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AISLAMIENTO DE ADN A PARTIR DE SANGRE POR METODO DE SATING

OUT
AUTORES
Murillo, Juan c; Caicedo Juan C.; Hidalgo Angela; Cespedes Boris; Correa Miguel
DIRECCION
Laboratorio de gentica molecular. Mdulo de gentica y mejoramiento animal
universidad de la amazonia.
TITULO EN INGLES:
ISOLATION OF DNA FROM BLOOD BY METHOD OF SALTING OUT
ABSTRACT:
A protocol for DNA extraction was performed from a blood sample. First proceeded
to lyse the cell membrane, then it was centrifuged and the supernatant was
discarded, then the solution of nucleic lysis is added, allowed to incubate for one
hour at 37 C, solution of protein precipitation is added, centrifuged again, extract
the supernatant to another eppendorf tube, to this is added isopropanol,
centrifuged for last look and the supernatant was discarded for ethanol, the tube is
inverted on absorbent paper and allowed to dry at room temperature, rehydration
solution is added and allowed to incubate for an hour, and finally the DNA in a plant
agarose gel and observed by electrophoresis.
KEY WORDS:
Extraction, Isolation, DNA, blood sample, electrophoresis.
RESUMEN:
Se realiz un protocolo de extraccin de ADN a partir de una muestra de sangre.
Primero se procedi a lisar la membrana celular, posteriormente se centrifugo y se
descart el sobrenadante, luego se adiciona la solucin de lisis nucleica, se deja
encubar durante una hora a 37 grados, se adiciona solucin de precipitacin
proteica, centrifugar nuevamente, se extrae el sobrenadante en otro tubo de
eppendorf, a este se le agrega isopropanol, se centrifuga por ultima ves y se
descarta el sobrenadante para agregar etanol, se invierte el tubo en papel
absorbente y se deja secar a temperatura ambiente, se agrega solucin de
rehidratacin y se deja incubar por una hora, para finalmente sembrar el ADN en
una gel de agarosa y observar por medio de electroforesis.

PALABRAS CLAVE:
Extraccin, aislamiento, ADN, muestra de sangre, electroforesis.
INTRODUCCION:
La extraccin de ADN es el primer paso en cualquier tipo de estudio gentico, por
lo tanto es importante conocer el protocolo ideal para la extraccin de una muestra
de ADN de calidad que ser puerta que nos abra todo un universo de posibilidades
en el estudio de la gentica. En general, el proceso de extraccin de ADN
comprende: lisis de la membrana celular, eliminacin de protenas, concentracin
del ADN, lavado y resuspensin. (1, 2)
Para la extraccin de ADN se han descripto diversos procedimientos los cuales
difieren entre s en la etapa de purificacin de las protenas del extracto. (3, 4)
Algunos mtodos aprovechan las propiedades desnaturalizantes de algunos
solventes orgnicos como cloroformo, fenol, etc. (1, 3), otros mtodos utilizan el
cambio de solubilidad que sufren las protenas cuando son sometidas a cambios
en la concentracin salina del medio. (1, 5) As es como en bajas concentraciones
salinas, se evidencia un pequeo aumento de la solubilidad de las protenas
(salting-in). Por otro lado en altas concentraciones de sal, la solubilidad de las
protenas disminuye y se precipitan (salting-out) (6), esto es el fundamento
fisicoqumico de la precipitacin de protenas por medio de sales. (7)
Sin embargo, estos protocolos siempre estn sujetos a modificaciones para lograr
un mejor resultado dependiendo de las posibilidades del laboratorio en que se
realizan.
MATERIALES Y METODOS:
Los materiales utilizados para la realizacin del protocolo fueron:
- Cinta de enmascarar
- Sharpie
- Guantes de nitrilo
- Guantes de La tex
- Bata
- Tapabocas
- Microcentrifugadora
- Vortex
- Electroforesis
- Microonda
- Fuente de
- Reloj de vidrio
- Tubos de ensayo EDTA

Aguja vaccutaimer
Micropipeta
Baln volumtrico
Papel, reactivos, entre otros.

Antes del inicio del laboratorio, es necesario preparar las soluciones necesarias,
en este caso las soluciones estaban preparadas con anticipacin (lisis celular, lisis
nucleica, precipitacin proteica y buffer TE) por lo tanto se procedi a realizar el
aislamiento del ADN.
Para realizar este proceso correctamente, es indispensable manejar
correctamente las micropipetas, ya que de esto depende la exactitud las
soluciones que se agregan y determinan un buen resultado.
Ya para iniciar la extraccin de ADN se extrae la muestra de sangre en un tubo
tapa lila con anticoagulante. De all se extraen dos muestras de 250l y se
deposita cada una en un tubo de eppendorf y se le adiciona primeramente la
solucin de lisis celular (750l) mezclando suavemente durante 10 minutos
invirtindola de 5 a 6 veces. Pasados los 10 minutos se centrifugo a 14mil RPM
durante 3 minutos. Se observ un sobrenadante y un decantado de color rojo
intenso, del cual se descart el sobrenadante y se conserv el decantado.
Posteriormente se le dio vortex al precipitado por 10 segundos para resuspender
las clulas decantadas.
Posteriormente se agregaron 250 l de lisis nucleica a cada tubo de eppendorf y
se pipeteo 5 veces, esto se hace para lisar las clulas blancas. Con esto la
solucin se torn viscosa por lo tanto se incubo durante 1 hora a 37c,
posteriormente se agregaron 150 l de solucin de precipitacin de protenas y se
sometieron las muestras a vortex durante 20 segundos. Posterior a esto se
observ un cumulo viscoso en la muestra que al parecer era de protena y se
extrajo con una pinza en un tubo de eppendorf para ser observado en gel de
agarosa. El resto de la muestra se centrifugo a 14mil RPM durante 3 minutos. Se
transfiri el sobrenadante a un nuevo tubo de eppendorf y se desech el
precipitado. Al sobrenadante extrado se le adicionaron 250 l de isopropanol a
cada uno. Se mezcl la solucin suavemente y posteriormente se centrifugo a
14mil RPM durante 1 minuto, de ah se descart el sobrenadante y se le
adicionaron 750 l de etanol al 70% a cada muestra con el cual se lava el ADN
invirtiendo los tubos suavemente y finalmente se centrifuga a 14mil RPM por 1
minuto antes de invertirlo sobre una papel absorbente y dejarlo secar la muestra
de ADN antes de comenzar el montaje.
Cuando el tubo de eppendorf se ha secado totalmente y ha quedado la muestra de
ADN sola, se procedi a rehidratar la muestra con 50 l de solucin en cada
muestra, se incubo durante una hora a 56 grados mientras se prepar el gel de
agarosa para sembrar el ADN, luego de sembrado el ADN se someti la gel a la
cmara de luz UV y se observaron los resultados.
RESULTADOS:

De la siembra de las dos muestras ms el material viscoso separado con


anterioridad no se pudo observar nada, la gel de agarosa expuesta en la cmara
de luz UV no mostro ADN en nuestras muestras, sin embargo en una de las
muestras de nuestros compaeros pudimos observar una pequea porcin de
ADN parcialmente desplazado de color naranja.

IMAGEN 1. (Tomada por Murillo, Juan C.) Se observa la nica muestra de ADN
que se desplaz realizada por otro grupo de compaeros del mismo laboratorio.
DISCUSIN:
La extraccin de ADN es un proceso muy delicado y de mucha precisin que
requiere ajustarse dependiendo de las posibilidades del laboratorio en que se
realiza, muchos factores pueden influir en el resultado final. En este caso los
procesos se llevaron a cabo con rigurosidad pero aun as no tuvimos el resultado
deseado. Cabe resaltar que es tan complicado y varia tanto este procedimiento
que muchos genetistas consagrados tienen que realizar el procedimiento una y
otra vez con el fin de obtener los resultados esperados y desarrollar su propio
protocolo que sea efectivo.
En nuestro caso lo pudimos constatar, ya que partiendo de la experiencia de
nuestra prctica, al da siguiente se modific en cierta medida el protocolo por
parte del director de la prctica resultando en que nuestros compaeros lograron
extraer ADN y visualizarlo casi en la totalidad de las muestras procesadas.

La modificacin que se le realizo al protocolo fue la de utilizar inicialmente el doble


de la muestra de sangre que nuestro grupo tomo y por consiguiente el doble de
reactivos para cada paso. Esto tiene sentido ya que al utilizar mayor cantidad de
sangre, aumenta tambin la cantidad de ADN aislado y da como resultado la
obtencin de una muestra significativa de ADN que se puede visualizar
perfectamente en la cmara de electroforesis.
CONCLUCION:
Con esto podemos ver que el protocolo es flexible y est sujeto a modificaciones.
Y que con cada experiencia as sea inesperado el resultado, podemos aprender
cosas que nos ayudaran en un futuro a realizar mejores prcticas.
REFERENCIAS:
1. Cariaga Martinez, A. E.; Zapata, P. D.; El laboratorio de Biologa Molecular. Una
gua prctica. Coleccin: cuadernos de Ctedra. Editorial Universitaria de
Misiones. Ao 2005.
2. Parimoo, S.; Parimoo, B.; Sample Preparation Techniques in Analytical
Chemistry. Volume 162. Cap. 6. Sample preparation in DNA analysis, p. 271-290.
3. QIAGEN. Sample & Assay Technologies. Technical hints, applications, and
protocols. Genomic DNA purification. P. 10-11
4. Austin, M.; Ordovas, J.; Eckfeldt J.; Tracy, R.; Boerwinkle, E.; Lalouel, JM;
Printz,
M. Guidelines of the National Heart, Lung, and Blood Institute Working Group on
Blood Drawing, Processing, and Storage for Genetic Studies. American Journal of
Epidemiology. Vol. 144. Number 5, p. 437-441. 1996.
5. Miller, S.A.; Dykes D. D.; A simple salting out procedure for extracting DNA from
human nucleated cells. Nucleic Acid Research; 16(3): p. 1215; 1988.
6. Claros, M.; Avila, C.; Gallardo, F.; Canovas, F.; Bioqumica Aplicada. Diseo
Experimental y Anlisis de Datos; Septem Ediciones, 2001; Madrid Espaa. p
36,37.

7. Huan-Xiang Zhou. Interactions of Macromolecules with Salt Ions: An


Electrostatic
Theory for the Hofmeister Effect. PROTEINS: Structure, Function, and
Bioinformatics 61:6978 (2005).