carnes, pescados y productos vegetales) son
ligeramente cidos. La mayor parte de las frutas son bastantes cidas y solo algunos
alimentos, como la clara de huevo por ejemplo, son alcalinos. Para preservar los alimentos,
durante miles de aos se ha venido aumentando su acidez, bien sea de manera natural, por
fermentacin, o artificial, por adicin de cidos dbiles, con lo que se consigue inhibir la
proliferacin microbiana. De este modo, la acidez puede ser un factor bsico en la
preservacin, como en el caso de algunos alimentos fermentados tales como el yogur, la col
fermentada o los pepinillos en vinagre, o tener un papel auxiliar, cuyo efecto se combina con
el de otros factores tales como conservantes qumicos, calor o actividad de agua (aw).
El pH es el logaritmo de la inversa de la concentracin de iones hidrgeno de una disolucin.
Proporciona una indicacin de la actividad de estos iones sobre los componentes del medio.
Influye sobre las reacciones qumicas y bioqumicas y, en consecuencia, sobre los
microorganismos.
Comportamiento de los microorganismos respecto del pH: Como sabemos, las bacterias
pueden desarrollarse a pHs entre 4,5 y 9 con un ptimo de crecimiento entre 6,5 y 7,5. Esto
quiere decir que a valores de pHs comprendidos entre estos rangos la velocidad de
crecimiento es mayor y, por tanto la duracin de la fase de latencia es menor que cuando las
bacterias crecen a valores de pHs inferiores o superiores a los ptimos. Naturalmente existen
excepciones, es decir, como las bacterias acticas y las bacterias lcticas, que soportan pHs
inferiores a 3,5. Para las primeras el pH ptimo se sita en torno a 5,4 6,3, mientras que
para las segundas oscila entre 5,5 (incluso menor) y 6 (ICMSF, 2000). En nuestro caso
particular y segn describe Mescle y Zucca (1994), los lmites de pH para el crecimiento de E.
coli y S. aureus son:

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Microorganismo
pH mnimo
pH ptimo
pH mximo
E. coli
4.3
6.0 8.0
9.0
S. aureus
4.2
6.8 7.5
9.3 9.8*
* ICMSF, 2000.
Como hemos mencionado, muchos microorganismos pueden crecer dentro de un apmplio
rango de pH, cabra suponer pues, que estas clulas tienen la capacidad o disponen de
mtodos eficaces para estabilizar su pH interno. Sin embargo, se ha comprobado que el pH
interior puede sufrir o verse considerablemente afectado por el pH del medio exterior. Esta
cuestin se ha estudiado a travs del seguimiento paso a paso, a travs de la membrana
celular, de un cido dbil, la 5,5-dimetil-2,4-oxaxolidindiona (DMO). En el rango de pH entre 5
y 7, el pH interno de E. coli result ser ms alcalino que el del medio exterior y por encima de
pH 7, ms cido (ICMSF, 2000).
Mecanismo de accin del pH sobre el crecimiento de los microorganismos: La accin
del pH sobre el crecimiento de los microorganismos se puede situar a tres niveles: el medio,
la permeabilidad de la membrana y la actividad metablica. La disponibilidad de ciertos
nutrientes en el medio de cultivo sufre modificaciones en funcin del equilibrio inico. Como
ocurre con los iones metlicos, a pHs cidos los iones magnesio forman complejos
insolubles, a pHs bsicos lo hacen los iones de zinc, calcio y los frricos. Bajo estas formas,
estos iones, que son indispensables como cofactores de enzimas, son difcilmente utilizables.
La permeabilidad de la membrana se ve igualmente afectada por las variaciones en la
concentracin de iones H+ y OH-. En medio cido las permeasas catinicas se saturan de
iones hidrgeno, lo que limita o anula el transporte de cationes indispensables. En medio
alcalino, son los iones hidroxilo los que saturan la membrana, impidiendo la transferencia de
aniones. Las reacciones enzimticas poseen un ptimo de actividad por encima o por debajo
del cual la cintica sufre cambios. Toda variacin del pH citoplsmico entraa una
disminucin de la actividad enzimtica y, por tanto, del crecimiento del microorganismo. No
todos los enzimas tienen el mismo comportamiento en funcin del pH, las hidrolasas
extracelulares son menos sensibles en general que los enzimas citoplsmicos.
En la prctica se pueden emplear dos tipos de conservadores cidos en alimentos que actan
sobre los tres niveles antes mencionados:
-
cidos fuertes (fosfrico o el clorhdrico). Su efecto consiste en bajar considerablemente

el pH, proporcionando una concentracin externa de protones muy elevada, que
determina la acidificacin del medio interno celular. Tales condiciones son normalmente
inaceptables en alimentos pero permisibles en bebidas carbnicas.
cidos dbiles lipoflicos (lctico, ctrico, actico, frmico). Provocan la entrada de

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protones a travs de la membrana celular, acidificando el interior de la clula e

inhibiendo el transporte de nutrientes. Algunos cidos se disocian dando lugar a aniones
(lactato o citrato) que la clula es capaz de transportar y cuya presencia por tanto no
inhibe el metabolismo energtico. En su defecto, el cido actico o el frmico, son
eficaces conservadores debido a que no solo son buenos conductores de protones, sino
que adems pueden dar lugar a concentraciones intracelulares de sus aniones que
ejercen accin inhibitoria.
Tambin existen algunos iones que potencian la accin de los cidos, tal es el caso del sulfito
o el nitrito (las sales minerales de cidos dbiles), que resultan altamente inhibitorios a pH
bajos.
Cultivo madre de E. coli y S. aureus en fase logartmica (mantenido en caldo BHI).

Pipetas de 10 ml y 1 ml estriles.
Espectrofotmetro.
Incubadora a 35C +/- 2C
Frascos erlenmeyer con 99 ml de caldo BHI ajustado a pHs 5,0; 6,0 y 7,0.
REACTIVOS
No aplica
PROCEDIMIENTO
A partir del cultivo madre inocular 1 ml en un frasco erlenmeyer conteniendo 99 ml de
caldo BHI ajustado a diferentes concentraciones de pH.
De esta suspensin determine la absorbancia a 600 nm y confronte con la curva patrn de
Ab vs. LnN obtenida en la prctica anterior (Fig 1 y Fig 2), y prediga la poblacin inicial.
Esta poblacin ser la equivalente a la poblacin inicial a tiempo 0.
Colocar a incubar la suspensin a 35C +/- 2C y cada hora determine la absorbancia
durante dos horas. A partir de las 2 horas reduzca el tiempo de medida a 30 minutos
hasta obtener por lo menos 8 datos de incrementos en la absorbancia. Confrontar estos
resultados con la curva patrn y calcular la poblacin a los diferentes intervalos de
tiempo.
Realizar la grfica de crecimiento a cada valor de pH y calcular en cada una de ellas la
duracin de la fase de latencia, la velocidad de crecimiento especfico y el tiempo de
duplicacin.

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Tiempo (min)
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120
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180
210
240
270
Ab (600 nm)
NIVEL DE RIESGO
Pantaln Largo.
BIBLIOGRAFA
Mescle, J.F., Zucca, J. (1994). El comportamiento de los microorganismos en los

alimentos, incidencia del pH. En: Microbiologa alimentaria, volumen 1. Aspectos
microbiolgicos de la seguridad y calidad alimentaria. Editorial Acribia, S.A. Zaragoza,
Espaa. Pps. 7-50.
ICMSF. (2000). pH y Acidez, Captulo 5. En: Ecologa microbiana de los alimentos 1.

Factores que afectan a la supervivencia de los microorganismos en los alimentos.
Editorial Acribia, S.A. Zaragoza, Espaa. Pps. 97-117.

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ACTIVIDAD 5
EFECTO DE DIVERSOS DEPRESORES DE LA ACTIVIDAD DE AGUA (AW)
[CONCENTRACIN DE NaCl, GLUCOSA Y SACAROSA] SOBRE EL CRECIMIENTO
BACTERIANO
OBJETIVO
Comprender el efecto que la actividad de agua (aw) y la concentracin de solutos
depresores de aw tienen sobre la viabilidad y crecimiento bacteriano.
Evidenciar la relacin existente entre la concentracin de sal, glucosa y sacarosa vs la
actividad de agua de un medio.
Conocer el mecanismo bsico de accin de la actividad de agua y solutos depresores de
la misma sobre el metabolismo bacteriano.
MARCO TERICO
Los microorganismos requieren la presencia de agua, en una forma disponible, para que
puedan crecer y llevar a cabo sus actividades metablicas. La mejor forma de medir la
disponibilidad de agua es mediante la actividad de agua (aw). La deshidratacin es un
mtodo de conservacin de los alimentos basado en la reduccin de la aw, lo que se
consigue eliminando el agua de los productos. Durante el curado y/o salazonado, as como
en el almbar y otros alimentos azucarados, son los solutos los que, al ser aadidos,
descienden la aw. un pequeo descenso de la aw es a menudo suficiente para evitar la
alteracin de los alimentos siempre que esta reduccin sea potenciada por otros agentes tal
como ocurre con los nitritos en muchas carnes curadas y con los componentes del humo en
los alimentos ahumados, salazonados y desecados. De esta forma la aw puede tener un
papel principal en la conservacin de alimentos o en su defecto tener un papel auxiliar, cuyo
efecto se combina con el de otros factores tales como conservantes qumicos, calor, acidez,
etc.
La actividad de agua (aw) es definida como la relacin de la presin parcial del vapor de
agua en el producto (p) y la del agua pura (po) a la misma temperatura (Christian, 1980;
Mathlouthi, 2001).
A medida que una solucin se concentra, la presin de vapor disminuye y la aw va

descendiendo a partir de un valor mximo de 1 para el agua pura (en ausencia de capilares

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o fuerzas de adsorcin). La aw est relacionada con el punto de congelacin y con el de

ebullicin as como con la humedad relativa en equilibrio (HRE) y la presin osmtica.
Relacin entre la Actividad de Agua, la Humedad Relativa en equilibrio y la Presin
Osmtica: Segn Christian (1980) los primeros estudios sobre el efecto de la humedad en el
crecimiento microbiano se describieron en trminos de HRE o presin osmtica. La relacin
entre la aw y la humedad relativa viene dada por la frmula:
% = 100
En este caso la HRE al igual que la aw, es la relacin entre la presin de vapor de la solucin
y la del agua pura pero expresada en porcentaje. Esta ecuacin podra ser vlida para
sistemas en los cuales tericamente se alcance el equilibrio, sin embargo, en la praxis
resulta complejo que la aw y la HRE alcancen el equilibrio, an incluso en aquellos alimentos
que podramos considerar cerrados como los enlatados, la aw no alcanza el equilibrio con la
humedad relativa). La HRE se refiere estrictamente a la atmsfera en equilibrio con una
solucin o alimento y constituye una expresin menos apropiada que la aw como forma de
medir el agua disponible. La presin osmtica est relacionada con la aw a travs de la
siguiente ecuacin:
. =
Donde R es la constante de los gases, T la temperatura absoluta (K), lnaw el logaritmo

natural de la aw y V el volumen molar parcial del agua. El uso de la presin osmtica
presupone la presencia de una membrana con unas caractersticas de permeabilidad
adecuadas.
Relacin entre la Actividad de Agua y la concentracin de depresores de la misma: La
aw de un alimento puede reducirse aumentando la concentracin de solutos en la fase
acuosa de los alimentos bien mediante la extraccin del agua (secado, deshidratacin, etc.)
o mediante la adicin de solutos (NaCl, azcar, glicerina, etc.). Algunas molculas del agua
se orientan en torno a las molculas del soluto y otras quedan absorbidas por los
componentes insolubles de los alimentos. En ambos casos, el agua queda en forma ligada
que es una forma menos reactiva (no disponible). La relacin entre la aw y la concentracin
de solutos viene dada por la ley de Raoult y puede expresarse de la siguiente forma:
2
=
0
1 + 2

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Es decir, la relacin entre la presin de vapor de la solucin y la del solvente puro es igual a
la fraccin molar del solvente, donde p y po son las presiones de vapor de la solucin y del
solvente, respectivamente y n1 y n2 el nmero de moles del soluto y del solvente,
respectivamente. En la figura 1 se presenta la relacin de tres solutos depresores de la
actividad de agua (Sacarosa, Glucosa y NaCl) frente a la aw.
Figura 1. Relacin entre la concentracin de sacarosa, glucosa y cloruro sdico (g/L) vs
actividad de agua en medio acuoso a 25C.
1,02
0,98
aw
0,94
0,90
Sacarosa
Glucosa
Sal
0,86
0,82
0,78
0,74
0
500
1000
1500
2000
Concentracin (g/Lt)
Fuente: adaptada de los valores de Christian, 1980.

A partir de la figura anterior podemos inferir que la relacin entre la concentracin tanto de
sacarosa, glucosa y NaCl y la actividad de agua es inversamente proporcional, tomando una
relacin de tipo lineal. En este sentido, el cloruro de sodio acta como un fuerte represor de
la actividad de agua y en menor medida la glucosa y sacarosa. Con los datos anteriores se
puede predecir la aw de una solucin acuosa sencilla de composicin conocida, sin embargo,
la relacin entre la composicin de un alimento y su aw es mucho ms compleja. Para
conocer estas relaciones, lo habitual es determinar los valores de la a w de un alimento con
diferentes concentraciones de solutos, los que se representan grficamente con el fin de
obtener la curva de correlacin entre el % soluto vs aw. A partir de los datos mostrados en la
figura 1, se obtienen las siguientes ecuaciones que pueden ser usadas para preparar medios
sencillos con diferentes valores de aw para el estudio de las relaciones de agua desde un
punto de vista microbiolgico, la bondad de las grficas (coeficiente de determinacin R2)
es de 0,996 para la sacarosa y NaCl y 0,993 para la glucosa:
-
Sacarosa:
= 0,00007
+ 1,00412

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- Glucosa:
= 0,00010
- NaCl:
= 0,00067
+ 0,99808
+ 1,00551
Relacin entre la Actividad de Agua y la Temperatura: La relacin entre la concentracin

de los solutos y la actividad de agua es dependiente de la temperatura, dado que esta influye
sobre la presin de vapor de agua de las soluciones pero el efecto es pequeo con la
mayora de los solutos salvo que las soluciones sean saturadas. En tales casos, las
cantidades de algunas sustancias de la solucin, y por tanto la aw, pueden variar
marcadamente con la temperatura.
Concentracin
de NaClentre
para diversos
valores
Figura 2. Relacin
la actividad
dedeagua
Aw a 25C
25C y b 30C.
de NaCl para diversos valores de

y el Concentracin
porcentaje de
NaCl en solucin acuosa: a
Aw a 30C
y = -0,0064x + 1,0043
R2 = 0,9975
1,010
1,020
1,000
1,000
0,980
0,970
0,940
Aw
Aw
0,960
0,920
0,840
0,00
0,960
0,950
0,900
0,860
0,990
0,980
0,880
y = -0,0067x + 1,0015
R2 = 0,996
0,940
0,930
y = 0,0064x + 1,0043
R2 = 0,9975
5,00
10,00
0,920
15,00
NaCl (% p/p)
20,00
25,00
0,910
0,00
Y = - 0,0067x + 1,0015
R2 = 0,996
2,00
4,00
6,00
8,00
10,00
12,00
14,00
NaCl (% p/p)
En la figura 2 (a y b) puede verse la relacin entre la actividad de agua y el % de NaCl a dos

temperaturas (25 y 30C). A manera de ejemplo y para ilustrar la relacin entre la
temperatura y actividad de agua podemos calcular la aw para una concentracin del 10% de
NaCl a 25C y 30C, en este caso los valores obtenidos a partir de las ecuaciones equivalen
a una aw = 0,930 a 25C, mientras a 30C esta misma concentracin equivale a una aw =
0,935. En trminos generales aunque la variacin es poca (0,005 unidades) podra resultar
letal en algn momento si existe una combinacin de diversos factores que afecten el
crecimiento (temperatura, pH, aw, atmsfera gaseosa, presencia e antimicrobianos, etc.).
A temperaturas inferiores a las del punto de congelacin de una solucin o alimento, la
presin de vapor del agua lquida disminuye al descender la temperatura y por tanto,
disminuye tambin la aw. La aw de una solucin o alimento congelados es funcin de la
temperatura presentando un valor de 0,953 a -5C; de 0,907 a -10C; de 0,864 a -15C y de
0,823 a -20C (Christian, 1980). Si representamos los datos anteriores en forma grfica
(Figura 3), podemos apreciar el concepto descrito anteriormente, es decir, con el descenso

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de la temperatura por debajo el punto de congelacin de un alimento (generalmente situado

en torno a los -1,5C a -2,5C) disminuye la actividad de agua en forma proporcional as:
= 0,0087 + 0,995 ( 2 = 0,999)

Figura 3. Relacin entre la temperatura de congelacin de un alimento y la actividad de
agua del mismo.
0,96
aw
0,92
0,88
0,84
0,80
-20
-15
-10
-5
Temperatura de congelacin (C)
Comportamiento de los microorganismos respecto a la aw

Como sabemos, la mayora de los microorganismos, incluyendo las bacterias patgenas,
crecen ms rpidamente a niveles de aw de 0,995 0,980 (la aw de la mayora de los medios
de cultivo empleados en laboratorio es de 0,999 0,990) (ICMSF, 2000). A valores de a w
inferiores a estos, la velocidad de crecimiento y la poblacin estacionaria o la masa celular
final disminuye y la fase de latencia aumenta (Figuras 5, 6 y 7 -Anexos). A una aw
suficientemente baja, la cual es difcil de definir con precisin, la fase de latencia se hace
infinita, es decir, el crecimiento cesa. Por ejemplo, la tasa de crecimiento de S. aureus
desciende en un 10% de su mximo cuando la aw baja a 0,90 (Mescle y Zucca, 1994). A una
aw suficientemente baja, la cual es difcil de definir con precisin, la fase de latencia se hace
infinita, es decir, el crecimiento cesa (ICMSF, 2000).
El crecimiento de la mayora de las bacterias y hongos ocurre a aw superiores a 0,90. Sin
embargo, entre los microorganismos que tienen una importancia en la conservacin de los
alimentos existen muchos que pueden multiplicarse a valores de aw muchos ms bajos.
Dichos microorganismos se denominan de forma variada: halfilos, xerfilos y osmfilos. Al
igual que el crecimiento, la aw del medio tambin afecta a la supervivencia de los
microorganismos. La letalidad se reduce, a temperatura ambiente y bajo refrigeracin
(ICMSF, 2000), al descender la aw o al aumentar la concentracin de solutos. Esta
proteccin que proporciona una aw baja puede disminuirse bajo condiciones de acidez

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(ICMSF, 2000). Especficamente hablando de microbiologa de alimentos, la supervivencia

de microorganismos es ms importante en el contexto del tratamiento trmico. La
supervivencia a altas temperaturas es generalmente menor a altos valores de a w.
Entre las bacterias gram-negativas de mayor importancia estn las Pseudomonas spp y las
Enterobacteriaceae, las que habitualmente proliferan slo a aw superiores a 0,96 y 0,93,
respectivamente. Por otro lado las bacterias gram-positivas no formadoras de esporas son
mucho ms tolerantes a las aw reducidas que las gram-negativas. Dentro de este grupo el
patgeno ms tolerante es S. aureus el cual puede desarrollarse a aw de 0,86 y 0,83
dependiendo del sustrato. Sin embargo, a aw inferiores de 0,93 no se ha observado la
produccin de toxina (ICMSF, 2000). Dentro de los gram-positivos formadores de esporas el
lmite normal de aw es de 0,90 0,91. A aw de 0,97 0,93 no germinan ni crecen las cepas
de B. cereus productoras de ETAs. Por otro lado C. botulinum deja de producir toxina a unos
valores de aw cercanos a los de crecimiento. Estos valores dependen del tipo as: 0,95 para
el tipo A, 0,94 para el B y 0,97 para el E. C. perfringens presenta una aw de crecimiento
prximo a 0,95 (ICMSF, 2000).
Mecanismo de accin de la actividad de agua (aw) sobre el crecimiento/supervivencia
de los microorganismos
Cuando una bacteria es expuesta a un incremento en la presin osmtica del ambiente
(adicin de un soluto como la NaCl, el cual disminuye la actividad del agua) trae consigo un
fenmeno de plasmlisis de la clula (Sperber, 1983). Esto disminuye o paraliza el
crecimiento de los microorganismos, a causa de la inhibicin de las actividades enzimticas.
Algunas bacterias responden a este hecho mediante la acumulacin de biomolculas en el
interior celular para prevenir la deshidratacin o mantener la presin intracelular (Pocard et
al., 1994; Mazomba y Mabinya, 2010).
Estas biomolculas usualmente no interfieren con las funciones macromoleculares, y son
denominadas como solutos compatibles, debido a que funcionan, a grandes
concentraciones intracelulares, como protectores de la actividad enzimtica en vez de actuar
como inhibidores. En sntesis general, los microorganismos responden frente a aw reducidas
acumulando potasio, aminocidos y polialcoholes.
Algunas molculas como la glicina betaina, prolina, prolina betaina, trehalosa, colina,
dimetilglicina, dimetilsulfoniopropionato, ectoina, glucosilglicerol y carnitina, han sido
reportadas por Kempf y Bremer (1998) y Prescott et al., (1999) como osmoprotectores en
Escherichia coli, y juegan un papel importante en la ecologa bacteriana, especialmente en
ambientes adversos. Estos componentes pueden ser acumulados bien sea directamente
desde el medio exterior o ser sintetizados a partir de compuestos presentes en este medio
(Mazomba y Mabinya, 2010).

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Sperber (1983) y Mezcle y Zucca (1994) describen el mecanismo general de adaptacin al

descenso de la aw seguido por aquellas bacterias que son capaces de crecer cuando la aw es
reducida, este mecanismo supone dos fases:
A. Con una aw igual o mayor a 0,995 el desarrollo microbiano tiene lugar en ptimas
condiciones. La aw intracelular de las clulas es significativamente menor que el del
medio exterior, de tal forma que las clulas son capaces de mantener la turgencia.
Cuando la aw del medio externo es reducido (shock osmtico: por ejemplo el aw pasa de
0,995 a 0,950), se observa en primer lugar un fenmeno de plasmlisis con una prdida
rpida de agua. Durante este lapso la clula es incapaz de crecer. Paso seguido, se
evidencia una acumulacin citoplasmtica de iones potasio (K+) e iones Glutamato. La
acumulacin de solutos en el citoplasma permite la recuperacin de la turgencia.
B. Cuando se presenta una reduccin de la aw menor a 0,950, nuevamente hay prdida de
agua y el crecimiento se detiene. El descenso de la concentracin de agua intracelular
incrementa efectivamente la concentracin interna de iones potasio desde la
concentracin inicial. El incremento en estos iones, activan la enzima Glutamato
deshidrogenasa, la cual reduce la -cetoglutarato a Glutamato, que se acumula en el
citoplasma, provocando un nuevo ingreso de agua al interior, tras lo cual se reactiva el
crecimiento aunque a velocidades menores. En general, la mayora de las bacterias ms
comunes han mostrado una acumulacin de aminocidos intracelulares cuando se
enfrentan a stress osmtico (Sperber, 1983). Aquellos que generalmente acumulan
Glutamato por lo general son incapaces de crecer a aw menor a 0.95. El Glutamato,
puede afectar negativamente al pH celular (acidificndolo), por lo que se requiere de la
presencia de cationes (usualmente in potasio) para contrapesarla. Cuando la
concentracin de iones Glutamato es suficiente para reducir la aw intracelular a 0,950, la
concentracin de iones potasio se eleva tanto que resulta ser txico para algunas de las
funciones celulares y el crecimiento cesa. Algunas especies de bacterias que son
capaces de producir Glutamato son: Pseudomonas aeruginosa, Vibrio parahaemolyticus,
Escherichia coli, Salmonella oranienburg, Clostridium sporogenes, Lactobacillus
plantarum, Serratia marcescens y Klebsiella aerogenes.
Algunos microorganismos pueden adaptarse a un descenso ms pronunciado de la aw
bien sea descarboxilando el Glutamato hasta cido -aminobutrico (GABA) o bien
reduciendo el Glutamato hasta Prolina, compuestos que se acumulan en el citoplasma
bacterianoLos anteriores aminocidos son compuestos sin carga, por lo que no se
requiere de la presencia de cationes de contrapeso; por consiguiente, las clulas que
son capaces de aumentar estos aminocidos pueden crecer a valores ms bajos de aw
que aqullos que aumentan slo en Glutamato (Sperber, 1983). Segn seala Mescle y
Zucca (1994), estos microorganismos pueden crecer incluso a aw de 0,930 0,900 o an
a valores de aw de 0,860.

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Figura 4. Adaptacin intracelular a la reduccin de actividad de agua (o = iones potasio;

o = iones Glutamato, = cido -aminobutrico GABA o Prolina)
aw mayor a 0.995
Reduccin de aw (0.950)
aw menor a 0.950
cido -aminobutrico
Incremento de (K+)
-cetoGlutarato
Glutamato
Prolina
Microorganismos como Micrococcus lysodeikticus, Sarcina lutea, Staphylococcus aureus,

Bacillus subtilis, Bacillus cereus Streptococcus faecalis, Klebsiella aerogenes, Serratia
marcescens, Bacillus megaterium, Lactobacillus plantarum, Clostridium sporogenes, Salmonella
oranienburg y Eschericia coli pueden producir un incremento en Prolina, mientras que
Escherichia coli, Clostridium sporogenes y Streptococcus faecalis pueden producir GABA.
Hajmeer et al. (2006), evaluaron el efecto del cloruro de sodio sobre E. coli O157:H7 y S. aureus,
encontrando que E. coli O157:H7 fue menos tolerante a la NaCl que S. aureus en
concentraciones de 5% y 10%. Estos resultados estn de acuerdo con los datos tericos
reportados por Jay (1992) o Stein (2000), dnde los niveles de tolerancia a la sal para E. coli
O157:H7 se sita en un 8% cuando est creciendo en los medios de cultivo, mientras que
algunas cepas de S. aureus son capaces de tolerar hasta un 20%. La osmotolerancia de S.
aureus al NaCl se debe a su habilidad de mantener la integralidad estructural de la membrana
exterior. As mismo, S. aureus puede crecer en ambientes osmticos altos debido a la
acumulacin de productos osmoprotectores tales como la prolina y glicinbetaina en las clulas
bajo estres osmtico (Neidhardt et al., 1990).
Jablonski y Bohach (1999) observaron que diferentes compuestos aumentan en S. aureus tales
como L-prolina, el betaine del proline, el choline, taurino, y sobre todo betaine de glicina que
refuerza el crecimiento del staphylococcal bajo la tensin osmtica

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Tabla 1. Valores mnimos de actividad de agua para el crecimiento y/o germinacin de ciertos patgenos
alimentarios.
Mnimo
Organismo
NaCl
Glucosa
Glicerol
Campylobacter spp.
0.980
----Clostridium botulinum tipo E (Crecimiento)
*0.970
---
*0.940
Clostridium botulinum tipo E (Germinacin)
*0.930
---
*0.890
Shigella spp.
0.970
---
---
Yersinia enterocolitica
0.970
---
---
Vibrio vulnificus
0.960
---
---
Escherichia coli Enterohemorrgica
0.950
---
---
Salmonella spp.
0.940
---
---
Vibrio parahaemolyticus
*0.948
*0.984
*0.937
Bacillus cereus (Crecimiento)
*0.950
---
*0.930
Bacillus cereus (Germinacin)
*0.950
---
*<0.85
Clostridium botulinum tipos A y B (Crecimiento)
*0.960
---
*0.930
Clostridium botulinum tipos A y B (Germinacin)
*0.930
---
*0.890
Clostridium perfringens (Crecimiento)
*0.970
*0.960
*0.950
Listeria monocytogenes
0.920
0.830
*0.860
0.880
---
---
---
---
---
---
*0.957
---
0.94*
Staphylococcus aureus (Crecimiento)

Staphylococcus aureus (Produccin de toxina)
Pseudomonas fluorescens
Fuente: ICMSF, 1996. *Sperber, 1983.
Modelamiento del efecto de la aw sobre el crecimiento

Diversos autores han estudiado el efecto de la aw sobre el crecimiento de varios
microorganismos y estabilidad de los alimentos (Sperber, 1983; Neumeyer et al., 1997a y 1997b;
Carrillo et al., 2007; Grau et al., 2007; Mathlouthi, 2010; Mazomba y Mabinya, 2010). Muchos de
los trabajos solo se tratan de simples curvas de crecimiento a diversos valores de a w, de la cual
se determina la velocidad de crecimiento. Sin embargo, otros autores como McMeekin et al.
(1987) y el mismo Neumeyer et al. (1997) describen un modelo de regresin no lineal tipo
Blehrdek que permite estimar los valores de la velocidad de crecimiento () como una funcin
dependiente de la actividad de agua. Este modelo es:
Donde
b = la pendiente de la lnea de regresin
aw = actividad de agua

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awmin = aw mnima terica para crecimiento al cual la velocidad de crecimiento es

predicha como cero.
Cultivo madre de E. coli, S. aureus u otra bacteria en fase logartmica (mantenido en

caldo BHI y ajustado a un patrn McFarland 0,5).
Micropipetas de 5-10 ml y 100-1000 l.
Espectrofotmetro.
Incubadora a 35C +/- 2C
Frascos erlenmeyer con 50 ml de caldo BHI ajustado a concentraciones de NaCl,

Glucosa y Sacarosa: 0,5%; 2%; 4%; 6% y 8%.
REACTIVOS
No aplica
PROCEDIMIENTO
Debido a la concentracin de solutos variable y el nivel de color para cada depresor,
medir la absorbancia inicial a 600 nm para cada medio de cultivo (Absorbancia blanco Abb).
A partir del cultivo madre inocular 2ml en un frasco erlenmeyer conteniendo 50 ml de
caldo BHI ajustado a las diferentes concentraciones de los depresores de a w.
De esta suspensin determine la absorbancia a 600 nm (Abt0) y reste la Abb para
corregir el valor de la absorbancia.
El resultado de esta Abt0 corregida se confronta con la curva patrn de Ab vs. Ln ufc/ml
obtenida en la prctica 1, para predecir la poblacin inicial. Esta poblacin ser la
equivalente al tiempo 0.
Colocar a incubar la suspensin a 35C +/- 2C y cada hora determine la absorbancia
(Abt1 Abtn) hasta obtener por lo menos 8 datos de incrementos en este valor. Corregir
los valores de absorbancia y confrontar estos resultados con la curva patrn para
calcular la poblacin a los diferentes intervalos de tiempo.
Realizar la grfica de crecimiento para cada concentracin del depresor y calcular en
cada una de ellas la duracin de la fase de latencia, la velocidad de crecimiento
especfico y el tiempo de duplicacin. Discuta adems el comportamiento del crecimiento
a cada una de las diferentes concentraciones de NaCl, Glucosa y Sacarosa.
Tabla 2. Resultados para cada concentracin de soluto depresor.
Tiempo (min)
60
120
150
180
210
240
270
Ab (600 nm)

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Ln N (ufc/ml)
NIVEL DE RIESGO
Pantaln Largo.
BIBLIOGRAFA
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ACTIVIDAD 6
EFECTO DE LA TEMPERATURA SOBRE LA MUERTE BACTERIANA
6.1 OBJETIVO
Comprender el efecto integrado temperatura-tiempo sobre la supervivencia microbiana.
Aplicar modelos primarios y secundarios de destruccin trmica para predecir el nmero
de supervivientes.
Evaluar el efecto de la temperatura sobre la velocidad de muerte.
6.2 MARCO TERICO
La mayor parte de las bacterias patgenas tienen una tolerancia limitada a las variaciones
extremas en su medio ambiente fsico y escasa capacidad para sobrevivir fuera del organismo
vivo. Otras, en cambio, producen esporas que son muy resistentes a las condiciones fsicas
deletreas del medio ambiente y que dotan al microorganismo de un valor incrementado de
supervivencia.
En el vocabulario comn se emplea la palabra esterilizacin como un absoluto que implica la
inactivacin total de todas las formas de vida microbiana en trminos de la capacidad del
microorganismo para reproducirse. El sufijo cida se agrega cuando se hace alusin a una accin
letal, en tanto que stasis se aade cuando simplemente se trata de inhibir el desarrollo o la
multiplicacin del microorganismo.
Tericamente se ha descrito que la destruccin de una poblacin bacteriana sigue un orden
matemtico progresivo, que obedece a un descenso exponencial. Rahn (1929, 1930) atribuy a
Madsen y Nyman (1907) y Chick (1908) como los primeros en observar la naturaleza
aparentemente exponencial de las curvas de supervivencia, aunque los primeros autores
aportaron pocos datos para poyar su conclusin con respecto a la muerte trmica. Couvert et al.
(2005) tambin atribuye el modelo cintico de muerte de primer orden a Madsen y Nyman, el
cual fue corroborado por diversos estudios realizados por Chick (1908 y 1910); Esty y Meyer
(1922) y Esty y Williams (1924) con clulas vegetativas. Estos estudios se basaron en el efecto
de la temperatura sobre las clulas, pero con el tiempo se fue extendiendo para evaluar el efecto
de diversos factores medioambientales sobre la supervivencia microbiana, por ejemplo, el efecto
del tipo y concentracin de antimicrobianos, efecto del pH (tipo y concentracin de acidulantes),
efecto de la depresin de la actividad de agua, etc.
6.2.1. ndice de letalidad de los microorganismos: la informacin referida a la cintica de la
destruccin de una poblacin bacteriana es esencial para comprender las bases de la

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esterilizacin por agentes letales. Para los microorganismos el nico criterio vlido de muerte es
la prdida irreversible de la capacidad de reproducirse. Esto en general est determinado por
tcnicas de siembra en placas que cuantifican, por medio de recuento de colonias, el nmero de
sobrevivientes.
Cuando se expone una poblacin bacteriana a un agente letal, con el tiempo tiene lugar una
reduccin progresiva en el nmero de microorganismos sobrevivientes. La cintica de la
destruccin de una poblacin microbiana suele ser de primer orden y en la mayora de los casos
de tipo exponencial: el nmero de sobrevivientes disminuye en funcin del tiempo y puede
representarse por medio de la ecuacin 6.1 que se describe a continuacin:
= 0
Ecuacin 6.1
Si el logaritmo natural del nmero de supervivientes se representa como una funcin del tiempo
de exposicin se obtiene una lnea recta (figura 6.1) cuya pendiente negativa define la velocidad
de destruccin. Sin embargo, el ndice germicida solo nos dice que fraccin de la poblacin
inicial sobrevive a un periodo determinado de exposicin al agente antimicrobiano. Para
determinar el nmero real de sobrevivientes es necesario conocer el tamao inicial de la
poblacin. Esta relacin se expresa de forma matemtica por la ecuacin 6.2:
1
= 0
Ecuacin 6.2
Donde k es la velocidad de muerte, N0 el nmero inicial de microorganismos y Nf el nmero final

que queda luego de un tiempo t de exposicin.
Figura 6.1. Grfica de la velocidad de muerte bacteriana (Curva de supervivientes).

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No. Supervivientes
14,5
Log clulas
13,5
12,5
11,5
10,5
9,5
8,5
20
40
Tiempo (min)
60
80
y = -0,08296x + 13,82022
R = 0,99999
Como puede apreciarse en la figura 6.1, la pendiente negativa de la curva obtenida refleja la tasa
de destruccin de la poblacin a ese factor especfico; pero dicha tasa es independiente del
nmero inicial de bacterias y se ve influenciada por un sinnmero de factores. Esto es comn
para todas las bacterias, pero cada una de ellas difiere en su velocidad de destruccin, la cual se
halla reflejada en la pendiente de la grfica. Esta velocidad ser la que determine el grado de
resistencia del microorganismo, por lo tanto sta ser diferente para cada especie bacteriana;
constituyndose en una importante herramienta para la medida de la resistencia bacteriana. En
el ejemplo mostrado en la figura 6.1, la velocidad de muerte de la poblacin es: 0.08296 log
clulas/min.
6.2.2 Modelo del valor D
El tiempo necesario para la esterilizacin es inversamente proporcional a la temperatura de
exposicin. Esta relacin se puede expresar por el trmino de tiempo de muerte trmica o valor
D de inactivacin trmica (McDonald y Sun, 1999; Joklik et al., 1997; Brennan et al., 1990), que
se refiere al tiempo mnimo necesario para destruir el 90% de una suspensin de
microorganismos a una temperatura predeterminada en un medio ambiente especificado
(Rahman et al., 2004), lo cual equivale a reducir la poblacin en una unidad logartmica. Por
tanto, el modelo del valor D puede catalogarse como un modelo primario (McDonald y Sun,
1999).
Este valor D, como veremos ms adelante es equivalente al valor del inverso de la pendiente de
la curva TDT). La definicin de lo que conocemos como tiempo de reduccin decimal DRT
(Modelo del valor D) fue presentado por Katzin et al., en 1943, pero fueron Ball y Olson en 1957
quienes simbolizaron este tiempo como Valor D. Debido a los elevados coeficientes de
temperatura implicados en la esterilizacin por calor, un cambio mnimo en la temperatura altera

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de manera significativa el tiempo de muerte trmica. De acuerdo con la ley de accin de masas,
el tiempo de esterilizacin se relaciona de forma directa con el nmero de microorganismos en la
suspensin.
El modelo del valor D puede representarse por la siguiente expresin matemtica (Ecuacin 6.3):
10 0 10
Ecuacin 6.3
Donde t corresponde al lapso de tiempo que ha transcurrido para que la poblacin inicial
(Log10N0) se reduzca hasta una poblacin final (Log10Nf).
Si representamos los datos de supervivientes en coordenadas logartmicas (Log10 poblacin) en
el eje de las ordenadas y el tiempo en las abscisas, obtendremos una lnea recta, tal como se
muestra en la figura 6.2.
Figura 6.2. Representacin logartmica de una poblacin microbiana frente al tiempo.
Log10 Supervivientes
6,50
Log10 clulas
6,00
5,50
5,00
4,50
4,00
3,50
0
20
40
Tiempo (min)
60
80
y = -0,03603x + 6,00205
R = 0,99999
La pendiente de la lnea recta est directamente relacionada con el tiempo de reduccin

decimal (Singh y Heldman, 1997) o valor D; por tanto, este valor D es equivalente al valor
inverso de la pendiente de la curva TDT (ecuacin 6.4).
Ecuacin 6.4
En el ejemplo mostrado en la figura 6.2, el valor D puede calcularse reemplazando la pendiente

en la ecuacin 6.4, obteniendo un valor de 27.75 minutos (D = -1/-0.03603).

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Debido a que cada ensayo para evaluar o determinar un valor D, se hace a una temperatura
constante; sta temperatura debe indicarse como un subndice en la letra, as por ejemplo, el
valor D215F, indica el tiempo de reduccin decimal de una poblacin a una temperatura
correspondiente a 215F.
Existe una relacin inversa entre la velocidad de muerte y el tiempo de reduccin decimal (D), la
cual es mostrada en la ecuacin 6.5.
2.303
Ecuacin 6.5
A partir de los resultados obtenidos de la figura 6.2 podemos calcular la velocidad de muerte,
reemplazando el valor D en la ecuacin 6.5. As obtenemos una velocidad de 0.08297/min, la
cual es idntica al valor de la pendiente obtenida en la figura 6.1.
6.2.3 Modelo del valor Z
La constante de resistencia trmica o valor Z, es un factor que describe la resistencia trmica de
una poblacin. Se define como el aumento de temperatura necesario para causar una
disminucin del 90% en el tiempo de reduccin decimal D (Rahman et al., 2004). Si
representamos los valores D obtenidos a diferentes temperaturas en coordenadas logartmicas,
el valor Z representa el aumento de temperatura necesario para cambiar un orden logartmico el
valor de D, tal como se muestra en la figura 6.3.
Figura 6.3. Representacin logartmica del tiempo de reduccin decimal frente a la temperatura.
1,600
1,400
Log10 D (min)
1,200
1,000
0,800
0,600
0,400
0,200
0,000
100
105
Temperatura (C)
110
115
120
y = -0,09177x + 10,97885
R = 0,99969
En base a la definicin anterior, z puede expresarse mediante la siguiente ecuacin (6.6):

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2 1
1 2
Ecuacin 6.6
Donde T2 y T1 corresponde a la Temperatura ms alta y ms baja, respectivamente, mientras

que el LogDT2 y LogDT1 corresponde a los valores D para T1 y T2, respectivamente.
Al igual que el modelo del Valor D, el valor Z puede obtenerse a partir de la grfica logartmica
del tiempo de reduccin decimal frente a la temperatura (figura 6.3). Como puede verse en esta
grfica, se obtiene una lnea recta y por medio del inverso de la pendiente puede hallarse el valor
Z (ecuacin 6.7).
1
= Ecuacin 6.7
Como hemos visto, el modelo del valor Z evala el efecto de la temperatura sobre la resistencia
trmica microbiana, por tanto, desde la clasificacin propuesta por Whiting y Buchanan (1993), el
modelo del valor Z puede catalogarse como un modelo secundario (McDonald y Sun, 1999).
6.2.4 Modelo de Arrhenius
La ecuacin de Arrhenius es una expresin matemtica que se utiliza para demostrar la
dependencia de la constante de velocidad (k) de una reaccin con la temperatura a la que se
lleva a cabo esa reaccin, de acuerdo con la expresin 6.8, esta expresin fue inicialmente
propuesta por Svante Arrhenius en 1889. Salvo contadas excepciones, la velocidad de una
reaccin aumenta, a menudo con el aumento de la temperatura (Man, 2004).
Ecuacin 6.8
Donde k es la velocidad de reaccin o constante cintica, A es un factor pre-exponencial o factor

de frecuencia, Ea es la energa de activacin de la reaccin (KJ/mol), R la constante universal de
los gases (8,3143 JK-1mol-1 o 0,001987 KcalK-1mol-1) y T la temperatura absoluta (K). Esta
ecuacin es considerada como una primera aproximacin adecuada para el estudio del efecto de
la temperatura sobre la cintica de reaccin.
En la ecuacin 6.8 puede verse que a temperatura constante cuanto mayor es la Ea, ms
pequea ser la constante de velocidad y por lo tanto ms lenta ser la velocidad de reaccin.
Por el contrario, velocidades de reaccin rpida tendrn una Ea pequea. Esta ecuacin tambin
ha sido utilizada para evaluar el efecto o dependencia de la velocidad especfica de crecimiento
o muerte () de una poblacin a una temperatura especfica. Por tanto, es posible sustituir en la
expresin 6.8 la constante de velocidad (k) por la velocidad especfica (ecuacin 6.9).

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Ecuacin 6.9
De la anterior expresin puede concluirse que, cuanto menor sea la temperatura de crecimiento
(T), mayor energa (Ea) requiere el microorganismo para su desarrollo y por tanto, su velocidad
de crecimiento ser menor (). Un caso similar lo veremos cuando la temperatura sobrepasa la
mxima de crecimiento, a medida que aumenta la temperatura de exposicin, menor energa se
requiere para causar un dao letal en la clula y por tanto la velocidad de muerte aumenta.
Para que la expresin 6.9 pueda ser usada como un modelo de regresin lineal entre las
variables y T-1, esta ecuacin puede ser reescrita como se muestra en la expresin 6.10a y
6.10b:
ln =
Ecuacin 6.10a
log10 = 10 2.303
Ecuacin 6.10b
En teora, si representamos ln con el recproco de la temperatura absoluta se debera obtener

una lnea recta, siendo su inclinacin la energa de activacin dividida por la constante universal
de los gases (Ea/R). Las grficas de k con 1/T se llaman grficas de Arrhenius. Muchas
reacciones cumplen con el modelo de Arrhenius, es decir sus grficas son una lnea recta. Por
tanto, estudiando la reaccin y midiendo k a dos o tres temperaturas diferentes, se puede
extrapolar lo que pasar a una temperatura inferior y predecir la velocidad a esa temperatura
(Man, 2004).
De igual forma que el modelo del valor Z, el modelo de Arrhenius puede clasificarse como un
modelo secundario en la clasificacin propuesta por Whiting y Buchanan (1993) (McDonald y
Sun, 1999), ya que evala la dependencia de la velocidad de reaccin en funcin de la
temperatura.
6.2.5 Relacin entre el modelo de Arrhenius y el modelo del Valor Z
Sin embargo, la representacin que se utiliza con mayor frecuencia entre los industriales es una
representacin del valor D basado en el modelo de Arrhenius, el cual se trata de un modelo
usado inicialmente en cintica qumica para describir la influencia de la temperatura en la
constante de velocidad de reaccin enzimtica (Singh y Heldman, 1997); sin embargo, este
modelo se ha empleado en aquellos casos donde se quiera evaluar la influencia de la
temperatura sobre la velocidad de reaccin, en este caso se relaciona el logaritmo neperiano de
D en funcin de la inversa de la temperatura absoluta (en grados Kelvin K). En esta grfica la
exactitud es tan buena o mejor que la de la ecuacin del valor z descrita anteriormente, con la

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ventaja de que en la recta de Arrhenius uno puede hacer ligeras extrapolaciones y en la de la

ecuacin del valor z el hacerlo resultara en una imprudencia (Cerf et al., 1988). La pendiente en
la recta de Arrhenius es igual a Ea/R; Ea es la energa de activacin (expresada en J/mol) y R la
constante de los gases ideales (8,314 J/molK). Existe una relacin sencilla entre Ea y z:
2
= 19,15
(5.9)
La ecuacin anterior puede utilizarse usando un valor de T que corresponda a la temperatura

absoluta media experimental.
6.2.6 Mecanismo de la lesin trmica: la inactivacin de las bacterias por calor no puede ser
definida en trminos bioqumicos simples. Aunque el efecto letal del calor hmedo por encima de
una temperatura determinada en general se atribuye a la desnaturalizacin y coagulacin de las
protenas, el patrn del dao trmico es bastante complejo y la coagulacin sin duda enmascara
otros cambios ms sutiles inducidos en la clula antes de que se evidencie la coagulacin. La
produccin de rupturas en una hebra de DNA puede ser el primer episodio letal. La prdida de
viabilidad de las clulas expuestas a una temperatura suave se puede correlacionar con la
introduccin de estas rupturas. El dao al DNA parece ser de naturaleza enzimtica y es una
consecuencia de la inactivacin de las nucleasas. La capacidad de la clula para reparar este
dao y para recuperar la viabilidad depende del estado fisiolgico del microorganismo y de su
conformacin gentica.
El calor tambin ocasiona una prdida de la integridad funcional de la membrana y la filtracin de
pequeas molculas y de material absorbente a 260 nm. Este material es de origen ribosmico y
aparentemente proviene de la degradacin de los ribosomas por ribonucleasas activadas por el
tratamiento trmico. Parece existir una correlacin entre la degradacin del RNA ribosmico y la
prdida de viabilidad de las clulas expuestas a temperaturas elevadas. El mecanismo por el
cual los microorganismos resultan destruidos por el calor seco es diferente al del calor hmedo.
Los efectos letales del calor seco, o la desecacin en general, habitualmente se atribuyen a la
desnaturalizacin proteica, al dao por oxidacin y a los efectos txicos de elevadas
concentraciones de electrolitos. En ausencia de agua el nmero de grupos polares sobre las
cadenas peptdicas disminuye y se requiere ms energa para abrir las molculas; de ah el
aumento aparente de la estabilidad del microorganismo.
6.3 MATERIALES, EQUIPOS E INSUMOS
30 tubos con 9 ml de agua peptonada estril 0.1%.

2 fiolas con 99 mL de caldo BHI
1120 mL de agar BHI fundido y mantenido a una temperatura de 55C.
Cepas de bacterias mantenidas a 35C en caldo BHI (en fase exponencial).

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56 cajas de petri estriles.

40 pipetas estriles de 1 mL.
2 pipetas de 5 mL estril.
2 Baos serolgicos ajustados a diferentes temperaturas.
Patrn de McFarland No 0,5.
6.4 REACTIVOS
No requiere.
6.5 PROCEDIMIENTO (Se seguir la metodologa propuesta por Byrne et al., 2006).
A partir de la cepa mantenida en caldo BHI se prepara una solucin patrn 0,5 de
McFarland.
A partir del patrn se toma una alicuota de 11 ml que se suspende y homogeniza en 99 ml
de solucin diluyente para disminuir 10 veces la concentracin y preparar una suspensin
de una poblacin terica aproximada de 1,5x107 bact/mL.
Se pasa 1 mL exacto de la suspensin, previamente homogenizada, a cada uno de los 6
tubos con 9 ml de agua peptona estril. De sta manera reducimos 10 veces la anterior
poblacin, es decir que supuestamente cada tubo tendr una concentracin de 1,5x106
bact/mL. Cada tubo se rotula con 9, 18, 27, 36, 45 y 54 minutos.
Se toma el tubo rotulado para 9 minutos, y se le realiza un recuento inicial para verificar la
concentracin de las suspensiones. El recuento se hace de la dilucin 103, por duplicado en
agar BHI.
En un bao serolgico, mantenido a una temperatura constante, indicada por el profesor
para cada microorganismo, se introducen los 6 tubos, manteniendo la temperatura
constante. Transcurridos los primeros 9 minutos, se toma el respectivo tubo, con la debida
asepsia, y se le realiza el correspondiente recuento de la siguiente manera: se lleva hasta la
dilucin 10-1, tomndose 1 y 0,1 mL para inocular en las placas de Petri estriles, cubriendo
con agar BHI fundido.
El procedimiento anterior se repite para cada tubo cuando se cumpla el tiempo respectivo de
exposicin a la temperatura indicada.
Se incuban las placas durante 24 48 horas a 37C, segn el microorganismo a ensayar. Se
hace la lectura correspondiente y se construye la grfica para especificar el valor D del
mismo.
6.6 NIVEL DE RIESGO

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Pantaln Largo.
6.7 BIBLIOGRAFA
Brennan, J.G., Butters, J.R., Cowell, N.D. (1990). Heat processing 2. In: Food Engineering
Operations, Elsevier, UK. Pages 297 302.
Byrne, B., Dunne, G., Bolton, D.J. (2006). Thermal inactivation of Bacillus cereus and
Clostridium perfringens vegetative cells and spores in pork luncheon roll. Food Microbiol.,
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review. Int. J. Food Microbiol., 52: 1 27.
Whiting, R.C., Buchanan, R.L. (1993). A classification of models for predictive
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Editorial Acribia, S.A. Zaragoza, Espaa. Pgs. 91 92.
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Factores que afectan a la supervivencia de los microorganismos en los alimentos. Editorial
Acribia, S.A. Zaragoza, Espaa. Pgs. 1 38.
Singh, R.P., Heldman, D.R. (1997). Captulo 5: Procesado trmico. En: Introduccin a la
Ingeniera de los alimentos. 1 edicin. Editorial Acribia, S.A. Zaragoza, Espaa. Pgs.245
265.
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Katzin, L.I., Sandholzer, L.A., Strong, M.E. (1943). Application of the decimal reduction
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Brailsford Robertson, T. (1914). On the conditions under which discontinuous events may
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Couvert, O., Gaillard, S., Savy, N., Mafart, P., Legurinel, I. (2005). Survival curves of
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Gen. Physiol., 13: 179 205.
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Madsen, T., Nyman, M. (1907). Zur theorie der desinfection. I. Z. Hyg., 57: 388 404.

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Chick, H. (1908). An investigation of the laws of disinfection. J. Hyg., 8: 92 158.

Chick, H. (1910). The process of disinfection by chemical agencies and hot wter. J. Hyg.,
10: 237 286.
6.8. ANEXOS
Tabla 6.1. Relacin de temperatura y tiempo para determinacin del valor D y z en cultivos
asporgenos.
Temperatura
Tiempo (minutos)
(C)
50
10
20
30
40
55
17
25
34
60
14
21
28
65
12
18
24
70
10
15
20
75
12
16
80
12
85
10
Tabla 6.2. Tiempos mnimos requeridos para la esterilizacin por calor hmedo y calor seco a
diferentes temperaturas.
Calor hmedo
Calor seco
Temperatura
(C)
Tiempo (min)
Presin (lb)
Tiempo (min)
121
15
15
126
10
20
134
30
140
180
150
150
160
120
170
60
Fuente: Joklik et al., 1997.

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Figura 6.4. Diagrama de flujo del proceso

6 ml
Cepa
S. aureus
54 ml
Cultivo de
trabajo
10 ml
TRATAMIENTO
TRMICO
10 ml
T0
10 ml
T1
10 ml
T2
1 ml
10 ml
T3
1 ml
5 ml
T4
1 ml
CT
Control
Temperatura
10-1
1 ml
1 ml
1 ml
1 ml
1 ml
10-2
1 ml
1 ml
DILUCIONES
Y SIEMBRA
1 ml
10-3
1 ml
1 ml
1 ml
10-4
1 ml
1 ml

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Ejemplo de la determinacin del valor z empleando el modelo tradicional y el modelo basado en

la cintica de Arrhenius.
Tabla 6.3. Valores D de S. senftenberg 774W y S. typhimurium en chocolate lacteado.
Valores D (min)*
S. senftenberg
S. typhimurium
774W
360
720
480
678
480
1050
144
222
96
222
108
222
36
78
30
72
42
---
Temperatura
(C)
70
80
90
Valor D medio (min)

S. senftenberg
S. typhimurium
774W
440 69,3
816 203,7
116 24,9
222 0,0
36 6,0
75 4,24
* Datos de Olson y Nottingham (1980).

Figura 6.4. Representacin del Log10D vs. T para S. senftenberg 774W y S. typhimurium
obtenidos en chocolate lacteado.
3,50
Log10 D
3,00
S. senftenberg 774W
S. typhimurium
2,50
2,00
y = -0,0544x + 6,4367
R = 0,9986
1,50
y = -0,0518x + 6,5242
R = 0,9973
1,00
60
70
80
90
100
Temperatura (C)

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Figura 6.5. Representacin del LnD vs. 1/TA para S. senftenberg 774W y S. typhimurium
obtenidos en chocolate lacteado.
7,00000
6,00000
S. senftenberg 774W
Ln D
S. typhimurium
5,00000
4,00000
y = 15589x - 39,378
R = 0,9995
3,00000
y = 14868x - 36,668
R = 0,9987
0,002700
0,002800
0,002900
0,003000
1/Temperatura (K)
Como puede verse en las figuras anteriores, cuando se grafica el Log10D vs T, se obtienen
lneas rectas con una bondad de ajuste de 0,9986 y 0,9973 para S. senftenberg 774W y S.
typhimurium, respectivamente; mientras que si usamos el modelo modificado de Arrhenius, los
coeficientes de correlacin son mejores con valores de 0,9995 y 0,9987, respectivamente. Los
valores de z obtenidos por los dos modelos son similares tal y como puede verse en la tabla
siguiente, sin embargo, ya hemos visto que la bondad de ajuste de la grfica es mayor para el
modelo modificado de Arrhenius.
Tabla 6.4. Valores z para S. senftenberg 774W y S. typhimurium en chocolate lacteado
Modelo de z
Modelo tradicional
Modelo de Arrhenius
Valores z (C)
S. senftenberg 774W
S. typhimurium
18,382
19,305
18,266
19,152

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ACTIVIDAD 7
EFECTO CONJUGADO DE LA TEMPERATURA, ACTIVIDAD DE AGUA (% NaCl), pH Y
COMPOSICIN DEL MEDIO SOBRE LA CINTICA DE CRECIMIENTO FNGICA
OBJETIVOS
Disear diversas metodologas para cuantificar el crecimiento miceliar fngico
Desarrollar protocolos para cuantificar la cintica conidial
Evaluar el/los efecto(s) individual o conjugado de diversos factores sobre el crecimiento
de hongos.
MARCO TEORICO
Todos los organismos tienen un potencial de incrementar su masa por divisin celular,
alargamiento celular, o ambos. De esta forma, el incremento de la masa se constituye en
una medida de su crecimiento. Muchos miclogos y cientficos tienen un nmero diverso de
razones prcticas para estudiar lo concerniente al crecimiento fngico. Primero, los hongos
son extremadamente importantes en los hbitats naturales donde ellos crecen como
saprfitos o simbiticos. Las actividades saprofticas y el crecimiento fngico estn envueltas
en los ciclos nutritivos dentro del suelo, mientras que en la vida simbitica hacen parte de
otros organismos. El conocimiento de cmo los hongos crecen y de los factores que afectan
su crecimiento es importante para entender la ecologa fngica. Segundo, el crecimiento de
los hongos tambin puede ser controlado. Muchos hongos causan alteraciones o prdidas
grandes de alimentos y materiales de importancia para los humanos. El crecimiento
parastico a expensas de su hospedador puede resultar en una enfermedad o muerte de su
hospedador. Naturalmente, los fitopatlogos, veterinarios, y dems profesionales
relacionados son conscientes de controlar el crecimiento de estos hongos, mientras que por
otras razones individuales existe una necesidad directa de permitir su crecimiento.
Si bien se han desarrollado una multitud de trabajos evaluando el papel de los hongos
(mohos y levaduras) como agentes deteriorantes, estos se han enfocado principalmente al
efecto de diversas tecnologas de conservacin (qumica, fsica, biolgica) sobre la
supervivencia de los mismos en alimentos, materiales de construccin, etc., o a describir
simplemente una curva normal de supervivencia cuando son expuestos a diversos factores
medioambientales de forma individual; pero son relativamente pocas las publicaciones sobre
investigaciones hechas a partir del modelamiento predictivo del efecto conjunto de la
temperatura, aw y pH en el crecimiento/supervivencia de mohos.
Lo anterior puede explicarse debido al hecho de que la medida del crecimiento fngico no es
fcil de cuantificar, ya que a diferencia de las bacterias y levaduras, los hongos no crecen

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como clulas individuales, sino como filamentos hifales que no pueden ser cuantificados por
las habituales tcnicas de enumeracin. Adems, las hifas fngicas pueden penetrar en los
sustratos slidos haciendo difcil su extraccin. As mismo, la capacidad de los hongos para
producir esporas, resulta en un gran aumento en el nmero de clulas viables (ufc/ gr o ml)
que a menudo tienen poca relacin con la biomasa (Pitt, 1984; Taniwaki et al., 2006).
Tradicionalmente el crecimiento y caracterizacin ecofisiolgica de los hongos
contaminantes de alimentos ha sido determinado usando un alto nivel de inculo en forma
de suspensin de esporas o discos circulares cortados de los mrgenes de un cultivo fngico
(Samapundo et al., 2007).
Crecimiento de los hongos
Es importante tener en cuenta que en el crecimiento en los mohos se da de forma micelial, slo
el borde de la colonia (las puntas de las hifas) crece. La parte central de una colonia micelial est
formada por clulas viejas mientras que el borde de la colonia est formado por clulas jvenes.
Las clulas jvenes se encuentran en trofofase (fase de alimentacin y crecimiento), mientras
que las clulas viejas se encuentran en idiofase (fase de diferenciacin). Cuando observamos
una colonia micelial (por ejemplo una colonia de moho sobre una naranja), el crecimiento de la
colonia se produce slo por el borde de la parte mohosa y en la parte central de la colonia se
produce la diferenciacin que dar lugar a la formacin de las esporas y a la aparicin del color
verdoso caracterstico. Las clulas jvenes desarrollan la mayora de la actividad metablica del
hongo, liberando enzimas al medio y absorbiendo los nutrientes. La zona central, por otra parte,
tiene clulas en las que se acumulan las substancias de reserva que pueden ser necesarias para
que el micelio colonice nuevas zonas pobres en nutrientes (por ejemplo, cuando el moho de una
fruta comienza a extenderse por la fuente de plstico en la que se encuentra) o cuando el hongo
se diferencia (por ejemplo, cuando produce esporas o cuerpos fructferos) (Aristegui, B., 2002).
Por otra parte, para la medicin del crecimiento fngico se han desarrollado varios mtodos, a
pesar que solo hasta hace algunos aos se ha comenzado a comprender bien sus principios y
aplicaciones. El mtodo ms frecuentemente usado ha sido el del recuento de clulas viables o
unidades formadoras de colonias (ufc/ g o ml), una tcnica derivada del recuento de bacterias en
alimentos. Sin embargo, este mtodo sufre graves inconvenientes, ya que el conteo de esporas
suele reflejar solo nmeros en lugar de la biomasa (Pitt, 1984); cuando el crecimiento de los
hongos consiste fundamentalmente en el crecimiento de hifas, es decir, en jvenes individuos en
el interior de las colonias, por tanto, el recuento de este tipo dar unos resultados bajos al inicio,
pero cuando se produce la esporulacin, el conteo a menudo aumenta rpidamente sin que se
observe un aumento de la biomasa. En consecuencia, se considera que el recuento de clulas
viables es un pobre indicador del grado de crecimiento de los hongos y parece que se
correlacionan mal con otras medidas tales como ergosterol (Taniwaki et al., 2006).

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Un segundo mtodo comnmente utilizado es la medicin del dimetro de la colonia. Cuando se

mide el tiempo durante varios intervalos, el dimetro de la colonia puede traducirse en tasas de
crecimiento, que son con frecuencia muy lineal a lo largo de grandes perodos de tiempo
(Taniwaki et al., 2006) y han sido ampliamente utilizados en estudios de actividad de agua. Sin
embargo, el dimetro de la colonia como una medida de la biomasa de los hongos no tiene en
cuenta la densidad de la colonia.
Factores que afectan el crecimiento de los hongos
El desarrollo de los hongos, se afecta profundamente por el medio ambiente. Las variaciones en
el ambiente externo no solo influye en el grado de crecimiento sino que en la mayora de los
casos pueden dar lugar a diferencias en el tipo del mismo, por esta razn se describe a
continuacin algunos de estos factores:
Necesidades nutricionales: Los hongos son considerados generalmente como

quimiohetertrofos estrictos. Son incapaces de fotosintetizar y por consiguiente necesitan
substratos ricos en energa para alcanzar sus requerimientos de energa y biomasa. Los
hongos producen una amplia variedad de enzimas extracelulares, principalmente oxidasas e
hidrolasas y pueden utilizar la mayor parte de los sustratos orgnicos que existen
naturalmente, incluyendo la celulosa, la quitina, el almidn, azucares, hemicelulosas y
lignina. Normalmente los carbohidratos son las principales fuentes de carbono accesibles a
los hongos; son metabolizados para proporcionar energa y tambin actan como
precursores para sntesis del material celular. Otras fuentes de carbono utilizadas incluyen
alcoholes, hidrocarburos, glicerol y almidn. Los hongos utilizan nitrgeno,
fundamentalmente en la forma de amonio, aunque casi todos pueden utilizar nitrato.los
hongos generalmente crecen en el laboratorio sobre medio definido que contiene azucares,
como glucosa y sacarosa, o sobre polmeros como celulosa. Actualmente los investigadores
utilizan tambin medios complejos no definidos sobre los que crecen los hongos, incluyendo
el medio Agar Papa dextrosa y medios basados en vegetales. Otros nutrientes minerales
requeridos y de gran importancia para un mximo rendimiento de los hongos incluyen
fosforo, azufre, potasio y magnesio (Wainwright, M. 1995).
Respiracin: Todos los hongos necesitan de oxigeno para su crecimiento, pero pueden
crecer en ambientes bajos en tenciones de oxgeno, por ejemplo cuando crecen sumergidos
en medio liquido pueden llegar a producir estructuras atpicas, a veces semejantes a
levaduras, otras veces viscosas pero de igual manera el crecimiento es lento y depende del
oxigeno disuelto en el liquido. Las esporas de muchos hongos filamentosos germinan
cuando se sumergen en un medio lquido, pero crecen con excesiva lentitud hasta que
algunas hifas alcanzan la superficie, desarrollndose despus rpidamente y de forma tpica
hasta cubrir la superficie. Uno de los efectos ms comunes cuando se limita la aireacin es
la supresin del color normal, tanto del micelio como de los conidios. Si bien los hongos no

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pueden aprovechar el CO2 para la fotosntesis y normalmente libera el gas, se ha

demostrado que por lo menos algunos reabsorben parte del CO2 producido en la respiracin
y lo utilizan para formar compuestos de 4 o ms tomos de carbono. Actualmente se sabe
muy poco sobre el mecanismo de la respiracin en los hongos filamentosos (Smith, G.,
1963)
Influencia de la luz: No es posible generalizar en cuanto a la influencia de la luz sobre el

desarrollo de los hongos, pues existen muchas especies comunes que parecen
desarrollarse lo mismo en la luz que en la oscuridad, otras se afectan de diversas maneras
por la accin de aquella. Como por ejemplo muchas Mucorceas parecen ser
completamente indiferentes a la accin de la iluminacin moderada; en cambio, algunas
cepas de Rhizopus nigricans crecen especialmente mejor en la luz difusa que en la
oscuridad. Algunos hongos son fototrpicos, es decir crecen en presencia de la luz,
dirigiendo sus rganos reproductores hacia esta. En muchos mohos el efecto de la luz
consiste en estimular la produccin de esporas u rganos reproductores, por lo que las
breves exposiciones a la luz solar constituyen un mtodo til para inducir la esporulacin en
cultivos que haban llegado estriles. Otro efecto de la luz moderada es la produccin de
pigmentos miceliales (Smith, G., 1963)
Influencia de la temperatura: Los hongos muestran grandes diferencias en su reaccin a

los cambios de temperatura y en su resistencia al calor y frio. Se ha visto que cada especie
se desarrolla mejor a una cierta temperatura, denominada temperatura optima. En general
las especies de Penicillium son ms comunes en pases templados y su temperatura ptima
se encuentra entre 20C y 25C, por otro lado, las especies del gnero Aspergillus se
desarrollan mejor alrededor de los 30C siendo comunes en regiones clidas. Se trata de
una generalizacin muy amplia y con muchas excepciones, pero con frecuencia valiosa en
trabajos industriales, donde el 90% de los hongos aislados crecen a temperaturas alrededor
de 25 30C.
Influencia de la aw: El agua es el solvente en donde ocurren las reacciones qumicas y

enzimticas de la clula y es indispensable para el desarrollo de los microorganismos.
Variaciones en la actividad de agua puede afectar la tasa de crecimiento, la composicin
celular y la actividad metablica del hongo debido a que si no disponen de suficiente
cantidad de agua libre en el medio necesitaran realizar ms trabajo para obtenerla y
disminuir el rendimiento del crecimiento. Cuando un microorganismo se encuentra en un
substrato con una actividad de agua menor que la que necesita, su crecimiento se detiene.
Esta detencin del crecimiento no suele llevar asociada la muerte del microorganismo, sino
que ste se mantiene en condiciones de resistencia durante un tiempo ms o menos largo.
En el caso de las esporas, la fase de resistencia puede ser considerada prcticamente
ilimitada. La gran mayora de los microorganismos requiere unos valores de actividad de
agua muy altos para poder crecer. De hecho, los valores mnimos de actividad para

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diferentes tipos de microorganismos son, a ttulo orientativo, los siguientes: bacterias aw

>0.90, levaduras aw >0.85, hongos filamentosos aw >0.80. Como puede verse, los hongos
filamentosos son capaces de crecer en substratos con una actividad de agua mucho menor
(ms secos) de la que permite el crecimiento de bacterias o de levaduras. Por esta razn se
puede producir deterioro de alimentos de baja actividad de agua (por ejemplo, el queso o
almbares) por mohos (hongos filamentosos) y no por bacterias.
Influencia del pH: Un cambio drstico en el pH produce una drstica reduccin de la

supervivencia de los microorganismos. La mayora de los microorganismos crecen a pH
entre 5 y 8, en general los mohos y las levaduras son capaces de crecer a pH ms bajos
que las bacterias. Puesto que la acidificacin del interior celular conduce a la prdida del
transporte de nutrientes, los microorganismos no pueden generar ms energa de
mantenimiento y, a una velocidad variable segn las especies, se produce la muerte celular.
(Pereira, G., et al 2007)

Cepas de hongos filamentosos obtenidas de la coleccin de cultivos microbianos del Cepario
de la Universidad de Pamplona. Las cepas son mantenidas en Agar Patata Dextrosa
(PDA) e incubadas a 27 0,5C por un mximo de 5-7 das hasta obtener un crecimiento
miceliar y formacin abundante de conidias.
Calibrador Vernier o Nonio 0,1 mm.
Incubadoras a 25C, 30C y 35C.
2 tubos con 10 ml de agua destilada estril + Tween 80.
Perforadora de agar de mm de dimetro.
Micropipeta de 100 1000 l.
Micropipeta de 1- 20 l.
Cajas de Petri de 4 divisiones de 100 x 20 mm o en su defecto cajas de petri corrientes de
100 x 20 mm.
REACTIVOS Y MEDIOS
27 cajas de petri con 20 ml de Agar PDA

27 cajas de petri con 20 ml Agar Sabouraud
27 cajas de petri con 20 ml de Agar Malta
27 cajas de petri con 20 ml de Agar OGY
27 cajas de petri con 20 ml de Agar Rosa de Bengala

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PROCEDIMIENTO
Para el desarrollo de esta prctica se empleara un diseo factorial 4X3X3X3X2 para evaluar
el efecto del medio de cultivo (4), temperatura (3), actividad de agua (3), pH (3) y por
duplicado (2) sobre el crecimiento radial.
La actividad de agua de los cuatro medios de cultivo se modificarn empleando como soluto
depresor el cloruro de sodio (NaCl) en concentraciones de 0,5%, 5% y 10% en cada medio
de cultivo, para obtener una actividad de agua terica* de 0,995; 0,971 y 0,938,
respectivamente. Las cajas inoculadas sern incubadas a 25C, 30C y 35C.
Para la siembra de los diversos mohos se emplear la tcnica de puncin central descrita
por Samson et al., 1999 y Gra et al., 2007:
Tomar una caja de petri estril y trazar por la parte inferior de la base dos lneas
perpendiculares que pasen por el centro de tal forma que dividan la caja en 4
cuadrantes.
Inocular la cepa en el centro de la caja con ayuda de un asa de puncin.
1
4
2
3
Incubar de forma invertida las cajas a cada una de las temperaturas, y hacer lectura del
crecimiento radial en cada cuadrante con ayuda de un calibrador Vernier cada da,
durante 15 das o hasta que el crecimiento alcance el borde de la caja.
Obtener el valor medio de crecimiento fngico (expresado en mm) para cada tiempo
(expresado en horas):
4
1
Donde
es el radio medio,
4
1 es la sumatoria del valor de los radios medidos y
es el nmero de radios contados.

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Tabla 7.1. Crecimiento radial fngico expresado en mm, para una temperatura de 25C y
0% NaCl en agar PDA.
Tiempo
(horas)
radio 1
radio 2
radio 3
radio 4
radio medio
Desviacin
estndar
0
48
96
144
192
240
288
336
360
Repetir el cuadro anterior para cada temperatura, medio, porcentaje de NaCl y pH.
Graficar los datos para calcular la velocidad radial de crecimiento fngico (mm/horas),
segn la figura mostrada de ejemplo.
Graficar las velocidades radiales de crecimiento fngico como una funcin de cada
combinacin empleando grficos de respuesta superficial (Excel, SPSS, Statistica, etc.)
Tomada de Gra et al., 2007.

NIVEL DE RIESGO

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Pantaln Largo.
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ACTIVIDAD 8 y 9
CONOCIMIENTO Y MANEJO DE LA BASE DE DATOS COMBASE, PATHOGEN MODELING
PROGRAM (PMP), SEAFOOD SPOILAGE AND SAFETY PREDICTOR (SSSP), MICROFIT
OBJETIVO
Conocer los diversos software de modelamiento microbiano como instrumento
fundamental de la simulacin bacteriana.
Aplicar las distintas bases de datos como una herramienta prctica para el estudio del
comportamiento de una poblacin bacteriana.
Utilizar los software especficos para cada caso particular.
Utilizar el software DMFit y MicroFit para la estimacin de diversos parmetros cinticos
(crecimiento/muerte) en el estudio de poblaciones bacterianas.
MARCO TERICO
El desarrollo de los diversos modelos de prediccin empleados en microbiologa descansa
sobre unas bases matemticas preestablecidas con anterioridad. Los diferentes softwares de
modelamiento han empezado a popularizarse a partir de los aos 90.
En el presente documento se describe en forma general el aplicativo ComBase y sus
componentes principales: ComBase Predictor, Perfringens Predictor y el DMFit web edition.
MATERIALES, EQUIPOS E INSUMOS (por estudiante)
Ordenador con conexin a internet (fundamental para el normal desarrollo de la prctica)
REACTIVOS
No aplica
PROCEDIMIENTO
Esta prctica se desarrollar en tres sesiones. A travs de una serie de ventanas y ejemplos
prcticos se explicar paso a paso la metodologa a seguir para el manejo de cada software.
NIVEL DE RIESGO
Para el desarrollo de la presente prctica se ha definido un Nivel de Riesgo bajo, ya que no se
manejaran. Por tanto, todo estudiante, auxiliar y docente que oriente e intervenga en el
desarrollo de la misma deber usar los siguientes equipamientos:
Bata de Laboratorio manga larga, Zapato Cerrado Bajo, Pantaln Largo.

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ANEXOS

tericas y prcticas
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I.
NORMAS DE SEGURIDAD
La bioseguridad comprende el conjunto de medidas preventivas destinadas a proteger la salud

del personal frente a riesgos por agentes, biolgicos, qumicos y/o fsicos en las reas de
trabajo del laboratorio, as corro medidas de seguridad aplicables a los edificios e instalaciones
donde se realicen las actividades. Su objetivo es crear un ambiente de trabajo SEGURO Y
ORDENADO que permita alcanzar la productividad ptima.
Reglas bsicas de seguridad:
Usar ropa adecuada (bata manga larga abotonada y limpia, zapatos cerrados y limpios, uso
de cofia y tapabocas).
No permitir el acceso a las reas de trabajo sin la debida precaucin. Respetar las reas de
acceso restringido; no ingresar inmediatamente a cuartos de siembra previamente
esterilizados con radiacin ultravioleta.
Al iniciar y finalizar las prcticas, lavarse las manos con agua y jabn
Flamee el asa antes y despus de usarla.
El lugar de trabajo debe estar siempre limpio y ordenado. Antes de comenzar cada prctica
es conveniente desinfectar la superficie de trabajo. Los desinfectantes ms habituales para
este propsito son la leja y el alcohol (etanol 96), o una solucin de hipoclorito a 15 - 20
ppm.
Los microorganismos deben manejarse siempre alrededor de la llama. Se deben evitar los
desplazamientos innecesarios con el asa bacteriolgica cargada con algn microorganismo
por el laboratorio, ya que pueden crear corrientes que originen contaminaciones, aerosoles
o producir accidentes.
Durante las prcticas est prohibido comer, beber, fumar o mascar chicle.
Cuando se manipulan microorganismos hay que evitar llevarse las manos a la boca, nariz,
ojos, y otras partes del cuerpo (por ejemplo heridas) que podran constituirse en puertas de
entrada de microorganismos oportunistas, ya que los dedos y las uas se contaminan
fcilmente, llevando microorganismos y otras sustancias nocivas; por tanto es
recomendable el uso de guantes de ltex, en especial cuando se manipulen
microorganismos patgenos o aquellos considerados oportunistas.
No portar maquillaje o aplicarse cosmticos en el laboratorio.
En caso de no contar con micropipetas, debe emplearse pipeteadores para la transferencia
de volmenes y colocar algodn, est prohibido pipetear soluciones con la boca (reactivos,
sueros y soluciones en general).
Libros, carpetas, abrigos y cualquier otro material que no se utilice en la realizacin de la
prctica deben estar apartados del lugar de trabajo.
Para deshacernos del material contaminado utilizaremos los recipientes adecuados
(generalmente de color rojo o bolsas de este mismo color), los cuales deben estar

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debidamente marcados con el logo de residuos biolgicos. Estos recipientes sern

esterilizados posteriormente. Nunca se debe tirar nada por el fregadero o a la basura
comn.
Bajo ningn concepto debe sacarse ninguna muestra contaminada del laboratorio.
El suministro de gas para los mecheros Bunsen requiere las precauciones propias de estas
instalaciones. Los escapes de gas son muy peligrosos, por lo que hay que cerrar todas las
llaves de paso de gas al finalizar la prctica, evitar la presencia de sustancias inflamables y
revisar peridicamente las conducciones.
En las prcticas en que se trabaje con luz ultravioleta debe tenerse en cuenta que la
exposicin a este tipo de radiacin es peligrosa, ya que tiene poder mutagnico. Por tanto,
nunca se debe mirar directamente el foco emisor. Hay que protegerse los ojos y cualquier
zona de la piel expuesta a la radiacin (gafas, guantes, mscaras, etc.).
En caso de accidente (ruptura de material, derramamiento de microorganismos, etc.) se
comunicar inmediatamente al instructor.
Trabaje solamente en su puesto.
Marque cuidadosamente todos los cultivos y las preparaciones que de ellas se hacen.
Incube en el lugar asignado por el instructor.
Al terminar cada sesin de trabajo, limpie la superficie de la mesa. Descarte el material que
no necesita ya sea usando los recipientes respectivos o entregndolos al instructor, al
monitor o auxiliar de laboratorio.
Nunca retire los cultivos de microorganismos del lugar de trabajo sin previa autorizacin del
instructor.
Los cultivos microbianos empleados para las prcticas solo se deben abrir durante el
momento de ser usados.
Trabaje con el cabello recogido, evite usar joyas (anillos, pulseras y cadenas largas por
fuera de la blusa).
Esterilizar todo el material de desecho. Deben establecerse reglas para la eliminacin de
desechos slidos, incluyendo agujas hipodrmicas, que deben colocarse en envases
sellados etiquetados como "material peligroso". Los medios de cultivo o muestras de suero
que se sospecha que contienen un agente Infeccioso, o virus de la hepatitis, deben
autoclavarse antes de su eliminacin final.
Si se trabaja con material que no es desechable, tener las debidas precauciones.
Etiquetar todos los frascos con fecha, nombre de la preparacin, concentracin y personal
que elabor. Cada tubo de cultivo, placa de medio y reactivo debe tener una etiqueta que
indique claramente el contenido y las fechas de preparacin y vencimiento. Los tubos,
medios y reactivos "codificados por ser peligrosos" deben estar etiquetados de forma tal
que incluso personal ajeno al laboratorio pueda interpretar el signo.
Almacenar las sustancias voltiles en envases adecuados, ventilados y fros.
Disponer de neutralizantes para usar en caso de accidente y extinguidores
Deben utilizarse guantes adecuados cuando se manipulan instrumentos calientes, as

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como protectores faciales u oculares cuando se manipulan o mezclan sustancias custicas.

Todas las sustancias corrosivas o custicas deben designarse con una etiqueta de color
brillante y guardarse en gabinetes cerrados cerca del piso. Las soluciones corrosivas que
se vierten en las piletas deben enjuagarse con abundante agua, antes de la eliminacin
real y despus de ella.
Todo el equipo elctrico debe estar apropiadamente conectado a tierra y debe tomarse la
preocupacin de no sobrecargar los circuitos. No manipular con las manos hmedas o sin
conocer adecuadamente su funcionamiento.
En el laboratorio esta estrictamente prohibido el uso extensiones elctricas y artefactos
domsticos, como cafeteras o calentadores elctricos.
El personal de laboratorio debe informar al supervisor sobre cualquier choque elctrico con
el uso del aparato. Nunca debe intentarse la reparacin mientras el dispositivo est
conectado con el circuito elctrico.
Los tanques de gases comprimidos deben asegurarse bien a la pared y el nombre de su
contenido debe estar claramente indicado en la etiqueta.
Recomendaciones antes y durante la prctica:

Llegue siempre al laboratorio con un conocimiento completo de la prctica que va a
realizar.
Llegue a tiempo para la prctica, evite interrupciones.
Atienda las explicaciones del profesor y pregunte lo que no entienda.
Marque todos sus cultivos y especmenes del estudio siguiendo las indicaciones del
instructor. Dicha marcacin debe contener por lo menos:
Grupo de trabajo, Fecha, Nombre del microorganismo, Datos relativos a la prctica
como temperatura y tiempo de incubacin, medio de cultivo, nmero de lista y otros
que considere pertinente, Semestre y nombre de la asignatura.
Para estos rtulos usar marcador de vidrio, rtulos adhesivos o escriba en cinta de
enmascarar, que usted debe llevar al laboratorio.
No olvide llevar siempre el kit de trabajo elemental: porta y cubreobjetos, lanilla o toalla,
jabn, marcador, cinta de enmascarar, cortapapel, asas de siembra reta, redonda, de
Driglasky y todo lo dems que considere necesario.

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II.
NIVEL DE RIESGO
Para el desarrollo en general de este curso se han definido en cada una de las prcticas el nivel
de riesgo, sin embargo de forma genrica para las actividades descritas en este manual se ha
definido un Nivel de Riesgo Medio o Nivel 2, ya que se manejaran microorganismos
considerados oportunistas y que en algn momento por malas prcticas de laboratorio pueden
conllevar algn peligro para los manipuladores. Por tanto, todo estudiante, auxiliar y docente
que oriente e intervenga en el desarrollo de este curso deber usar los siguientes elementos
protectores:
Pantaln Largo
Nota 1: el docente ser el responsable de velar por el cumplimiento de los elementos descritos
anteriormente.
Nota 2: cada estudiante deber portar un kit de trabajo conteniendo mnimo los siguientes
elementos:
Pipeteador, tijeras, cinta de enmascarar, marcador para vidrio, jabn lquido, en polvo o
en barra antibacterial, toalla absorbente, porta y cubre objetos, guantes desechables de
ltex, gasa, algodn, asas de platino redonda, recta y de Driglasky (hockey),
encendedor o fsforos, alcohol antisptico.

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FUNDAMENTOS DE MICROBIOLOGA

PREDICTIVA: Aplicaciones tericas y

Fundamentos de Microbiologa Predictiva: aplicaciones tericas y

Copyright 2011 by Enrique Cabeza Herrera

Queda prohibida su reproduccin total o parcial por

ENRIQUE ALFONSO CABEZA HERRERA

Ph.D., D.E.A. Ciencia y Tecnologa de alimentos

FACULTAD DE CIENCIAS BSICAS

Fundamentos de Microbiologa Predictiva: aplicaciones

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UNIDAD 1. INTRODUCCIN A LA MICROBIOLOGA PREDICTIVA

El modelamiento Predictivo es un campo promisorio de la microbiologa, se trata de un rea

Finalmente se est recurriendo a anlisis cualitativos de la calidad de alimentos mediante el

La necesidad de tomar decisiones oportunas con respecto a la calidad microbiolgica de los

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mismo, el uso de modelos predictivos pueden permitir estimar de la vida til de

El uso de los modelos matemticos en microbiologa de alimentos no es nuevo, ya que

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habamos comentado, los orgenes de la microbiologa predictiva de alimentos

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1.3. MODELAMIENTO MATEMTICO

modelo es un anlogo de la realidad fsica, tpicamente simple e idealizada. Los

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anlogo matemtico de la realidad fsica, que describe las propiedades y caractersticas de un

fenomenal crecimiento en el poder de la computacin y la facilidad de uso de estas

modelos predictivos microbiolgicos pueden ser clasificados desde diversas

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K.R. Davey. Food Microbiology, 9: 355.

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UNIDAD 2. MATEMTICAS DEL CRECIMIENTO BACTERIANO

El crecimiento o desarrollo bacteriano puede definirse como el aumento ordenado de todos

En el desarrollo de un cultivo bacteriano se produce un aumento tanto de la masa celular

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Fuente: Adaptado de Madigan et al., 2008.

estudio del crecimiento bacteriano suele hacerse a nivel de laboratorio en cultivos

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Logaritmo del nmero de clulas

Figura 2.2. Representacin grfica de la curva de crecimiento bacteriano.

En muchos tipos de trabajos de investigacin es conveniente emplear microorganismos que

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Si x(t) denota la concentracin celular entonces en un cultivo bacteriano la velocidad de

Por consiguiente, la velocidad de crecimiento especfica puede medirse como la inclinacin

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